FI78503B - Plasmider, som innehaoller dna, vilket kodar foer det kristallina proteinet av bacillus thuringiensis, ett foerfarande foer deras framstaellning och anvaendningen av dem i e. coli-stammar som transformerats med plasmiderna. - Google Patents
Plasmider, som innehaoller dna, vilket kodar foer det kristallina proteinet av bacillus thuringiensis, ett foerfarande foer deras framstaellning och anvaendningen av dem i e. coli-stammar som transformerats med plasmiderna. Download PDFInfo
- Publication number
- FI78503B FI78503B FI824277A FI824277A FI78503B FI 78503 B FI78503 B FI 78503B FI 824277 A FI824277 A FI 824277A FI 824277 A FI824277 A FI 824277A FI 78503 B FI78503 B FI 78503B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- plasmid
- subspecies
- thuringiensis
- dna
- coli
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 127
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 title claims description 71
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 title claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 25
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 6
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 28
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 28
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 15
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 13
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 7
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 6
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UDZWHXWBCXFBSF-UHFFFAOYSA-N 1-amino-1-cyclohexylethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(N)(C)C1CCCCC1 UDZWHXWBCXFBSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 230000002362 anti-crystal effect Effects 0.000 description 3
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000256010 Manduca Species 0.000 description 2
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 241001147758 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700032487 GAP-43-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101000836310 Moraxella bovis Type II restriction enzyme MboI Proteins 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl WORJEOGGNQDSOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 108700039708 galantide Proteins 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002723 toxicity assay Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
! 78503
Plasmideja, jotka sisältävät Bacillus thuringiensiksen kiteistä proteiinia koodaavan DNA:n, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö kiteisen proteiinin plasmideilla transformoitujen E. coli-kantojen avulla 5
Keksintö koskee plasmideja, joilla transformoidut E. coli-kannat on tallennettu laitokseen American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852. Plasmidi pESl on saatavissa ATCCrstä talletusmunerolla 31995; plas-10 midi pJWK20 on saatavissa ATCCrstä talletusnumerolla 31997; ja plasmidi pJWK18 on saatavissa ATCCrstä talletusnumerolla 31998. Hakijat ovat määränneet, että solut ovat suuren yleisön saatavilla Yhdysvaltain patentin julkaisun jälkeen.
Keksintö koskee tietyille kasveille vahingollisten 15 hyönteisten torjuntaan soveltuvien aineiden tuottamista. Aivan erityisesti keksintö koskee parannettuja keinoja tuottaa aineita, jotka ovat myrkyllisiä tupakan sarvi-toukkia Manduca sexta sekä läheisiä lajeja kohtaan.
Kuten on tunnettua, B. thuringiensiksen valmistama 20 kideproteiini on myrkyllistä monien lepidopteran-hyönteis-ten toukkia kohtaan. Kiteitä sisältäviä valmisteita käytetään kaupallisesti erittäin selektiivisinä, biologisina insektisideinä. Tällaisten insektisidien käyttöön liittyvät ongelmat sekä näiden insektisidien suhteellisen kor-25 keat valmistuskustannukset ovat kuitenkin monissa tapauksissa syynä siihen, etteivät tällaiset insektisidit pysty tehokkaasti kilpailemaan muiden kaupallisesti saatavien tuotteiden kanssa.
Se seikka, että B. thuringiensis tuottaa kideprote-30 iinia vain sporulaation avulla, merkitsee huomattavaa haittaa valmistuksen ja kiteiden käytön yhteydessä. Sellainen kasvivaiherajoitus voi erityisesti teollisen valmistuksen yhteydessä johtaa hankaluuteen ja ylimääräisiin aikavaa-timuksiin valmistuksen aikana. Tietyt rasitukset, jotka 35 ovat seurausta kasvuvaiherajoituksista tai muista teki- 73503 2 jöistä, saattavat jopa tuottaa B. thuringiensiksen kantoja, jotka menettävät kiteidenvalmistuskykynsä. Sellaisilla kiteettömillä kannoilla ei ole hyönteistenvastaista aktiivisuutta.
5 Keksinnön kohteena on tarjota parannetut keinot B. thuringiensis-kideproteiinin valmistamiseksi.
Toinen keksinnön kohde on tarjota B. thuringiensis-kideproteiinin parannetut valmistuskeinot siirtämällä B. thuringiensis-kideproteiinia koodaava DNA muihin mikro-10 organismeihin, niin että toksiinin tuotolla ei ole mitään kasvuvaiherajoituksia.
Muut keksinnön kohteet tulevat selviksi aiheeseen perehtyneille seuraavasta kuvauksesta yhdessä oheisten piirrosten kanssa, joissa: 15 Kuvio 1 on plasmidi-DNA:iden ja markkeri-DNA-frag- menttien agaroosigeelianalyysi, jossa on 0,7-%:isten (kaistat 1-5) sekä 0,35-%:isten (kaistat 6 ja 7) etidiumbromidil-la värjättyjen agaroosigeelilaattojen kuva; kuvio 2 koskee nitroselluloosalle siirrettyjen plas-20 midi-DNA:iden hybridisaatioanalyysiä käsittäen valokuvan 0,7-%:isesta, etidiumbromidilla värjätystä agaroosigeelistä 32 (kaistat 1-3) sekä P:llä leimattujen plasmidien autora-diogrammit (kaistat 4-12); kuvio 3 on valokuva, joka esittää ES12-bakteerikan-25 nan tuottamien proteiinien ja kiteisen proteiinin radioimmunologista pitoisuusmääritystä ennen ja jälkeen trypsii-nillä suoritettua uuttamista; ja kuvio 4 on etidiumbromidilla värjätyn geelin valokuva, joka esittää plasmideja, jotka on löydetty B. thu-30 ringiensiksen eri kantojen uutteista.
Keksintö koskee plasmideja, jotka pystyvät replikoi tumaan E. coli-bakteeri-isännässä ja jotka sisältävät ekspressoituvaa, heterologista DNA:a, joka koodaa B. thuringiensiksen kiteistä proteiinia. Plasmideihin sisältyy 35 edelleen ekspressiomekanismi heterologiselle DNA:lie, 3 73503 jonka E. coli-bakteeri-isäntä tunnistaa, mutta jolla ei ole isäntäbakteerissa mitään oleellisia kasvuvaiherajoi-tuksia. Toisena toteutusmuotonaan keksintö koskee geneettisesti rakennettuja E. coli-bakteerikantoja, jotka on 5 transformoitu tällaisilla plasmideilla.
Bakteerikannat, jotka on geneettisesti rakennettu siten, että ne sisältävät tämän keksinnön mukaisia yhdis-telmäplasmideja, voidaan transformoida ekspressoimaan B. thuringiensis-kideproteiinia. Näiden geneettisesti 10 rakennettujen kantojen tuottama proteiini on myrkyllistä monien lepidopteran-hyönteisten toukille. Näitä kiteitä sisältäviä valmisteita voidaan käyttää erittäin selektiivisinä biologisina insektisideinä.
Keksinnön edullisen muodon mukaisesti luodaan uu-15 siä yhdistelmäplasmideja, kun tunnettu kloonausvektori-plasmidi pBR322, Bolivar et ai., Gene 2:95-113 (1977) yhdistetään plasmidifragmenttien kanssa, jotka on saatu B. thuringiensis-kantojen sisältämistä plasmideista.
"Suuri plasmidijae" on erityisesti edullinen. Tämä "suuri 20 plasmidi jae" sisältää fragmentteja, joiden koko on suurempi kuin 10 megadaltonia. B. thuringiensis-kantojen sisältämien plasmidien uskotaan saavan aikaan kideproteiinin valmistumisen B. thuringiensiksessa. B. thuringiensis-plasmidifragmentit, joita on käytetty konstruoimaan yhdis-25 telmäkideproteiinia koodaavia tämän keksinnön mukaisia plasmideja, voivat olla peräisin B. thuringiensiksen eri kannoista, joista muutamat ovat julkisesti saatavissa. Esimerkiksi B. thuringiensis-alalaji kurstaki HD-1 on saatavissa Agricultural Research Culture Collectionista 30 (NRRL), joka sijaitsee Preoriassa, Illinoisissa USA:ssa.
Se on saanut NRRL-numeron B-3792. B. thuringiensis-alala-ji kurstaki HD-73 on myös saatavissa Agricultural Research Culture Collectionista. Se on saanut NRRL-numeron B-4488. Seuraavassa esitetyt esiemrkit valaisevat useiden B. thu-35 ringiensis-kantojen käyttöä.
4 78503
Esimerkki I
B. thuringiensis-alalajin kurstaki HD-l-Dipel plas-midi-DNA:n fragmenttien käyttö keksinnön mukaisten yhdis-telmäplasmidien konstruoinnissa 5 Kidettä tuottavat B. thuringiensiksen kannat vaih- televat sisältämiensä plasmidien lukumäärän ja koon suhteen. Plasmidit, jotka on saatu B. thuringiensis-alala-jista kurstaki HD-l-Dipel, vaihtelevat molekyylimassal-taan noin 47:stä megadaltonista 1,32 megadaltoniin, kuten 10 on osoitettu kuvion 1 kaistassa 1, joka esittää normaalisti tästä kannasta saadun kokonaisplasmidikomplementin. Tässä kannassa on suurempia plasmideja, mutta niitä ei helposti todettu suljettuina rengasmaisina muotoina tutkimuksessa käytetyissä kasvuolosuhteissa. Kuitenkin B. thu-15 ringiensiksestä eristetyt plasmidifraktiot sisälsivät pieniä määriä näiden suurien plasmidien lineaarisen muodon saaneita muotoja. B. thuringiensis-alalaji kurstaki HD-1-Dipel-kannasta saatiin kaksi plasmidijaetta, kuten on esitetty kuvion 1 kaistoissa 2 ja 3. Yksi jae, joka on esi-20 tetty kaistassa 2, sisälsi 47, 32 ja 30 megadaltonin plasmidit sekä vähäisiä määriä B. thuringiensiksen hyvin suurien plasmidien lineaariseksi tehtyjä muotoja (molekyyli- g paino x 10 esitetty vasemmalla). Toinen jae sisälsi 4,9, 5,2, 5,5 ja 9,6 megadaltonin suuruisia pienempiä plasmi-25 deja, kuten on esitetty kaistassa 3.
Edullinen keksinnön mukainen yhdistelmäplasmidi, jota on merkitty pESl:llä (saatavissa ATCC:stä talletus-numerolla 31995), esitetään kuvion 1 kaistassa 4, jossa plasmidin geelianalyysiä saatetaan verrata pBR322:n kans-30 sa, joka on esitetty kaistassa 5. Sen jälkeen, kun on uutettu entsyymillä, joka pilkkoo plasmidin kerran, lineaariseksi tehdyllä plasmidilla on liikkuvuus, joka vastaa noin 11 x 10^ M^sa, kun verrataan HindIII:lla uutettuun lambda DNA:han (esitetty kuvion 1 kaistoissa 6 ja 7). Mo-35 lekyylipainot (x 10 ^) kuvan oikealla puolella tarkoittavat HindIII:lla uutettua lambda DNA:a. Nuoli kuvion 1 I! 5 78503 oikealla puolella merkitsee kaistojen 6 ja 7 lähtökohtaa.
Konstruoitaessa yhdistelmäplasmideja, kuten esimerkiksi pESl (saatavissa ATCC:stä talletusnumerolla 31995), keksinnön mukaan, seurattiin seuraavia yksityiskohtaisia 5 menetelmiä. Nämä menetelmät on esitetty myös Schnepfin ja Whiteleyn julkaisussa, Proc. Natl, Acad. Sei., USA, 78:2893-2897 (1981). Kahta erotettua plasmidi-jaetta, joita on merkitty "suurena" ja "pienenä", jotka on saatu B. thuringiensis-alalajista kurstaki HD-l-Dipel, uutettiin 10 Sau3Al:n eri laimennuksilla. Sitä tarkkailtiin agaroosi-geelielektroforeesilla. Inserttien lähteen kehittämiseksi "suurta plasmidijaetta" uutettiin vähimmäismäärällä entsyymiä joka tarvittiin muuttamaan kaikki suljetut kovalentti-set rengasmaiset molekyylit lineaariseen muotoon. Käytet-15 tiin restriktioendonukleaaseja Sali, Hindlll, BamRl sekä Sau3Al, kuten tuottaja oli suositellut (New England Bio-labs). Tämä tuotti fragmentteja, joiden keskimääräinen koko oli suurempi kuin 10 megadaltonia. "Pienelle plasmidi jakeelle" käytettiin Sau3Al:n määrää, joka jätti jäljel-20 je joitakin suljettuja, kovalenttisia, renkaan muotoisia molekyylejä, mutta tuotti joitakin lineaarisia fragmentteja, jotka olivat kooltaan alle 2 x 10^ M .
Kukin jae sidottiin sitten pBR322:een, joka oli avattu uuttamalla restriktioentsyymillä BamHl. Plasmidi 25 pBR322 eristettiin E. coli-kannasta HB101 (pBR322), kuten Blair et ai. ovat esittäneet, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69:2518-2522 (1972). DNA-fragmentit (3 yug B. thuringien-sis-plasmidi-DNA:a ja 0,15 jiq pBR322 DNA:a 10 ^il:n tilavuudessa) liitettiin kuten Maniatis et ai. ovat kuvanneet 30 koossapysyvien päiden suhteen, Cell 15:667-701 (1978).
Sitten rekombinantit seulottiin ja valittiin. Stap- 127 hylococcus proteiini A (Pharmacia) leimattiin I:llä (Amersham) käyttämällä kloramiini T:tä, kuten Erlich et ai. ovat kuvanneet, Cell 13:681-689 (1978). DNA-polyme-35 raasi I:n katalysoimaa täydennysreaktiota, jota Maniatis 6 78503 et ai. kuvasivat julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 72:1184-1188 (1975), käytettiin merkitsemään /a-^P/-cDTPrllä (Amersham) DNA-fragmentteja, jotka oli saatu Sau3Al-digestion avulla.
5 Plasmidit saatiin B. thuringiensis-alalajista kurstaki HD-l-Dipel, jonka tohtori Lee A. Bulla, Jr. ystävällisesti antoi käyttöön, Whiten ja Nesterin, J. Bacte-riol. 141:1134-1141 (1980), plasmidien seulontamenetelmän mukaan. Kaikki plasmidivalmisteet lisäksi puhdistettiin 10 sentrifugoimalla cesiumkloridi-etidiumbromidi-gradien- teissa. Näytteet (100 ^ig DNA:a gradienttia kohden) kloo-nauskokeita varten fraktioitiin sentrifugoimalla 5-25-%:isissä sakkaroosigradienteissa 2,5 tunnin ajan 35 000 kierroksella minuutissa International B-60-sentri-15 fugissa käyttämällä SB-283-roottoria. Agaroosigeelissä suoritettua elektroforeesia käytettiin plasmidi-DNA:iden analysointiin, kuten Meyers et ai. ovat kuvanneet, J. Bac-teriol. 127:1529-1537 (1976). Plasmidien fragmentteja valmistettiin uuttamalla DNA:ta restriktioentsyymeillä alal-20 la tunnetulla tavalla. Hybridisaatio plasmidi-DNA:iksi suoritettiin osittaisen puriinien poiston jälkeen, kuten Wahl et ai. ovat kuvanneet, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 76:3683-3687 (1979) ja DNA:n siirto geeleistä nitrosellu-loosalle tehtiin, kuten Thomashow et ai. ovat kuvanneet, 25 Cell 19:729:739 (1980).
Täten tuotetut yhdistelmäplasmidit transformoitiin sitten E. coliin. Transformaatio suoritettiin, kuten on kuvattu, tunnetuin menetelmin ja transformantit valittiin elatusaineella, joka sisälsi ampisilliinia 100 |ig/ml.
30 Koska kloonaus suoritettiin lähetti-DNA:n insertiolla pBR322:n BamHl-kohtaan, joka sijaitsee geenissä, joka koodaa tetrasykliiniresistenssiä, ampisilliinille resistentit transformantit seulottiin herkkyyden suhteen tetrasykliiniä kohtaan (25 jig/ml) . Pesäkkeiden, joiden oletet-35 tiin olevan resistenttejä ampisilliinille, mutta herkkiä
II
78503 7 tetrasykliinille, oletettiin sisältävän inserttejä.
Ne transformoidut pesäkkeet, joiden otaksuttiin kantavan B. thuringiensis-DNA-inserttejä, seulottiin kiteisen proteiiniantigeenin valmistuksen suhteen käyttämäl-5 lä vasta-aineita ja I-proteiini-A:ta. Kiteiden vasta-aineiden valmistamiseksi kiteet puhdistettiin ensin B. thuringiensiksen itiöitä muodostaneista viljelmistä, jotka olivat kasvaneet muunnellussa G-elatusaineessa, Aronson et ai., J. Bacteriol. 106:1016-1025 (1971), neljän 10 peräkkäisen sentrifugoinnin avulla Renograffin-gradienteis-sa (Squibb). Faasimikroskopian perusteella määritelty itiö-kontaminaatio oli vähemmän kuin 0,1 %. Liuotetuista kiteistä suoritettiin elektroforeesi preparatiivisilla, 10-%:isillä polyakryyliamidigeelilevyillä, jotka sisälsivät 15 NaDodS04:a, ja geelin osa, joka sisälsi pääosan kiteistä proteiinipolypeptidiä, leikattiin geelistä, murskattiin, sekoitettiin yhtä suuren määrän Freundin täydellistä adju-vanttia ja käytettiin kaniinien immunisointiin. Iramunoglo-buliini G-jae puhdistettiin immunisoitujen kaniinien see-20 rumista saostamalla ammoniumsulfaatilla ja kromatografoi-tiin DEAE-selluloosalla sekä analysoitiin Ouchterlony-im-munodiffuusion avulla tunnetulla tavalla.
Antigeeneillä toteamiseen perustuvaa seulontaa varten pesäkkeet siirrettiin ensin agarlevyiltä suodatinpape-25 rille ja denaturoitiin fenoli-kloroformi-heptaanilla ja kloroformi-metanolilla, kuten Henning et ai. ovat kuvanneet, Anal. Biochem. 87:153-157 (1979). Suodattimet upotettiin l-%:iseen naudanseerumialbumiiniin (Sigma, frak- 125 tio V) sekä inkuboitiin vasta-aineen ja I-proteiini 30 A:n kanssa, kuten Renart et ai. ovat kuvanneet, Proc.
Natl. Acad. Sei., USA, 76:3116-3120 (1979). Pesäkkeet, jotka sisälsivät materiaalia, joka pystyi reagoimaan ki- deproteiinivasta-aineiden kanssa, todettiin autoradiogra- -3 -4 fian avulla. Vasta-aineen (10 - 10 laimennus) ja 125 fi 35 I-proteiini A:n (0,2 - 1 x 10° iskua minuutissa) kon- 8 73503 sentraatioita vaihdettiin, jotta saatiin olosuhteet, joissa oli mahdollista havaita 5 ng kiteistä proteiinia 1 ^il:ssa, joka oli sijoitettu suodattimelle, samalla kun E. coli HB101:n (pBR322) pesäkkeet eivät joko reagoineet 5 tai näyttivät vaaleilta harmaata taustaa vasten. Proteii-ninäytteistä ajettiin elektroforeesi 10 %:lla NaDodS04/ polyakryyliamidigeelilevyillä, siirrettiin elektroforeet- tisesti nitroselluloosalle ja niitä inkuboitiin vasta-ai--3 125 neen (5 x 10 laimennus) sekä I-proteiiniA:n kanssa 5 10 (6 x 10 iskua minuutissa) tunnettujen menetelmien mukai sesti. Siirrettyjen peptidien reaktio vasta-aineen ja 125 I-proteiini A:n kanssa todettiin radioautografiän avulla.
Solut, joita oli kasvatettu 16 tunnin ajan L-liha-15 liemessä, joka sisälsi 100 ug/ml ampisilliiniä, koottiin sentrifugoimalla, lietettiin pH 7,0:ssa 0,1 M Tris-pusku-riin, jossa oli 1 mM EDTA:a, 200 pg/ml fenyylimetyylisul-fonyylifluoridia, ja solut rikottiin äänikäsittelyllä. Liukenematon aine, joka oli saatu sentrifugoimalla 20 100 000 x g:llä 30 minuutin ajan ultraäänikäsittelyllä rikottuja soluja, lietettiin perusteellisesti 4 M ureaan, 0,285 M 2-merkaptoetanoliin, 0,05 M NaHCO^teen, pH 9,5 ja sitä dialysoitiin 0,05 M Tris-puskuria vastaan pH 7,4:ssä hyönteisten vastaisia toksisuusmäärityksiä tai elektrofo-25 reettista analyysiä varten. Subtilisiinillä tai trypsii-nillä suoritettavaa proteolyysiä varten valmistettiin näytteet yllä esitetyllä tavalla korvaamalla 0,05 M syk-loheksyyliaminoetaanisulfonihapolla (CHES), pH 10,0 ja 0,285 M 2-merkaptoetanolilla pH 9,5:n ureapuskuri; lopul-30 linen dialyysi suoritettiin 0,01 M CHES-puskuria vastaan, pH 10,0. Trypsiinillä suoritettavan uuttamisen yhteydessä käytettiin 0,01 M CHES:a puskurina ja uuttaminen suoritettiin huoneen lämpötilassa tätä puskuria vastaan suoritetun dialyysin aikana; subtilisiini-uutto suoritettiin 35 Clevelandin et ai. mukaan, J. Biol. Chem. 252:1102-1106 (1977). Reaktiot pysäytettiin keittämällä näytteet elekt-
II
9 78503 roforeesinäytepuskurissa ja polypeptidit, jotka pystyivät reagoimaan kideproteiinin vasta-aineen kanssa, todettiin . . 125 käyttämällä I-proteiini A:a ja radioautografiaa, kuten edellä on kuvattu. Proteiinikonsentraatiot määritettiin 5 Bradfordin mukaan, Anal. Biochem. 72:248-254 (1976).
Yhdistelmäplasmidi pESl (saatavissa ATCC:stä talle-tusnumerolla 31995) käsittää plasmidivektorin pBR322 sekä DNA-homologit 30, 32 ja 47 megadaltonin plasmideille sekä DNA-homologit B. thuringiensiksen hyvin suurien plasmidien 10 lineaariseksi tehdyille muodoille. Yksi selitys tälle tulokselle on, että useat, kustakin suuresta B. thuringiensis-plasmidista peräisin olevat, Sau3Al:lla suoritetulla osit-taishajotuksella saadut fragementit liittyivät yhteen; tämä heteromultimeeri pystyi sitten sitoutumaan vektoriin.
15 Toinen mahdollisuus on, että näennäinen hybridisaatio 47 megadaltonin plasmidiin, kuten kuviossa 2 on esitetty, on itse asiassa jälkiartefakti, joka on peräisin 30 tai 32 megadaltonin plasmideista.
Esimerkki II
20 Todiste siitä, että keksinnön mukaisilla yhdistel- mäplasmideilla transformoitu E. coli tuottaa B. thuringien-sis-kideproteiinia Tämän keksinnön mukaisia yhdistelmäplasmideja voidaan käyttää E. coli-solujen transformaatioon. Nämä 25 transformoidut solut tuottavat B. thuringiensis-kidepro-teiinia. Sellainen transformaatio on mahdollinen, koska tämän keksinnön mukaiset yhdistelmäplasmidit sisältävät sekä vektori-DNA:n että DNA:n, joka on peräisin B. thu-ringiensis-plasmideista ja koodaa kiteistä proteiinia.
30 Plasmidia pESl (saatavissa ATCC:sta talletusnumerolla 31995) käytettiin tätä demonstroimaan.
Kuten kuviossa 2 on esitetty, plasmidi pESl (saatavissa ATCC:stä talletusnumerolla 31995) käsittää merkittävän homologian DNA:n kanssa, joka on peräisin plasmidi 35 pBR322:sta, sekä DNA-homologin 30, 32 ja 47 megadaltonin plasmideille sekä DNA-homologin B. thuringiensiksen hyvin 10 73503 suurten plasmidien lineaariseksi tehdyille muodoille. Kuviossa 2 kaistat 1-3 esittävät 0,7-%:isella etidiumbromi-dilla värjätyn agaroosigeelin valokuvaa: Kaista 1 esittää BamHl:llä uutetun pBR322:n DNA:ta; kaista 2 esittää B.
5 thuringiensiksen kokonaisplasmidikomplementtia ja kaista 3 esittää B. thuringiensiksestä saatua "suurta plasmidijaet- 32 ta". Kaistat 4-6 esittävät autoradiogranunia P:llä leimatusta pBR322:n DNA:sta, joka on hybridisoitu BamHl:llä uutetun pBR322:n DNA:n kanssa, kuten on esitetty kaistassa 4; 10 kokonaisplasmidikomplementin kanssa, kuten on esitetty kaistassa 5; ja B. thuringiensiksestä saadun "suuren plasmidi- jakeen" kanssa, kuten on esitetty kaistassa 6. Kaistat 7-9 32 esittävät autoradiogrammia P:lla leimatusta pESl:n (saatavissa ATCC:stä talletusnumerolla 31995) DNA:sta, joka 15 on hybridisoitu BamHl:llä uutetun pBR322:n kanssa, kuten on esitetty kaistassa 7; kokonaisplasmidikomplementin kanssa, kuten on esitetty kaistassa 8; ja B. thuringiensiksestä peräisin olevan "suuren plasmidijakeen" kanssa, kuten on esitetty kaistassa 9. Kaistat 1-12 esittävät au-32 20 toradiogrammia P:llä leimatusta B. thuringiensis-koko-naisplasmidi-DNA:sta, joka on hybridisoitu BamH l:nä uutetun pBR322 :n DNA:n kanssa, kuten on esitetty kaistassa 10; kokonaisplasmidikomplementin kanssa, kuten on esitetty kaistassa 11; ja B. thuringiensiksestä saadun "suuren 25 plasmidijakeen" kanssa, kuten on esitetty kaistassa 12.
Nuolet tässä kuviossa esittävät lineaariseksi tehtyjen fragmenttien paikkaa sekä koettimen hybridisaatiota sellaisiin fragmentteihin.
Kuvio 3 esittää radioimmunologista pitoisuusmääri-30 tystä transformoidun E. colin kannan ES12 tuottamasta ki-deproteiinista ennen ja jälkeen trypsiinillä suoritettua uuttoa. Kuvion 3 kaistoissa 1-3 esitetään polypeptidien kiinteäfaasi radioimmunologisen pitoisuusmäärityksen au-toradiogrammeja. Nämä jakeet reagoivat anti-kide-vasta-35 aineen kanssa NaDodSO^/polyakryyliamidigeelielektroforee-sin mukaisesti. Kaista 1 esittää 1 jig B. thuringiensis- li n 78503 kideproteiinia. Kaista 2 esittää 100 pg E. coli HB 101 :n (pBR322) proteiiniuutetta. Kaista 3 esittää 100 pg ES12:n proteiiniuutetta. Kaista 4 on peräisin liuotetuista B. thuringiensis-kiteistä, jotka ovat reagoineet 5-%:isen 5 (paino/paino) trypsiinin kanssa pH:ssa 10 kolmen tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Kaistat 5-7 esittävät ES12-uu-tetta, joka on reagoinut: 2-%risen (paino/paino) trypsiinin kanssa, kuten on esitetty kaistassa 5; 4-%-isen (paino/paino) trypsiinin kanssa, kuten on esitetty kaistassa 10 6; sekä 6-%:isen (paino/paino) trypsiinin kanssa pH:ssa 10 kolmen tunnin ajan huoneen lämpötilassa, kuten on esitetty kaistassa 7.
Kuvion 3 kaistat 1-3 esittävät, että ES12:n valmistamalla antigeenillä, joka reagoi kideproteiinivasta-ai-15 neiden kanssa, oli sama elektroforeettinen liikkuvuus kuin B. thuringiensis-kideproteiinilla. Liuotetuista B. thuringiensis-kiteistä ja HBlOlrn (pBR322) sekä ES12:n solu-uutteista ajettiin elektroforeesi NaDodSO^/polyakryy- liamidigeelillä ja ne saatettiin reagoimaan anti-kide- 125 20 vasta-aineen sekä I-proteiini A:n kanssa nitrosellu-loosalle suoritetun siirtämisen jälkeen. ES12-uute, joka on esitetty kuvion 3 kaistassa 3, sisälsi polypeptidianti-geenin, jolla oli sama (tai hyvin samankaltainen) elektroforeettinen liikkuvuus kuin liuotetuilla B. thuringiensis-25 kiteillä, jotka on esitetty kuvion 3 kaistassa 1. Tämä po-lypeptidiantigeeni- puuttui HBlOlrn (pBR322) samanlaisista uutteista, kuten on esitetty kuvion 3 kaistassa 2, eikä sitä havaittu, kun anti-kide-vasta-aine korvattiin preimmuu- 125 niseerumilla tai kun I-proteiini A:ta käytettiin ilman 30 edeltävää vasta-aine-käsittelyä (tuloksia ei ole esitetty).
Kuviossa 3 esitettyjen vyöhykkeiden vertailu (1 pg kiteistä proteiinia kaistassa 1) kaistaan 3 viedyn proteiinin kokonaismäärän kanssa (100 pg) osoittaa, että kitei-35 nen proteiiniantigeeni on pieni osa (1 % tai vähemmän) ES12:n proteiinista. Kun polypeptidin radioimmunologista ilmaisua käytettiin ES12-uutteiden fraktioinnin tarkkailuun, havaittiin, että pelkistävää ainetta sekä denaturoi- 12 78503 roivaa ainetta tai alkalista pH:ta tarvittiin liuottamaan kiteinen proteiiniantigeeni. Näitä olosuhteita tarvitaan myös B. thuringiensis-kiteiden liuottamiseen.
Lilley et ai. ovat esittäneet, J. Gen. Microbiol.
5 118:1-11 (1980), että kiteinen proteiini voidaan pilkkoa useilla proteaaseilla pH:ssa 10 pääasiassa yksinkertaisen polypeptidin tuottamiseksi. Kuvion 3 kaistat 4-7 esittävät tulokset kokeesta, missä liuotettuja B. thuringiesis-kiteitä ja eluaattia, joka oli peräisin ES12:n tietystä 10 jakeesta, käsiteltiin osittaisuutolla pH:ssa 10 käyttäen esitettyjä trypsiinin määriä. Kuten nähdään kuvion 3 kaistoissa 5, 6 ja 7, ES12-uutteen pilkkominen trypsiinin lisääntyvillä määrillä tuotti rakenteen, kuten on esitetty kuvion 3 kaistassa 7, joka oli samankaltainen kuin raken-15 ne, joka saatiin B. thuringiensiksen kideproteiinin tryp-siinillä suoritetulla uutolla, kuten on esitetty kuvion 3 kaistassa 4. Näistä kahdesta valmisteesta saatujen vyöhykkeiden rakenteet olivat kvalitatiivisesti samankaltaiset. Kvantitatiiviset ja vähäiset kvalitatiiviset erot 20 saattavat heijastaa tehottomampaa kiteisen proteiinianti-geenin pilkkoutumista ES12-uutteissa, mikä johtuu useiden muiden polypeptidilajien läsnäolosta.
Näissä kokeissa kiteisen proteiinin trypsiiniuu-tolla tuotettujen polypeptidien suurempi lukumäärä verrat-25 tuna Lilley et. al:n Q. Gen. Microbiol. 118: 1-11 (1980)_7 esittämään lukumäärään, saattaa johtua trypsiinikäsitte-lyolosuhteissa vallinneista eroista. Samanlaisia kokeita, joissa käytettiin subtilisiiniä ja jotka olivat yhtäpitäviä B. thuringiensiksen kideproteiinista tuotettujen vyö-30 hykkeiden elektroforeettisten liikkuvuuksien kanssa, saatiin määrittämällä hyönteistoksisuus. E. coli HB101:stä (pBR322) ja ES12:sta saatujen tiettyjen jakeiden uutteet sekoitettiin rehujauhon kanssa, jota syötettiin tupakka-sarvimadon Manduca sextan vastasyntyneille toukille. Toh-35 torit J. Truman ja L. Riddiford, Department of Zoology, University of Washington, antoivat käytettäviksi Manduca
II
13 78503 sextan vastasyntyneitä toukkia. Uutteet valmistettiin yllä kuvatulla tavalla 8 litrasta sopivia E. coli-kanto-ja; 6-8 millilitraa uutetta sekoitettiin 50 ml:n kanssa sulatettua agarpohjaista ravintoa ja valettiin nopeasti, 5 jotta saatiin matala kerros. Kiinteytyneen ravinteen kaistaleita pantiin lasipulloihin (3-4 ml/pullo) yhden vastasyntyneen toukan kanssa 10 päiväksi huoneen lämpötilaan.
Tulokset osoittivat, että geneettisesti rakennetun 10 rekombinanttikannan uutteet olivat toksisia perhosentouk-kia kohtaan. 15 toukkaa, jotka asetettiin alttiiksi ES12-uutteille, eivät tehneet valmiiksi ensimmäistä muodonvaih-dosta ennen kuolemaa. Kontrollikannasta, E. coli HB101:stä (pBR322) saadun uutteen ekvivalenttisella määrällä ei ol-15 lut huomattavaa vaikutusta 15 toukan kasvuun ja kehittymiseen ainakaan kolmannen muodonvaihdoksen aikana, kun verrattiin toukkiin, jotka olivat kasvaneet rehujauholla, johon ei ollut lisätty mitään uutetta. Samankaltaisia tuloksia saatiin, kun tämä koe suoritettiin toisella sarjal-20 la E. coli-uutteita. Vähimmäismäärää ESl2-uutetta, joka tarvittiin tappamaan perhosentoukat, ei ole vielä määritetty. Olettaen, että kiteinen proteiiniantigeeni ES12-uutteissa oli 0,5 - 1 % kokonaisproteiinista, silloin ES12:sta saadun uutteen avulla valmistettu rehujauho si-25 sälsi 12-25 ^ug kideproteiinia millilitraa kohti, kun taas puhtaan kiteisen proteiinin konsentraatio 2 jig/ml oli riittävä tappamaan toukat 100-%:isesti.
Saadussa transformoidussa E. colin ES12-kannassa on rekombinanttiplasmidi, ja se tuottaa proteiiniantigee-30 nin, joka reagoi vasta-aineiden kanssa, jotka ovat spesifisiä B. thuringiensiksen kiteiselle proteiinille. Tämä on varmistettu yllä kuvattujen testien avulla, joissa tästä kannasta (ATCC-numero 31995) eristetty rekombinanttiplasmidi pESl samanaikaisesti transformoi E. coli-kannan 35 HB101 viljelmiä sekä ampisilliinille resistenteiksi sekä tuottamaan kideproteiiniantigeenia, kun taas plasmidivek- 78503 14 tori pBR322 transformoi HB101:n ampisilliinille että tet-rasykliinille resistenteiksi, mutta mitään kideantigeenia ei voitu havaita. Koetulokset osoittavat, että rekombinant-tiplasmidin (saatavissa ATCC:stä talletusnumerolla 31995) 5 DNA-insertti koodaa kyvyn valmistaa polypeptidi, jolla on samanlaiset ominaisuudet kuin B. thuringiensiksen kidepro-teiinilla. Tosiasiassa tulokset antavat syyn uskoa, että pSEl:n (saatavissa ATCC:stä talletusnumerolla 31955) DNA-insertti koodaa B. thuringiensiksen kideproteiinia ja että 10 tämä geeni ilmentyy biologisesti aktiivisessa muodossa E. colissa. Valmisteita, jotka on tehty tästä uudesta geneettisesti rakennetusta kannasta ES12, saatetaan sen tähden käyttää insektisideinä tarkoituksenmukaisissa tapauksissa.
Esimerkki III
15 B. thuringiensis-alalajin kurstaki HD-73 (NRRL
N-4488) plasmidi-DNA-fragmenttien käyttö keksinnön mukaisten yhdistelmäplasmidien konstruoinnissa B. thuringiensis-alalaji kurstaki HD-73 sisältää vähemmän ns. suuria plasmideja kuin jotkut muista B. thurin-20 giensis-kannoista. Kuitenkin, kuten tämä esimerkki kuvaa, tätä kantaa voidaan käyttää tuottamaan DNA-fragmentteja, joita on käytetty hyväksi konstruoitaessa tämän keksinnön mukaisia yhdistelmäplasmideja. "Suuri plasmidijae" B. thuringiensis-alala ji kurstaki HD-73 saatiin sakkaroosigradient-25 tisentrifugoinnin avulla samalla tavalla kuin "suuri plasmidijae" B. thuringiensis-alalaji kurstaki HD-l-Dipel, joka on kuvattu esimerkissä I. Tämän jakeen uuttaminen restrik-tioentsyymi Bglllilla tuotti kuusi fragmenttia, joista yksi hybridisoitui PvuII-C DNA-koettimen kanssa, joka oli saatu 30 pESl:stä (saatavissa ATCC:stä talletusnumerolla 31995). Koe-tinta käsitellään lähemmin esimerkissä IV. "Suurta plasmidi-jaetta" uutettiin Bglllrlla, liitettiin BamHI:llä pilkottuun pBR322:een ja transformoitiin E. coliin. Pesäkkeet, jotka olivat ampisilliinille resistenttejä ja tetrasykliinille 35 herkkiä, seulottiin hybridisaation suhteen PvuII-C DNA-koettimen kanssa sekä niiden kyvyn suhteen syntetisoida li 15 73503 kideproteiiniantigeeniä. James W. Kronstadt eristi kannan, joka merkittiin JWKl:ksi (ATCC-numero 31997), jossa on plasmidi pJWK20, jonka lineaariseksi tehty massa on noin 13,5 megadaltonia. Alustavien analyysien tulokset, joissa 5 käytetään pJWK20:n Bglll- Sali- sekä Hindlll-uuttoa sekä "suurta plasmidijaetta" HD-73:sta, viittaavat siihen, että pJWK20:ssä on arviolta 10,9 megadaltonin yksinkertainen insertti, joka on peräisin B. thuringiensis-ala-lajin kurstaki HD-73 45 megadaltonin plasmidista.
10 Geneettisesti rakennetun kannan JWK1 uutteiden ha vaittiin sisältävän arviolta 130 000 Mf:n polypeptidin, joka reagoi HD-l-Dipelistä peräisin olevan kideproteii-nin vasta-aineen kanssa. Tämän peptidin liikkuvuus sopii yhteen HD-l-Dipelistä saadun kideproteiinin liikkuvuuden 15 kanssa. Hyönteistoksisuutta koskevat kokeet osoittivat, että rehujauho, jota oli täydennetty transformoidun E. coli-kannan JWKl:n uutteilla oli tupakkasarvimatoja tappava. Toksisten oireiden puhkeaminen oli samankaltainen kuin oli havaittu toukilla, joita oli ruokittu jau-20 hoilla, joka sisälsi liuotettua kiteistä proteiinia. Kuten aiemmin kuvatuissa toksisuuskokeissa E. colin (pBR322) uutteita sisältävä jauho ei hidastanut toukkien kasvua. Täten on nähtävissä, että geneettisesti rakennettu E. co-li-kanta JWK1 tuottaa proteiinia, joka on samankaltainen 25 kooltaan, antigeenisuudeltaan sekä biologisten aktiivisuuksien suhteen kuin kiteinen B. thuringiensis HD-l-Di-pelin proteiini.
Esimerkki IV
B.thuringiensis-kantojen tutkimus plasmidisisällön 30 ja näiden plasmidien kyvyn suhteen hybridisoitua pESlcstä (saatavissa ATCCjstä telletusnumerolla 31995) saadun koettimen kanssa pESlieen siirrettyjen transposoni Tn5-inserttien restriktioentsyymianalyysi (tuloksia ei ole esitetty) il-35 maisee, että pääosa oletetusta kiteisestä proteiinigee-nistä sisältyy kahden PvuII-pilkkoutumiskohdan väliseen osaan B. thuringiensis-plasmideissa. Pilkkoutumiskohdat ie 73503 määrittelevät PvuII-C DNA-fragmentin, jota voidaan käyttää koettimena B. thuringiensiksen eri kantojen plasmidi-profiilien analysointiin sen seikan määrittämiseksi, mitkä plasmidit sisältävät geenin. PvuII-C-koetinfragmentti 5 puhdistettiin sakkaroosigradienttisedimentaation avulla.
32 DNA-fragmentit leimattiin alfa- P-dCTP:llä käyttämällä joko DNA-polymeraasin katalysoimaa täydennysreaktiota, jota Maniatis et ai. ovat kuvanneet, Cell 15:667-701 (1978), tai lovitranslaation avulla, jota Maniatis et ai.
10 ovat kuvanneet, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 72:1184-1188 (1975). Koetin hybridisoitiin sitten plasmideihin, jotka olivat erilaisista B. thuringiensiksen kannoista, elektroforeesin ja nitroselluloosalle siirtämisen jälkeen. Tämän hakemuksen tekemisajankohtana noin 20 B. thuringiensiksen 15 kiteitä tuottavaa kantaa oli tutkittu plasmidisisällön sekä näiden plasmidien kyvyn suhteen hybridisoitua pESl:stä (saatavissa ATCC:stä talletusnumerolla 31995 peräisin olevan PvuII-C-koetinfragmentin kanssa. Kuviossa 4 on esitetty esimerkki yhdestä näistä geeleistä, jotka oli ajettu osana 20 tästä selvityksestä. Valokuva on etidiumbromidilla värjätystä geelistä, joka esittää plasmideja, jotka on havaittu erilaisten B. thuringiensis-kantojen uutteissa. Kaista on alalajista tolworthi; kaista b on alala jista darmstadiensis ; kaista c on alalajista sotto; kaistat d-g ovat vastaavas-25 ti alala jeista thuringiensis F10, HD-290, HD-120 ja HD-2; kaistat h-j ovat vastaavasti lajeista kurstaki HD-244, HD73 sekä HD-1. Numerot marginaalissa ilmaisevat plasmi-midin kokoa megadaltoneina. Muut geelit ajettiin (tietoja ei esitetty) uutteilla, jotka olivat B. thuringiensis 30 alalajista alesti HD-4, alalajista toumanoffi F-9, alalajista galleriae HD-8, alalajista wuhnanesis F-6 ja alalajista morrisoni F-5. Elektroforeesin tulokset on esitetty kuviossa 4 ja ne havainnollistavat usean plasmidivyöhyk-keen läsnäolon kussakin uutteessa. Luultavasti useimmat 35 vyöhykkeistä käsittävät suljettuja renkaan muotoisia molekyylejä, vaikka jotkut vyöhykkeet saattavat edustaa
II
17 78503 avoimia, rengasmaisia muotoja. Kannat vaihtelevat suuresti sisältämiensä plasmidien lukumäärän ja koon suhteen; kuitenkin useissa kannoissa oli läsnä joitakin vyöhykkeitä, joilla oli samat tai samanlaiset liikkuvuudet. Keksi-5 jät kiinnittävät huomiota siihen, että kuviossa 4 esitetyt tiedot edustavat mekaanisesti CsCl-puhdistettujen plasmidivalmisteiden analyysiä ja mitään yrityksiä ei ole tehty kasvun, plasmidiuuton tai elektroforeesiolosuh-teiden varmistamiseksi siinä tarkoituksessa, että todet-10 täisiin kaikki mahdolliset plasmidit tai toistettaisiin muiden tutkijoiden käyttämiä elektroforeesiolosuhteita. Lisäksi koot on karkeasti määritetty vertaamalla liikkuvuuksia sellaisten plasmidien liikkuvuuteen, joiden ääriviivapa tuudet Stahley et ai. ^iochem. Biophys. Res.
15 Comm., 84:581-588 (1978),7 ovat määrittäneet elektronimikroskopian avulla.
Kuviossa 4 esitetyssä kokeessa tutkitut kannat eroavat flagellojen serotyypin sekä niiden kyvyn suhteen ristireagoida kannan HD-l-Dipel kideproteiinin vasta-ai-20 neen kanssa. Kurstaki-kantojen serotyyppi on 3a; 3b; thu-ringiensis-kannat ovat tyyppiä 1; alalaji sotto on tyyp-piö 4a, 4b; alalaji darmstadiensis on tyyppiä 10 ja alalaji tolworthii on tyyppiä 9. Katso de Barjac ja Bonne-foi, C.R. Acad. Sei., 264:1811-1813 (1967). Neljätoista 25 20 testatusta kannasta reagoi kannan HD-l-Dipel kideprote iinin vasta-aineen kanssa ja osoitti hybridisaatiota Pvu II-C-koettimen kanssa.
Esimerkki V
B. thuringiensis-alalajin sotto plasmidi-DNA-frag-30 menttien käyttö keksinnön mukaisten yhdistelmäplasmidien konstruoinnissa
Menetelmät, joita käytettiin kloonaamaan B. thuringiensis-alala jista sotto peräisin oleva kideproteiini-geeni, ovat oleellisesti samoja menetelmiä, joita käytet-35 tiin kloonaamaan B.thuringiensis-alalaji kurstaki HD-73:sta peräisin oleva geeni. Menetelmät on esitetty esimerkissä III.
18 73503
Alalaji sotto valittiin kideproteiinigeenin kloo-namiseen, koska se sisältää kaksi plasmidia ja kuuluu eri serotyyppiin. Geenin kloonausta varten CsCl-etidiumbromidi-gradientissa sentrifugoimalla puhdistettu kokonaisplasmidi-5 DNA pilkottiin osittain endonukleaasi MboI:llä. Syntyvät fragmentit sidottiin pBR322:n BamHI-kohtaan. E. coliin suoritetun transformaation jälkeen valittiin pesäkkeet, jotka olivat ampisilliinille resistenttejä ja tetrasyklii-nille herkkiä. Nämä pesäkkeet seulottiin niiden kyvyn mu-10 kaan hybridisoitua PvulI-C-fragmentin kanssa sekä kyvyn suhteen tuottaa kideproteiinia. Yksi yhdistelmäkanta, JWK11 (eristänyt James W. Kronstadt), sisälsi plasmidin pJWK18; insertoidun B. thuringiensis-plasmidi-DNA:n kokoa ei ole vielä määritetty tarkasti. Kanta JWK11 valmistaa 130 000 M -15 proteiinia, joka ristireagoi antiseerumien kanssa, jotka on valmistettu B. thuringiensis kurstaki HD-l-Dipelistä eristettyä kiteistä proteiinia vastaan. JWKll:n uutteet ovat Manuca sexta-toukille myrkyllisiä.
Sen tähden voidaan huomata, että keksinnön mukai-20 sesti yhdistelmäplasmidilla transformoitu E. coli-isäntä tuottaa B. thuringiensiksen kiteistä proteiinia. In vivo B. thuringiensis tuottaa kiteistä proteiinia vain sporu-loinnin aikana. Eräs keksinnön etu on se, ettei isäntäso-lun tarvitse sporuloitua, jotta kiteisen proteiinin eks-25 pressio tapahtuu. Keksinnön mukaisissa plasmideissa sijaitsevan geneettisen informaation ekspressio ei rajoitu spesifiseen kasvuvaiheeseen isäntäsolussa, koska kiteinen proteiini ekspressoituu ekspressiomekanismin mukaisesti, jonka isäntälajit tunnistavat kaikissa kasvun päävaiheissa. Pois-30 tamalla kasvuvaiherajoitukset toksiinin tuottaminen on nyt mahdollista panosviljelyn sijasta jatkuvan viljelyn avulla. Tämä mahdollistaa suuren nopeuden ja fermentoinnin korkean tuottavuuden samalla kun laitteiston pääomakustannukset vähenevät.
35 Keksinnön erilaiset muunnokset esitettyjen ja tässä yhteydessä kuvattujen lisäksi ovat edellä esitetyn kuvauksen ja liitteinä olevien piirrosten perusteella alan ammattimiehelle ilmeisiä. Sellaisten muunnosten on tarkoitettu kuuluvan oheisten patenttivaatimusten piiriin.
Il 19 78503
Kirjallisuusviitteet 1. Aronson, A.I., Angeno, N., ja Holt, S.C., J, Bacteriol. 106:1016-1025 (1971).
2. Blair, D.G., Sherrat, D.J., Clewell, D.B., ja 5 Helinski, D.R., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 69:2518-2511 (1972) .
3. Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., ja Boyer, H.W., Gene 2:95-113 (1977).
10 4. Bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254 (1976).
5. Cleveland, D.W., Fischer, S.G., Kirschner, M.W., ja Laemmli, U.K., J. Biol. Chem. 252(3):1102-1106 (1977).
6. DeBarjac, H., ja Bonnefoi, A., C. R. Acad. Sci. 264:1811-1813 (1967).
15 7. Erlich, H.A., Cohen, S.N., ja McDevitt, H.O.,
Cell 13:681-689 (1978).
8. Henning, U,. Schwarz, H., ja Chen, R., Anal. Biochem. 97,-153-157 (1979).
9. Lilley, M., Ruffell, R.N., ja Somerville, H.J.
20 J. Gen. Microbiol. 118:1-11 (1980).
10. Maniatis, T., Hardison, R.C., Lacy, E., Lauer, J., O'Connell, C., Quon, D., Sim, G.K., ja Efstratiadis, A. Cell 15:667-701 (1978) .
11. Maniatis, T., Jeffrey, A., ja Kleid, D.G., Prog. 25 Nat. Acad. Sci., USA, 72:1184-1188 (1975).
12. Meyers, J.A., Sanchez, D., Elwell, L.P., ja Falkow, S, J. Bacteriol. 127:1529-1537 (1976).
13. Renart, J., Reiser, J., ja Stark, G.R., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 76,-31 16-3120 (1979).
30 14. Schnepf, H.E., ja Whitley, H.R., Proc. Nat.
Acad. Sci., USA 78:2893-2897 (1981).
15. Stahly, D.P., Dingman, D.W., Bulla, L.A., ja Aronson, A.I., Biochem. Biophys. Res. Comm. 84:581-588 (1978).
35 16. Thomashow, M.W., Nutter, R., Montoya, A.L.,
Gordon, M.P., ja Nester, E.W., Cell 19:729-739 (1980).
20 73503 17. Wahl, G.M., Stern, M., ja Stark, G.H., Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 76:3683-3687 (1979).
18. White, F.F., ja Nester, E.W., J. Bacteriol.
141:1 134-1 141 (1981) .
Il
Claims (7)
1. Plasmidi, joka sisältää DNA:ta, joka on saatu B. thuringiensiksen plasmidijakeesta, jonka molekyylimassa 6 5 on suurempi kuin 10 x 10 M^, ja joka voidaan identifioida DNA-fragmenttikoettimen avulla, joka on jahdettu plasmidis-ta pESl (saatavissa ATCC:stä talletusnumerolla 3199!}) ja sisältyy sen kahden PvuII-pilkkoutumiskohdan väliin, tunnettu siitä, että plasmidi pystyy replikoitumaan E. 10 coli-bakteeri-isännässä ja sisältää ekspressoituvan hetero-logisen DNA:n, joka koodaa Bacillus thuringiensiksen kiteistä proteiinia,sekä ekspressiomekanismin mainittua hete-rologista DNA:ta varten, jonka E. coli-bakteeri-isäntä tunnistaa, mutta jolla ei ole huomattavia kasvuvaiherajoituk- 15 siä E. coli-bakteeri-isännässä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että plasmidijae on johdettu ryhmästä, joka käsittää B. thurihgiensis-alalajin tolworthi; alalajin darmstadiensis; alalajin sotto; alalajin thuringiensis,
20 F-10; alalajin thuringiensis, HD-290,; alalajin thurin giensis, HD-120; alalajin thuringiensis, HD-2; alalajin kurstaki, HD-244; alalajin kurstaki, HD-73; alalajin kurstaki, HD-1; alalajin alesti, HD-4; alalajin toumanoffi, F-9; alalajin galleriae, HD-8; alalajin wuhnanesis, F-6 25 sekä alalajin morrisoni, F-5.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että se on plasmidi pESl (saatavissa ATCC:stä talletusnumerolla 31995),pJWK20 (saatavissa ATCCsstä talletunumerolla 31997) tai pJWK18 (saatavissa
30 ATCC:stä talletusnumerolla 31998).
4. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaisen plasmidin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että kiteistä proteiinia tuottavan bacillus thuringiensis-kannan plasmidijakeesta, jonka molekyylimassa on suurempi 35 kuin 10 x 10** Mr, eristetään DNA-fragmentti, joka käsittää kiteistä proteiinia koodaavan aksprossoituvan DNA:n ja joka voidaan identifioida plasmidista pESl (saatavissa 22 7 8 5 03 ATCC:stä talletusnumerolla 31995) saadun DNA-koettimen avulla, joka sisältyy plasmidin kahden PvuII-pilkkoutumis-kohdan väliin, ja DNA-fragmentti liitetään E. coli-baktee-rissa replikoituvan plasmidin DNAshan, jolloin heterologisen 5 kiteistä proteiinia tuottavan DNA:n koodauksen ekspression oikea järjestäminen E. coli-bakteeri-isännässä saavutetaan isännän tunnistaman ekspressiomekanismin avulla, jolla ei ole huomattavia kasvuvaiherajoituksia.
5. Menetelmä geneettisesti tuotetun E. coli-bak-10 teerikannan muodostamiseksi, joka kanta kykenee tuottamaan Bacillus thuringiensiksen kiteistä proteiinia, tunnettu siitä, että E. coli-isäntäbakteerikanta transformoidaan liittämällä siihen jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen plasmidi, jolloin isännän ekspressoituva 15 geneettinen aines sisältää B. thuringiensiksen kiteistä proteiinia koodaavan heterologisen DNA:n, joka voidaan identifioida plasmidista pESl (saatavissa ATCC:stä talletusnumerolla 31995) saadun DNA-koettimen avulla, joka sisältyy plasmidin kahden PvuII-pilkkoutumiskohdan väliin.
6. Menetelmä Bacillus thuringiensiksen kiteisen proteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 5 menetelmän mukaisesti tuotettua bakteerikantaa tai bakteerikantoja E. coli ES12 (ATCC 31995), JWK1 (ATCC 31997) tai JWK11 (ATCC 31998).
7. Menetelmä insektidisen vaikutuksen tuottamiseksi ympäristöön, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä toteutetaan ja ympäristö käsitellään näin saadulla kiteisellä proteiinilla, joka mahdollisesti on formulaattina, joka sisältää laimennus-30 aineen, kantajan tai täyteaineen, tai altistamalla ympäristö patenttivaatimuksen 5 mukaisen bakteerikannan tai bakteerikantojen E. coli ES12 (ATCC 31995), JWK1 (ATCC 31997) tai JWK11 (ATCC 31998) kasvulle. 23 78503
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/257,963 US4448885A (en) | 1981-04-27 | 1981-04-27 | Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli |
| US25796381 | 1981-04-27 | ||
| US32056081A | 1981-11-12 | 1981-11-12 | |
| US32056081 | 1981-11-12 | ||
| US06/362,634 US4467036A (en) | 1981-11-12 | 1982-03-30 | Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli |
| US36263482 | 1982-03-30 | ||
| PCT/US1982/000491 WO1982003872A1 (en) | 1981-04-27 | 1982-04-20 | B.thuringiensis crystal protein in e.coli |
| US8200491 | 1982-04-20 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI824277L FI824277L (fi) | 1982-12-13 |
| FI824277A0 FI824277A0 (fi) | 1982-12-13 |
| FI78503B true FI78503B (fi) | 1989-04-28 |
| FI78503C FI78503C (fi) | 1989-08-10 |
Family
ID=27401088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI824277A FI78503C (fi) | 1981-04-27 | 1982-12-13 | Plasmider, som innehaoller dna, vilket kodar foer det kristallina proteinet av bacillus thuringiensis, ett foerfarande foer deras framstaellning och anvaendningen av dem i e. coli-stammar som transformerats med plasmiderna. |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0063949B1 (fi) |
| JP (1) | JPH0795953B2 (fi) |
| AU (1) | AU550672B2 (fi) |
| CA (1) | CA1198992A (fi) |
| DE (1) | DE3276374D1 (fi) |
| DK (1) | DK160998C (fi) |
| ES (1) | ES511695A0 (fi) |
| FI (1) | FI78503C (fi) |
| IE (1) | IE53201B1 (fi) |
| IL (1) | IL65565A (fi) |
| MX (1) | MX7702E (fi) |
| WO (1) | WO1982003872A1 (fi) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4957939A (en) * | 1981-07-24 | 1990-09-18 | Schering Aktiengesellschaft | Sterile pharmaceutical compositions of gadolinium chelates useful enhancing NMR imaging |
| FR2525630B1 (fr) * | 1982-04-26 | 1985-07-05 | Pasteur Institut | Adn contenant une sequence codant pour une proteine du cristal ou un polypeptide doue de proprietes insecticides, micro-organismes transformes par de tels adn, compositions contenant lesdites proteines du cristal, polypeptide ou micro-organismes |
| US6943282B1 (en) * | 1983-09-26 | 2005-09-13 | Mycogen Plant Science, Inc. | Insect resistant plants |
| BR8404834A (pt) * | 1983-09-26 | 1985-08-13 | Agrigenetics Res Ass | Metodo para modificar geneticamente uma celula vegetal |
| DE3346138A1 (de) * | 1983-12-21 | 1985-07-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Bacillus thuringiensis var. tenebrionis sowie ein insektizid wirkendes, hieraus erhaeltliches praeparat bzw. toxin sowie deren verwendung zur bekaempfung von coleoptera |
| US4652628A (en) * | 1984-02-22 | 1987-03-24 | Syntro Corporation | Methods and compositions for expression of BTI endotoxin |
| CA1301094C (en) * | 1984-08-31 | 1992-05-19 | Helen Riaboff Whiteley | Bacillus thuringiensis crystal protein gene toxin segment |
| US4792523A (en) * | 1984-08-31 | 1988-12-20 | Cetus Corporation | 3'Expression enhancing fragments and method |
| JP2540484B2 (ja) | 1984-12-12 | 1996-10-02 | サントリー株式会社 | 殺虫性蛋白質をコ−ドする遺伝子 |
| DE3685968T2 (de) * | 1985-01-22 | 1993-07-01 | Mycogen Corp | Zellulare einkapselung biologischer pestizide. |
| DE195285T1 (de) * | 1985-02-28 | 1987-06-11 | University Of Georgia Research Foundation, Inc., Athens, Ga. | Molekulare klonierung des delta-endotoxingens von bacillus thuringiensis var. israelensis. |
| EP0202470B1 (en) * | 1985-05-20 | 1992-06-03 | Abbott Laboratories | Cloning and expression of delta-endotoxin genes of bacillus thuringiensis in bacterial cells and products therefrom |
| NZ216723A (en) * | 1985-07-18 | 1988-11-29 | Lubrizol Genetics Inc | Production of insecticidal protein by genetic engineering methods |
| US4771131A (en) * | 1985-08-16 | 1988-09-13 | Mycogen Corporation | Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene encoding a protein toxic to beetles of the order Coleoptera |
| US5231008A (en) * | 1985-10-28 | 1993-07-27 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Production of insecticidal protein of bacillus thuringiensis subsp. aizawal IPL by the expression of insecticidal protein gene in host cells |
| KR870004140A (ko) * | 1985-10-28 | 1987-05-07 | 모리 히데오 | 살충성 단백질 유전자의 숙주 세포내 발현에 의한 바실러스 튜린지엔시스아이자와이 ipl 아종의 살충성 단백질 제조방법 |
| USRE35714E (en) * | 1985-10-28 | 1998-01-13 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Production of insecticidal protein of Bacillus thuringiensis subsp. aizawai by the expression of insecticidal protein gene in host cells |
| CA1341092C (en) * | 1985-12-12 | 2000-09-05 | David L. Edwards | Process for altering the host range of bacillus thuringiensis toxins, and novel toxins produced thereby |
| GB2188049B (en) * | 1986-03-15 | 1990-09-05 | Ciba Geigy Ag | Insecticidal proteinaceous substance |
| US5597945A (en) * | 1986-07-25 | 1997-01-28 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Plants genetically enhanced for disease resistance |
| DE3751338T2 (de) * | 1986-07-25 | 1995-11-23 | Univ Louisiana State | Verfahren zum verleihen bei pflanzen eines widerstands gegen krankheiten und pest sowie neue gene in pflanzen die hierfür kodieren. |
| JPH0817705B2 (ja) * | 1986-08-19 | 1996-02-28 | 住友化学工業株式会社 | Ｂｔ殺虫性蛋白遺伝子 |
| US5196342A (en) * | 1987-04-16 | 1993-03-23 | Prutech R&D Partnership Ii | Bacillus thuringiensis P-2 toxin gene |
| ATE150089T1 (de) * | 1987-04-16 | 1997-03-15 | Ecogen Inc | Bacillus thuringiensis p-2-toxingen, protein und damit in zusammenhang stehende insektizide zusammensetzungen |
| US5861478A (en) * | 1987-07-06 | 1999-01-19 | Helix Biomedix, Inc. | Lytic peptides |
| EP0383770B1 (en) * | 1987-07-06 | 1995-09-13 | Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College | Inhibition of eucaryotic pathogens and neoplasms with lytic peptides |
| CA1327311C (en) | 1987-07-06 | 1994-03-01 | Jesse M. Jaynes | Therapeutic antimicrobial polypeptides, their use and methods for preparation |
| DE68929471D1 (de) * | 1988-09-06 | 2003-07-10 | Bayer Bioscience Nv | Pflanzen, die mit einer lepidopter-lethalen DNS-Sequenz aus Bazillus thuringiensis transformiert werden |
| DE69033816T2 (de) | 1989-02-24 | 2002-08-08 | Monsanto Technology Llc | Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung |
| US5164180A (en) * | 1989-05-18 | 1992-11-17 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests |
| CA2015951A1 (en) * | 1989-05-18 | 1990-11-18 | Mycogen Corporation | Novel bacillus thuringiensis isolates active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins |
| CA2042868A1 (en) * | 1990-06-11 | 1991-12-12 | Kenneth E. Narva | Bacillus thuringiensis microbes active against nematodes, and genes encoding novel nematode-active toxins cloned from bacillus thuringiensis isolates |
| NZ242560A (en) * | 1991-05-03 | 1994-01-26 | Mycogen Corp | Toxin effective against nematodes and its use in controlling them. |
| FR2740472B1 (fr) * | 1995-10-27 | 1998-01-16 | Pasteur Institut | Nouvelles souches de bacillus thuringiensis et composition pesticide les contenant |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3073749A (en) * | 1959-06-09 | 1963-01-15 | Bioferm Corp | Preparation of microbial insecticide |
| US3702359A (en) * | 1970-10-30 | 1972-11-07 | Us Agriculture | Certain microbial insecticides and methods of preparation thereof |
| US4000258A (en) * | 1972-01-19 | 1976-12-28 | Sandoz, Inc. | Liquid compositions of Bacillus thuringiensis |
| US4133716A (en) * | 1976-11-22 | 1979-01-09 | Crc Compagnia Ricerca Chimca, S.A. | Method for the biosynthesis of a microbial insecticide |
-
1982
- 1982-04-20 JP JP57501694A patent/JPH0795953B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1982-04-20 WO PCT/US1982/000491 patent/WO1982003872A1/en active IP Right Grant
- 1982-04-21 IL IL65565A patent/IL65565A/xx not_active IP Right Cessation
- 1982-04-23 CA CA000401534A patent/CA1198992A/en not_active Expired
- 1982-04-24 AU AU84583/82A patent/AU550672B2/en not_active Ceased
- 1982-04-26 EP EP82302137A patent/EP0063949B1/en not_active Expired
- 1982-04-26 DE DE8282302137T patent/DE3276374D1/de not_active Expired
- 1982-04-26 ES ES511695A patent/ES511695A0/es active Granted
- 1982-04-26 MX MX821040U patent/MX7702E/es unknown
- 1982-04-27 IE IE984/82A patent/IE53201B1/en not_active IP Right Cessation
- 1982-12-13 FI FI824277A patent/FI78503C/fi not_active IP Right Cessation
- 1982-12-14 DK DK555082A patent/DK160998C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK160998B (da) | 1991-05-13 |
| EP0063949A3 (en) | 1983-04-13 |
| IL65565A0 (en) | 1982-07-30 |
| DE3276374D1 (en) | 1987-06-25 |
| JPH0795953B2 (ja) | 1995-10-18 |
| AU550672B2 (en) | 1986-03-27 |
| FI824277L (fi) | 1982-12-13 |
| JPS58500565A (ja) | 1983-04-14 |
| IL65565A (en) | 1985-06-30 |
| IE820984L (en) | 1982-10-27 |
| EP0063949A2 (en) | 1982-11-03 |
| FI824277A0 (fi) | 1982-12-13 |
| MX7702E (es) | 1990-09-20 |
| DK555082A (da) | 1982-12-14 |
| CA1198992A (en) | 1986-01-07 |
| FI78503C (fi) | 1989-08-10 |
| AU8458382A (en) | 1982-11-24 |
| IE53201B1 (en) | 1988-08-31 |
| ES8305045A1 (es) | 1983-03-16 |
| ES511695A0 (es) | 1983-03-16 |
| DK160998C (da) | 1991-11-11 |
| WO1982003872A1 (en) | 1982-11-11 |
| EP0063949B1 (en) | 1987-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI78503B (fi) | Plasmider, som innehaoller dna, vilket kodar foer det kristallina proteinet av bacillus thuringiensis, ett foerfarande foer deras framstaellning och anvaendningen av dem i e. coli-stammar som transformerats med plasmiderna. | |
| US4467036A (en) | Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli | |
| US4448885A (en) | Bacillus thuringiensis crystal protein in Escherichia coli | |
| Schnepf et al. | Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli. | |
| Whiteley et al. | The molecular biology of parasporal crystal body formation in Bacillus thuringiensis | |
| AU645080B2 (en) | B. Thuringiensis CRYIIIC gene and coleopteran toxic protein | |
| Brown et al. | Molecular characterization of two novel crystal protein genes from Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni | |
| US4652628A (en) | Methods and compositions for expression of BTI endotoxin | |
| Minnich et al. | Regulation of protoxin synthesis in Bacillus thuringiensis | |
| Hodgman et al. | Characterization of a Bacillus thuringiensis strain which is toxic to the housefly Musca domestica | |
| US5308760A (en) | Crystal proteins of Bacillus thuringiensis, genes encoding them, and host expressing them | |
| IE62833B1 (en) | Bacillus thuringiensis and bacillus cereus recombinant transformation | |
| US5073632A (en) | CryIIB crystal protein gene from Bacillus thuringiensis | |
| Yamamoto et al. | Nucleotide sequence of the gene coding for a 130-kDa mosquitocidal protein of Bacillus thuringiensis israelensis | |
| Nakamura et al. | Construction of chimeric insecticidal proteins between the 130-kDa and 135-kDa proteins of Bacillus thuringiensis subsp. aizawai for analysis of structure–function relationship | |
| EP0367767B1 (en) | Bacillus thuringiensis p-2 toxin gene, protein and related insecticide compositions | |
| EP0209370A2 (en) | Insecticidal rhizobiaceae cells | |
| NO160010B (no) | Fremg.m. for fremst. av et plasmid med dna som koder for krystallprotein fra b. thuringiensis, fremg.m. for fremst.av en e. coli bakteriestamme for bruk ved fremst. av proteinet, og fremg.m. for fremst.av slikt krystallprotein | |
| JP2609786B2 (ja) | 甲虫目昆虫の幼虫に対する殺虫性タンパク質、及びその殺虫性タンパク質をコードする新規ｄｎａ | |
| EP0202470B1 (en) | Cloning and expression of delta-endotoxin genes of bacillus thuringiensis in bacterial cells and products therefrom | |
| Suh et al. | Relative Insecticidal Activities of Bacillus thuringiensis Subsp. kurstaki Toxins CrylA (b) and CrylA (c), produced in Escherichia coli | |
| Kim et al. | Molecular cloning of a new crystal protein gene cry1Af1 of Bacillus thuringiensis NT0423 from Korean sericultural farms | |
| US4978623A (en) | Methods and compositions for expression of BTI endotoxin | |
| Villanueva et al. | A Strain of Bacillus thuringiensis Containing a Novel cry7Aa2 Gene That Is Highly Toxic to Leptinotarsa decemlineata (Say)(Coleoptera; Chrysomelidae) | |
| Salama et al. | The induction of Bacillus thuringiensis new types by foreign DNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: WASHINGTON RESEARCH FOUNDATION |