NO160010B - Fremg.m. for fremst. av et plasmid med dna som koder for krystallprotein fra b. thuringiensis, fremg.m. for fremst.av en e. coli bakteriestamme for bruk ved fremst. av proteinet, og fremg.m. for fremst.av slikt krystallprotein - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et plasmid som er i stand til replikasjon i en Escherichia coli bakterievertcelle og som inneholder uttrykkbart heterologt DNA som koder for krystallprotein fra Bacillus thuringiensis, og det særegne ved fremgangsmåten

i henhold til oppfinnelsen er at man fra enplasmidfraksjon av en krystallprotein-produserende stamme av Bacillus thuringiensis, hvilken fraksjon har en molekylmasse fra 10 x 10^ M„ r til 250 x 10^ M r.isolerer en DNA-sekvens som koder for krystallprotein, og som kan identifiseres med en DNA- probe avledet fra plasmidet p ESI (erholdbart fra ATCC

nr. 31995), hvor DNA-proben befinner seg mellom to Pvu II restriksjonspunkter, og ligerer det isolerte DNA-fragment med DNA fra et plasmid som er i stand til replikasjon i en Escherichia coli bakterievert-celle.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av en Escherischia coli bakteriestamme som er i stand til fremstilling av krystallprotein fra Bacillus thuringiensis,

og det særegne ved denne fremgangsmåte er at man transformerer en Escherichia coli vert-bakteriestamme ved innføring i denne av et plasmid fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten som angitt i det ovenstående, idet det uttrykkbare genetiske material i verten dermed inkluderer heterologt DNA som koder for Bacillus thuringiensis-krystallprotein.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av B. thuringiensis krystallprotein, og det særegne ved denne fremgangsmåte er at man i et passende dyrkingsmedium dyrker en bakteriestamme oppnådd ved hjelp av den sistnevnte fremgangsmåte og deretter isolerer det fremstilte Bacillus thuringiensis krystallprotein.

Heri beskrives plasmider deponert i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852. Plasmid pESl er tildelt betegnelsen ATCC nr. 31995; plasmid pJWK20 er blitt tildelt betegnelsen ATCC nr. 31997; og plasmid pJWK18 er blitt tildelt betegnelsen ATCC nr. 31998. Det er gitt direktiv om at cellene skal være fritt tilgjengelige for almenheten etter utstedelse av et US-patent.

Oppfinnelsen muliggjør fremstilling av substanser

for kontroll av insekter som er skadelige for visse planter. og tillater fremstilling av forbedrede midler for fremstilling av substanser som er giftige for larvene til tobakks-hornormen Manduca sexta og beslektede arter.

Som vel kjent er krystall-proteinet fremstilt av

B. thuringiensis giftig for larvene til et antall av lep idoptera-insekter. Preparater inneholdende krystaller anvendes kommersielt som et sterkt selektivt biologisk insekticid. Problemer forbundet med bruken av slike insekticider, sammen med forholdsvis høye fremstillings-omkostninger, har imidlertid i mange tilfeller gjort det vanskelig at slike insekticider kan konkurrere effektivt med andre kommersielt tilgjengelige produkter.

Det forhold at B. thuringiensis fremstiller krystall--■roteinet bare under sporuleringen representerer en vesentlig ulempe i forbindelse med fremstillingen og bruken av krystallene. En slik vekstfase-begrensning, spesielt i en industriell prosess, kan resultere i ulemper og for store tidsbehov under fremstillingen. Visse biologiske trykk som resulterer fra vekstfasebegrensninger eller andre faktorer kan faktisk endog resultere i at stammer av B. thuringiensis mister sin evne til å fremstille krystallene. Slike akrystallstammer har ikke insekticidaktivitet.

Det er et formål for den foreliggende oppfinnelse å frem-bringe en forbedret fremstillingsmåte for B. thuringiensis krystallprotein.

Et annet formål for oppfinnelsen er å tilveiebringe en forbedret måte for fremstilling av B. thuringiensis krystallprotein ved overføring av det DNA som koder for krystallproteinet i B. thuringiensis til E. coli mikroorganismer slik at toksinfremstillingen ikke har noen vekstfasebegrensninger.

Forklaring av de vedføyde figurer.

Fig. 1 er en agarose-gel-analyse av plasmid DNA og markør DNA-fregmenter omfattende et fotografi av 0,7% (kolonner 1-5) og 0,35% (kolonner 6 og 7) agarose-klumpgeler farget med ethidium-bromid. Fig. 2 er en hybridiserings-analyse av plasmid DNA overført til nitrocellulose omfattende et fotografi av en 0,7% ethidium-bromid-farget agarose-gel (kolonner 1 til 3) og autoradiogrammer av 32P merkede plasmider (kolonner 4 til 12); Fig. 3 er et fotografi som viser et radioimmun-forsøk med krystallprotein og proteiner frembragt av bakteriestammen ES12 før og etter behandling med trypsin, og Fig. 4 er et fotografi av en ethidiumbromid-farget gel som viser plasmider detektert i ekstrakter av forskjellige stammer av B. thuringiensis.

Oppfinnelsen lærer således fremstilling av et plasmid som er istand til replikasjon i en E. coli vert og som inneholder heterologt DNA som kan bringes til ekspresjon og som koder for krystallproteinet i B. thuringiensis. Plasmidene inkluderer videre en ekspresjonsmekanisme for det heterologe DNA som gjenkjennes av vert-artens system, men ikke fremviser noen vesentlig vekstfasebegrensninger i bakterie-vertarten. Ved oppfinnelsen kan man oppnå genetisk oppbygde bakteriestammer omdannet av disse plasmider.

Bakteriestammer er transformert med de rekombinante plasmider fremstilt ved den foreliggende oppfinnelse til å gi ekspresjon av B. thuringiensis krystallprotein. Proteinet fremstilt av disse genetisk oppbygde stammer er giftig for larver av et antall lepidodopterainsekter. Preparater inneholdende disse krystaller kan anvendes som et høyt selektivt biologisk insekticid.

I samsvar med en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen skapes nye re-kombinantplasmider når det kjente klonings-vektorplasmid pBR322, Bolivar et al, Gene 2:95-113 (1977) kombineres med plasmidfragmenter oppnådd fra plasmider inneholdt i stammer av B. thuringiensis. Den "store plasmidfraksjon" foretrekkes spesielt. Denne "store plasmidfraksjon" inkluderer fragmenter med en størrelse større enn omtrent 10 megadalton. Plasmidet inneholdt i stammene av B. thuringiensis antas å være ansvarlige for dannelsen av krystallproteinet-"-i- B. thuringiensis. B. thuringiensis plas-midf ragmentene anvendt for å konstruere de rekombinante krystall-protein-kodende plasmider som oppnås ved oppfinnelsen kan avledes fra en rekke B. thuringiensis stammer, hvorav noen er tilgjengelige for almenheten. F.eks. er B. thuringiensis stammen Kurstaki HD-1 tilgjengelig fra Agriculture Research Culture Collection (NRRL) i Peoria, Illinois, U.S.A. Den er tilkjent betegnelsen NRRL nr. B-3792. B. thuringiensisstammen Kurstaki HD-73 er også tilgjengelig fra Agriculture Research Culture Collection.

Den er tilkjent NRRL nr. B-4488. Eksempler er inkludert i beskrivelsen for å illustrere bruken av flere B. thuringiensis stammer.

Oppfinnelsen illustreres ved hjelp av det etterfølgende eksempelmateriale.

EKSEMPEL 1

Bruk av B. thuringiensis stamme Kurstaki HD-1-Dipel plasmid DNA fragmenter ved oppbygging av rekombinant-plasmidene.

Krystallproduserende stammer av B. thuringiensis varierer i antall og størrelser av de plasmider de inneholder. Plasmider oppnådd fra B. thuringiensis stamme Kurstaki HD-1-Dipel rangerer i molekylstørrelse fra omtrent 47 til 1,32 megadalton som vist i kolonne 1 i fig. 1, som viser det totale plasmid-komplement normalt oppnådd fra denne stamme. Større plasmider er tilstede i denne stamme, men ble ikke lett detektert som lukkede sirkulære former under de vekst-betingelser som ble anvendt ved denne undersøkelse. Plasmidfraksjoner isolert fra B. thuringiensis inneholdt imidlertid små mengder av de lineariserte former av disse større plasmider. To plasmidfraksjon er ble oppnådd fra B. thuringiensis stamme Kurstaki HD-1-Dipelstammen som vist i kolonner 2 og 3 i fig- 1. En fraksjon, vist i kolonne 2, inneholdt 47,32 og 30 megadalton plasmidene såvel som spormengder av lineariserte former av de meget store plasmider av B. thuringiensis (molekylvekt x 10^ vist til venstre). Den annen fraksjon inneholdt mindre plasmider på 4, 9, 5.2, 5.5 og 9.6 megadalton som vist i kolonne 3. Rekombinant-plasmidet fremstilt ved oppfinnelsen, betegnet pES1 (ATCC nr. 31995), er vist i kolonne 4 i fig. 1 hvori gel-analyse av plasmidet kan sammenlignes med pBR322, vist i kolonne 5. Etter behandling med et enzym, som kutter plasmidet 1 gang har det lineariserte plasmid en mobilitet tilsvarende omtrent 11 x 10^ M ved sammenligning ved Hind III behandlet lambda DNA (vist i kolonner 6 og 7 i fig. 1). Molekylvekter (x 10^) til høyre på Fig. 1 refererer til Hind III behandling av lambda DNA, pilen til høyre i fig.

1 markerer oppfinnelsen for kolonner 6 og 7.

Fig. 1 refererer til Hind III behandling av lambda DNA, pilen til høyre i fig. 1 markerer opprinnelsen for kolonner 6 og 7.

Ved oppbygging av re-kombinant-plasmidet pES1 (ATCC nr. 31995) i samsvar med oppfinnelsen ble følgende detaljerte metoder fulgt. Disse metoder er også skissert i Schnepf, og Whiteley, Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 78:2893-2897 (1981).

De to separerte plasmidfraksjoner, betegnet som "stor"

og "liten", oppnådd fra B. thuringiensis var. Kurstaki HD-1-Dipel ble behandlet med varierende fortynninger av Sau3Al.. Dette ble overvåket ved hjelp av agarose-gel-elektroforese. For å utvikle en kilde for innskudd ble den "store plasmidfraksjon" behandlet med den minste mengde av enzym nødvendig for å omdanne alle de lukkede kovalente sirkulære molekyler til den lineære form. Restriksjons-endonukleaser Sal I, Hind III, BamH 1 og Sau 3A1 ble anvendt som anbefalt av fabrikanten. Dette resulterte i fragmenter med en gjennomsnittlig størrelse større enn 10 megadalton. For den "lille plasmidfraksjon" ble en mengde Sau3A1 anvendt som etterlot noen lukkede kovalente sirkulære molekyler, men fremstilte få lineære fragmenter under 2 x 10^ i størrelse.

Hver fraksjon ble så ligert til pBR322 som var blitt åpnet ved behandling med restriksjonsenzymet Bam Hl. Plasrrid pBR322 ble isolert fra E.coli stammen HB101 (pBR322) som skissert av Balir et al, Proe.Nat.Acad.Sei. USA, 69:2518 til 2522 (1972). DNA fragmenter (3 mikrogram av B.thuringiensis plasmid DNA og 0,15 mikrogram pBR322 DNA i et volum på 10

mikroliter) ble ligert som beskrevet for klebrige ender av Maniatis et al, i Cell 15:667-701 (1978).

Rekombinantene ble så undersakt og selektert. Staphylococcus Protein A ble merket med 125-1

under anvendelse av kloramid T som beskrevet av Erlich et al, Cell 13:681-689 (1978). DNA polymerase I-katalysert inn-

f.yllingsreaksjonen beskrevet av Maniatis et al, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 72:1184-1188 (1975) ble anvendt for

merking av DNA-fragmenter av Sau3Al-behandlingsprodukter med Za-<32>P_7 dCTP .

Plasmider ble oppnådd fra B.thuringiensis var Kurstaki HD-l-Dipel, elskverdig skaffet til veie av Dr. Lee A. Bulla, junior, i samsvar med metoden for plasmid-undersøkelse til White og Nester, J. Bacteriol. 141:1134-1141 (1980). Alle plasmidpreparater ble ytterligere renset ved sentrifugering i cesium-klorid-ethidiumbromid-gradienter. Prøver (100 mikrogram DNA pr. gradient) for kloningsforsøk ble fraksjonert ved sentrifugering gjennom 5 til 25% sukrose-gradienter i 2,5 timer ved 35.000 omdreininger pr. minutt i en sentrifuge International B-60 under anvendelse av SB-283 rotor. Elektroforese i agarosegeler ble anvendt for å analysere plasmid DNA som beskrevet av Meyer et al,

J. Bacteriol. 127:1529-1537 (1976). Fragmenter av plasmidene ble fremstilt ved behandling av DNA med restriksjon, sen 7. yrne r som kjent innen dette området. Hybridisering til plasmid DNA ble gjennomført etter delvis de-purinering som beskrevet av Wahl et al, Proe. Nat. Acad. Sei. USA. 76:3683-3687 (1979) og overføring av DNA fra geler til nitrocellulose ble gjort som beskrevet av Thomashow et al, Cell 19:729-739 (1980).

De således fremstilte rekombinantplasmider ble så transformert inn i E.coli. Transformeringen ble gjennomført som beskrevet ved hjelp av kjente metoder og transformantene ble selektert på media inneholdende 100 mikrogram/ml ampicillin. Ettersom kloning ble gjennomført ved innskudd av DNA-materialet i BamH 1-stedet i pBR322, som befinner seg i et gen som koder for tetracyklin-resistens, ble ampicillin-resistente transformanter utvalgt for sensi-tivitet overfor tetracyklin (25 mikrogram/ml). Kolonier resistente mot ampicillin men sensitive for tetracyklin ble forutsatt å inneholde innskudd.

De transformerte kolonier som var antatt å bære B.thuringiensis DNA innskudd ble så undersøkt for fremstilling av krystallprotein-antigen under anvendelse av antistoffer og 125-I-Protein A. For fremstilling av antistoffer til krystallene ble krystallene først renset for sporulerte kulturer av B. thuringiensis dyrket i modifisert G medium, Aronson et al, J. Bacteriol, 106:1016-1025 (1971) ved hjelp av 4 suksessive sentri-fugeringer i "Renograffin"-gradienter . Foru-

rensning med sporer ble anslått til mindre enn 0,1% ved hjelp av fase-mikroskopering. Oppløseliggjorte krystaller ble elektroforese-behandlet på preparative 10% poly-akrylamid-klumpgeler inneholdende NaDodSO^ Og den del av gelen inneholdende det vesentlige krystallprotein-polypeptid ble kuttet av fra gelen, knust, blandet med en like stor mengde Freund^s Complete Adjuvant og anvendt for immunisering av kaniner. Immunoglobulin G-fraksjonen ble renset fra serumet av de immuniserte kaniner ved utfelling med ammoniumsulfat og kromatografering på DEAE cellulose og analysert ved hjelp av Ouchterlony immuno-diffusjon .

For deteksjon av antigener ble først kolonier overført fra agarplater til filterpapir og denaturert med fenol-kloroform-heptan og kloroform-metanol som beskrevet av Henning et al, Anal. Biochem. 97:153-157 (1979). Filterne ble impregnert

i 1% bovint serumalbumin, og inkubert med antistoff og 125-1- Protein A som beskrevet av Renart et al,

Proe. Nat. Acad.Sei. USA, 76:3116-3120, (1979). Kolonier inneholdende material istand til reaksjon med krystall-protein-antistoffene ble detektert ved autoradio.grafering. Konsentrasjonene av antistoff (10<->"<*> - lo'* fortynning) , og 125-I-Protein A (0,2 til 1 x 10<6>cpm) ble variert til å

oppnå betingelser som tillot deteksjon av 5 ng krystall-protein i 1 mikroliter dryppet på et filter hvor kolonier av E.coli HB101 (pBR322) enten var ikke-reaktive eller syntes lett mot en grå bakgrunn. Proteinprøver ble elektroforese-behandlet på 10% NaDodSO^-polyakrylamid-klumpgeler, overført elektroforetisk til nitrocellulose, og inkubert med antistoff (5 x 10"^ oppløsning) og 125-I-Protein A

(6 x 10^ cpm) i samsvar med kjente metoder. Reaksjonen av overførte peptider med antistoff og 125-1 ble detektert ved radioautografi.

Celler dyrket i 16 timer i L- væske inneholdende 100 mikrogram/ml ampicillin ble høstet ved sentrifugering, suspendert i 0,1 M Trisbuffer ved pH 7,0, 1 mM EDTA, 200 mikrogram/ml fenyl-metyl-sulfonylfluorid og knust ved ultra-lydbehandling. Uoppløselig material, oppnådd ved sentrifugering av materialet fra lydbehandlingen ved 100.000

x g i 30 minutter ble grundig suspendert i 4 M urea,

0,285 M 2-merkaptoetanol, 0,05 M NaHC03, pH 9,5 og dialysert mot 0,05 M Tris buffer pH 7,4 for insekts-giftighets-, bestemmelse eller for elektroforetisk analyse. For proteo-lyse med subtilisin eller trypsin ble prøvene fremstilt som ovenfor ved at 0,05 M cykloheksylaminetan-sulfonsyre (CHES), pH 10,0, 0,285 M 2-merkaptoetanol erstattet pH

9,5 urea-buffer. Endelig analyse var mot 0,01 M CHES-buffer, pH 10,0. For trypsinbehandling ble 0,01 M CHES anvendt som buffer og behandlingen ble gjennomført ved romtemperatur under dialysen mot denne buffer. Behandling med subtilisin ble gjennomført i samsvar med Cleveland et al, J. Biol. Chem. 252:1102-1106 (1977). Reaksjonene ble stanset ved koking av prøvene i elektroforese-prøvebuffer og polypeptider i stand til reaksjon med antistoff til krystallproteinet ble detektert under anvendelse av 125-1-protein A og radioautografi som beskrevet ovenfor. Protein-konsentrasjonene ble bestemt i henhold til Bradford, Anal.Biochem, 72:248-254 (1976).

Rekombinant-plasmidet pESl (ATCC nummer 31995) består

av plasmid-vektoren pBR322 og DNA homologene til 30, 32 og 47 megadalton plasmidene, såvel som DNA homologene til lineariserte former av selve de store plasmider av B. thuringiensis. En forklaring til dette resultat

er at flere Sau3Al partiale behandlingsfragmenter fra hver av de store B. thuringiensis plasmider ble ligert sammen.

Denne heteromultimer kunne så ha vært ligert inn i vektoren.

En annen mulighet er at den øyensynlige hybridisering til

47 megadalton-plasmidet som vist i fig. 2 faktisk er en ting som stammer fra 30 eller 32 megadalton-plasmidene.

EKSEMPEL 2

Bevis på at E.coli transformert med rekombinant-plasmider oppnådd ved oppfinnelsen frembringer B. thuringiensis krystallprotein.

Rekombinant-plasmidene oppnådd ved oppfinnelsen an-

vendes for transfoi-mering av E.coli celler. Disse transformerte celler frembringer B. thuringiensis krystallprotein. Slik omdannelse er mulig pga. at rekombinant-plasmidene

oppnådd ved oppfinnelsen inneholder både vektor DNA og DNA

fra B.thuringiensis plasmider som koder for krystall-

protein . Plasmid pESl (ATCC nr. 31995) ble anvendt for å demonstrere dette.

Som illustrert i fig. 2 inneholder plasmid pESl (ATCC nr.

31995) vesentlig homologi med DNA fra plasmidet pBR322 såvel som DNA homologi med 30, 32 og 47 megadalton plasmider såvel som DNA homologi med lineariserte former av de meget store plasmider fra B. thuringiensis.. I fig. 2 viser kolonner 1 til 3 et fotografi av en 0,7 ethidium-bromidfarget agarosegel: Kolonne 1 viser BamH 1 behandlet pBR322 DNA; kolonne 2 viser totalt plasmidkomplement fra B. thuringiensis og kolonne 3 viser den "store plasmidfraksjon" fra B. thuringiensis.Kolonner 4-6

viser et autoradiogram av 32p -merket pBR322 DNA hybridisert med BamH 1 behandlet pBR322 DNA som vist i kolonne 4; totalt plasmidkomplement, som vist i kolonne 5; og den "store plasmidfraksjon" fra B.thuringiensis som vist i kolonne 6. Kolonner 7-9 viser et autoradiogram av 32p -merket pESl (ATCC

nr. 31995) DNA hybridisert med: BamH 1 behandlet pBR322,

som vist i kolonne 7, totalt plasmidkomplement, som vist i kolonne 8; og "den store plasmidfraksjon" fra B.thuringiensis, som vist i kolonne 9- Kolonner 1 til 12 viser et autoradiogram av ^ 2p -merket totalt B.thuringiensis plasmid DNA hybridisert med BamH 1 behandlet pBR322 DNA som vist i kolonne 10; totalt

plasmidkomplement, som vist i kolonne 11; og den "store plasmidfraksjon" fra B.thuringiensis, som vist i.kolonne 12. Pilene i denne figur viser posisjonen av de lineariserte fragmenter og hybridiseringen av prøven til slike fragmenter.

Fig. 3 viser en radioimmun-prøverekke av krystallprotein fremstilt av transformerte E. coli-stammen ES12 før og etter behandling med trypsin.

Autoradiogrammer av en fast-fase radioimmun-prøve for polypeptider er vist i kolonner 1 -3 i figur 3. Disse fragmenter reagerer med antikrystallstoff etter NaDodSO^-polyakrylamid-gel-elektroforese. Kolonne 1 viser et mikrogram B.thuringiensis krystallprotein. Kolonne 2 viser 100 mikrogram E.coli HB101 (pBR322) proteinekstrakt. Kolonne 3 viser.. 100 mikrogram ES12 proteinekstrakt. Kolonne 4 er avledet fra oppløste B.thuringiensis-krystaller omsatt med 5%

(vekt/vekt) trypsin ved pH 10 i 3 timer ved romtemperatur. Kolonner til 7 viser ES12 ekstrakten omsatt med: 2% (vekt/vekt) trypsin, som vist i kolonne 5; 4% (vekt/vekt) trypsin som vist i kolonne 6; og 6% (vekt/vekt) trypsin ved pH 10 i 3 timer ved romtemperatur, som vist i kolonne 7.

Kolonner 1 til 3 i fig. 3 viser at antigenet fremstilt av ES12, som reagerte med krystall-proteinantistoffene, hadde den samme elektroforetiske mobilitet som B.thuringiensis krystallprotein. Oppløste B.thuringiensis krystaller og celleekstrakter av HB101 (pBR322) og ES12 ble elektro-foresebehandlet på en NaDodSO^/polyakrylamidgel og omsatt med anti-krystallantistoff og 125-I-Protein A etter overføring til nitrocellulose. ES12-ekstrakten, vist i kolonne 3 i fig-3, inneholdt et polypeptid-antigen med den samme (eller meget like) elektroforetiske mobilitet som de oppløste B.thuringiensis krystaller vist i kolonne 1 i fig. 3. Dette polypeptidantigen manglet i en lignende ekstrakt av HB101 (pBR322) som vist i kolonne 2 av fig. 3, og ble ikke detektert

når pre-immunserum erstattet anti-krystall-antistoffet,

eller når 125-I-Protein A ble anvendt uten forutgående antistoffbehandling (data ikke vist).

Sammenligning av båndene vist i fig. 3 (1 mikrogram krystallprotein i kolonne 1) med den totale mengde av protein til-ført kolonne 3 (100 mikrogram) indikerer at krystall-protein-antigenet svarer for en liten mengden av proteinet [ 1% eller mindre) i ES12. Når radioimmun-deteksjonen av polypeptidet ble anvendt for å styre fraksjoneringen av ES12 ekstraktene, ble det funnet at et reduserende middel pluss et denaturerende middel eller alkalisk pH

var nødvendig for oppløseliggjøring av krystallprotein-antigenet. Disse betingelser kreves også for oppløselig-gjøring av B.thuringiensis-krystaller.

Det er rapportert av Lilley et al, J. Gen. Microbiol. 118:ø-ll

(1980) at krystallproteinet kan behandles med et antall proteaser ved pH 10 for primær fremstilling av et enkelt polypeptid. Kolonner 4 til 7 i fig. 3 viser resultatene av et forsøk hvor oppløste B.thuringiensis-krystaller og et eluat fra den partikkelformede fraksjon av ES12 ble underkastet partial behandling ved pH 10 med de angitt mengder av trypsin. Som det sees i kolonner 5,6 og 7 i fig- 3, gir behandling av ES12-ekstrakten med økende mengder trypsin et mønster som vist i kolcme 7 i fig. 3, som var lik mønstret frembragt ved trypsinbehandling av krystallproteinet av B.thuringiensis, som vist i kolonne 4 i fig. 3. Kvalitativt var mønstrene av båndene generert fra de to preparater like. De kvantitative, og mindre kvalitative, forskjeller kan reflektere en mindre effektiv behandling av krystall-protein-antigenet i ES12-ekstrakter som skyldes nærværet av tallrike andre polypeptid-arter.

Det store antall polypeptider fremstilt ved trypsinbehandling av krystallproteinet i disse forsøk i motsetning til det antall som rapporteres av Lilley et al, supra, kan skyldes forskjeller i betingelsene ved trypsinbehandlingen. Lignende forsøk under anvendelse av subtilisin viste

også at samsvar i de elektroforetiske mobiliteter av båndene frembragt fra krystallproteinet i B.thuringiensis ble oppnådd ved prøven på insektgiftighet. Ekstrakter av partikkelformede fraksjoner oppnådd fra E.coli HB101 (pBR322) og ES12 ble blandet med formel tilført neonat-larver av tobakks-hornorm Manduca sexta. Neonat-larver av Manduca sexta ble levert av Dr. J. Truman og L. Riddiford, Department Zoology, University of Washington. Ekstrakter ble fremstilt som beskrevet ovenfra fra 8 liter av de passende E.coli-stammer; 6-8 ml ekstrakt ble blandet med 50 ml smeltet agarbasert diett og hurtig helt ut til å gi

et grunt lag. Striper av den størknede diett ble anbragt i glassampuller (3-4 ml/ampulle) med en neonatlarve i 10 døgn ved romtemperatur.

Resultatene indikerte at ekstraktene av den genetisk kon-struerte re-kombinantstamme var giftige for larver. De 15 larver utsatt for ES12 ekstrakter fullførte ikke den første instar før de døde. En ekvivalent mengde ekstrakt fra kontrollstammen, E.coli HB101 (pBR322) hadde ingen påviselig virkning på veksten og utviklingen av 51 larver gjennom minst tredje instar ved sammenligning med larver utviklet på f&rmel uten noen tilsatt ekstrakt. Identiske resultater ble oppnådd når dette forsøk ble gjentatt med et annet sett av E.coli-ekstrakter. Den minste mengde av ekstrakt av ES12 nødvendig for å drepe larven er ennå ikke bestemt. Under forutsetning av krystallprotein-s-antigenet i ES12 ekstraktene var 0,5 til 1% av det totale protein, inneholdt formelet fremstilt med ekstrakten fra ES12, 12 til 25 mikrogram krystallprotein pr. ml mens en konsentrasjon på 2 mikrogram/ ml rent krystallprotein er tilstrekkelig til å oppnå 100% dreping av larvene.

Den resulterende transformerte stamme av E.coli, ES12, bærer et rekombinant plasmid og frembringer et proteinantigen som reagerer med antistoffene spesifikke for krystallproteinet til B. thuringiensis. Dette bekreftes ved de ovenfor beskrevne tester hvori rekombinant-plasmidet isolert fra denne stamme, pESl (ATCC nr. 31995) samtidig omdanner kulturer av E.coli stammen HB101 til både ampicillin-resistens og fremstilling av krystallprotein-antigen,

mens plasmidvektoren pBR322 transformerer HB101 til ampicillin og tetracyklinresistens uten at noe krystallantigen kan detekteres. Testresultater indikerer at DNA-innskuddet i rekombinant-plasmid pESl (ATCC nr. 31995) koder for evnen til å fremstille et polypeptid med egenskaper tilsvarende som for krystallproteinet i B.thuringiensis.

Resultatene tyder på at DNA-innskuddet i pESl

(ATCC nr. 31995) koder for genet for krystallproteinet i B.thuringiensis og at det gis ekspresjon for dette gen i

en biologisk aktiv form i E.coli. Preparatet fremstilt fra denne nye genetisk oppbygde stamme, ES12, kan derfor anvendes som et insekticid i passende tilfeller.

EKSEMPEL 3

Bruk av B.thuringiensis var Kurstaki HD-73 (NRRL B-4488) plasmid DNA fragmenter ved oppbygning av rekombinantplasmider i samsvar med oppfinnelsen.

B. thuringiensis var kurstaki HD-73 inneholder færre så-kalte større plasmider enn noen av de andre B. thuringiensis stammer. Som dette eksempel illustrerer kan denne stamme imidlertid anvendes for å generere de DNA-fragmenter som anvendes ved oppbygning av rekombinantplasmidene oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse. Den "store plasmidfraksjon"

fra B. thuringiensis var kurstaki HD-73 ble oppnådd ved sukrose gradient-sentrifugering på samme måte som den "store plasmid-:.fraksjon" fra B. thuringiensis var kurstaki HD-l-Dipel beskrevet i eksempel I. Behandling av denne fraksjon med restriksjonsenzymet Bgl II ga omtrent 6 fragmenter hvorav et ble hybridisert med Pvu II-C DNA-prøve oppnådd fra pESl

(ATCC nr. 31995). Denne prøve er drøftet mer fullstendig

i eksempel 4. Den "store plasmidfraksjon" ble behandlet med Bgl II, ligert til BamH I-behandlet pBR322 og transformert inn i E. coli. Kolonier som var ampicillin-resistente og tetracyklin-sensitive ble selektert for hybridisering med Pvu II-C DNA prøve og med hensyn til deres evne til syntetisering av krystall-protein-antigenet.

James W. Kronstad isolerte en stamme, betegnet JWK1, med

et plasmid, pJWK20 (ATCC nr. 31997) med linearisert masse omtrent 13,5 megadalton. Resultatene av preliminær analyse under anvendelse av Bgl II, Sal I, og Hind III behandling av pJWK20 og den "store plasmidfraksjon" fra HD-72 antyder at pJWK20 har et enkelt innskudd på omtrent 10,9 megadalton derivert fra 45 megadalton plasmidet av B. thuringiensis var kurstaki HD-73.

Ekstrakter av genetisk oppbygd stamme JWK1 ble funnet å inneholde et polypeptid med omtrent 130.000 Mr som reagerte med antistoffet til krystallproteinet fra HD-l-Dipel. Mobiliteten av dette peptid tilsvarte mobiliteten av krystall-proteinet av HD-l-Dipel. Tester for insekt-giftighet viste at foVmel supplert med ekstrakter av transformert E. coli stamme JWK1 var letale for larver av tobakks-hornormen. Begynnelsen av toksiske symptomer var tilsvarende som iakttatt for larver tilført mel inneholdende oppløseliggjort krystallprotein. Som i de foregående beskrevne giftighets-tester sinket ikke mel inneholdende ekstrakter av E. coli (pBR322) veksten av larvene. Det kan således sees at genetisk oppbygget E. coli stamme JWK1 frembringer et protein som er tilsvarende i størrelse, antigenisitet og biologiske aktivi-teter som krystallproteinet fra B. thuringiensis HD-l-Dipel.

EKSEMPEL 4.

Bedømmelse av plasmidinnhold i B. thuringiensis-stammer og disse plasmiders evne til hybridisering med en prøve fra pES1 (ATCC nr. 31995).

Restriksjons-enzymanalyse av transposon Tn5-innskudd i pES1 (data ikke vist) indikerer at en hovedandel av det antatte krystallprotein-gen er inneholdt innenfor to Pvu II kuttesteder på B. thuringiensis-plasmidene. Kuttestedene difinerer et Pvu II-C DNA-fragrnent som kan anvendes som en prøve for å analysere plasmidprofilene av de forskjellige stammer av B. thuringiensis for å bestemme hvilket plasmid inneholder genet. Pvu II-C-prøvefragmentet ble renset ved hjelp av sukrosegradient-sedimentering. DNA-fragmentene ble

7,2

merket med alfa p-dCTP under anvendelse av enten DNA polymerasekatalysert innfyllingsreaksjon beskrevet av Maniatias et al, Cell 15:667-701 (1978) eller ved såkalt nicktranslasjon, beskrevet av Maniatias et al, Proe.Nat.Acad. Sei. USA, 72:1184-1188 (1975). Prøven ble så hybridisert til plasmider fra forskjellige B. thuringiensis stammer etter elektroforese og overføring til nitrocellulose. Ved tids-punktet for oppfinnelsen var omtrent 20 krystallproduserende stammer av B. thuringiensis blitt undersøkt med hensyn til plasmidinnhold og for disse plasmiders evene til hybridisering med Pvu II-C-prøvefragmentet fra pES1 (ATCC nr. 31995). Et eksempel på et av gelforsøkene som en del av denne under-søkelse er vist i fig. 4. Fotografiet er av en ethidium-bromid-farget gel som viser plasmider detektert i ekstrakter fra forskjellige B. thuringiensis-stammer. Kolonne a er stammen tolworthii, kolonne b er stammen darmstadiensis, kolonne c er stammen sotto, kolonner d til g er var. thuringiensis henhv. F-10, HD-290, HD-120 og HD-2, kolonner h-j er var. kurstaki, henhv. kurstaki, henhv. HD-244, HD-73 og HD-1. Tallene i margen indikerer plasmidstørrelsen i megadalton. Andre geler ble undersøkt (data ikke vist) med ekstrakter fra B. thuringiensis-stammen alesti HD-4, stammen toumanoffi F-9, stammen galleriae HD-8, stammen wuhnanesis F-6 og stammen morrisoni F-5. Resultatene av elektroforesen vist i fig. 4 viste nærværet av forskjellige plasmidbånd i hver av dem. De fleste av båndene består antatt av lukkede sirkulære molekyler selv om noen bånd kan representere åpne sirkulære former. Stammene varierte sterkt i antall og størrelser av de plasmider de inneholdt, men noen bånd av de samme eller lignende mobiliteter var tilstede i flere

stammer. Det påpekes at data presentert i fig. 4 representerer analyse av rutinemessig CsCl-rensede plasmidpreparater og at ingen forsøk har vært gjort på å verifisere betingelser for vekst, plasmidekstraksjon eller elektroforese for å de-tektere alle mulige plasmider eller duplisere elektroforese-betingelsene anvendt av andre forskere. I tillegg er stør-relsene grovt anslått ved sammenligninger med mobilitene av plasmider med konturlengder undersøkt ved elektro-mikroskopering av Stahley et al, Biochem, Biophys. Res. Comm. 84:581-588 (1978).

Stammene undersøkt ved forsøket vist i fig. 4 er forskjellige med hensyn til flagellar-serotype og ved deres evne til kryssreaksjon med antistoffet til krystallproteinet i stammen HD-1-Dipel. Serotypen av kurstaki-stammene er 3a, 3b, Bacillus thuringiensis-stammene er type 1; stammen sotto er type 4a, 4b; stammen darmstadiensis er type og stammen tolworthii er type 9. Se De Barjac og Bonnefoi, CR. Acad. Sei, 264:1811-1813 (1967). Fjorten av de testede 20 stammer reagerte med antistoffet til krystallproteinet i stammen HD-1-Dipel og viste hybridisering med Pvu II-C-prøven.

EKSEMPEL 5.

Bruk av B. thuringiensis stamme sotto plasmid DNA-fragmenter ved oppbygning av re-kombinantplasmidene som kan fremstilles i samsvar med oppfinnelsen.

Metodene anvendt for kloning av krystall-protein-genet fra B. thuringiensis-stammen sotto er hovedsakelig de samme metoder som anvendt for kloning av genet fra B. thuringiensis var. kurstaki HD-73- Metodene er skissert i eksempel 3. Stammen sotto ble selektert for kloning av krystall-protein-genet pga. at det inneholder bare to plasmider og hører til en annen serotype. For kloning av genet, ble totalt plasmid DNA renset ved sentrifugering i en CsCl-ethidiumbromid gradient delvis underkastet restriksjon med endonuklease Mbo I. De resulterende fragmenter ble ligert inn i BamH I-stedet i pBR322. Etter transformering inn i E. coli ble kolonier selektert som var ampicillin-resistente og tetracyklinsensi-tive. Disse kolonier ble selektert med hensyn på deres evne til hybridisering med Pvu II-C-fragment og deres evne til å. fremstille krystallproteinet. En rekombinant stamme, JWK 11 (isolert av James W. Kronstad) inneholdt plasmidet pJWKl8. Størrelsen av det innskutte B. thuringiensis plasmid DNA er ennå ikke bestemt nøyaktig. Stammen JWK 11 frembringer et 130.000 M^ protein som kryssreagerer med antisera fremstilt mot krystallprotein isolert fra B. thuringiensis kurstaki HD-1-Dipel. Ekstrakter av JWK 11 er giftige for larver av Manduca sexta.

Det kan derfor sees at krystallprotein fra B. thuringiensis kan fremstilles av en vertstamme transformert med rekombinante plasmider. In vivo frembringer B. thuringiensis bare krystallprotein ved sporulering. En fordel tilveiebragt ved oppfinnelsen er at det ikke lenger er nødvendig at verten- må sporulere for at ekspresjon av krystallprotein skal skje. Ekspresjon av den genetisk informasjon i plasmidene er således ikke lenger begrenset til en spesifikk vekstfase i verten pga. at krystallproteinet kommer til ekspresjon i samsvar med en ekspresjonsmekanisme som gjenkjennes av den anvendte vertstamme i alle vesentlige vekstfaser. Ved fjernelse av vekst-faserestriksjonene kan nå produksjon av toksinet skje ved kontinuerlig dyrking og ikke ved porsjons-dyrking. Dette kan tillate høye kapasiteter og høye frem-stillingfermenteringer med mindre krav til kapitalutstyr.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et plasmid som er i stand til replikasjon i en Escherichia coli bakterievert-celle og som inneholder uttrykkbart heterologt DNA som koder for krystallprotein fra Bacillus thuringiensis, karakterisert ved at man fra en plasmidfraksjon av en krystallprotein-produserende stamme av Bacillus thuringiensis, hvilken fraksjon har en molekylmasse fra 10 x 10 M r til 250 x 10 M r', isolerer en DNA-sekvens som koder for krystallprotein, og som kan identifiseres med en DNA-probe avledet fra plasmidet p ES1 (erholdbart fra ATCC nr. 31995), hvor DNA-proben befinner seg mellom to Pvu II restriksjonspunkter, og ligerer det isolerte DNA-fragment med DNA fra et plasmid som er i stand til replikasjon i en Escherichia coli bakterievert-celle.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at man som den nevnte stamme av Bacillus thuringiensis anvender Bacillus thuringiensis subspecies tolworthi, subspecies darmstadiensis, subspecies sotto, subspecies thuringiensis HD-902, subspecies thuringiensis HD-120, subspecies thuringiensis HD-2, subspecies kurstaki HD-1, subspecies kurstaki HD-73, subspecies kurstaki HD-1, subspecies alesti HD-4, subspecies toumanoffi F-9, subspecies galleriae HD-8, subspecies wuhnanesis F-6 eller subspecies morrisoni F-5.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at ovennevnte plasmid om-fatter en DNA-sekvens som koder for en uttrykksmekanisme for heterologt DNA i ovennevnte Escherichia coli-bakterievert-celle hvori ovennevnte DNA-sekvens som koder for en uttrykksmekanisme for heterologt DNA i ovennevnte Escherichia coli bakterievert-celle stammer fra plasmidet pBR322 (ATCC 37017).

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det således fremstilte plasmid er plasmid pESl (erholdbart fra ATCC 31995), plasmid pJWK20 (erholdbart fra ATCC 31997) eller plasmid PJWK18 (erholdbart fra ATCC 31998).

5. Fremgangsmåte for fremstilling av en Escherischia coli bakteriestamme som er i stand til fremstilling av krystall-protein fra Bacillus thuringiensis, karakterisert ved at man transformerer en Escherichia coli vert-bakteriestamme ved innføring i denne av et plasmid fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten som angitt i hvilke som helst av kravene 1-4, idet det uttrykkbare genetiske material i verten dermed inkluderer heterologt DNA som koder for Bacillus thuringiensis-krystallprotein.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at den således fremstilte Escherichia coli bakteriestamme er Escherichia coli ES12 (ATCC 31995), JWK1 (ATCC 31997) eller JWK11 (ATCC 31998).

7. Fremgangsmåte for fremstilling av Bacillus thuringiensis krystallprotein, karakterisert ved at man i et passende dyrkingsmedium dyrker en bakteriestamme oppnådd ved hjelp av fremgangsmåten som angitt i krav 5 og 6 og deretter isolerer det fremstilte Bacillus thuringiensis krystallprotein.