JPS62224295A - 殺虫性タンパク質物質 - Google Patents
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
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- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
バチルス スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ 、 Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ ）は、通常昆虫に対して病原となるグラム陽性
細菌である（ニス、チヤツプ＋１）。（参考文献は、本
明細書の一部をなしている参考文献一覧表に掲載されて
おり、そこに、より詳細に対応して記載されている刊行
物およびその他のものは、その参考文献によって本明細
書に加入する。）Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの
さまざまな種類は、それらの毒性および昆虫の宿主域に
おいて著しく異なる。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓの殺虫有効性は、成長の胞子形成段階で産生されるタ
ンパク質性バラ胞子性結晶から実質的にまたは完全に生
じる。
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ 、 Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ ）は、通常昆虫に対して病原となるグラム陽性
細菌である（ニス、チヤツプ＋１）。（参考文献は、本
明細書の一部をなしている参考文献一覧表に掲載されて
おり、そこに、より詳細に対応して記載されている刊行
物およびその他のものは、その参考文献によって本明細
書に加入する。）Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの
さまざまな種類は、それらの毒性および昆虫の宿主域に
おいて著しく異なる。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓの殺虫有効性は、成長の胞子形成段階で産生されるタ
ンパク質性バラ胞子性結晶から実質的にまたは完全に生
じる。
該結晶の毒性タンパク！（ポリペプチド）をコードする
遺伝子（群）は、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの
プラスミドＤＮＡおよび／または染色体ＤＮＡ上に見出
されている。
遺伝子（群）は、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの
プラスミドＤＮＡおよび／または染色体ＤＮＡ上に見出
されている。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓにより産生されるそ
の他の化合物の存在から生じる不利益を避けるために、
そして大量に殺虫性ポリペプチドを得るために相当する
遺伝子、すなわち相当するＤＮＡ配列を、Ｂ、 ｔｈｕ
ｒｉＢｉｅｎｓｉｓの外側で、所望する殺虫性タンパク
質をコードする遺伝子（またはＤＮＡ）を利用すること
は望ましい。それにもかかわらずＢ、 ｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓを前記ＤＮＡ配列で形質転換することも可
能であり、そして特別な場合には有利である。
の他の化合物の存在から生じる不利益を避けるために、
そして大量に殺虫性ポリペプチドを得るために相当する
遺伝子、すなわち相当するＤＮＡ配列を、Ｂ、 ｔｈｕ
ｒｉＢｉｅｎｓｉｓの外側で、所望する殺虫性タンパク
質をコードする遺伝子（またはＤＮＡ）を利用すること
は望ましい。それにもかかわらずＢ、 ｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓを前記ＤＮＡ配列で形質転換することも可
能であり、そして特別な場合には有利である。
この方法で、構造および性質において天然のタンパク質
に対する類似体を得ることが可能である。本発明により
得られるタンパク質（ポリペプチド）を、以後ＭＧＥＩ
と呼ぶ。
に対する類似体を得ることが可能である。本発明により
得られるタンパク質（ポリペプチド）を、以後ＭＧＥＩ
と呼ぶ。
本発明は、タンパク質物質の殺虫性タンパク質ＭＧＥＩ
をコードする全ＤＮＡ配列の発見および同定を含めて、
殺虫性のタンパク質物質の製造方法に関するが、このＤ
ＮＡ配列は公知のＢ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ遺
伝子の配列（エイチ、イー。
をコードする全ＤＮＡ配列の発見および同定を含めて、
殺虫性のタンパク質物質の製造方法に関するが、このＤ
ＮＡ配列は公知のＢ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ遺
伝子の配列（エイチ、イー。
シュネフ等４）、エム、ジエイ、アダング等３）、およ
びワイ、シバノ等３０′ 並びにＷ Ｏ８６１０１５３
６号）とは構造上著しく異なっている。
びワイ、シバノ等３０′ 並びにＷ Ｏ８６１０１５３
６号）とは構造上著しく異なっている。
本発明は、第２表に示すヌクレオチド配列をコードし、
タンパク質ＭＣ；ＥｌをコードするＤＮＡ断片、並びに
タンパク質ＭＧＥＩそれ自体にも関し、そしてＢ、 ｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種クルスタキ（ｋｕｒｕ
ｓｔａｋｉ）から得られる殺虫性のタンパク質物質をコ
ードするＨｐａ１（０）からＰｓｔ Ｉ （４３５５）
のＤＮＡ断片にも関するが、このＤＮＡ断片は、殺虫性
を失わないという条件でその先端を切断された部分も包
含する。
タンパク質ＭＣ；ＥｌをコードするＤＮＡ断片、並びに
タンパク質ＭＧＥＩそれ自体にも関し、そしてＢ、 ｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種クルスタキ（ｋｕｒｕ
ｓｔａｋｉ）から得られる殺虫性のタンパク質物質をコ
ードするＨｐａ１（０）からＰｓｔ Ｉ （４３５５）
のＤＮＡ断片にも関するが、このＤＮＡ断片は、殺虫性
を失わないという条件でその先端を切断された部分も包
含する。
°゛タンパク質物質“という語は、殺虫性タンパク質Ｍ
ＧＥＩ並びに生体外で得られるようなそれらの誘導体お
よび変性体を意味し、例えば他のタンパク賞断片、特に
その他のを寄生物防除性、特に殺虫性をコードする別の
クローン化ＤＮＡから得られるものと結合したタンパク
質ＭＧＥＩであり、タンパク質のこのような結合は°゛
融合タンパク質“と定義される。殺虫性のほかに、有害
生物防除性は、例えば殺バクテリア性、殺ウイルス性、
殺菌性および除草性および特に植物病原性有機体に対す
る有効性を含む。
ＧＥＩ並びに生体外で得られるようなそれらの誘導体お
よび変性体を意味し、例えば他のタンパク賞断片、特に
その他のを寄生物防除性、特に殺虫性をコードする別の
クローン化ＤＮＡから得られるものと結合したタンパク
質ＭＧＥＩであり、タンパク質のこのような結合は°゛
融合タンパク質“と定義される。殺虫性のほかに、有害
生物防除性は、例えば殺バクテリア性、殺ウイルス性、
殺菌性および除草性および特に植物病原性有機体に対す
る有効性を含む。
タンパク質物質のうち、殺虫性タンパク質ＭＧＥｌのみ
が好ましい。
が好ましい。
本発明の別の面は、第２表に示すＤＮＡ断片を含むクロ
ーニング手段および発現手段を構成する方法に関し、そ
して前記手段それら自体にも関する。適当なりＮＡベク
ターは、例えばプラスミド例えばｐ Ｂ Ｒ３２２およ
びｐＵｃ８、またはファージ例えばＭ１３である。
ーニング手段および発現手段を構成する方法に関し、そ
して前記手段それら自体にも関する。適当なりＮＡベク
ターは、例えばプラスミド例えばｐ Ｂ Ｒ３２２およ
びｐＵｃ８、またはファージ例えばＭ１３である。
さらに、本発明は、第２表に示すヌクレオチド配列をコ
ードするＤＮＡ断片を含む生きているまたは死んだ微生
物、特にサツ力ロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）種に属する
微生物に関する。本発明は微生物、特にＢ、 ｔｈｕｒ
ｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕｒｕｓｔａｋｉから得ら
れる殺虫性のタンパク質物質をコードするＨ ｐａｌ（
０）からＰ ｓ ｔ Ｉ （４３５５）のＤＮＡ断片お
よび殺虫性を失わないという条件でその先端を切断され
た部分も含むサツカロマイセス セレビシアエ種の微生
物に関する。そのような微生物は、例えば酵母、特にサ
ツカロマイセス セレビシアエ、細菌およびフィロプラ
ン菌 （ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎ ｆｕｎｇｉ）であるがただし
、前記微生物がＢ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの群
に属する場合には、このバチルスは第２表に示すＤＮＡ
断片で形質転換されたものである。
ードするＤＮＡ断片を含む生きているまたは死んだ微生
物、特にサツ力ロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）種に属する
微生物に関する。本発明は微生物、特にＢ、 ｔｈｕｒ
ｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕｒｕｓｔａｋｉから得ら
れる殺虫性のタンパク質物質をコードするＨ ｐａｌ（
０）からＰ ｓ ｔ Ｉ （４３５５）のＤＮＡ断片お
よび殺虫性を失わないという条件でその先端を切断され
た部分も含むサツカロマイセス セレビシアエ種の微生
物に関する。そのような微生物は、例えば酵母、特にサ
ツカロマイセス セレビシアエ、細菌およびフィロプラ
ン菌 （ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎ ｆｕｎｇｉ）であるがただし
、前記微生物がＢ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの群
に属する場合には、このバチルスは第２表に示すＤＮＡ
断片で形質転換されたものである。
本明細書全体で、°′形質転換“という語は、接合性機
構（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ−１ｉｋｅ ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍ ）からなるものとして理解されたい。
構（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ−１ｉｋｅ ｍｅｃｈａｎ
ｉｓｍ ）からなるものとして理解されたい。
本発明は、生物学的起原の二次物質に完全に取り囲まれ
た一次物質からなるバイオエンカプセル系（ｂｉｏｅｎ
ｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ）にも関し、
一次物質は第２表に示すＤＮＡ断片により発現されたも
のであり、そして二次物質は微生物全体により発現され
たものであるが、ただし前記微生物が８． ｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓの群に属する場合には、このバチルス
は第２表に示すＤＮＡ断片により形質転換されたもので
ある。ＤＮＡ成分は、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓの変種ｋｕｒｕｓｔａｋｉから得られる殺虫性のタン
パク質物質をコードするＨｐａＩ （０）からＰ ｓ
ｔ Ｉ （４３５５）のＤＮＡ断片および殺虫性を失わ
ないという条件でその先端を切断された部分であって良
い。特に適当な微生物はＩ’ｌｌ ｆ！）、特にサツカ
ロマイセス セレビシアエ、例えばサツカロマイセス
セレビシアエＧＲＦ１８ である。
た一次物質からなるバイオエンカプセル系（ｂｉｏｅｎ
ｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ）にも関し、
一次物質は第２表に示すＤＮＡ断片により発現されたも
のであり、そして二次物質は微生物全体により発現され
たものであるが、ただし前記微生物が８． ｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓの群に属する場合には、このバチルス
は第２表に示すＤＮＡ断片により形質転換されたもので
ある。ＤＮＡ成分は、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉ
ｓの変種ｋｕｒｕｓｔａｋｉから得られる殺虫性のタン
パク質物質をコードするＨｐａＩ （０）からＰ ｓ
ｔ Ｉ （４３５５）のＤＮＡ断片および殺虫性を失わ
ないという条件でその先端を切断された部分であって良
い。特に適当な微生物はＩ’ｌｌ ｆ！）、特にサツカ
ロマイセス セレビシアエ、例えばサツカロマイセス
セレビシアエＧＲＦ１８ である。
本発明はさらに、第２表に示すＤＮＡ配列によりエンコ
ードされたタンパク質ＭＧＥ１を含有するタンパク質物
質で、昆虫特に鱗翅類の昆虫〔鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐ
ｔｅｒａ ）に属する昆虫）およびとりわけビニリス（
Ｐｉｅｒｉｓ ）、ヘリオチス（ｌ１ｅｌｉｏｔｉｓ
）、スボドプテラ（５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ）およびプ
ルテラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ）ＪＦｆＫのもの、例えば
ビニリス ブラッシカエ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉ
ｃａｅ ）、へりオチス ビレ・ンセンス（Ｈｅ１ｉｏ
ｔｉｓ ｖｉｒｅｓｃｃｎｓ ） 、へりオチス ゼ
ア（Ｈｅ１ｉｏｔｉｓ ｚｅａ ）、スボドプテラ
リットラリス（Ｓρｏｄｏｐｔｅｒａ ］１ｔｔｏｒａ
ｌｉｓ ） 、プルテラ キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌ
ｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ ）および関連種を防除す
る組成物および方法に関する。この方法は、昆虫または
その生育地に、タンパク質ＭＧＥＩをコードするＤＮＡ
断片により少なくとも部分的にエンコードされたタンパ
ク質物質の殺虫有効量を施用することからなる。前記組
成物は、タンパク質ＭＧＥＩをコードするＤＮＡ断片に
より少なくとも部分的にエンコードされたタンパク質物
質の殺虫有効■を含む。
ードされたタンパク質ＭＧＥ１を含有するタンパク質物
質で、昆虫特に鱗翅類の昆虫〔鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐ
ｔｅｒａ ）に属する昆虫）およびとりわけビニリス（
Ｐｉｅｒｉｓ ）、ヘリオチス（ｌ１ｅｌｉｏｔｉｓ
）、スボドプテラ（５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ）およびプ
ルテラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ）ＪＦｆＫのもの、例えば
ビニリス ブラッシカエ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉ
ｃａｅ ）、へりオチス ビレ・ンセンス（Ｈｅ１ｉｏ
ｔｉｓ ｖｉｒｅｓｃｃｎｓ ） 、へりオチス ゼ
ア（Ｈｅ１ｉｏｔｉｓ ｚｅａ ）、スボドプテラ
リットラリス（Ｓρｏｄｏｐｔｅｒａ ］１ｔｔｏｒａ
ｌｉｓ ） 、プルテラ キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌ
ｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ ）および関連種を防除す
る組成物および方法に関する。この方法は、昆虫または
その生育地に、タンパク質ＭＧＥＩをコードするＤＮＡ
断片により少なくとも部分的にエンコードされたタンパ
ク質物質の殺虫有効量を施用することからなる。前記組
成物は、タンパク質ＭＧＥＩをコードするＤＮＡ断片に
より少なくとも部分的にエンコードされたタンパク質物
質の殺虫有効■を含む。
さらに、本発明は、タンパク質ＭＧＥ１をコードするす
るＤＮＡ断片により少なくとも部分的にエンコードされ
たタンパク質物質の殺虫有効量を含有する形質転換され
た生きているまたは死んだ酵母細胞からなる受は渡し系
（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ）に関する。こ
のように形質転換された酵母細胞を慣用の方法例えば作
付地に噴霧（地上または空中施用）により施用した場合
には、長期間続く殺虫有効性が得られる。有効成分は、
不利な条件例えば日光または葉の表面の不利な条件から
生じる早期の分解からうまく保護されている。
るＤＮＡ断片により少なくとも部分的にエンコードされ
たタンパク質物質の殺虫有効量を含有する形質転換され
た生きているまたは死んだ酵母細胞からなる受は渡し系
（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ）に関する。こ
のように形質転換された酵母細胞を慣用の方法例えば作
付地に噴霧（地上または空中施用）により施用した場合
には、長期間続く殺虫有効性が得られる。有効成分は、
不利な条件例えば日光または葉の表面の不利な条件から
生じる早期の分解からうまく保護されている。
クローン化遺伝子は、酵母プロモーターの制御の下にお
かれ得、そして発現され得、殺虫有効性は、ａ）抽出物
およびｂ）細胞全体で示され得る。適当な酵母プロモー
ターは、欧州特許第１００，５６１号明細書に記載され
ている。特にＰ１１０５プロモーターが適当である。
かれ得、そして発現され得、殺虫有効性は、ａ）抽出物
およびｂ）細胞全体で示され得る。適当な酵母プロモー
ターは、欧州特許第１００，５６１号明細書に記載され
ている。特にＰ１１０５プロモーターが適当である。
殺虫有効タンパク質をコードするＢ、 ｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓの遺伝子の少なくともいくつかは、大腸菌
（ＥＳｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ、 Ｅ、ｃｏｌｉ
） ＲＮＡポリメラーゼにより認識され得るプロモー
ターを結合シー、ウオング等２′）。
ｉｅｎｓｉｓの遺伝子の少なくともいくつかは、大腸菌
（ＥＳｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ、 Ｅ、ｃｏｌｉ
） ＲＮＡポリメラーゼにより認識され得るプロモー
ターを結合シー、ウオング等２′）。
本発明による殺虫性のタンパク質物質を製造する方法は
、ＩＥ、ｃｏｌｉまたは酵母によるタンパク質への同定
したＤＮＡ配列を有する本発明による遺伝子の転写およ
び翻訳からなる。
、ＩＥ、ｃｏｌｉまたは酵母によるタンパク質への同定
したＤＮＡ配列を有する本発明による遺伝子の転写およ
び翻訳からなる。
ここに記載された工程は、出発ＤＮＡ材料を得るために
、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ ｉｓの変種ｋｕｒｕ
ｓ ｔａｋｉ ＨＤＩ、ＥＴＨ２４４４９株を使用して
行っている。咳株は、スイス国、チューリッヒにあるス
イス国立技術研究所（Ｔｈｅ ５ｗ１ｓｓ Ｆｅｄｅｒ
ａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
）の微生物学部門から入手でき、それは制限なしに誰
でも自由に利用できる。その出所は、テキサス州ブラウ
ンスピルにある農業研究センター（八ｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｒｅ５ｅｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）米農務省、綿昆
虫研究部門（Ｔｈｅ ＣｏｔｔｏｎＩｎｓｅｃｔｓ Ｒ
ｅ５ｅｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ）のエイチ、グルメイジ
コレクション（Ｔｈｅ Ｈ，Ｄｕｌｍａｇｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）でありそれは誰でも自由に利用できる
。
、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ ｉｓの変種ｋｕｒｕ
ｓ ｔａｋｉ ＨＤＩ、ＥＴＨ２４４４９株を使用して
行っている。咳株は、スイス国、チューリッヒにあるス
イス国立技術研究所（Ｔｈｅ ５ｗ１ｓｓ Ｆｅｄｅｒ
ａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
）の微生物学部門から入手でき、それは制限なしに誰
でも自由に利用できる。その出所は、テキサス州ブラウ
ンスピルにある農業研究センター（八ｇｒｉｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｒｅ５ｅｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）米農務省、綿昆
虫研究部門（Ｔｈｅ ＣｏｔｔｏｎＩｎｓｅｃｔｓ Ｒ
ｅ５ｅｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ）のエイチ、グルメイジ
コレクション（Ｔｈｅ Ｈ，Ｄｕｌｍａｇｅ Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）でありそれは誰でも自由に利用できる
。
本発明に従って、タンパク質ＭＧＥ１をコードするＤＮ
Ａは、下記のように得られる：ａ ） Ｂ、ｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕｒｕｓｔａｋｉ １１０１
の細胞を分離および溶菌し、そして公知の方法によりこ
のように得られた成分からプラスミドを分離し、このよ
うに得られたプラスミド成分を精製、透析し、； ｂ ） Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕ
ｒｕｓｔａｋｉ １１０１プラスミドＤＮＡのＤＮＡラ
イブラリィを調製し； ｃ）ｂ）工程により得られた断片化プラスミドＤＮＡを
適当なベクター、好ましくはプラスミドでクローニング
し； ｄ）例えば下記のｅ）ないしｇ）工程により行われ得る
タンパク［ＭＧＥｌの存在をスクリーニングし、 ｅ ） Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕｒ
ｕｓｔａｋｉの結晶タンパク質に対して調製された抗体
と反応する抗原の存在するクローンをスクリーニングし
、（各々のポリペプチドの発現をスクリーニングする）
； ｆ）ヤギ抗血清と特異的に反応するクローンを選択し、
；そして ｇ）ｆ）工程により得られた該クローンの抽出物の殺虫
有効性を試験する。
Ａは、下記のように得られる：ａ ） Ｂ、ｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕｒｕｓｔａｋｉ １１０１
の細胞を分離および溶菌し、そして公知の方法によりこ
のように得られた成分からプラスミドを分離し、このよ
うに得られたプラスミド成分を精製、透析し、； ｂ ） Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕ
ｒｕｓｔａｋｉ １１０１プラスミドＤＮＡのＤＮＡラ
イブラリィを調製し； ｃ）ｂ）工程により得られた断片化プラスミドＤＮＡを
適当なベクター、好ましくはプラスミドでクローニング
し； ｄ）例えば下記のｅ）ないしｇ）工程により行われ得る
タンパク［ＭＧＥｌの存在をスクリーニングし、 ｅ ） Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕｒ
ｕｓｔａｋｉの結晶タンパク質に対して調製された抗体
と反応する抗原の存在するクローンをスクリーニングし
、（各々のポリペプチドの発現をスクリーニングする）
； ｆ）ヤギ抗血清と特異的に反応するクローンを選択し、
；そして ｇ）ｆ）工程により得られた該クローンの抽出物の殺虫
有効性を試験する。
ＤＮＡは例えば下記のｈ）およびｉ）の工程による公知
の方法により同定され得る：ｈ）制限エンドヌクレアー
ゼで消化することにより陽性のクローンのＤＮＡをマツ
ピングし、そしてこのように得られた断片に放射能標識
ＲＮＡでハイブリッド形成させる；そしてｉ）各々のタ
ンパク質をコードするＤＮＡ断片の配列を決定する。
の方法により同定され得る：ｈ）制限エンドヌクレアー
ゼで消化することにより陽性のクローンのＤＮＡをマツ
ピングし、そしてこのように得られた断片に放射能標識
ＲＮＡでハイブリッド形成させる；そしてｉ）各々のタ
ンパク質をコードするＤＮＡ断片の配列を決定する。
下記において使用される略語の意味：
ｂｐ：塩基対
ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン
ＤＥＡＥ ニジエチルアミノエチル
ＤＦＰ ニジイソプロピルフルオロボスフェート
ＤＴＴ：１，４−ジチオスレイトール（１゜４−ジメル
カプト−２，３−ブタン ジオール） ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四節酸 Ｉ ＰＴＧ ：イソプロピル−β−チオガラクトピラノ
シド（セルバ、 ５ｅｒｖａ ）Ｋｂ：キロベース ＰＢＳ’ ：０．０１Ｍ燐酸塩緩衝液、 ｐＨ７，４
および０．８％ＮａＣＩ Ｐ Ｂ Ｓ ” ： １０ｍＭ燐酸ナトリウム、 ｐ
Ｈ７，８および０．１４％ＮａＣＩ Ｐ Ｅ Ｇ６０００：ポリエチレングリコール、平均分
子量６０００ ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフル力リド（フル
力、 Ｆｌｕｋａ ） ＲＴ：室温 ＳＤＳ ニドデシル硫酸ナトリウム ＳＴＥ ： ＴＮＥ参照 ＴＢＳ：１０ｍＭ）リス−ＭＣＩ、 ｐｆ１７．５およ
び０．１４ＭＮ ａ ＣＩ Ｔ Ｅ ： １０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，
５）および１ｍＭＥＤＴＡを含有する溶液 ＴＥＳ：０．５Ｍトリス、 ｐＨＢ，０，ｏ、００５Ｍ
Ｎ ａ Ｃ１および０．００５Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ＴＮ已： １００ｍＭ Ｎａ Ｃｌ、 １０ｍＭ）リス
−ＨＣ１（ｐＨ１７，５）および１＋ｉＭＥＤＴＡを含
有する溶液 トリス・ＨＣＩ：）リス−（ヒドロキシメチル）−アミ
ノメタン、ＨＣＩでｐＨ 調製 Ｘ−ＣＡＬ ： ５−ブロモ−４−クロロ−３−イント
キシルーβ−Ｄ−ガラクシド ２ｘＹＴ：１６ｇ バクト トリプトンＬｏｇ イ
ーストエキス（Ｂａｃｔｏ）５ｇ ＮａＣ１ 下記において使用される培地、緩衝液および溶液 ０ｘＳＳＣ 水８００ｍ１中にＮａＣ１１７５，３ｇおよびクエン酸
ナトリウム８８．２ｇを溶解。ＩＯＮのＮａＯＨ溶液数
滴でｐＨを７．０に調整。体積をｉｎに調整。適当に分
割。オートクレーブで殺菌。
カプト−２，３−ブタン ジオール） ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四節酸 Ｉ ＰＴＧ ：イソプロピル−β−チオガラクトピラノ
シド（セルバ、 ５ｅｒｖａ ）Ｋｂ：キロベース ＰＢＳ’ ：０．０１Ｍ燐酸塩緩衝液、 ｐＨ７，４
および０．８％ＮａＣＩ Ｐ Ｂ Ｓ ” ： １０ｍＭ燐酸ナトリウム、 ｐ
Ｈ７，８および０．１４％ＮａＣＩ Ｐ Ｅ Ｇ６０００：ポリエチレングリコール、平均分
子量６０００ ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフル力リド（フル
力、 Ｆｌｕｋａ ） ＲＴ：室温 ＳＤＳ ニドデシル硫酸ナトリウム ＳＴＥ ： ＴＮＥ参照 ＴＢＳ：１０ｍＭ）リス−ＭＣＩ、 ｐｆ１７．５およ
び０．１４ＭＮ ａ ＣＩ Ｔ Ｅ ： １０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ （ｐＨ７，
５）および１ｍＭＥＤＴＡを含有する溶液 ＴＥＳ：０．５Ｍトリス、 ｐＨＢ，０，ｏ、００５Ｍ
Ｎ ａ Ｃ１および０．００５Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ＴＮ已： １００ｍＭ Ｎａ Ｃｌ、 １０ｍＭ）リス
−ＨＣ１（ｐＨ１７，５）および１＋ｉＭＥＤＴＡを含
有する溶液 トリス・ＨＣＩ：）リス−（ヒドロキシメチル）−アミ
ノメタン、ＨＣＩでｐＨ 調製 Ｘ−ＣＡＬ ： ５−ブロモ−４−クロロ−３−イント
キシルーβ−Ｄ−ガラクシド ２ｘＹＴ：１６ｇ バクト トリプトンＬｏｇ イ
ーストエキス（Ｂａｃｔｏ）５ｇ ＮａＣ１ 下記において使用される培地、緩衝液および溶液 ０ｘＳＳＣ 水８００ｍ１中にＮａＣ１１７５，３ｇおよびクエン酸
ナトリウム８８．２ｇを溶解。ＩＯＮのＮａＯＨ溶液数
滴でｐＨを７．０に調整。体積をｉｎに調整。適当に分
割。オートクレーブで殺菌。
ｘＳＳＣ
２０ｘＳＳＣの１０％
ｘＳＳＣ
２０ｘＳＳＣの３３％
デンハルツ溶液（口ｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ５ｏｌｕｔｉ
ｏｎ ）（５０ｘ ） フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ ）７０ （相対分子量お
よそ７００．０００ ｉファルマシア（Ｆａｒｍａｃ
ｉａ ） ） ５ ｇポリビニルピロリドン〔カルバイ
オケム ベーリング社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｅｈ
ｒｉｎ８Ｃｏｒｐ、）） ５ ｇＢＳＡ Ｃシグマ（
Ｓｉｇｍａ ） ） ５ ｇ８．０ ５００ｍ１まで 使い捨て可能なナルゲン（Ｎａｌｇｅｎ ＠）フィルタ
ー（ナルゲン；ナルゲ社製、ロチェスター、ニューヨー
ク、米国）を通して濾過。２５ｍ１ずつ分取し、−２０
°Ｃで保存。
ｏｎ ）（５０ｘ ） フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ ）７０ （相対分子量お
よそ７００．０００ ｉファルマシア（Ｆａｒｍａｃ
ｉａ ） ） ５ ｇポリビニルピロリドン〔カルバイ
オケム ベーリング社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｅｈ
ｒｉｎ８Ｃｏｒｐ、）） ５ ｇＢＳＡ Ｃシグマ（
Ｓｉｇｍａ ） ） ５ ｇ８．０ ５００ｍ１まで 使い捨て可能なナルゲン（Ｎａｌｇｅｎ ＠）フィルタ
ー（ナルゲン；ナルゲ社製、ロチェスター、ニューヨー
ク、米国）を通して濾過。２５ｍ１ずつ分取し、−２０
°Ｃで保存。
溶液
Ｍ９培地
ａ）１２あたり：
Ｎａｇ ＨＰＯ４６ｇ
ＫＨ２ＰＯ４３ｇ
ＮａＣｌ ０．５ｇ
ＮＨ，ＣＩ Ｉｇ
ｐ Ｈを７．４に調整、オートクレーブ、冷却そして次
に添加； ｂ）ＬＭ Ｍｇ３０． ２ｍ１２０
％グルコース １１０ｍ１Ｌ ＣａＣ
Ｉｚ Ｏ，１ｍｌビタミンＢ １ （
４０ｍｇ／ｌｏｍｌ ） ５ ｍ、 １上記溶液
ａ）およびｂ）は、濾過（グルコース−ビタミンＢｌ）
またはオートクレーブにより個々に滅菌すべきである。
に添加； ｂ）ＬＭ Ｍｇ３０． ２ｍ１２０
％グルコース １１０ｍ１Ｌ ＣａＣ
Ｉｚ Ｏ，１ｍｌビタミンＢ １ （
４０ｍｇ／ｌｏｍｌ ） ５ ｍ、 １上記溶液
ａ）およびｂ）は、濾過（グルコース−ビタミンＢｌ）
またはオートクレーブにより個々に滅菌すべきである。
ＬＢ（ルリアーベルタニ（１ｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ
） ）培地 ■！あたり： バタトートリプトン １０ｇ バクトーイーストエキス ５ｇ ＮａＣｌ １０ｇ水酸化ナトリ
ウムでｐＨを７．５に調整。
） ）培地 ■！あたり： バタトートリプトン １０ｇ バクトーイーストエキス ５ｇ ＮａＣｌ １０ｇ水酸化ナトリ
ウムでｐＨを７．５に調整。
Ｌブロス
ＬＢ培地を参照。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕｒｕｓｔ
ａｋｉの胞子形成を得るために、ヨウステンおよびロゴ
ラフ（エイ、エイ、ヨウステンおよびエイチ、ロゴッフ
”）（１９６９年） （ｇ／Ｉｌ−’）によるＧｙｓ
培地が使用される。ニ ゲルコース １イーストエキ
ス（Ｄｉｒｃｏ ） ２（ＮＨ，）２Ｓ０．
２に、ＨＰｏ、
０． ５Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４・ ７Ｈ，
ＯＯ，２ ＣａＣ１ｚ ’２Ｈｚ Ｏ０，Ｏ８Ｍｎ ＳＯ４・
Ｈｚ ＯＯ，０５ オートクレーブする前に、ｐＨを水酸化カリウムで７．
３に調整する。
ａｋｉの胞子形成を得るために、ヨウステンおよびロゴ
ラフ（エイ、エイ、ヨウステンおよびエイチ、ロゴッフ
”）（１９６９年） （ｇ／Ｉｌ−’）によるＧｙｓ
培地が使用される。ニ ゲルコース １イーストエキ
ス（Ｄｉｒｃｏ ） ２（ＮＨ，）２Ｓ０．
２に、ＨＰｏ、
０． ５Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４・ ７Ｈ，
ＯＯ，２ ＣａＣ１ｚ ’２Ｈｚ Ｏ０，Ｏ８Ｍｎ ＳＯ４・
Ｈｚ ＯＯ，０５ オートクレーブする前に、ｐＨを水酸化カリウムで７．
３に調整する。
本発明において使用される微生物の特徴１、ＨＤＩ−Ｅ
ＴＨ２４４４９は、バチルススリンギエンシス亜種クル
スタキ株であり、そして鞭毛の抗原に対する免疫学的反
応により最初に区別される。ＨＤＩ−ＥＴＨ２４４４９
は３ａ、３ｂセロタイプ（Ａ、Ｋｒｉｅｇ”’ ）に
属する。次にＨＤＩ−ＥＴＨ２４４４９は、下記のＩｎ
、５．ｂに記載されるように行ったサザンプロット試験
での特徴的なパターンにより区別される。この株からの
全ＤＮＡを分離し、Ｈｉｎｄｌｌ［制限酵素で完全に消
化し、そしてこのようにして得られた断片を、アガロー
スゲルで大きさに従って分離し、ニトロセルロースシー
トに移す。放射能標識ＥｃｏＲＩ断片４２３位ないし１
１４９位（第２表）は、それぞれ６．６Ｋｂ、５，３Ｋ
ｂおよび４．５Ｋｂの大きさの３断片と特異的にハイブ
リッド形成する。
ＴＨ２４４４９は、バチルススリンギエンシス亜種クル
スタキ株であり、そして鞭毛の抗原に対する免疫学的反
応により最初に区別される。ＨＤＩ−ＥＴＨ２４４４９
は３ａ、３ｂセロタイプ（Ａ、Ｋｒｉｅｇ”’ ）に
属する。次にＨＤＩ−ＥＴＨ２４４４９は、下記のＩｎ
、５．ｂに記載されるように行ったサザンプロット試験
での特徴的なパターンにより区別される。この株からの
全ＤＮＡを分離し、Ｈｉｎｄｌｌ［制限酵素で完全に消
化し、そしてこのようにして得られた断片を、アガロー
スゲルで大きさに従って分離し、ニトロセルロースシー
トに移す。放射能標識ＥｃｏＲＩ断片４２３位ないし１
１４９位（第２表）は、それぞれ６．６Ｋｂ、５，３Ｋ
ｂおよび４．５Ｋｂの大きさの３断片と特異的にハイブ
リッド形成する。
２、ＨＢｌｏｌは、Ｅ、ｃｏｌｉＫ １２株とＥ、ｃｏ
ｌｉ Ｂ株との間の雑種である。それは、ラージスケー
ルのＤＮＡ精製のための良好な宿主である。それは、形
質転換試験のために使用され、そしてＣａ Ｃｌ ｚ成
分細胞は、スイス国、バーゼル市のギフコ ７クチエン
ゲゼルシヤフト（Ｇｉｆｃ。
ｌｉ Ｂ株との間の雑種である。それは、ラージスケー
ルのＤＮＡ精製のための良好な宿主である。それは、形
質転換試験のために使用され、そしてＣａ Ｃｌ ｚ成
分細胞は、スイス国、バーゼル市のギフコ ７クチエン
ゲゼルシヤフト（Ｇｉｆｃ。
ＡＧ ）カタログ番号５３０ ８２６０ ＳＡから市
販されており、利用できる。
販されており、利用できる。
３、ＪＭ１０３は、Ｅ、ｃｏｌｉＫ １２株であり、フ
ァルマシア ビイ−エル バイオケミカルズ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ）カ
タログ番号２７−１５４５−ｘｘ （１９８４年）から
市販されており、利用できる。
ァルマシア ビイ−エル バイオケミカルズ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ）カ
タログ番号２７−１５４５−ｘｘ （１９８４年）から
市販されており、利用できる。
Ｅ、ｃｏｌｉＨＢ １０１株およびＪＭ１０３株は、マ
ニアチス等により記載されている（ティー。
ニアチス等により記載されている（ティー。
マニアチス等６））。
株 遺伝子型
ＨＢＩＯＩ Ｆ−、ｈｓｄＳｚｏ（ｒ ’ｍ ＋
ｍ； ）。
ｍ； ）。
ｒｅｃＡ、、、 ａｒａ−１４，ｐｒｏＡｚ、 １ａｃ
Ｙ、。
Ｙ、。
Ｂａ１Ｋｔ、 ｒｐｓＬｇｏ （Ｓｔｎ’ ）＋ＸＮ−
５＋ｍｔ＋−１，５ｕｐＥ４ａ＋ λ− ＪＭ１０３ Δ（ｌａｃ ｐｒｏ）、ｔｈｉ、ｓｔ
ｒ＾、 ５ｕｐＥ。
５＋ｍｔ＋−１，５ｕｐＥ４ａ＋ λ− ＪＭ１０３ Δ（ｌａｃ ｐｒｏ）、ｔｈｉ、ｓｔ
ｒ＾、 ５ｕｐＥ。
ｅｎｄＡ ５ｂｃＢ、ｈｓｄＲ，Ｆ’ｔｒａＤ３６＋ｐ
ｒｏＡＢ、１ａｃｌｑｌｚΔＭ１５ 下記の実施例において、酵母はサツカロマイセス セレ
ビシアエをさす。
ｒｏＡＢ、１ａｃｌｑｌｚΔＭ１５ 下記の実施例において、酵母はサツカロマイセス セレ
ビシアエをさす。
竿２表
′ζξ２−＆ （９丁２ン
７２表 （っ）°、Ｆ）
Ｔ、ｒＪ ＋ａ＋ｕｕａ＋ａｕ
″１２表 （つつ゛ンン
ｈＪ 、表（つつ°ｉ）
′♀λ表 （つ丁ンノ
ＡＴＧ ＧＡＴ ＾ＡＣ＾ＡＴ Ｃ１：Ｇ Ａ
ＡＣＡＴＣＡＡＴ にＡＡＭｅｔ Ａｓｐ Ａｓｎ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ ＧｌｕＧ
ＴＡ ＧＡＡ ＧＴＡ ＴＴＡ ＧＧＴ Ｇ
ＧＡ ＧＡＡ ＡＧ八 八Ｔ＾νａｌ Ｇｌｕ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒ９１
１ｅＴＣＧ ＣＴＡ ＡＣＧ Ｃ八八 ＴＴＴ
ＣＴＴ ＴＴＧ ＡＧＴ ＧＡＡＳｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｔｈｒ Ｇｉｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌ
ｅｕ ９ｆ？ｒ ＧＩＬＬＧＴＴ ＧＡＴ Ａ
Ｔ＾ 八ＴＡ ＴＧＧ ｅＧＡ ＡＴＴ ＴＴ
Ｔ ＧＧＴνａｌ 八Ｓｐ ｒｂ＝ Ｉｌｅ
Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｈｓ ＧｌｙＧＡＡ
ＣＡＧ ＴＴＡ ＡＴＴ 八＾ＣＣ八八 八Ｇ＾
ＡＴ八 Ｇ八八Ｇｌｕ Ｇｉｎ Ｌｓ＝ｕ Ｉ
Ｉｓ Ａｓｎ （ｉｌｎ Ａｒ９１１ｒ： Ｇ
ＩＬＩＧＡＡ ＧＧＡ ＣＴＡ ＡＧＣＡＡＴ
ＣＴＴ ＴＡＴ ＣＡ＾ ＾ＴＴＧＩＬＩ Ｇｌ
ｙ Ｌｌ？ＬＩ Ｅｉｅｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｙｒ
Ｇｌｎ ＩＩＩＣＣＴ ＡＣＴ ＡＡＴ Ｃ（：Ａ
ＧＣＡ ＴＴＡ ＡＧＡ ＧＡＡ Ｃ１ＡＧＰｒｏ
Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｆ’ｒｏ＾ｌａ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇ
ＩＬＩ ＧＩＬＩＴＧＣＡＴＴ ＣＣＴ Ｔ＾丁
＾ＡＴ ＴＧＴ ＴＴＡ ＡＧＴ ＡＡＣＣＣ
Ｔ Ｇ八八Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ａｓ
ｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ ＧＩＬ
ＩＧＡ＾ 八ＣＴ ＧＧＴ ＴＡＣＡＣＣＣＣ＾
＾ＴＣＧＡＴ ＡＴＴ ＴＣＣＴＴＧＳｌｕ ｌ
’ｈｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
ＩＩｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ？、
、（：＋５
：Ｆ、７，５ＴＴＴ
ＧＴＴ Ｃζ：ＣＧＧＴ ＧＣＴ ＧＧＡ
ＴＴＴ ＧＴＧ ＴＴＡ ＧＧＡ ＣＴ＾Ｐ
ｈｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐ
ｈｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ：、６５
：９５ＣＣＣＴＣＴ Ｃ＾＾ Ｔ
ＧＧ ＧＡＣＧＣＡ ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＴＡ
ＣＡＡ ＡＴＴＰｒｏ Ｓａｒ Ｇｉｎ Ｔｒｐ
Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｈｅ １−ｅｕ Ｖａｌ Ｇｉ
ｎ ｌ１ｅ４２＋ａ；
４ｅ；
５Ｇ八八 丁ＴＣＧＣＴ Ａｌ′３Ｇ ｎ０ＣＣ八
八 ＧＣＣＡＴＴ ＴＣＴ 八ＧＡ ＴＴ八八ｌ
ｕ Ｆ’ｈＩ？ ＾ｌａ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇ
ｉｎ ＾ｌａ Ｉｌｌ？ Ｓｅｒ 八ｒｇ
Ｌｅｔ＋４日５
５！５ＴＡＣ
ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＣＴ ＴＴＴ ＡＧＡ ’
ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＡＴＴｙ
ｒ Ａｌａ ＧＩＬＩ ９１２１” Ｆ’ｈｅ
Ａｒｇ （’ｉｌｕ Ｔｒｐ ＧＩＬＩ
八ｌａ Ａｓｐ′５４５５７５ Ａ丁＋３ ＣＧＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＴＴＣ八
ＡＴ ｒｉＡＣＡＴに ＾＾ＣＡＧＴ ＧＣＣＭ
ｅｔ Ａｒｇ Ｉｌｅ［うｉｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ 八
ｓｐ Ｍｅ虹 ＾Ｓｎ Ｓｅｒ ＾ｌａ八ＡＣＡＧＴ
ＡＴＡ ＡＣＣＡＴＣＴＡＴ ＡＣＧ ＧＡ
Ｔ ＧＣＴＡｓｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ ｒ
ｌｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ ＡＳＩ） ＡｌａＴｈｒ Ｌｅ
ｕ Ｓｅｒ ’；ｔＲｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ａ
ｒｑ ＡｒｑＴｌ：Ｔ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＡＣＧ
ＧＧ ＡＣＡ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＣＴＳｅｒ
Ｖａｔ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｐｈｅ ／１ｌｌａＦ゛ｒｏ Ｐｒｏ
＾ｒｑ Ｇｉｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
Ｈｉｉ 八ｒ９Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇ
ｌ＋、＋ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇ１ｎ１１ｅ Ｖａｌ Ａｌ
ａ Ｇｌｎ ＬＬ？ｕ Ｇｌｙ Ｇｉｎ Ｇｌｙ Ｖａ
ｌ Ｔｙｒ ＡｒＬ：ｌＦ’ｒｏ Ｆ′ｈｅ Ａｓｎ
Ｈｅ Ｃ１ｔｙ Ｈｅ 八ｓｎ Ａｉｎ Ｇｌｎ
Ｇｉｎ Ｌｅｕｒｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ ’；ｅｒ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｅ＝ｕ Ｐｒｏ Ｆｉｅｒ
Ａｌａ ＶａｌＬｅｕ Ａｓｐ ＧＩＬＩ
Ｉｌｅ Ｆ’ｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｎ
ＡＳｎ Ａｓｎ Ｖａｌ竿？ゑ（っつυ １５１：１５ ＡＧＴ ＡＡ’ｒ ＡＧＴ ＡＧＴ ＧＴＡ
ＱＣｉＴ ＡＴＡ ＡＴＡ 八ＧＡ ＧＣＴ
ＣＣＴ ＾Ｔ（ｉＳｅｒ Ａｓｎ Ｅｉ＋？
ｒ Ｓａｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｉｌｅ ｒｌ
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ＴＴＴ ＡＡＴ ＡＡＴ Ａ丁＾ 八ＴＴ
ＣＣＴ ＴＣＡ ＴＣＡ ＣＡ八 ＾ＴＴ Ｉ
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Ａｓｐ Ｓ＋＝ｒ Ｖａｌ １３１ｕ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｍｅｔ７７７、 ？５ ＧＣＧ ＡＣＴ ＣＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ
ＴＡＴ ＧＡＧ／’ｌｌａ Ｔｈｒ Ｇｉｎ ＧＩ
ＬＩ ＧＩＬＩ Ｔｙｒ ＧＩＬＩＳ Ｔ、９５ ＴＡＴ ＧＡＡ ＡＧＣＡＡＴ ＴＣＴ ＴＣ
Ｔ ＧＴ＾Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｗ
５ｅｒＶａ１ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＣＧＡ
ＡＧＡ ＧＡＣＡＡ丁Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａ
ｒｇ Ａｒ９Ａｓｐ ＡｓｎＣＴＡ ＣＣＡ ＣＣ
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＾ｌａ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｖａｔ ＴｈｒＡＴＴ
６ＡＧ ＡＴＣＧＧＡ ＧＡＡ Ａｃｅ Ｇ
Ａ＾１１ｅ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｉ１ｕ Ｔ
ｈｒ Ｇｌ−ｕＧＡＧ ＧＡＡ ＴＡＡ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｅｎｄ （実施例） ■ ブースミドＤ Ｎ Ａ ３ｏ ” ニブラスミドＤ
ＮＡをホワイトおよびネスター（エフ、エフ、ホワイト
およびイー、ダプリュ。
ＣＣＣＡ ＧＡＡ ＡＣＣＧ＾Ｔ ＾へＧ ＧＴ
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ＮＡをホワイトおよびネスター（エフ、エフ、ホワイト
およびイー、ダプリュ。
ネスター７））の記載に従って下記のように調製する。
１、 Ｉ Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｉｅｎＳｉＳブースミ
ドＥ、ｃｏｌｉ ＨＢ １０１ ｆｊ［Ｉ胞をＬＢ培地
ｌｌ中で震盪して、１２ないし１４時間３７°Ｃで増殖
させそしてホワイトおよびネスター（エフ、エフ。
ドＥ、ｃｏｌｉ ＨＢ １０１ ｆｊ［Ｉ胞をＬＢ培地
ｌｌ中で震盪して、１２ないし１４時間３７°Ｃで増殖
させそしてホワイトおよびネスター（エフ、エフ。
ホワイトおよびイー、ダブリュ、ネスター７′）により
記載されたように調製゛する。集菌ののちに、細胞をア
ルカリ性溶菌緩衝液中に再懸濁し３７°Ｃに２０ないし
３０分保つ。このようにして得られた清澄な溶菌液を、
２Ｍトリス弓（Ｃ１（ｐＨＢ）の添加により中和する。
記載されたように調製゛する。集菌ののちに、細胞をア
ルカリ性溶菌緩衝液中に再懸濁し３７°Ｃに２０ないし
３０分保つ。このようにして得られた清澄な溶菌液を、
２Ｍトリス弓（Ｃ１（ｐＨＢ）の添加により中和する。
染色体ＤＮＡをＳＤＳおよびＮａＣ１の添加により沈澱
させる。溶菌液を氷上に置き、染色体ＤＮＡを遠心分離
で分離する。上清中にいまあるプラスミドＤＮＡを１０
％ＰＦＧ６０００で沈澱させる。
させる。溶菌液を氷上に置き、染色体ＤＮＡを遠心分離
で分離する。上清中にいまあるプラスミドＤＮＡを１０
％ＰＦＧ６０００で沈澱させる。
４°Ｃで一晩保存した後に、プラスミドＤＮＡを７ない
し８ｍｌのＴＥ中に再懸濁させる。培地ｌｌから得られ
るプラスミドＤＮＡをさらに２層のＣｓＣ１勾配で精製
する。固体ＣｓＣｌを添加する（上清８．７ｍｌに対し
てＣｓＣ１８，３ｇ）。
し８ｍｌのＴＥ中に再懸濁させる。培地ｌｌから得られ
るプラスミドＤＮＡをさらに２層のＣｓＣ１勾配で精製
する。固体ＣｓＣｌを添加する（上清８．７ｍｌに対し
てＣｓＣ１８，３ｇ）。
エチジウムプロミド（シグマ；最終濃度１ｍｇ／ｍｌの
上清）の添加後、溶液を１３．５ｍｌのクイック シー
ル ポリアロマ−チューブ （口ｕｉｃｋ ５ｅａｌ ｐｏｌｙａｌｌｏｍｅｒ ｔ
ｕｂｅ ） （ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ ） ）
に移し、そしてベックマンＴｉ５０ローター中４０時間
４００００ｒｐｍで遠心分離する。２本の螢光バンドを
長波長紫外線（３６６ｎｍ）で視ることができる。下側
のバンドには、２ｍｌのシリンジ（１８Ｇの針）で横側
からチューブを穿孔することにより集められる超らせん
プラスミドＤＮＡが含まれる。
上清）の添加後、溶液を１３．５ｍｌのクイック シー
ル ポリアロマ−チューブ （口ｕｉｃｋ ５ｅａｌ ｐｏｌｙａｌｌｏｍｅｒ ｔ
ｕｂｅ ） （ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ ） ）
に移し、そしてベックマンＴｉ５０ローター中４０時間
４００００ｒｐｍで遠心分離する。２本の螢光バンドを
長波長紫外線（３６６ｎｍ）で視ることができる。下側
のバンドには、２ｍｌのシリンジ（１８Ｇの針）で横側
からチューブを穿孔することにより集められる超らせん
プラスミドＤＮＡが含まれる。
エチジウムプロミドを、等量のイソプロパツール（Ｃｓ
Ｃ１で飽和された）で５回抽出することにより除去し、
生成物を３０ｍ１のコレックスチューブに移す。ＴＥ２
．５容量を加え、そしてＤＮＡをエタノールで沈澱させ
る。溶液を次に一２０°Ｃに１２ないし１５時間保つ。
Ｃ１で飽和された）で５回抽出することにより除去し、
生成物を３０ｍ１のコレックスチューブに移す。ＴＥ２
．５容量を加え、そしてＤＮＡをエタノールで沈澱させ
る。溶液を次に一２０°Ｃに１２ないし１５時間保つ。
沈澱したＤＮＡをツルバール（５ｏｒｖａｌｌ ） Ｈ
Ｂ −４０−ター中、０°Ｃで１２００Ｏｒｐｍ３０分
間遠心分離することにより集め、そしてＴＥ２００ｍｌ
中に再）猿濁する。
Ｂ −４０−ター中、０°Ｃで１２００Ｏｒｐｍ３０分
間遠心分離することにより集め、そしてＴＥ２００ｍｌ
中に再）猿濁する。
（Ｅ、ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ １０３もまた同じ方法で抽出
され使用される。） １、 ’１．Ｅ、ｃｏｌｉブースミ゛ 培地（ＬＢ培地）１００ｍｌからの細胞を遠心分離によ
り集め（ツルバール、ＧＳＡローター、６０００ｒｐｍ
で１０分間、４°Ｃ）、ＴＥ（１０ｍＭ トリス−Ｈ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨＢ，０）１００ｍｌ中
に再懸濁し、そして上記条件で遠心分離する。細胞のペ
レットをＴｓｕｃ （５０ｍＭ）リス・ＨＣｌ、 ｐ
Ｈ７，５，２５％（Ｗ／Ｖ）ショ糖）３ｍｌ中に再懸濁
し、５Ｓ−３４ポリプロピレン ツルバール チューブ
に移す。全ての引き続く工程を氷上で行う：５分後、リ
ゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｉｌワーシングトン（Ｗｏｒ
ｔｈｉｎｇｔｏｎ ）から購入。
され使用される。） １、 ’１．Ｅ、ｃｏｌｉブースミ゛ 培地（ＬＢ培地）１００ｍｌからの細胞を遠心分離によ
り集め（ツルバール、ＧＳＡローター、６０００ｒｐｍ
で１０分間、４°Ｃ）、ＴＥ（１０ｍＭ トリス−Ｈ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨＢ，０）１００ｍｌ中
に再懸濁し、そして上記条件で遠心分離する。細胞のペ
レットをＴｓｕｃ （５０ｍＭ）リス・ＨＣｌ、 ｐ
Ｈ７，５，２５％（Ｗ／Ｖ）ショ糖）３ｍｌ中に再懸濁
し、５Ｓ−３４ポリプロピレン ツルバール チューブ
に移す。全ての引き続く工程を氷上で行う：５分後、リ
ゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｉｌワーシングトン（Ｗｏｒ
ｔｈｉｎｇｔｏｎ ）から購入。
１１．０ＯＯＵ／ｍｇ） ０． ３ ｍ ｌを添加する
。ＥＤＴＡ（５００ｍＭ、ｐＨＢ，０＞ １ 、 ２
ｍ ｌ 、そしてもう５分後、界面活性剤〔０，１％
トリトンＸ−１００（メルク） 、 ５０ｍＭＥ Ｄ
Ｔ Ａ、 ５０Ｉｌ＋Ｍ トリス・ＨＣｌ、 ｐＨＢ，
０） ４． ８ｍ ｌを添加する。５分後、溶菌液を予
備冷却した５Ｓ−３４０−ター中で４０分間４°Ｃで遠
心分離する。上清を注意深く除去し、そして固体ＣｓＣ
１の添加後、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓプラス
ミドＤＮＡのために記載したようにＣｓＣｌ勾配で精製
する。ハイブリッドプラスミドＤＮＡ５０ないし１００
μ２を培養液１００ｍ ｌから回収する。
。ＥＤＴＡ（５００ｍＭ、ｐＨＢ，０＞ １ 、 ２
ｍ ｌ 、そしてもう５分後、界面活性剤〔０，１％
トリトンＸ−１００（メルク） 、 ５０ｍＭＥ Ｄ
Ｔ Ａ、 ５０Ｉｌ＋Ｍ トリス・ＨＣｌ、 ｐＨＢ，
０） ４． ８ｍ ｌを添加する。５分後、溶菌液を予
備冷却した５Ｓ−３４０−ター中で４０分間４°Ｃで遠
心分離する。上清を注意深く除去し、そして固体ＣｓＣ
１の添加後、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓプラス
ミドＤＮＡのために記載したようにＣｓＣｌ勾配で精製
する。ハイブリッドプラスミドＤＮＡ５０ないし１００
μ２を培養液１００ｍ ｌから回収する。
Ｂ、ｔｈｕｒｉｎＨｉｅｎｓｉｓ （変種ｋｕｒｕｓ
ｔａｋｉ １ｌＤｌ＋ＥＴｌｌＺ４４４９株）を、上記
のようにヨウステンおよびロゴラフ（エイ、エイ、ヨウ
ステンおよびエイチ、ロゴッフ５′）に従って、フエル
ンパッハフラスコの培地で培養するが、グルコースの濃
度を高める（０．１％の代わりに０．３％）。培養時間
は、３０°Ｃで４ないし５日である。コロニーを胞子形
成後直ちに集める（ビイ、トリュムピ８））。
ｔａｋｉ １ｌＤｌ＋ＥＴｌｌＺ４４４９株）を、上記
のようにヨウステンおよびロゴラフ（エイ、エイ、ヨウ
ステンおよびエイチ、ロゴッフ５′）に従って、フエル
ンパッハフラスコの培地で培養するが、グルコースの濃
度を高める（０．１％の代わりに０．３％）。培養時間
は、３０°Ｃで４ないし５日である。コロニーを胞子形
成後直ちに集める（ビイ、トリュムピ８））。
パラ胞子体および胞子を互いに分離するために、ブラフ
イールド等（エフ、ビイ、ブラフイールド等９１）によ
る方法を用いる。
イールド等（エフ、ビイ、ブラフイールド等９１）によ
る方法を用いる。
ａ および七８の八 ニ
ー０．０１％トリトン−Ｘ−１００（メルク）を含有す
る０、１ＭＮａＣ１１０，０２Ｍｔａ酸カリウム緩衝液
（ｐｕ ７．０ ＞中に自己溶菌した培養液を懸濁す
る。
る０、１ＭＮａＣ１１０，０２Ｍｔａ酸カリウム緩衝液
（ｐｕ ７．０ ＞中に自己溶菌した培養液を懸濁す
る。
一徹粒子成分、例えば寒天残渣等を分離するために懸濁
液を濾過する。
液を濾過する。
一遠心分離する
−２６０ ｎｍで吸収する成分が上清中に微量になるま
で、沈澱物を上記溶液で数回洗浄する一〇、２ＭＮａＣ
１１０，００４Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）／ Ｏ、
Ｏ１％トリトン−Ｘ−１００中で微粒子成分を洗浄する
。
で、沈澱物を上記溶液で数回洗浄する一〇、２ＭＮａＣ
１１０，００４Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）／ Ｏ、
Ｏ１％トリトン−Ｘ−１００中で微粒子成分を洗浄する
。
−０，０１％トリトン−Ｘ−１００で再び洗浄する
〜水中に粒子を懸濁する
一懸濁液から残渣細胞を除去する
一遠心分離し、そして残渣細胞と結晶を０．０２Ｍ燐酸
塩緩衝液（ｐＨ７，０）／ ０． ０１％トリトン−Ｘ
〜１００中で３度洗浄する −同じ緩衝液１８２ｍ１中の懸濁液を、デキストラン硫
酸ナトリウム５００（シグマ）の２０％（ｗ／＋４）水
性溶液１０５ｇ、固体ポリエチレングリコール６０００
、（メルク）１３．２ｇ、燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０
）３．３ｍｌおよびＮａＣ１７，５ｇを含有する円柱状
の分液ロートに移す 一固体成分を溶解するために震盪する 一同成分で、細菌成分を含有しない十分に震盪した溶液
を添加することにより体積を６００ｍ１に調整する −強く震盪する 一５゛Ｃで３０分間放置する −分離された層の上層（大部分胞子を含有し結晶をほと
んど含有しない）を除去する 一上層を遠心分離する 一上清を、分液ロートにまだ残っている下層（胞子およ
び結晶の混合物を含有する）に加える 一抽出を繰り返す １０度目の抽出後、下層の結晶は、実質的に胞子を含ま
ず、遠心分離により集めることができる。胞子および結
晶の両方を、冷却蒸留水で５回洗浄する。結晶を水中で
の懸濁液として一５°Ｃで貯蔵する。
塩緩衝液（ｐＨ７，０）／ ０． ０１％トリトン−Ｘ
〜１００中で３度洗浄する −同じ緩衝液１８２ｍ１中の懸濁液を、デキストラン硫
酸ナトリウム５００（シグマ）の２０％（ｗ／＋４）水
性溶液１０５ｇ、固体ポリエチレングリコール６０００
、（メルク）１３．２ｇ、燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０
）３．３ｍｌおよびＮａＣ１７，５ｇを含有する円柱状
の分液ロートに移す 一固体成分を溶解するために震盪する 一同成分で、細菌成分を含有しない十分に震盪した溶液
を添加することにより体積を６００ｍ１に調整する −強く震盪する 一５゛Ｃで３０分間放置する −分離された層の上層（大部分胞子を含有し結晶をほと
んど含有しない）を除去する 一上層を遠心分離する 一上清を、分液ロートにまだ残っている下層（胞子およ
び結晶の混合物を含有する）に加える 一抽出を繰り返す １０度目の抽出後、下層の結晶は、実質的に胞子を含ま
ず、遠心分離により集めることができる。胞子および結
晶の両方を、冷却蒸留水で５回洗浄する。結晶を水中で
の懸濁液として一５°Ｃで貯蔵する。
ｂ 日の口′六 二
結晶の懸濁液の一部を、１０分間１２０００ｇで遠心分
離する。このようにして得られる沈澱物を、０．０５Ｍ
炭酸塩緩衝液および１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＤ
Ｔ、 シグマ；以下炭酸塩／ＤＤＴとして示す、炭酸
塩緩衝液およびジチオトレイトールの混合物）中に、炭
酸塩／ＤＤＴ混合物１ｍｌあたり沈澱物５ｍｇの濃度で
再懸濁する。
離する。このようにして得られる沈澱物を、０．０５Ｍ
炭酸塩緩衝液および１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＤ
Ｔ、 シグマ；以下炭酸塩／ＤＤＴとして示す、炭酸
塩緩衝液およびジチオトレイトールの混合物）中に、炭
酸塩／ＤＤＴ混合物１ｍｌあたり沈澱物５ｍｇの濃度で
再懸濁する。
３７°Ｃで３０分間培養後、未溶解の粒子を２５０００
ｇで１０分間遠心分離により分離する。上清を炭酸塩緩
衝液に対して透析し、続いてタンパク含量および生物学
的試験において有効性を試験する。
ｇで１０分間遠心分離により分離する。上清を炭酸塩緩
衝液に対して透析し、続いてタンパク含量および生物学
的試験において有効性を試験する。
貯蔵のために、プロトキシン溶液を急速に凍る部分に分
ける。解凍の際、ＤＤＴから離れたタンパク質は、ゲル
様の密度を有する。タンパク質の完全な溶液は、１ｍＭ
ＤＤＴの添加で得られる。
ける。解凍の際、ＤＤＴから離れたタンパク質は、ゲル
様の密度を有する。タンパク質の完全な溶液は、１ｍＭ
ＤＤＴの添加で得られる。
ｃ ｋＣｌ、＋、Ａプローアーーｔｏ−，’
：結晶懸濁液のセリンプロテアーゼおよび金運プロテア
ーゼ（チェツキナ等ｌ０））を、下記の方法でジイソプ
ロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ、セルバ）および
ＥＤＴＡを添加することにより、不活性化する。
：結晶懸濁液のセリンプロテアーゼおよび金運プロテア
ーゼ（チェツキナ等ｌ０））を、下記の方法でジイソプ
ロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ、セルバ）および
ＥＤＴＡを添加することにより、不活性化する。
結晶を、０．０１Ｍ燐酸塩緩衝液、ｐＨＢ，０および１
ｍＭＥＤＴＡ中に、緩衝液／ＥＤＴＡ混合物１ｍｌあた
り結晶５ないし１０ｍｇの濃度となるように懸濁する。
ｍＭＥＤＴＡ中に、緩衝液／ＥＤＴＡ混合物１ｍｌあた
り結晶５ないし１０ｍｇの濃度となるように懸濁する。
単一分散懸濁液が得られるまで、懸濁液を超音波処理す
る（光学顕微鏡で試験する）。
る（光学顕微鏡で試験する）。
ドラフト内で、共通の予防計測をして、１ｍＭＤＥＰを
Ｈ？３濁液に添加する。ｐＡ濁液の入っているチューブ
を気密にし、強力に震盪する。室温で一晩培養後、不活
性化懸濁液をＨ，Ｏおよび１ｍＭＥＤＴＡに対して平衡
に達するまで透析する。
Ｈ？３濁液に添加する。ｐＡ濁液の入っているチューブ
を気密にし、強力に震盪する。室温で一晩培養後、不活
性化懸濁液をＨ，Ｏおよび１ｍＭＥＤＴＡに対して平衡
に達するまで透析する。
ｕ、−ｒ王ｍυ区作
炭酸塩／ＤＤＴ中に結晶を溶解し、このようにして得ら
れる溶液を炭酸塩緩衝液および１ｍＭＤＴＴに対して透
析し、そして０．４５μｍミリポアフィルタ−を使用し
て、無菌濾過により抗原を精製することにより、３．
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ血清型Ｈ−３の結晶から抗
原を調製する。
れる溶液を炭酸塩緩衝液および１ｍＭＤＴＴに対して透
析し、そして０．４５μｍミリポアフィルタ−を使用し
て、無菌濾過により抗原を精製することにより、３．
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ血清型Ｈ−３の結晶から抗
原を調製する。
抗原溶液を完全フロインドアジュバント（バクト）と、
１：ｌの比で混合し、そして４°Ｃで保存する。
１：ｌの比で混合し、そして４°Ｃで保存する。
セントアラビン（スイス国、フリブルグ）にあるチバー
ガイギー アクチェンゲゼルシャフトの実験所で、２匹
のヤギを、Ｈ−３プロトキシンで免疫化した。各々のヤ
ギを、抗原０． ５ｍｇの内皮注射および百日咳菌（Ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ ）〔ベーゾング（Ｂｅｈｒｉｎｇ
） ） １． ５ｍ ｌの皮下注射により処理した。後
者の処理は、免疫学的反応を増やすためのものである。
ガイギー アクチェンゲゼルシャフトの実験所で、２匹
のヤギを、Ｈ−３プロトキシンで免疫化した。各々のヤ
ギを、抗原０． ５ｍｇの内皮注射および百日咳菌（Ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ ）〔ベーゾング（Ｂｅｈｒｉｎｇ
） ） １． ５ｍ ｌの皮下注射により処理した。後
者の処理は、免疫学的反応を増やすためのものである。
全部の処理を０．２８．および７６日に行った。血液試
料を３５．４０．８４および８９日目に採取し、３５日
目には５ｍｌ、そしてその他の日には８０ｍ１採取した
。
料を３５．４０．８４および８９日目に採取し、３５日
目には５ｍｌ、そしてその他の日には８０ｍ１採取した
。
血液が凝固した場合には、血清を５６°Ｃで３０分間イ
ンキエベートし、このように補体を不活性化する。血清
を一２０°Ｃで保存する。
ンキエベートし、このように補体を不活性化する。血清
を一２０°Ｃで保存する。
ヤギＨ−３抗体血清の■ｇＧ（免疫グロプリ゛ンＧ）画
分を、硫酸アンモニウム沈澱、次にＤＥＡＥセルロース
上のクロマトグラフィーによリ精製し、そしてとューパ
ーールカック（エイチ、ヒューバーールカック１１ ）
により記載の方法に従ってオフテルロニー寒天拡散（０
ｕｃｈｔｅｒ１ｏｎｙ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏ
ｎ）プレート（オー、オクテルロニ−１′）で分析する
。
分を、硫酸アンモニウム沈澱、次にＤＥＡＥセルロース
上のクロマトグラフィーによリ精製し、そしてとューパ
ーールカック（エイチ、ヒューバーールカック１１ ）
により記載の方法に従ってオフテルロニー寒天拡散（０
ｕｃｈｔｅｒ１ｏｎｙ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏ
ｎ）プレート（オー、オクテルロニ−１′）で分析する
。
このように、３．２Ｍ硫酸アンモニウム３０ｍ１を、Ｐ
Ｂ Ｓ ’ （０，０１Ｍ燐酸塩緩衝液、 ｐＨ７
゜４および０．８％ＮａＣ１）１５ｍｌ中のヤギ抗Ｈ３
血清１５ｍ１に滴下する。混合物を１５分間放置する。
Ｂ Ｓ ’ （０，０１Ｍ燐酸塩緩衝液、 ｐＨ７
゜４および０．８％ＮａＣ１）１５ｍｌ中のヤギ抗Ｈ３
血清１５ｍ１に滴下する。混合物を１５分間放置する。
混合物を遠心分離（１００００ｇ、２０分間）したのち
、沈澱をＰＢＳ’ ７．５ｍｌに分散させ、４°ＣＴ：
ＰＢＳ’ １０００ｍｌに対して３回透析し、次いで
０．０１Ｍ燐酸塩緩衝液。
、沈澱をＰＢＳ’ ７．５ｍｌに分散させ、４°ＣＴ：
ＰＢＳ’ １０００ｍｌに対して３回透析し、次いで
０．０１Ｍ燐酸塩緩衝液。
ｐＨ７，８１０１００Ｏに対して透析し、そして遠心分
離（３０００ｇ、２０分間）する。
離（３０００ｇ、２０分間）する。
上清をＤＥＡＥの３０ｍ１カラムに移し、室温において
０．０１Ｍ燐酸塩緩衝液、ｐ Ｈ７。
０．０１Ｍ燐酸塩緩衝液、ｐ Ｈ７。
８で溶出する（流速：２０ないし８０ ｍ ｌ ／ ｈ
）。
）。
最初のピークの両分を集め、凍結乾燥する。ＩｇＧの平
均数計は、血清１５ｍ１あたり１８０ｍｇである。Ｉｇ
Ｇ画分を、ウサギの抗ヤギ■ｇＧ抗体および抗ヤギ血清
抗体〔マイルズ ラボラトリーズ（Ｍｉｋｓ Ｉａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｓ ） ）に対する免疫拡散（オー、オク
テルロニ−１１ゝ ）ニヨり精製度を検査する。
均数計は、血清１５ｍ１あたり１８０ｍｇである。Ｉｇ
Ｇ画分を、ウサギの抗ヤギ■ｇＧ抗体および抗ヤギ血清
抗体〔マイルズ ラボラトリーズ（Ｍｉｋｓ Ｉａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｓ ） ）に対する免疫拡散（オー、オク
テルロニ−１１ゝ ）ニヨり精製度を検査する。
Ｈ３プロトキシンが結合しているセファロース（５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ” ） （ファルマシア）カラムでの吸
収により、抗体をさらに精製する。プロトキシンのＣＮ
Ｂ ｒ−セファロース（ファルマシア）への結合は、下
記にまとめられているように業者の説明書に従って行わ
れる： ＣＮＢｒ活性化セファロース６ＭＢ１とを、最終ゲル容
量約３ｍｌとなるように計りとる。
ｈａｒｏｓｅ ” ） （ファルマシア）カラムでの吸
収により、抗体をさらに精製する。プロトキシンのＣＮ
Ｂ ｒ−セファロース（ファルマシア）への結合は、下
記にまとめられているように業者の説明書に従って行わ
れる： ＣＮＢｒ活性化セファロース６ＭＢ１とを、最終ゲル容
量約３ｍｌとなるように計りとる。
ゲルを洗浄し、そしてＩｍＭＨＣ１２００ｍｌを使用し
、焼結ガラスフィルター上で再膨張させる。上記のＵ、
１．ｃにより得られるＨ３抗原タンパク質を０．１ＭＮ
ａ ＨＣＯｘおよび０．５ＭＮａＣ１に溶解する。ゲル
１ｍｌは、タンパク質５ないしＬＯｍｇを含有する。ゲ
ル懸濁液および抗原を室温で２時間混合する。
、焼結ガラスフィルター上で再膨張させる。上記のＵ、
１．ｃにより得られるＨ３抗原タンパク質を０．１ＭＮ
ａ ＨＣＯｘおよび０．５ＭＮａＣ１に溶解する。ゲル
１ｍｌは、タンパク質５ないしＬＯｍｇを含有する。ゲ
ル懸濁液および抗原を室温で２時間混合する。
０、 １ ＭＮａ ＨＣＯｚ （ｐＨＢ、３ ）、０
． ５ＭＮａｃｌおよび０．５Ｍエタノールアミンで洗
浄することにより過剰なタンパク質を除去する。
． ５ＭＮａｃｌおよび０．５Ｍエタノールアミンで洗
浄することにより過剰なタンパク質を除去する。
さらに０．１ＭＮａＨＣＯｚ （ｐＨＢ，３）および０
．５ＭＮａＣｌで洗浄し、Ｏ，ｔＭ Ｃｆ（：ＩＣ０
ＯＮａ（ｐＨ４）および０．５ＭＮａＣｌでさらに洗浄
する。最終の洗浄工程を、０．ＩＭＮ ａ ＨＣＯ：ｌ
および０．５ＭＮａＣｌで再び行う。タンパク質−セフ
ァロース結合物は、ファルマシア力ラムに９（ファルマ
シア）の中に充填するように準備する。このカラム上で
ＩｇＧを、効果的に精製することができる。
．５ＭＮａＣｌで洗浄し、Ｏ，ｔＭ Ｃｆ（：ＩＣ０
ＯＮａ（ｐＨ４）および０．５ＭＮａＣｌでさらに洗浄
する。最終の洗浄工程を、０．ＩＭＮ ａ ＨＣＯ：ｌ
および０．５ＭＮａＣｌで再び行う。タンパク質−セフ
ァロース結合物は、ファルマシア力ラムに９（ファルマ
シア）の中に充填するように準備する。このカラム上で
ＩｇＧを、効果的に精製することができる。
特異的に結合した抗体を、３ＭＫＳＣＮで溶出し、そし
てＰ Ｂ Ｓ” （１０ｍＭ 燐酸ナトリウム。
てＰ Ｂ Ｓ” （１０ｍＭ 燐酸ナトリウム。
ｐＨ７，８，０，１４ＭＮ ａ ＣＩ ）に対して透析
する。その抗体をクロラミン−Ｔ法（アメルシャム ブ
フラー レビュー１３））を用いて１２５ １で放射能
標識する。
する。その抗体をクロラミン−Ｔ法（アメルシャム ブ
フラー レビュー１３））を用いて１２５ １で放射能
標識する。
土工ｍｔ二
沃化すトリウム−”’ｌ１ｍＣ１を０．５Ｍ燐酸塩緩衝
液（ｐｌ！ ７．２） １００μｌを含むチェーブに
入れる。連続撹拌しながら、タンパク質溶液（ＴＢＳ中
０．５＋＋＋ｇ／ｍｌ ） ５ ｕ ｇおよび０．０５
Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）中のクロラミン５０μｇ
を添加する。室温で１分間培養後ＮａｚＳｚＯｓ１２０
μｇを添加する。セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ
＠） Ｇ −２５を充填した０、９Ｘ１２ｃｍカラムで
、遊離沃素を標識タンパク質から分離する。標識タンパ
ク質のカラムへの吸収をさけるために、最初にＢ Ｓ
Ａ （１００ｍｇ／ｍり０．５ｍｌを充填したカラムに
通す。これが終了後、標識成分を定量的にカラムの上に
移し、燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）で溶出する。両分（
１ｍｌ）を、全タンパク質が溶出するまで集める。
液（ｐｌ！ ７．２） １００μｌを含むチェーブに
入れる。連続撹拌しながら、タンパク質溶液（ＴＢＳ中
０．５＋＋＋ｇ／ｍｌ ） ５ ｕ ｇおよび０．０５
Ｍ燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）中のクロラミン５０μｇ
を添加する。室温で１分間培養後ＮａｚＳｚＯｓ１２０
μｇを添加する。セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ
＠） Ｇ −２５を充填した０、９Ｘ１２ｃｍカラムで
、遊離沃素を標識タンパク質から分離する。標識タンパ
ク質のカラムへの吸収をさけるために、最初にＢ Ｓ
Ａ （１００ｍｇ／ｍり０．５ｍｌを充填したカラムに
通す。これが終了後、標識成分を定量的にカラムの上に
移し、燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）で溶出する。両分（
１ｍｌ）を、全タンパク質が溶出するまで集める。
■、δ−エンドトキシン゛ −のクローニングＢ、 ｔ
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕｒｕｓｔａｋｉ
１１０１からの部分的な５ａｕ３Ａ Ｄ Ｎ Ａライ
ブラリィ、ＥＴＨ２４４４９株プラスミドＤＮＡは、マ
ニアチス等（ティー、マニアチス等１０ ）に従って実
質的に調製し、そして下記のようにベクターＤＮＡとし
てｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位にサブクローン化する
。： アガロースゲル上での切断ＤＮＡのエチジウムプロミド
着色が、はとんど２ないし１０Ｋｂの大きさの範囲にあ
るような方法で５ａｕ３Ａでの消化を行う。これはマニ
アチス等により記載されている（ティー、マニアチス等
１４））方法を用いて行う。部分的に切断したＤＮＡの
分画は、下記のＩＶ、 ２に記載したような調製アガ
ロースゲルで、または好ましくはＮａＣ１塩勾配で行わ
れる。直線状の塩勾配は、ＴＥ緩衝液中の５と２０％Ｎ
ａＣ１で行われ、３５Ｋｒｐｍで５Ｗ４０Ｔｉベツクマ
ンロ一ター中３時間行われる。集めた両分を、エタノー
ルの添加により沈澱させ、アガロースゲル上で分析する
。
ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕｒｕｓｔａｋｉ
１１０１からの部分的な５ａｕ３Ａ Ｄ Ｎ Ａライ
ブラリィ、ＥＴＨ２４４４９株プラスミドＤＮＡは、マ
ニアチス等（ティー、マニアチス等１０ ）に従って実
質的に調製し、そして下記のようにベクターＤＮＡとし
てｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位にサブクローン化する
。： アガロースゲル上での切断ＤＮＡのエチジウムプロミド
着色が、はとんど２ないし１０Ｋｂの大きさの範囲にあ
るような方法で５ａｕ３Ａでの消化を行う。これはマニ
アチス等により記載されている（ティー、マニアチス等
１４））方法を用いて行う。部分的に切断したＤＮＡの
分画は、下記のＩＶ、 ２に記載したような調製アガ
ロースゲルで、または好ましくはＮａＣ１塩勾配で行わ
れる。直線状の塩勾配は、ＴＥ緩衝液中の５と２０％Ｎ
ａＣ１で行われ、３５Ｋｒｐｍで５Ｗ４０Ｔｉベツクマ
ンロ一ター中３時間行われる。集めた両分を、エタノー
ルの添加により沈澱させ、アガロースゲル上で分析する
。
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、、ｐＨ７，４，１００ｍＭＮ
ａＣ１および１０ｍＭＭｇ Ｃｌｚ ５０μｌ中のＢａ
ｍＨＩエンドヌクレアーゼ１ｏユニットで、ｐＢＲ３２
２プラスミド１０μｇを３７°Ｃ，１ないし２時間消化
する。切断ＤＮＡのホスファターゼ処理を下記のように
行う：ＤＮＡｌ０μｇをトリス・ＨＣＩ、ｐＨＢ，５０
μ！中に溶解し、ウシ膵臓アルカリホスファターゼ〔ベ
ーリンガ−（Ｂａｈｒｉｎｇｅｒ ） ）をＤＮＡ１ａ
ｇあたり３ユニツトの量で添加する。３７°Ｃで３０分
間培養後、ＤＮＡを２回フェノール化し、最後にクロロ
ホルムで抽出する。エタノール沈澱後、ＤＮＡをＨ２Ｏ
２０μｉ中に再懸濁し、部分的な５ａｕ３Ａ消化から誘
導される断片の連結反応に使用される。反応を下記のよ
うに行う：ＨｚＯ１０μｆ中の５ａｕ３Ａ消化ＤＮＡ０
．４ｇにホスファターゼ処理ベクター０．１ａｇを添加
する。連結反応は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，
４，１ｍＭＡＴＰ。
ａＣ１および１０ｍＭＭｇ Ｃｌｚ ５０μｌ中のＢａ
ｍＨＩエンドヌクレアーゼ１ｏユニットで、ｐＢＲ３２
２プラスミド１０μｇを３７°Ｃ，１ないし２時間消化
する。切断ＤＮＡのホスファターゼ処理を下記のように
行う：ＤＮＡｌ０μｇをトリス・ＨＣＩ、ｐＨＢ，５０
μ！中に溶解し、ウシ膵臓アルカリホスファターゼ〔ベ
ーリンガ−（Ｂａｈｒｉｎｇｅｒ ） ）をＤＮＡ１ａ
ｇあたり３ユニツトの量で添加する。３７°Ｃで３０分
間培養後、ＤＮＡを２回フェノール化し、最後にクロロ
ホルムで抽出する。エタノール沈澱後、ＤＮＡをＨ２Ｏ
２０μｉ中に再懸濁し、部分的な５ａｕ３Ａ消化から誘
導される断片の連結反応に使用される。反応を下記のよ
うに行う：ＨｚＯ１０μｆ中の５ａｕ３Ａ消化ＤＮＡ０
．４ｇにホスファターゼ処理ベクター０．１ａｇを添加
する。連結反応は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，
４，１ｍＭＡＴＰ。
１０ｍＭＭｇＣ１２および１５ｍＭＤＴＴの添加、次い
でＴ４ＤＮＡリガーゼ〔バイオラプス（Ｂｉｏｌａｂｓ
）） ２０ユニツトの添加で起こる。
でＴ４ＤＮＡリガーゼ〔バイオラプス（Ｂｉｏｌａｂｓ
）） ２０ユニツトの添加で起こる。
１５°Ｃで一晩培養後、ＤＮＡは、Ｅ、ｃｏｌｉ ８８
１０１株コンピテント細胞を形質転換するために使用さ
れる。
１０１株コンピテント細胞を形質転換するために使用さ
れる。
部分的な５ａｕ３Ａライブラリイを調製する方法の代わ
りに、Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ （変種ｋｕ
ｒｕｓｔａｋｉ ＨＤＩ 、ＥＴＨ２４４４９株）から
のＤＮＡライブラリィを完全にはＢａｍＨＩで、そして
部分的にはＣ１ａ ＩでプラスミドＤＮＡを消化するこ
とにより調製する。引き続いてそれを、Ｃ１ａ■とＢａ
ｍＨ１部位との間のｐＢＲ３２２中にクローン化する。
りに、Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ （変種ｋｕ
ｒｕｓｔａｋｉ ＨＤＩ 、ＥＴＨ２４４４９株）から
のＤＮＡライブラリィを完全にはＢａｍＨＩで、そして
部分的にはＣ１ａ ＩでプラスミドＤＮＡを消化するこ
とにより調製する。引き続いてそれを、Ｃ１ａ■とＢａ
ｍＨ１部位との間のｐＢＲ３２２中にクローン化する。
１［［２Ｐ カルシウム° による）ｒ −川５ Ｘ
１０ ’ ｃｅｌｌ／ｍｌの密度の増殖細胞を、塩化
カルシウムで処理することにより、コンピテント細胞の
調製を行う（マニアチス等１Ｓ））。
１０ ’ ｃｅｌｌ／ｍｌの密度の増殖細胞を、塩化
カルシウムで処理することにより、コンピテント細胞の
調製を行う（マニアチス等１Ｓ））。
これらの細胞を４２°Ｃに３分間保ち、ＬＢ培地１ｍｌ
で希釈し、３７°Ｃで６０分間培養し、そして慣用の方
法（マニアチス等＋５１）により選択培地上に展開した
後で、該細胞にＤＮＡを添加することにより、形質転換
を行う。
で希釈し、３７°Ｃで６０分間培養し、そして慣用の方
法（マニアチス等＋５１）により選択培地上に展開した
後で、該細胞にＤＮＡを添加することにより、形質転換
を行う。
ｍａ ｒ’ノｉ、’＋
δ−エンドトキシン遺伝子を含むコロニーは、精製およ
び溶解した毒素結晶に類似した生物学的有効性を有する
タンパク質を出す（エイチ。
び溶解した毒素結晶に類似した生物学的有効性を有する
タンパク質を出す（エイチ。
イー、シュネフ等１６））。それらタンパク質は、それ
ゆえに、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕ
ｒｕｓ ｔａ、ｋｉの結晶タンパク質に対して調製した
ヤギ抗体（１・Ｉ３抗体）で免疫学的に選びだされる。
ゆえに、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕ
ｒｕｓ ｔａ、ｋｉの結晶タンパク質に対して調製した
ヤギ抗体（１・Ｉ３抗体）で免疫学的に選びだされる。
細菌のコロニーをアンピシリンの存在下ＬＢ培地５ｍｌ
中で個々に増殖される。培養液をため、集め、１０ｍＭ
Ｎａ Ｃｌで洗浄し、そして最後に細胞を４００ｍＭＮ
ａＣＩ、０．１ＭＮａＯＨ。
中で個々に増殖される。培養液をため、集め、１０ｍＭ
Ｎａ Ｃｌで洗浄し、そして最後に細胞を４００ｍＭＮ
ａＣＩ、０．１ＭＮａＯＨ。
１ｍＭＰＭＳＦ ２ｍｌ中で溶菌させる。室温で２０
分間培養後、溶菌液を２Ｍｔ−リス・ＨｅｌｐＨ７，０
２０μｌの添加により中和する。
分間培養後、溶菌液を２Ｍｔ−リス・ＨｅｌｐＨ７，０
２０μｌの添加により中和する。
５Ｓ３４ツルバールローター中で遠心分離（２０分間、
１０１００００ｒｐ した後に、溶菌液を’ＴＢＳ（１
０ｍＭトリス・ＨＣｌ、 ｐＨ７，５゜０．１４ＭＮａ
Ｃ１）に対して広範囲に透析する。
１０１００００ｒｐ した後に、溶菌液を’ＴＢＳ（１
０ｍＭトリス・ＨＣｌ、 ｐＨ７，５゜０．１４ＭＮａ
Ｃ１）に対して広範囲に透析する。
−里ユー」ニー」凹と 中多の ・ ゲ・スクリー
ニング クラーク等（エル、クラーク等１７′）により記載され
たプラスチックウェル法を使用して、抽出物を免疫学的
にδ−エンドトキシン抗原の存在に関し試験する。単一
プラスチックウェルを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
９，３中の精製１−ｉ ３ヤギ抗体（１０μｓ／ｍ１）
１５０μにで一晩被覆し、４°Ｃに一晩保つ。ウェルを
ＴＢＳ／ツイーン（ＴＢＳ＋０．５％ツイーン２０）で
３回洗浄し、細菌抽出物１５０μ２で満たし、そして３
７゛Ｃで６時間培養する。洗浄後、ウェルを２５％ウマ
血清を含むＴＢＳ中の〔１２Ｓ Ｉ）標識ウサギ抗−
ヤギＨ３抗体（６０ｎ ｇ。
ニング クラーク等（エル、クラーク等１７′）により記載され
たプラスチックウェル法を使用して、抽出物を免疫学的
にδ−エンドトキシン抗原の存在に関し試験する。単一
プラスチックウェルを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
９，３中の精製１−ｉ ３ヤギ抗体（１０μｓ／ｍ１）
１５０μにで一晩被覆し、４°Ｃに一晩保つ。ウェルを
ＴＢＳ／ツイーン（ＴＢＳ＋０．５％ツイーン２０）で
３回洗浄し、細菌抽出物１５０μ２で満たし、そして３
７゛Ｃで６時間培養する。洗浄後、ウェルを２５％ウマ
血清を含むＴＢＳ中の〔１２Ｓ Ｉ）標識ウサギ抗−
ヤギＨ３抗体（６０ｎ ｇ。
１０’ｃｐｍ）１５０μｇで満たし、室温で一晩培養す
る。ＴＢＳ／ツイーンで洗浄後、ウェルをシンチレーシ
ョンカウンターで計測する。
る。ＴＢＳ／ツイーンで洗浄後、ウェルをシンチレーシ
ョンカウンターで計測する。
乏皿血止
旦ユ」」及ヱ」」ユ４久
Ｂ、ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ １１０１ 、ＥＴ
ＩＩＺ４４４９株の５ａｕ３Ａライブラリイに関し、上
記した免疫学的スクリーニング法から得られるｐＫ１９
ＤＮＡクローンの制限マツプは、種々の制限酵素による
プラスミドＤＮＡの一重、二重および三重消化から推定
される。消化は、酵素供給者の説明書に従って全て行わ
れた。要するにＤＮＡ （１μｇ１５０μ２）を適当な
制限エンドヌクレアーゼに適する緩衝液に溶解し、そし
て３７°Ｃで１ないし２時間の培養後、消化ＤＮＡをア
ガロースゲル上に載せ、電気泳動する。第二の酵素での
処理が、第一の酵素に不適当である条件下で行う必要が
ある場合には（例えば不適当な緩衝ｔ（り、ＤＮＡを最
初にフェノール：クロロホルムさせ、そして前には不適
当だった条件に曝す（例えば、第二の酵素に必要な緩衝
液）。
ＩＩＺ４４４９株の５ａｕ３Ａライブラリイに関し、上
記した免疫学的スクリーニング法から得られるｐＫ１９
ＤＮＡクローンの制限マツプは、種々の制限酵素による
プラスミドＤＮＡの一重、二重および三重消化から推定
される。消化は、酵素供給者の説明書に従って全て行わ
れた。要するにＤＮＡ （１μｇ１５０μ２）を適当な
制限エンドヌクレアーゼに適する緩衝液に溶解し、そし
て３７°Ｃで１ないし２時間の培養後、消化ＤＮＡをア
ガロースゲル上に載せ、電気泳動する。第二の酵素での
処理が、第一の酵素に不適当である条件下で行う必要が
ある場合には（例えば不適当な緩衝ｔ（り、ＤＮＡを最
初にフェノール：クロロホルムさせ、そして前には不適
当だった条件に曝す（例えば、第二の酵素に必要な緩衝
液）。
上り土エヱ法土
δ−エンドトキシンをコードする配列は、胞子を形成す
るＢ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞から分離され
た放射能標識Ｒ Ｎ Ａを、ｐＫ１９の特異的な制限断
片にハイブリッド化することにより、局在化する。これ
は、サザン（サザンＩ“） ）により記載されたトラン
スファー法により行われる： アガロースゲルで電気泳動により大きさに従って分離さ
れたＤＮＡ断片を変性させ、ニトロセルロースフィルタ
ーに移し、不動化する。ゲル内でのＤＮＡ断片の相対位
置は、フィル ターへのＤＮＡ断片の移動の間で保持さ
れる。フィルターに結合したＤＮＡを次に３２Ｐ−標識
ＲＮＡにハイブリッドさせ、そしてオートラジオグラフ
ィーは、放射性プローブに相補的なハンドの位置を決め
るために使用される。
るＢ． ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞から分離され
た放射能標識Ｒ Ｎ Ａを、ｐＫ１９の特異的な制限断
片にハイブリッド化することにより、局在化する。これ
は、サザン（サザンＩ“） ）により記載されたトラン
スファー法により行われる： アガロースゲルで電気泳動により大きさに従って分離さ
れたＤＮＡ断片を変性させ、ニトロセルロースフィルタ
ーに移し、不動化する。ゲル内でのＤＮＡ断片の相対位
置は、フィル ターへのＤＮＡ断片の移動の間で保持さ
れる。フィルターに結合したＤＮＡを次に３２Ｐ−標識
ＲＮＡにハイブリッドさせ、そしてオートラジオグラフ
ィーは、放射性プローブに相補的なハンドの位置を決め
るために使用される。
アガロースゲルからニトロセルロース紙へのＤＮＡの移
動は、マニアチス等１９′ により記載されているよう
に行う。
動は、マニアチス等１９′ により記載されているよう
に行う。
Ｃ）サザンフィルターのハイブリッド形成：予備ハイブ
リッド形成およびハイブリッド形成は、下記の修正をし
てマニアチス等（ティー。
リッド形成およびハイブリッド形成は、下記の修正をし
てマニアチス等（ティー。
マニアチス等９ゝ）に従って行う：焼成したフィルター
をヒートシール可能なプラスチックの袋の中に置く。予
備ハイブリッド形成混合物０。
をヒートシール可能なプラスチックの袋の中に置く。予
備ハイブリッド形成混合物０。
２ｍｌをニトロセルロースフィルター１ｃｍ四方につき
添加する。
添加する。
予備ハイブリッド形成混合物：
ｘＳＳＣ
５０％ホルムアミド
０、２％ＳＤＳ
２０ｍＭＥＤＴＡ
２５ｍＭ燐酸カリウム（ｐＨ７．２
５Ｘデンハルト溶？夜
１００μｇ／ｍｌ 子牛の胸腺の変性ＮＡ
袋を通常３ないし４時間、３７°Ｃで培養する。
予備ハイブリッド形成混合物を除去し、下記のハイブリ
ッド形成混合物（５０μ／ｃｍ２二Ｉ・ロセルロースフ
ィルター）で置換する。
ッド形成混合物（５０μ／ｃｍ２二Ｉ・ロセルロースフ
ィルター）で置換する。
ハイブリッド形成混合物：
予備ハイブリッド形成混合物と同様で
あるが、ここでは下記ＩＩ１． ５． ｄのように調
製した３ｔｐ標識変性ＲＮＡプローブ（１０）ｃｐｍ／
フィルター）を含む。
製した３ｔｐ標識変性ＲＮＡプローブ（１０）ｃｐｍ／
フィルター）を含む。
袋を通常３７°Ｃで一晩保つ。ハイブリッド形成の後に
、フィルターを室温で２ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ
中で、１５分間洗浄し、この洗浄を２回繰り返し、そし
てフィルターを０゜１ ｘｓｓｃおよび０．１％ＳＤＳ
中で６０分間洗浄する。フィルターをホワットマン３Ｍ
Ｍ紙上で乾燥し、オートラジオグラフィー用に調製する
。
、フィルターを室温で２ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ
中で、１５分間洗浄し、この洗浄を２回繰り返し、そし
てフィルターを０゜１ ｘｓｓｃおよび０．１％ＳＤＳ
中で６０分間洗浄する。フィルターをホワットマン３Ｍ
Ｍ紙上で乾燥し、オートラジオグラフィー用に調製する
。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの変種ｋｕｒｕｓｔ
ａｋｉ細胞を、０．１％グルコース含有のロゴフ培地で
増殖させる（エイ、エイ、ヨーステンおよびエム、エイ
チ、ロゴフ１）。培養液５００ｍ１を、３０Ｑｒｐｍお
よび３０°Ｃで２１のエルシンマイヤーフラスコ中で震
盪する。増殖の間にｐＨは、７から約４．８に下がり、
そして７に再び上がる。このあたりで細胞は凝集しはじ
める。ｐＨが再び出発点に達した時間を、胞子形成の開
始点とみなす。細胞をさらに５ないし６時間増殖させる
。リフアビジン（５０μｇ／ｍ １ ）を添加し、そし
て細胞を１０分間震盪する。氷冷した細胞を集め、４Ｍ
グアニジウムチオシアネート、０．５％ザルコシル、２
５ｍＭクエン酸ナトリウムｐ Ｈ７および０．１Ｍ２−
メルカプトエタノール１０ｍ１中に再懸濁させる。細胞
を一８０°Ｃで凍結し、そしてフレンチプレスで破壊す
る。１５０００ｒｐｍで１５分間抽出物の遠心分離（ツ
ルバール５Ｓ３４０−ター）後、０．５ｇ／ｍ１ｃｓｃ
１を上清に添加し、それを次にベックマン６０Ｔｉ遠心
分雌用チューブ中の５．７ＭＣｓＣｌ、０．ＩＭＥＤＴ
Ａクッション上に積層する。３８０００ｒｐｍで２０、
時間遠心分離後、ＲＮＡベレットをエタノールで洗浄し
、乾燥させ、７Ｍ塩酸グアニジン中に溶解し、エタノー
ルで沈澱させる。胞子形成細胞からの全ＲＮＡを脱ホス
ホリル化し、エヌ。
ａｋｉ細胞を、０．１％グルコース含有のロゴフ培地で
増殖させる（エイ、エイ、ヨーステンおよびエム、エイ
チ、ロゴフ１）。培養液５００ｍ１を、３０Ｑｒｐｍお
よび３０°Ｃで２１のエルシンマイヤーフラスコ中で震
盪する。増殖の間にｐＨは、７から約４．８に下がり、
そして７に再び上がる。このあたりで細胞は凝集しはじ
める。ｐＨが再び出発点に達した時間を、胞子形成の開
始点とみなす。細胞をさらに５ないし６時間増殖させる
。リフアビジン（５０μｇ／ｍ １ ）を添加し、そし
て細胞を１０分間震盪する。氷冷した細胞を集め、４Ｍ
グアニジウムチオシアネート、０．５％ザルコシル、２
５ｍＭクエン酸ナトリウムｐ Ｈ７および０．１Ｍ２−
メルカプトエタノール１０ｍ１中に再懸濁させる。細胞
を一８０°Ｃで凍結し、そしてフレンチプレスで破壊す
る。１５０００ｒｐｍで１５分間抽出物の遠心分離（ツ
ルバール５Ｓ３４０−ター）後、０．５ｇ／ｍ１ｃｓｃ
１を上清に添加し、それを次にベックマン６０Ｔｉ遠心
分雌用チューブ中の５．７ＭＣｓＣｌ、０．ＩＭＥＤＴ
Ａクッション上に積層する。３８０００ｒｐｍで２０、
時間遠心分離後、ＲＮＡベレットをエタノールで洗浄し
、乾燥させ、７Ｍ塩酸グアニジン中に溶解し、エタノー
ルで沈澱させる。胞子形成細胞からの全ＲＮＡを脱ホス
ホリル化し、エヌ。
マイゼルｚＩ） により記載された下記の標準法に従っ
て（”Ｐ）ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
で標識する。
て（”Ｐ）ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
で標識する。
ポリヌクレオチドキナーゼでのＲＮＡ標識：ＲＮＡ約１
／／ｇを５０ｍＭ）リス・ＨＣｌ（ｐＨ９，５）中加熱
することにより弱アルカリ加水分解に供する；培養の時
間および温度：９０°Ｃで２０分間。
／／ｇを５０ｍＭ）リス・ＨＣｌ（ｐＨ９，５）中加熱
することにより弱アルカリ加水分解に供する；培養の時
間および温度：９０°Ｃで２０分間。
この加水分解は、ポリヌクレオチドキナーゼの基質とし
て利用できる遊離の５” −ヒドロキシル基を生じる。
て利用できる遊離の５” −ヒドロキシル基を生じる。
加水分解は、４μｌの密閉毛細管中で行う。キナーゼ標
識は、５０ｍＭｌ−リス・ＨＣ１（ｐ １（９、５）、
１０ｍＭＭｇＣｌ。
識は、５０ｍＭｌ−リス・ＨＣ１（ｐ １（９、５）、
１０ｍＭＭｇＣｌ。
５ｍＭジチオトレイトール、５％グリセロールおよび６
０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの特異活性で標識された１μＭ
（Ｔ”Ｐ） −ＡＴＰを含有する反応試料１０μｌ中で
行う。各々の反応試料は、ＲＮＡ約１μｇおよびＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ２μｌを含み、そして反応は、
３７°Ｃで４５分間行う。これは、約３ ｘ １０’セ
レンコフ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ ） ｃ ｐ ｍ ／
ｐ ｇの特異活性を生ずる。ｔＲＮＡ担体５μｇの存在
下、３回のエタノール沈澱により〔γ”Ｐ）−ＡＴＰか
らＲＮＡを分離する。
０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの特異活性で標識された１μＭ
（Ｔ”Ｐ） −ＡＴＰを含有する反応試料１０μｌ中で
行う。各々の反応試料は、ＲＮＡ約１μｇおよびＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ２μｌを含み、そして反応は、
３７°Ｃで４５分間行う。これは、約３ ｘ １０’セ
レンコフ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ ） ｃ ｐ ｍ ／
ｐ ｇの特異活性を生ずる。ｔＲＮＡ担体５μｇの存在
下、３回のエタノール沈澱により〔γ”Ｐ）−ＡＴＰか
らＲＮＡを分離する。
コロニーハイブリッド形成（エム、グルンスタインおよ
びディ、ホグネス２２））は、マススタブレートからニ
トロセルロースフィルターへ細菌を移すことにより行わ
れる。フィルター上のコロニーを次に溶菌液し、遊離さ
れたＤＮＡをベーキングによりフィルターに固定する。
びディ、ホグネス２２））は、マススタブレートからニ
トロセルロースフィルターへ細菌を移すことにより行わ
れる。フィルター上のコロニーを次に溶菌液し、遊離さ
れたＤＮＡをベーキングによりフィルターに固定する。
３２Ｐ−標識プローブへのハイブリッド形成の後に、フ
ィルターをオートラジオグラフィーによりモニターする
。ＤＮＡが陽性のオートラジオグラフィーの結果を与え
るコロ；−は、次にマスク−プレートから回収し得る。
ィルターをオートラジオグラフィーによりモニターする
。ＤＮＡが陽性のオートラジオグラフィーの結果を与え
るコロ；−は、次にマスク−プレートから回収し得る。
δ−エンドトキシン遺遺伝円内ＤＮＡ断片、ｐＢＲ３２
２中のクローン化したＢａｍ、ＨＩ／Ｃ１ａｌプラスミ
ドＤＮＡライブラリィを選びだすために使用される。そ
の方法は、マニアラス等（ティー、マニアラス等ｚ３）
）に記載されている。
２中のクローン化したＢａｍ、ＨＩ／Ｃ１ａｌプラスミ
ドＤＮＡライブラリィを選びだすために使用される。そ
の方法は、マニアラス等（ティー、マニアラス等ｚ３）
）に記載されている。
フィルターは、１．６．ｂに記載されているように調製
した３ｚｐ−標識プローブにハイブリッド形成される。
した３ｚｐ−標識プローブにハイブリッド形成される。
オートラジオグラフィー像を得るために、フィルターを
サランラップで包み、そしてＸ線フィルムに貼る。
サランラップで包み、そしてＸ線フィルムに貼る。
陽性クローンをマスタープレートから分離しそして分析
する。それらは、毒素並びにＤＮＡ断片フランキング領
域をコードするＤＮＡ配列を含み、それらは免疫学的に
（上記ＩＩ１． ４参照）、制限マツピングにより（上
記ＩＩ１． ５参照）、そして生体内での生物試験にお
いて（上記１［［、７参照）見つけられた。これらクロ
ーンをここでｐＫ２５−ｉ（ｉは１ないし７）と命名す
る。
する。それらは、毒素並びにＤＮＡ断片フランキング領
域をコードするＤＮＡ配列を含み、それらは免疫学的に
（上記ＩＩ１． ４参照）、制限マツピングにより（上
記ＩＩ１． ５参照）、そして生体内での生物試験にお
いて（上記１［［、７参照）見つけられた。これらクロ
ーンをここでｐＫ２５−ｉ（ｉは１ないし７）と命名す
る。
ｂ）ＤＮＡニックトランスレーション
δ−エンドトキシン遺伝子の内部ＤＮＡ断片を下に記載
する手順により放射能標識する。
する手順により放射能標識する。
混合物：
ＤＮＡ （１μｇ）３μ！
ニックトランスレーション緩衝液
（１０倍濃縮８０．５２Ｍ１−リス、ｐＨＢ０，０５Ｍ
ＭｇＣ１ｚ ） １．５μ１２．５ｍＭｄグアノシ
ンートリホスフェート （ＧＴＰ）
１． ５ μ １２．５ｍＭｄシチジンート
リホスフェート（ＧＴＰ） １．５μ２
２．５ｍＭｄチミジンートリホスフェート（ＧＴＰ）
１．５μ２Ｈ，０２，５μ２ ＢＳＡ （１ｍｇ／ｍ１）０．７５μｆ１００ｍＭβ−
メルカプトエタノール １．５μｌ を混合し、そして乾燥〔３ｔｐ−α）−ＡＴＰ（１０ｍ
Ｃｉ／ｍｍｏ ｌ）１００ ｕＣｉに添加し、よく混合
する。
ＭｇＣ１ｚ ） １．５μ１２．５ｍＭｄグアノシ
ンートリホスフェート （ＧＴＰ）
１． ５ μ １２．５ｍＭｄシチジンート
リホスフェート（ＧＴＰ） １．５μ２
２．５ｍＭｄチミジンートリホスフェート（ＧＴＰ）
１．５μ２Ｈ，０２，５μ２ ＢＳＡ （１ｍｇ／ｍ１）０．７５μｆ１００ｍＭβ−
メルカプトエタノール １．５μｌ を混合し、そして乾燥〔３ｔｐ−α）−ＡＴＰ（１０ｍ
Ｃｉ／ｍｍｏ ｌ）１００ ｕＣｉに添加し、よく混合
する。
ニックトランスレーション緩衝液中のＤ Ｎ ａ ５ｅ
１１ｘｌＯ−’溶液を添加する。
１１ｘｌＯ−’溶液を添加する。
室温で１分間培養し、氷に移す。
ＩＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼＩ （バイオラプス；最終
容量：１５μＮ＞１μ２を添加する。
容量：１５μＮ＞１μ２を添加する。
１５°Ｃで３時間培養する。
６５°Ｃに１０分間加熱し； ５０ｍＭＥＤＴＡ３５μ
ｌおよびＲＮΔストック（１００μｇ）を添加する。
ｌおよびＲＮΔストック（１００μｇ）を添加する。
小さいセファデックスＧ−５０カラムでクロマトグラフ
ィーにより非結合ヌクレオチドを分離する。
ィーにより非結合ヌクレオチドを分離する。
ローン
ｐＵｃ８ベクターにューイングランド バイオラス）を
、制限酵素ＨｉｎｃＩＩおよびＰｓＬＩで、およびアル
カリ製ホスファターゼ処理（上記■、１参照）により完
全に消化する。δ−エンドトキシン遺伝子（第２表）を
コードするｐＫ２５−７ （上記１［１，６参照）から
のＨｐａ／Ｐｓｔｌ断片をベクターＤＮＡに連結し、そ
してＥ、ｃｏｌｉＨＢ １０１細胞に形質転換させる。
、制限酵素ＨｉｎｃＩＩおよびＰｓＬＩで、およびアル
カリ製ホスファターゼ処理（上記■、１参照）により完
全に消化する。δ−エンドトキシン遺伝子（第２表）を
コードするｐＫ２５−７ （上記１［１，６参照）から
のＨｐａ／Ｐｓｔｌ断片をベクターＤＮＡに連結し、そ
してＥ、ｃｏｌｉＨＢ １０１細胞に形質転換させる。
適切な形質転換クローンの１つをｐＫ３６と呼ぶ。
上記Ｉ［［、３に従って得られた清澄な溶閃液に硫酸ア
ンモニウムを３０％飽和の濃度まで添加する。沈澱を５
０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９゜５．２ｍｌに溶解し、
同じ緩衝液に対して透析する。対照として、Ｂ、 ｔｈ
ｕｒｔｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｄ Ｎ ＡなしのベクターＤ
ＮＡを含むＥ、ｃｏｌｉ抽出物を調製する。Ｅ、ｃｏｌ
ｉ細胞抽出物を超音波処理し、の調製した抽出物および
０．１％（Ｖ／Ｖ）水和剤中の毒素含量に従って４種の
濃度とする。生育室内で調整条件（２５°Ｃ２相対湿度
６０％）下生長させた綿植物からの葉の丸片を、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ細胞抽出物懸濁液中に浸す。適合試験で標準化し
たヘリオチス ビレッセンスの初齢の幼虫（１濃度につ
き幼虫３０匹）を、乾燥した葉の丸片上に置き、そして
各々２５°Ｃで３８間培養する。
ンモニウムを３０％飽和の濃度まで添加する。沈澱を５
０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９゜５．２ｍｌに溶解し、
同じ緩衝液に対して透析する。対照として、Ｂ、 ｔｈ
ｕｒｔｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｄ Ｎ ＡなしのベクターＤ
ＮＡを含むＥ、ｃｏｌｉ抽出物を調製する。Ｅ、ｃｏｌ
ｉ細胞抽出物を超音波処理し、の調製した抽出物および
０．１％（Ｖ／Ｖ）水和剤中の毒素含量に従って４種の
濃度とする。生育室内で調整条件（２５°Ｃ２相対湿度
６０％）下生長させた綿植物からの葉の丸片を、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ細胞抽出物懸濁液中に浸す。適合試験で標準化し
たヘリオチス ビレッセンスの初齢の幼虫（１濃度につ
き幼虫３０匹）を、乾燥した葉の丸片上に置き、そして
各々２５°Ｃで３８間培養する。
死んだ、そして生きているという基準を用いて、死生率
を％で計測した。死出を引き起こす抽出物は、クローン
化Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｄ Ｎ Ａから
生じる生物殺菌性を有する。
を％で計測した。死出を引き起こす抽出物は、クローン
化Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｄ Ｎ Ａから
生じる生物殺菌性を有する。
■一旦Ｎ八へ凰
δ−エンドトキシン遺伝子をエンコードするを決定した
。
。
クローン化δ−エンドトキシン遺伝子の制限マツピング
およびサザンブロッティング分析から、遺伝子はｐＫ３
６の２つのＤＮＡ断片：Ｈｐａ１（配列の０位）ないし
ＨｉｎｄｌＩ［（１８４７位）およびＥｃｏＲｌ（１７
３２位）ないしＰｓｔｌ （４３５５位）中に局在し
ていることがわかっている。最初の断片は、上記の連結
工程に類似の反応で、Ｍ１３ｍｐ８にューイングランド
バイオラプス）の−重Ｈｉ ｎ ｃ ［部位と一重Ｈ
ｉｎｄｌｎ部位との間にクローン化させる。
およびサザンブロッティング分析から、遺伝子はｐＫ３
６の２つのＤＮＡ断片：Ｈｐａ１（配列の０位）ないし
ＨｉｎｄｌＩ［（１８４７位）およびＥｃｏＲｌ（１７
３２位）ないしＰｓｔｌ （４３５５位）中に局在し
ていることがわかっている。最初の断片は、上記の連結
工程に類似の反応で、Ｍ１３ｍｐ８にューイングランド
バイオラプス）の−重Ｈｉ ｎ ｃ ［部位と一重Ｈ
ｉｎｄｌｎ部位との間にクローン化させる。
■、２９重 クローンの゛ン゛の 生
Ｂａ１３１法（エム、ボンク等２６））は、遺伝子の５
′端をコードするＨｐａＩ−ＨｉｎｄｍＤＮＡ断片を短
くするために用いられる。この短縮方法は、下記のとお
りである。：断片をＭ１３ｍｐ８の一重ＨｉｎｃｌＩ部
位と−ｆｉＨｉ ｎ ｄ ｍ部位との間にクローン化す
る。
′端をコードするＨｐａＩ−ＨｉｎｄｍＤＮＡ断片を短
くするために用いられる。この短縮方法は、下記のとお
りである。：断片をＭ１３ｍｐ８の一重ＨｉｎｃｌＩ部
位と−ｆｉＨｉ ｎ ｄ ｍ部位との間にクローン化す
る。
ＤＮＡの複製型１０ｍｇを制限制限エンドヌクレアーゼ
ＨｉｎｄＩＨで直線化し、そしてこれを６００ｍＭＮａ
Ｃ１，１２ｍＭＣａＣｌ２．１２ｍＭＭｇＣｌｚ 、２
０ｍＭトリス・ＨＣｌ 。
ＨｉｎｄＩＨで直線化し、そしてこれを６００ｍＭＮａ
Ｃ１，１２ｍＭＣａＣｌ２．１２ｍＭＭｇＣｌｚ 、２
０ｍＭトリス・ＨＣｌ 。
ｐＨＢおよび１ｍＭＥＤＴＡ１００ ｕｎ中のエンドヌ
クレアーゼＢａ１３１の作用に曝す。
クレアーゼＢａ１３１の作用に曝す。
混合物を３０°Ｃで５分間予備培養する。引き続ききＢ
ａ１３１ ５ユニツトを添加する。この添加後すぐに、
そして２，４，６，８．１０゜および１２分後、各々１
３μｌを採取する。採取後すぐに、別の反応を止めるた
めにフェノール２５μ！およびＴＥ緩衝液４０μｌを添
加する。混合物を遠心分離し、クロロホルムで抽出し、
つぎにエタノールで沈澱させる。このように得られたＤ
ＮＡ沈澱を１００ｍＭＮａ Ｃ１，１０ｍ Ｍ Ｍ ｇ
Ｃｌ ｚおよび２０ｍＭ）リス・ＨＣｌ中に再懸濁し
、そして最初にクローン化した断片の他の部位に見られ
る第二の酵素で消化する。この場合の第二の酵素は、Ｂ
ａｍＨＩである。アガロースゲル中で大きさを分離した
後に、短化断片をエチジウムプロミドで染色し、３６６
ｎｍの長波長紫外線下で視覚化する。短化断片を含有
するアガロースの部分をゲルから切り出し、６５°Ｃで
液化し、５００ｍＭＮａ Ｃ１に調整し、そして６５°
Ｃで２０分間培養する。
ａ１３１ ５ユニツトを添加する。この添加後すぐに、
そして２，４，６，８．１０゜および１２分後、各々１
３μｌを採取する。採取後すぐに、別の反応を止めるた
めにフェノール２５μ！およびＴＥ緩衝液４０μｌを添
加する。混合物を遠心分離し、クロロホルムで抽出し、
つぎにエタノールで沈澱させる。このように得られたＤ
ＮＡ沈澱を１００ｍＭＮａ Ｃ１，１０ｍ Ｍ Ｍ ｇ
Ｃｌ ｚおよび２０ｍＭ）リス・ＨＣｌ中に再懸濁し
、そして最初にクローン化した断片の他の部位に見られ
る第二の酵素で消化する。この場合の第二の酵素は、Ｂ
ａｍＨＩである。アガロースゲル中で大きさを分離した
後に、短化断片をエチジウムプロミドで染色し、３６６
ｎｍの長波長紫外線下で視覚化する。短化断片を含有
するアガロースの部分をゲルから切り出し、６５°Ｃで
液化し、５００ｍＭＮａ Ｃ１に調整し、そして６５°
Ｃで２０分間培養する。
フェノール１容量（１０ｍＭ）リス・ＨＣ１ｐ■イ ７
． ５． １ｍＭＥＤＴＡ、 ５００ｍＭＮａＣｌ
で平衡化）を添加する。水相をフェノールで２度および
クロロホルムで１度再抽出する。ＤＮＡを冷無水エタノ
ール２．５容量で沈澱させ、そして遠心分離によりあつ
める。ＤＮＡペレットを冷８０％エタノールで洗浄し、
そして減圧上乾燥させる。ＤＮＡをＴＥ２０μ！中に再
懸濁させる。
． ５． １ｍＭＥＤＴＡ、 ５００ｍＭＮａＣｌ
で平衡化）を添加する。水相をフェノールで２度および
クロロホルムで１度再抽出する。ＤＮＡを冷無水エタノ
ール２．５容量で沈澱させ、そして遠心分離によりあつ
める。ＤＮＡペレットを冷８０％エタノールで洗浄し、
そして減圧上乾燥させる。ＤＮＡをＴＥ２０μ！中に再
懸濁させる。
断片を引き続き各々の場所で２００ないし３００ｂｐに
短化させ、そしてその断片は、一方の側に一重ＢａｍＨ
Ｉ、もう一方にプラントエンドを有する。上記■、１に
記載したようにＢａｍＨＩとＨｉｎｃｌｌでの二重消化
の後に直線化されたＭ１３ｍｐ８ベクター内にこれら断
片をクローン化させる。
短化させ、そしてその断片は、一方の側に一重ＢａｍＨ
Ｉ、もう一方にプラントエンドを有する。上記■、１に
記載したようにＢａｍＨＩとＨｉｎｃｌｌでの二重消化
の後に直線化されたＭ１３ｍｐ８ベクター内にこれら断
片をクローン化させる。
上記の方法により、ＤＮＡ配列は、Ｈｉｎｄ■部位に始
まり、そしてＢａｍＨＩに向かって進む一本のＤＮＡ鎖
として得られる。同じＤＮＡ断片の相補的鎖の配列およ
び配列決定のために使用したエンドヌクレアーゼの制限
部位に従った戦略は、先ず第二のＤＮＡ断片、ＥｃｏＲ
１／ＰｓｔＩ断片の短小化であり、その配列をエム、ボ
ンク等２６ゝからの変法として第１図および第１表に示
す。
まり、そしてＢａｍＨＩに向かって進む一本のＤＮＡ鎖
として得られる。同じＤＮＡ断片の相補的鎖の配列およ
び配列決定のために使用したエンドヌクレアーゼの制限
部位に従った戦略は、先ず第二のＤＮＡ断片、ＥｃｏＲ
１／ＰｓｔＩ断片の短小化であり、その配列をエム、ボ
ンク等２６ゝからの変法として第１図および第１表に示
す。
第１図は、欠失変異株ライブラリィの製造工程を示すも
のである。工程：ｌ、挿入物〔（ａ）の太線部分〕が、
Ｍ２Ｓ中の付着端Ａ部位にクローン化され、；２．Ｂ部
位で線状化した後に、ファージＤＮＡを種々の時間、Ｂ
ＡＬ−３１で消化し〔（ｂ）の破線は、挿入物（太線）
とＭ１３（細線）のＢＡＬ−３１消化の範囲］、；３．
消化物は、Ａ部位で開裂され、そして挿入物のＢＡＬ−
３１誘導連続体が分離され、ＢＡＬ−３１誘導プラント
エンドおよび付着端Ａを有する異なった大きさの断片の
集まりを生じ（（Ｃ））、；４．プラントエンドが、Ｄ
ＮＡ配列決定に使用されるブライマーＰ部位に近くなる
ように、断片は、Ｍ１３内にサブクローン化される［（
ｅ）、 （ｆ）、 （ｇ）］。
のである。工程：ｌ、挿入物〔（ａ）の太線部分〕が、
Ｍ２Ｓ中の付着端Ａ部位にクローン化され、；２．Ｂ部
位で線状化した後に、ファージＤＮＡを種々の時間、Ｂ
ＡＬ−３１で消化し〔（ｂ）の破線は、挿入物（太線）
とＭ１３（細線）のＢＡＬ−３１消化の範囲］、；３．
消化物は、Ａ部位で開裂され、そして挿入物のＢＡＬ−
３１誘導連続体が分離され、ＢＡＬ−３１誘導プラント
エンドおよび付着端Ａを有する異なった大きさの断片の
集まりを生じ（（Ｃ））、；４．プラントエンドが、Ｄ
ＮＡ配列決定に使用されるブライマーＰ部位に近くなる
ように、断片は、Ｍ１３内にサブクローン化される［（
ｅ）、 （ｆ）、 （ｇ）］。
第１表
ａ）与えられた実施例による
ＩＶ、 ３． Ｅ、ｃｏｌｉＪＭｌ ０３ のニ、云
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ １０３１１１胞をＭＱｉ大培地
に保つ形質転換を下記のように行う： １、 Ｅ、ｃｏｌｊＪＭ １０３の単一コロニーを２ｘ
Ｙ′１゛中に接種し；撹拌しながら一晩保つ。
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ １０３１１１胞をＭＱｉ大培地
に保つ形質転換を下記のように行う： １、 Ｅ、ｃｏｌｊＪＭ １０３の単一コロニーを２ｘ
Ｙ′１゛中に接種し；撹拌しながら一晩保つ。
２、工程ｌで得られた培養液２００μｌで２ＸＹＴ４０
ｍｌに接種する。
ｍｌに接種する。
３．００．、。が０．５になるまで撹拌して３７°Ｃに
保つ。
保つ。
４、氷上に５分間保つ。
５．５Ｓ３４ツルバールローター（使用前に冷却）中５
分間６０００ｒｐｍで遠心分離する。
分間６０００ｒｐｍで遠心分離する。
６、細胞を５０ｍＭの無菌の氷冷ＣａＣ１ｇ２０ｍ１中
に懸濁する（ＣａＣ１□は新たに調製すべきである）。
に懸濁する（ＣａＣ１□は新たに調製すべきである）。
７、氷上で４０分間保つ。
８．５Ｓ３４ツルバ一ルローター中５分間６０ＱＱｒｐ
ｍで遠心分離する。
ｍで遠心分離する。
９、細胞を氷冷ＣａＣ１，３ｍｌ中に懸濁する。
１０、工程９により得られた細胞２００μ２にＤＮＡ１
ないし５ ／／ ｌまたはりガーゼ配合物フないし１５
μ２を添加する。
ないし５ ／／ ｌまたはりガーゼ配合物フないし１５
μ２を添加する。
１１、氷上で３０分間保つ。
１２．４２°Ｃに３分間保つ。
１３、工程１により得られた細胞２００μ２を添加する
。
。
１４、トップアガー（むｏｐ ａｇａｒ ） を沸騰さ
せる。
せる。
１５、 チューブにトップアガー３ｍｌ、Ｘ−ＧＡＬ（
２０ｍｇ／ｍｌジメチ／Ｉｚ ス／Ｌ／ ＃キシド）３
０μ！を満たす。
２０ｍｇ／ｍｌジメチ／Ｉｚ ス／Ｌ／ ＃キシド）３
０μ！を満たす。
１６、十分に混合し、そして使用前に加温した１ｘＹＴ
プレート上にすぐに移す。
プレート上にすぐに移す。
１７、約１時間、乾燥した円形の平らな平面にする。
１８、ひっくり返し、３７°Ｃで培養する。
このようにして得られたプラークは、次の処理に適して
いる。
いる。
対照：
製
１、分離した単一の白色プラークを、２ｘＹＴ９ｍｌお
よび上記ＴＶ、 ３の工程１により得られた培養液１
ｍｌ中に注意深く移し、そして３７°Ｃに７時間保つ。
よび上記ＴＶ、 ３の工程１により得られた培養液１
ｍｌ中に注意深く移し、そして３７°Ｃに７時間保つ。
２．４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
３、上清を４°Ｃに一晩保つ。
４、工程３により得られた上清１０ｍ１および上記ＴＶ
、 ３の工程１により得られた培養液１０ｍ１を２Ｘ
ＹＴ１に中に接種する。
、 ３の工程１により得られた培養液１０ｍ１を２Ｘ
ＹＴ１に中に接種する。
５．３７°Ｃで４．５時間震盪する。
６．５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。
７、細胞を５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨＢ中の１０％
シヨｔＪ！ １０ ｍ ｌ中に懸濁、そして冷却する。
シヨｔＪ！ １０ ｍ ｌ中に懸濁、そして冷却する。
８、遠心分離のために３０ｍ１のチューブに移す。
９、新たに調製したリゾチーム（ｌＯｍｇ／ｍ１．０．
２５Ｍｌ−リス−ＨＣｌ 、 ｐ ＨＢ） ２ ｍｌ
を添加する。
２５Ｍｌ−リス−ＨＣｌ 、 ｐ ＨＢ） ２ ｍｌ
を添加する。
１０．０．２５ＭＥＤＴＡ８ｍｌを添加し、注意深く混
合する。
合する。
１１、氷上で１０分間保つ。
１２．１０％ＳＤＳ４ｍｌ （または２５％５ＤＳ１
．６ｍ１）を添加し、そしてガラス棒で撹拌する。
．６ｍ１）を添加し、そしてガラス棒で撹拌する。
１３．５ＭＮａＣ１６ｍｌを添加しく最終濃度ＩＭ）、
注意深く撹拌する。
注意深く撹拌する。
１４、氷上で１時間保つ。
１５．３３３４ツルバ一ルローター中４０分間２０００
Ｏｒｐｍで遠心分離する。
Ｏｒｐｍで遠心分離する。
１６、上清を採取し、５ＭＮａＣ１の１／ｌＯ容量に相
当する量およびＴＮＥ中の３０％ＰＥＧ１５ｍ１を添加
する。
当する量およびＴＮＥ中の３０％ＰＥＧ１５ｍ１を添加
する。
１７．４°Ｃに一晩保つ。
１８．８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。
１９、ペレットを採取し、ＴＥ、ｐＨＢ，１８ｍ１に移
す。
す。
２０、ＣｓＣ１（Ｉｇ／ｍｌ）１８ｇに添加する。
２１、Ｔｉ−５０−チューブに移し、そしてエチジウム
プロミド（１０ｍｇ／ｍ１）０．４ｍｌを添加するか、
またはＴｉ−６０−チューブに移し、そしてエチジウム
プロミド（１０ｍｇ／ｍ１）０．４ｍｌを添加する。
プロミド（１０ｍｇ／ｍ１）０．４ｍｌを添加するか、
またはＴｉ−６０−チューブに移し、そしてエチジウム
プロミド（１０ｍｇ／ｍ１）０．４ｍｌを添加する。
２２、Ｃ８Ｃ１溶液（ＣｓＣ１１ｇ＋ＴＥ１ｍｌ）を満
たす。
たす。
２３．２０°ＣＣ１３５００ｒｐで３６ないし４８時間
遠心分離する。
遠心分離する。
２４、紫外線（３６６ｎｍ）の下で下層側のバンドを採
取する。
取する。
２５、水飽和させたブタノールで３ないし４回抽出する
。
。
２６、無菌ＴＥ各々１２に対して４°Ｃで３回透析する
。
。
ＩＶ、 ５．− ｔ’ｉｒ ｌＤＮＡの君、−１１
，２ｘＹＴ培地５ｍｌ中のＥ、ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ １０
３細胞を３７°Ｃで一晩震盪する。
，２ｘＹＴ培地５ｍｌ中のＥ、ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ １０
３細胞を３７°Ｃで一晩震盪する。
２、工程１により得られた細胞懸濁液２滴を２ｘＹＴ培
地２５ｍ１に添加する。
地２５ｍ１に添加する。
３、工程２により得られた培養液２ｍｌをチューブに満
たし、そしてＩＶ、 ３により得られたようなチュー
ブ毎に１プラークを添加する。
たし、そしてＩＶ、 ３により得られたようなチュー
ブ毎に１プラークを添加する。
４．３７°Ｃで５．５時間震盪する。
５、エッペンドルフチューブにチューブの内容物を移し
、そして５分間遠心分離する。
、そして５分間遠心分離する。
６、上清１ｍｌを新しいエッペンドルフチューブに移す
。
。
７．２０％ＰＥＧ６０００／２．５ＭＮａＣｌ２００μ
２を添加する。
２を添加する。
８、室温で１５分間保つ。
９．５分間遠心分離する。
１０、上清を捨て、そして再び少し遠心分離する。
１１、引き伸ばしたパスツールピペットで吸引により上
清を注意深く取り出す。
清を注意深く取り出す。
１２、残っている方に対して、ＴＥ１００μ２およびフ
ェノール５０μｌを添加する。
ェノール５０μｌを添加する。
１３．１０秒間混合する（ポルテックスにより）５分間
放置し；ｌＯ秒間混合する（ボルナ・ンクスにより）；
１・分間遠心分離する。
放置し；ｌＯ秒間混合する（ボルナ・ンクスにより）；
１・分間遠心分離する。
１４、水相を新しいエッペンドルフチューブに移す。
１５．エチレンエーテル５００μ２を添加し、混合しく
ポルテックスにより）、そして１分間遠心分離する。
ポルテックスにより）、そして１分間遠心分離する。
１６、吸引によりエーテルを取り出し、チューブを閉じ
て１０分間保つ（この処理後、水相が不透明である場合
には溶液が清澄になるまで、パスツールピペットで空気
を通す）。
て１０分間保つ（この処理後、水相が不透明である場合
には溶液が清澄になるまで、パスツールピペットで空気
を通す）。
１７．３Ｍ酢酸ナトリウム１０μ！およびエタノール２
５０μｌを添加する。
５０μｌを添加する。
ｉｓ、−ｓｏｏＣに３０分間保つ。
１９．５分間遠心分離する。
２０．８０％エタノールで洗浄する。
２１．５分間遠心分離する。
２２、引き伸ばしたパスツールピペットで上ｍを取り出
す。
す。
２３、チューブを閉じて１５分間保つ。
２４、ベレットをＴＥ２５μ！中に溶解する。
２５、ベレット溶液２μｌを０． ６％アガロースゲル
に移す。
に移す。
■、６．配γ１１１− 応
上記のＩＶ、 ５により得られた鋳型ＤＮＡのＤＮＡ
配列分析は、ニューイングランド バイオラスにより刊
行されているマニュアル°゛Ｍ１３クローニングおよび
ＤＮＡ配列決定システム（Ｍｌ３ Ｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙ
ｓｔｅｍ ）に従って行った。
配列分析は、ニューイングランド バイオラスにより刊
行されているマニュアル°゛Ｍ１３クローニングおよび
ＤＮＡ配列決定システム（Ｍｌ３ Ｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙ
ｓｔｅｍ ）に従って行った。
全ＤＮＡ配列の分析は、分子量１３０６２２のタンパク
質のためのおよび１１５５個のアミノ酸をコードするた
めに十分に長い１個だけの読み枠が見つかったことを示
す。タンパク質のＮ−末端はＨｐａ１部位から１５６ｂ
ｐ下流にあり、Ｃ−末端のアミノ酸は、ヌクレオチド３
６１８ではじまるコドンによりコードされている。Ｈｐ
ａＩ部位とＰｓｔＩ部位との間のＤＮＡ配列は、第２表
に示し、誘導されるアミノ酸配列は第３表に示す。
質のためのおよび１１５５個のアミノ酸をコードするた
めに十分に長い１個だけの読み枠が見つかったことを示
す。タンパク質のＮ−末端はＨｐａ１部位から１５６ｂ
ｐ下流にあり、Ｃ−末端のアミノ酸は、ヌクレオチド３
６１８ではじまるコドンによりコードされている。Ｈｐ
ａＩ部位とＰｓｔＩ部位との間のＤＮＡ配列は、第２表
に示し、誘導されるアミノ酸配列は第３表に示す。
拉！し先入
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素遺伝子の配列を
コードするタンパク質と酵母ＰＨ０５プロモーター（欧
州特許第１００，５６１号明細書に記［）を結合するた
めに、毒素遺伝子の周囲のＤＮＡ配列を修飾する。修飾
は、毒素遺伝子の５°部分をコードする１、’５ Ｋｂ
ＢａｍＨＩ −３’ａ ｃ Ｉ挿入を含む一本鎖ファー
ジベクターＭ１３ｍｐ１Ｂでのオリゴヌクレオチド−直
接突然変異体により行う。挿入物２００１ｇは、プラス
ミドＤＮＡ３μｇをＢａｍＨＩと５ａｃＩで消化し、そ
して断片を上記の慣用の方法で分離することにより、プ
ラスミドｐＫ３６から得られる。Ｍ１３ｍｐ １８の複
製型（ＲＦ）１００ｎｇを同じ酵素で消化し、ＤＮＡを
フェノール化し、そしてエタノール添加により沈澱させ
、次に上記で得た挿入ＤＮＡ２００ｎｇと連結させる。
コードするタンパク質と酵母ＰＨ０５プロモーター（欧
州特許第１００，５６１号明細書に記［）を結合するた
めに、毒素遺伝子の周囲のＤＮＡ配列を修飾する。修飾
は、毒素遺伝子の５°部分をコードする１、’５ Ｋｂ
ＢａｍＨＩ −３’ａ ｃ Ｉ挿入を含む一本鎖ファー
ジベクターＭ１３ｍｐ１Ｂでのオリゴヌクレオチド−直
接突然変異体により行う。挿入物２００１ｇは、プラス
ミドＤＮＡ３μｇをＢａｍＨＩと５ａｃＩで消化し、そ
して断片を上記の慣用の方法で分離することにより、プ
ラスミドｐＫ３６から得られる。Ｍ１３ｍｐ １８の複
製型（ＲＦ）１００ｎｇを同じ酵素で消化し、ＤＮＡを
フェノール化し、そしてエタノール添加により沈澱させ
、次に上記で得た挿入ＤＮＡ２００ｎｇと連結させる。
Ｅ、 ｃ。
１１のトランスフェクション後、６個の白色プラークを
取り出し、ＢａｍＨ１（！ｌ：Ｓａ ｃ Ｉを使用して
制限消化により分析する。１個の適切な分離物を取り出
し、そしてＭ１３ｍＰ１８／Ｂａｍ−３ａｃと呼ぶ。
取り出し、ＢａｍＨ１（！ｌ：Ｓａ ｃ Ｉを使用して
制限消化により分析する。１個の適切な分離物を取り出
し、そしてＭ１３ｍＰ１８／Ｂａｍ−３ａｃと呼ぶ。
アプライド バイオシステム ＤＮＡ シンセサイザ
ー （ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭ ＤＮＡ
５ＹＮＴＩＩＥＳＩＺＥＲ）を使用して慣用の方法で、
配列（５’）ＧＡＧＧＴＡＡＣＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣ
（３°）を有するオリゴヌクレオチドを合成する。この
オリゴヌクレオチドは、プロトキシン遺伝子の１４１位
から１６４位のＭｌ ３ｍｐ １ Ｂ／Ｂａｍ−３ａｃ
の配列（第２表）に相補的であり、１５４．１５５位に
不適合を有する。突然変異の一般的な方法は、ジェイ、
エム、ソーラーおよびエム、スミス２７） に記載さ
れている。−末鎖ファージＭｌ ３ｍｐ １８／Ｂａｍ
−３ａ ｃＤＮＡおよそ５μｇを４０μ２の容量中のホ
スホリル化オリゴヌクレオチド０．３μｇとともに混合
する。混合物を６５゛Ｃまで５分間加熱し、５０゛ｃま
で冷却し、そしてゆっくりと４°Ｃまで冷やす。
ー （ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭ ＤＮＡ
５ＹＮＴＩＩＥＳＩＺＥＲ）を使用して慣用の方法で、
配列（５’）ＧＡＧＧＴＡＡＣＣＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣ
（３°）を有するオリゴヌクレオチドを合成する。この
オリゴヌクレオチドは、プロトキシン遺伝子の１４１位
から１６４位のＭｌ ３ｍｐ １ Ｂ／Ｂａｍ−３ａｃ
の配列（第２表）に相補的であり、１５４．１５５位に
不適合を有する。突然変異の一般的な方法は、ジェイ、
エム、ソーラーおよびエム、スミス２７） に記載さ
れている。−末鎖ファージＭｌ ３ｍｐ １８／Ｂａｍ
−３ａ ｃＤＮＡおよそ５μｇを４０μ２の容量中のホ
スホリル化オリゴヌクレオチド０．３μｇとともに混合
する。混合物を６５゛Ｃまで５分間加熱し、５０゛ｃま
で冷却し、そしてゆっくりと４°Ｃまで冷やす。
次に緩衝液、ヌクレオチドトリホスフェート、ＡＴＰ、
Ｔ４ ＤＮＡ、リガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの大
きな断片を添加し、ジ０、イ、エム、ソーラーおよびエ
ム、スミス２７） に記載されているように１５゛Ｃで
一晩培養する。アガロースゲル電気泳動後、環状二本鎖
ＤＮＡを精製し、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ １０３株にト
ランスフェクションする。できたプラークから、３ｚＰ
−標識オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する配列
を選びだし、ファージをＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ
により分析する。できたファージの中に、ｐＫ３６ＤＮ
Ａ中のＴの代わりに１５４と１５５位にＣを正しく有す
るクローンがある。このファージをＭｌ ３ｍｐ １８
／Ｂａｍ−３ａ ｃ／ＮＣＯと呼ぶ。
Ｔ４ ＤＮＡ、リガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼの大
きな断片を添加し、ジ０、イ、エム、ソーラーおよびエ
ム、スミス２７） に記載されているように１５゛Ｃで
一晩培養する。アガロースゲル電気泳動後、環状二本鎖
ＤＮＡを精製し、Ｅ、ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ １０３株にト
ランスフェクションする。できたプラークから、３ｚＰ
−標識オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する配列
を選びだし、ファージをＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ
により分析する。できたファージの中に、ｐＫ３６ＤＮ
Ａ中のＴの代わりに１５４と１５５位にＣを正しく有す
るクローンがある。このファージをＭｌ ３ｍｐ １８
／Ｂａｍ−３ａ ｃ／ＮＣＯと呼ぶ。
上記の慣用のクローニング法を使用して、ｐＫ３６の野
性型ＢａｍＨｌ−３ａ ｃ Ｉ断片を融合１．５Ｋｂ断
片に１き換えることにより、Ｍ１３ｍｐ１８／Ｂａｍ−
３ａｃ／Ｎｃｏの１゜５ＫｂＢａｍＨｌ−３ａ ｃ Ｉ
挿入は、プラスミドｐＫ３６にクローンバックされる。
性型ＢａｍＨｌ−３ａ ｃ Ｉ断片を融合１．５Ｋｂ断
片に１き換えることにより、Ｍ１３ｍｐ１８／Ｂａｍ−
３ａｃ／Ｎｃｏの１゜５ＫｂＢａｍＨｌ−３ａ ｃ Ｉ
挿入は、プラスミドｐＫ３６にクローンバックされる。
これは、プロトキシン遺伝子・・ＧＡＧＧＴＡＡＣ／Ｃ
ＣＡＴＧＣ；／ＡＴＡＡＣのＡＴＧの上流にＮｃｏ１部
位を有する。プラスミドｐＫ３６／ＮＣＯを生じる。こ
のベクター５μｇをＮｃｏＩで消化し、そして３゛の中
断した端部にマニアチス等２Ｂ〉 により記載されたタ
レノウポリメラーゼを加える。次にプラスミドをＡｈａ
［ＩＩで消化し、ＤＮＡを０．８％低融点アガロースゲ
ルで分離し、上記のように溶出する。プラスミドＰ３１
）７２８ｇ（欧州特許第１００，５６１号明細書に記ｓ
５りをＥｃｏＲＩで消化し、３′の中断した端部に上記
のタレノウポリメラーゼを加える。
ＣＡＴＧＣ；／ＡＴＡＡＣのＡＴＧの上流にＮｃｏ１部
位を有する。プラスミドｐＫ３６／ＮＣＯを生じる。こ
のベクター５μｇをＮｃｏＩで消化し、そして３゛の中
断した端部にマニアチス等２Ｂ〉 により記載されたタ
レノウポリメラーゼを加える。次にプラスミドをＡｈａ
［ＩＩで消化し、ＤＮＡを０．８％低融点アガロースゲ
ルで分離し、上記のように溶出する。プラスミドＰ３１
）７２８ｇ（欧州特許第１００，５６１号明細書に記ｓ
５りをＥｃｏＲＩで消化し、３′の中断した端部に上記
のタレノウポリメラーゼを加える。
プラントエンド３．６Ｋｂプロトキシン遺伝子壬子とプ
ラントエンドベクター３１ｙとの連結は、マニアチス等
２９ン により記載されたように室温で２０μ２中の各
々のＤＮＡ２００ｎｇを培養することにより行う。Ｅ、
ｃｏｌｉＨＢ １０１のアンシピリン抵抗性への形質転
換の後に、個々のクローンを制限分析することにより１
つの適切な分離体を取り出し、ｐ３Ｌｙ／Ｂ、ｔ、と呼
ぶ。
ラントエンドベクター３１ｙとの連結は、マニアチス等
２９ン により記載されたように室温で２０μ２中の各
々のＤＮＡ２００ｎｇを培養することにより行う。Ｅ、
ｃｏｌｉＨＢ １０１のアンシピリン抵抗性への形質転
換の後に、個々のクローンを制限分析することにより１
つの適切な分離体を取り出し、ｐ３Ｌｙ／Ｂ、ｔ、と呼
ぶ。
このプラスミドＤＮＡＩｕｇをＢａｍＨＩで消化し、４
Ｋｂ断片を柔らかいアガロースゲルから分離する。この
断片は、前もってＢａｍＨｌ （０，５μｇ）で消化
し、自己複製酵母ベクターｐＪＤＢ２０７に連結する（
欧州特許第１００．５６１号明細書に記載）、陽性クロ
ーンを、Ｅ。
Ｋｂ断片を柔らかいアガロースゲルから分離する。この
断片は、前もってＢａｍＨｌ （０，５μｇ）で消化
し、自己複製酵母ベクターｐＪＤＢ２０７に連結する（
欧州特許第１００．５６１号明細書に記載）、陽性クロ
ーンを、Ｅ。
ｃｏｌｔ形質転換体およびプラスミド調製物から分離す
る。適切な分離物は、ＢａｍＨＩを使用して制限分析に
より確認される。
る。適切な分離物は、ＢａｍＨＩを使用して制限分析に
より確認される。
酵母ＧＲＦ１Ｂ株（ＭＡＴα、１ｅｕ２−３．Ｉｅｕ２
−１１２゜ｈｉｓ３−１１．ｈｉｓ３−１５．ｃａｎ
”、 ）の形質転換を欧州特許第１００，５６１号明細
書に記載されているように行う。
−１１２゜ｈｉｓ３−１１．ｈｉｓ３−１５．ｃａｎ
”、 ）の形質転換を欧州特許第１００，５６１号明細
書に記載されているように行う。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ遺伝子を含む全体の
細胞は、ＭＧＥＩ生成物のバイオエンカプセル体（生物
学的材料からなり、そして保護材料により囲まれた遺伝
材料からなる人工的に構成された系）であり、これを植
物に施用した場合には、胞子形成しているＢ、 ｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓにより生産された結晶よりも、損
傷される影響例えば光による分解からよりよく保護され
、そして細胞を壊すことにより培地に達する。
細胞は、ＭＧＥＩ生成物のバイオエンカプセル体（生物
学的材料からなり、そして保護材料により囲まれた遺伝
材料からなる人工的に構成された系）であり、これを植
物に施用した場合には、胞子形成しているＢ、 ｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓにより生産された結晶よりも、損
傷される影響例えば光による分解からよりよく保護され
、そして細胞を壊すことにより培地に達する。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を含む酵母細胞
と、Ｂ。
と、Ｂ。
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素を含まない酵母細胞を
相当する光学密度まで蒸留水に懸濁する。このようにし
て得た懸濁液を、ある濃度に調製し、そして０．２％（
Ｖ／Ｖ）水和剤を混合する。上記Ｉ［、７と同様に葉の
九片試験をこれらの酵母細胞調製物の殺菌性を評価する
ために用いた。Ｂ。
相当する光学密度まで蒸留水に懸濁する。このようにし
て得た懸濁液を、ある濃度に調製し、そして０．２％（
Ｖ／Ｖ）水和剤を混合する。上記Ｉ［、７と同様に葉の
九片試験をこれらの酵母細胞調製物の殺菌性を評価する
ために用いた。Ｂ。
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ形質転換酵母細胞のへりオ
チスビレッセンスでの初動の幼虫での殺虫性を下表に示
す。
チスビレッセンスでの初動の幼虫での殺虫性を下表に示
す。
第４表
酵母細胞全体の代わりに欧州特許第１００，５６１号明
細書に記載されているように製造した酵母抽出物を使用
して、同じ生物試験で試験した場合、同様の結果が得ら
れている。
細書に記載されているように製造した酵母抽出物を使用
して、同じ生物試験で試験した場合、同様の結果が得ら
れている。
殺虫剤として施用するために、Ｂ、 Ｌｈｕｒｉｎｇｉ
ｅｎｓｉｓの毒素遺伝子を含む形質転換した微生物、好
ましくは生きているまたは死んだ酵母細胞混合物を含む
形質転換した生きているまたは死んだ酵母細胞が未変性
の形態で、またみ好ましくは製剤業界で慣用の補助剤と
共に使用され、公知の方法で、例えば乳剤原液、被覆で
きるペースト、直接噴霧可能なまたは希釈可能な溶液、
希釈乳剤、水和剤、粉剤および例えばポリマー物質によ
るカプセル化剤に製剤化される。組成物の性質と同様に
、施用の方法例えば噴霧、アトマイジイング、ダスティ
ング、撒水、被覆または注水は、目的とする対象および
使用環境に依存して選ばれる。
ｅｎｓｉｓの毒素遺伝子を含む形質転換した微生物、好
ましくは生きているまたは死んだ酵母細胞混合物を含む
形質転換した生きているまたは死んだ酵母細胞が未変性
の形態で、またみ好ましくは製剤業界で慣用の補助剤と
共に使用され、公知の方法で、例えば乳剤原液、被覆で
きるペースト、直接噴霧可能なまたは希釈可能な溶液、
希釈乳剤、水和剤、粉剤および例えばポリマー物質によ
るカプセル化剤に製剤化される。組成物の性質と同様に
、施用の方法例えば噴霧、アトマイジイング、ダスティ
ング、撒水、被覆または注水は、目的とする対象および
使用環境に依存して選ばれる。
製剤、部ち形質転換した、生きているまたは死んだ酵母
細胞またはその混合物、および適当な場合には固体また
は液体の補助剤を含む組成物または調合剤は、公知の方
法により、例えば酵母細胞を増量剤、例えば固体担体お
よび適当な場合には表面活性化合物（界面活性剤）と均
一に混合することにより製造される。
細胞またはその混合物、および適当な場合には固体また
は液体の補助剤を含む組成物または調合剤は、公知の方
法により、例えば酵母細胞を増量剤、例えば固体担体お
よび適当な場合には表面活性化合物（界面活性剤）と均
一に混合することにより製造される。
例えば粉剤および分散性粉末に使用される固体担体は通
常天然鉱物充填剤例えば方解石、タルク、カオリン、モ
ンモリロナイトまたはアタパルジャイトである。物性を
改良するために、高分散珪酸または高分散吸収性ポリマ
ーを加えることも可能である。適当な粒状化吸収性担体
は多孔性型のもので、例えば軽石、破砕レンガ、セビオ
ライトまたはベントナイトであり；そして適当な非吸収
性担体は例えば方解石または砂のような物質である。更
に非常に多くの予備粒状化した無機質および有機質の物
質、例えば特にドロマイトまたは粉状化植物残骸、を使
用し得る。
常天然鉱物充填剤例えば方解石、タルク、カオリン、モ
ンモリロナイトまたはアタパルジャイトである。物性を
改良するために、高分散珪酸または高分散吸収性ポリマ
ーを加えることも可能である。適当な粒状化吸収性担体
は多孔性型のもので、例えば軽石、破砕レンガ、セビオ
ライトまたはベントナイトであり；そして適当な非吸収
性担体は例えば方解石または砂のような物質である。更
に非常に多くの予備粒状化した無機質および有機質の物
質、例えば特にドロマイトまたは粉状化植物残骸、を使
用し得る。
適当な表面活性化合物は良好な乳化性および湿潤性を有
する非イオン性、カチオン性および／またはアニオン性
界面活性剤である。
する非イオン性、カチオン性および／またはアニオン性
界面活性剤である。
°“界面活性剤°゛の用語は界面活性剤の混合物をも含
むものと理解されたい。
むものと理解されたい。
適当なアニオン性界面活性剤は、水溶性石鹸および水溶
性合成表面活性化合物の両者であり得る。
性合成表面活性化合物の両者であり得る。
適当な石鹸は高級脂肪酸（Ｃ，、〜Ｃ２□）のアルカリ
金属塩、アルカリ土類金属塩、または非置換または置換
のアンモニウム塩、例えばオレイン酸またはステアリン
酸、あるいは例えばココナツツ油または獣脂から得られ
る天然脂肪酸混合物のナトリウムまたはカリウム塩であ
る。脂肪酸メチルタウリン塩もまた用い得る、例えばシ
ス−２−（メチル−９−オクタデセニルアミノ）−エタ
ンスルホン酸のナトリウム塩（製剤中の量、好ましくは
約３％）もまた用い得る。
金属塩、アルカリ土類金属塩、または非置換または置換
のアンモニウム塩、例えばオレイン酸またはステアリン
酸、あるいは例えばココナツツ油または獣脂から得られ
る天然脂肪酸混合物のナトリウムまたはカリウム塩であ
る。脂肪酸メチルタウリン塩もまた用い得る、例えばシ
ス−２−（メチル−９−オクタデセニルアミノ）−エタ
ンスルホン酸のナトリウム塩（製剤中の量、好ましくは
約３％）もまた用い得る。
しかしながら、いわゆる合成界面活性剤、特に脂肪族ス
ルホネート、脂肪族サルフェート、スルホン化ベンズイ
ミダゾール誘導体、アルキルアリールスルホネートまた
は脂肪族アルコール、例えば２，４．７．９−テトラメ
チル−５−デシン−４，７−ジオール（製剤中の量、好
ましくは約２％）が更に頻繁に使用される。
ルホネート、脂肪族サルフェート、スルホン化ベンズイ
ミダゾール誘導体、アルキルアリールスルホネートまた
は脂肪族アルコール、例えば２，４．７．９−テトラメ
チル−５−デシン−４，７−ジオール（製剤中の量、好
ましくは約２％）が更に頻繁に使用される。
脂肪スルホネートまたはサルフェートは通常アルカリ金
属塩、アルカリ土類金属塩または非置換または置換のア
ンモニウム塩の形態にあり、そしてアシル基のアルキル
部分をも含む炭素原子数８ないし２２のアルキル基を含
み、例えばりグツスルホン酸、ドデシルサルフェートま
たは天然脂肪酸から得られる脂肪族アルコールサルフェ
ートの混合物のナトリウムまたはカルシウム塩である。
属塩、アルカリ土類金属塩または非置換または置換のア
ンモニウム塩の形態にあり、そしてアシル基のアルキル
部分をも含む炭素原子数８ないし２２のアルキル基を含
み、例えばりグツスルホン酸、ドデシルサルフェートま
たは天然脂肪酸から得られる脂肪族アルコールサルフェ
ートの混合物のナトリウムまたはカルシウム塩である。
これらの化合物には硫酸エステルの塩および脂肪族アル
コール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸の塩も含
まれる。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、好ま
しくは二つのスルホン酸基と８ないし２２個の炭素原子
を含む一つの脂肪族基とを含む。アルキルアリールスル
ホネートの例は、ドデシルベンゼンスルホン酸、ジブチ
ルナフタレンスルホン酸、またはナフタレンスルホン酸
およびホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カル
シウムまたはトリエタノールアミン塩である。さらに対
応するホスフェート、例えばｐ−ノニルフェノール−（
４ないし１４）−エチレンオキシド付加物の燐酸エステ
ルの塩もまた適当である。
コール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸の塩も含
まれる。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、好ま
しくは二つのスルホン酸基と８ないし２２個の炭素原子
を含む一つの脂肪族基とを含む。アルキルアリールスル
ホネートの例は、ドデシルベンゼンスルホン酸、ジブチ
ルナフタレンスルホン酸、またはナフタレンスルホン酸
およびホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カル
シウムまたはトリエタノールアミン塩である。さらに対
応するホスフェート、例えばｐ−ノニルフェノール−（
４ないし１４）−エチレンオキシド付加物の燐酸エステ
ルの塩もまた適当である。
非イオン性界面活性剤は、好ましくは脂肪族または脂環
式アルコール、または飽和または不飽和脂肪酸およびア
ルキルフェノールのポリグリコールエーテル誘導体であ
り、該誘導体は３ないし３０個のグリコールエーテル基
および（脂肪族）炭化水素部分に８ないし２０個の炭素
原子、そしてアルキルフェノールのアルキル部分に６な
いし１８個の炭素原子を含む。
式アルコール、または飽和または不飽和脂肪酸およびア
ルキルフェノールのポリグリコールエーテル誘導体であ
り、該誘導体は３ないし３０個のグリコールエーテル基
および（脂肪族）炭化水素部分に８ないし２０個の炭素
原子、そしてアルキルフェノールのアルキル部分に６な
いし１８個の炭素原子を含む。
他の適当な非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオキ
シドとポリプロピレングリコール、エチレンジアミンプ
ロピレングリコールおよびアルキル鎖中に１ないし１０
個の炭素原子を含むアルキルポリプロピレングリコール
との水溶性付加物であり、その付加物は２０ないし２５
０個のエチレングリコールエーテル基および１０ないし
１００個のプロピレングリコールエーテル基を含む。こ
れらの化合物は通常プロピレングリコール単位当たりｌ
ないし５個のエチレングリコール単位を含む。
シドとポリプロピレングリコール、エチレンジアミンプ
ロピレングリコールおよびアルキル鎖中に１ないし１０
個の炭素原子を含むアルキルポリプロピレングリコール
との水溶性付加物であり、その付加物は２０ないし２５
０個のエチレングリコールエーテル基および１０ないし
１００個のプロピレングリコールエーテル基を含む。こ
れらの化合物は通常プロピレングリコール単位当たりｌ
ないし５個のエチレングリコール単位を含む。
非イオン性界面活性剤の代表例は、ノニルフェノール−
ポリエトキシエタノール、ヒマシ油ポリグリコールエー
テル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物、
トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエ
チレングリコールおよびオクチルフェノキシエトキシエ
タノールである。ポリオキシエチレンソルビタントリオ
レー１−の脂肪酸エステル例えばポリオキシエチレンソ
ルビタントリオレートもまた適当な非イオン性界面活性
剤である。
ポリエトキシエタノール、ヒマシ油ポリグリコールエー
テル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物、
トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエ
チレングリコールおよびオクチルフェノキシエトキシエ
タノールである。ポリオキシエチレンソルビタントリオ
レー１−の脂肪酸エステル例えばポリオキシエチレンソ
ルビタントリオレートもまた適当な非イオン性界面活性
剤である。
カチオン性界面活性剤は、好ましくはＮ−置換基として
少なくとも一つの炭素原子数８ないし２２のアルキル基
と、他の置換基として低級非置換またはハロゲン化アル
キル基、ベンジル基または低級ヒドロキシアルキル基と
を含む第四アンモニウム塩である。液塩は好ましくはハ
ロゲン化物、メチル硫酸塩またはエチル硫酸塩の形態に
あり、例えばステアリルトリメチルアンモニウムクロリ
ドまたはベンジルジー（２−クロロエチル）エチルアン
モニウムプロミドである。
少なくとも一つの炭素原子数８ないし２２のアルキル基
と、他の置換基として低級非置換またはハロゲン化アル
キル基、ベンジル基または低級ヒドロキシアルキル基と
を含む第四アンモニウム塩である。液塩は好ましくはハ
ロゲン化物、メチル硫酸塩またはエチル硫酸塩の形態に
あり、例えばステアリルトリメチルアンモニウムクロリ
ドまたはベンジルジー（２−クロロエチル）エチルアン
モニウムプロミドである。
製剤業界で慣用の界面活性剤は例えば下記の刊行物に記
載されている二“マクカッチャンズ デタージエンツ
アンド エマルジファイアーズ アニュアル（Ｍｃ Ｃ
ｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ
Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ Ａｎｎｕａｌ）” マ・ンク
出版社、リッジウッド、ニューシャーシー州、１９８０
年；ヘルムート シュツｙ ヘ（ｔｌｅｌｍｕｔ ５ｔ
ａｃｈｅ） ＋ ”テンジッドータッシエンブーフ （
Ｔｅｎｓｉｄ−Ｔａｓｈｅｎｂｕｃｈ）″。
載されている二“マクカッチャンズ デタージエンツ
アンド エマルジファイアーズ アニュアル（Ｍｃ Ｃ
ｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ
Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ Ａｎｎｕａｌ）” マ・ンク
出版社、リッジウッド、ニューシャーシー州、１９８０
年；ヘルムート シュツｙ ヘ（ｔｌｅｌｍｕｔ ５ｔ
ａｃｈｅ） ＋ ”テンジッドータッシエンブーフ （
Ｔｅｎｓｉｄ−Ｔａｓｈｅｎｂｕｃｈ）″。
カール ハンザ−フェルラーク（Ｃ，ｌｌａｎｓｅｒＶ
ｅｒｌａｇ） ＋ミュンヘンおよびウィーン、１９８１
年。
ｅｒｌａｇ） ＋ミュンヘンおよびウィーン、１９８１
年。
農薬組成物は、通常形質転換した生きているまたは死ん
だ酵母細胞またはその混合物０゜１％ないし９９％、好
ましくは０．１％ないし９５％、固体または液体補助剤
９９．９％ないし１％、好ましくは９９．８％ないし５
％、および界面活性剤０％ないし２５％、好ましくは０
． １％ないし２５％を含む。
だ酵母細胞またはその混合物０゜１％ないし９９％、好
ましくは０．１％ないし９５％、固体または液体補助剤
９９．９％ないし１％、好ましくは９９．８％ないし５
％、および界面活性剤０％ないし２５％、好ましくは０
． １％ないし２５％を含む。
市販品は好ましくは濃厚物として製剤化されるが、消費
者は通常実質的に低濃度の希釈製剤を使用する。
者は通常実質的に低濃度の希釈製剤を使用する。
この組成物はまた他の添加剤、例えば安定剤、消泡剤、
粘度調節剤、結合剤、粘着付与剤並びに肥料または特別
な効果を得るために他の有効成分を含有してもよい。
粘度調節剤、結合剤、粘着付与剤並びに肥料または特別
な効果を得るために他の有効成分を含有してもよい。
組み換えたＢ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの毒素遺
伝子を含む形質転換した生きているまたは死んだ酵母細
胞またはその混合物は、有害な昆虫を防除するために特
に適当である。特に言及すべきは、鱗翅目の植物損傷性
昆虫、特にビニリス（Ｐｉｅｒｉｓ ） 、ヘリオチス
（ｆｌｅｆｉｏｔｈｉｓ）、スボドブテラ（５ｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ ）、およびプルテラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ
）１ｍのもの、例えばビニリス ブラッシカエ（Ｐｉｅ
ｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ ）、へりオチス ビレッ
センス（１ｌｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ
） 、へりオチス ゼア（）ｌｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅ
ａ）、スボドブテラ リットラリス（５ｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ ｌ１ｔｔｏｒａｒｉｓ ） 、プルテラ キシロ
ステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ ’
）である。
伝子を含む形質転換した生きているまたは死んだ酵母細
胞またはその混合物は、有害な昆虫を防除するために特
に適当である。特に言及すべきは、鱗翅目の植物損傷性
昆虫、特にビニリス（Ｐｉｅｒｉｓ ） 、ヘリオチス
（ｆｌｅｆｉｏｔｈｉｓ）、スボドブテラ（５ｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ ）、およびプルテラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ
）１ｍのもの、例えばビニリス ブラッシカエ（Ｐｉｅ
ｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ ）、へりオチス ビレッ
センス（１ｌｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ
） 、へりオチス ゼア（）ｌｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅ
ａ）、スボドブテラ リットラリス（５ｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ ｌ１ｔｔｏｒａｒｉｓ ） 、プルテラ キシロ
ステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ ’
）である。
酵母細胞が使用される施用率は、各りの条件、天候条件
、土壌の性質および施用の時期に依存する。温室で処理
した試験に基づいて、１ヘクタールあたり酵母細胞りな
いし１０ｋｇ、特に３ないし９ｋｇの施用率がを利であ
ることが評価された。
、土壌の性質および施用の時期に依存する。温室で処理
した試験に基づいて、１ヘクタールあたり酵母細胞りな
いし１０ｋｇ、特に３ないし９ｋｇの施用率がを利であ
ることが評価された。
）！ｉｉを４ するＢ、ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
、３、の−′１下記の製造実施例において”°酵母細
胞°゛は組み換えたＢ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
毒素遺伝子を含有する酵母細胞を意味する。（全体を通
じ％は重量による） 旦−土一拉剋 ａ） ｂ） 酵母細胞 ５％ １０％カオリン
９４％ − 高分散珪酸 １％ − アタパルジャイト −９０％ 酵母細胞を塩化メチレンに溶解し、この溶液を担体に噴
霧し、続いて溶媒を減圧留去する。
、３、の−′１下記の製造実施例において”°酵母細
胞°゛は組み換えたＢ、 ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
毒素遺伝子を含有する酵母細胞を意味する。（全体を通
じ％は重量による） 旦−土一拉剋 ａ） ｂ） 酵母細胞 ５％ １０％カオリン
９４％ − 高分散珪酸 １％ − アタパルジャイト −９０％ 酵母細胞を塩化メチレンに溶解し、この溶液を担体に噴
霧し、続いて溶媒を減圧留去する。
ヱー」−」ボ赳
ａ） ｂ）
酵母細胞 ２％ ５％高分散珪酸
１％ ５％タルク ９７％
− カオリン ９０％酵母細胞を担体
とともに混合し、適当なミル中でこの混合物を摩砕する
ことにより、そのまま使用することのできる粉末を得る
。
１％ ５％タルク ９７％
− カオリン ９０％酵母細胞を担体
とともに混合し、適当なミル中でこの混合物を摩砕する
ことにより、そのまま使用することのできる粉末を得る
。
ヱー」−Ｊ（１赳
ａ） ｂ） ｃ）
酵母細胞 ２０％ ５０％ ７５％リグ
ノスルホン酸 す１−リウム ５％ ５％ −ラウ
リルスルホン酸 ナトリウム ３％ −５％ジイソブチ
ルナフタレン スルホン酸ナトリウム ６％ １０％オ
クチルフェノールポリ エチレングリコールニー チル（エチレンオキシド ７−８モル） ２％ −１高
分散珪酸 ５％ １０％ １０％カオリ
ン ６２％ ２７％ −酵母細胞を補
助剤とともに十分に混合した後に、該混合物を適当なミ
ルでよく摩砕する。水で希釈して所望の濃度の懸濁液を
得ることのできる水和剤が得られる。
ノスルホン酸 す１−リウム ５％ ５％ −ラウ
リルスルホン酸 ナトリウム ３％ −５％ジイソブチ
ルナフタレン スルホン酸ナトリウム ６％ １０％オ
クチルフェノールポリ エチレングリコールニー チル（エチレンオキシド ７−８モル） ２％ −１高
分散珪酸 ５％ １０％ １０％カオリ
ン ６２％ ２７％ −酵母細胞を補
助剤とともに十分に混合した後に、該混合物を適当なミ
ルでよく摩砕する。水で希釈して所望の濃度の懸濁液を
得ることのできる水和剤が得られる。
Ｌ−生一皿徂拉Ｍ
酵母細胞 １０％リグノ
スルホン酸ナトリウム ２％カルボキシメ
チルセルロース １％カオリン
８７％酵母細胞を補助剤とともに
混合および十分に摩砕し、続いてこの混合物を水で湿ら
す。この混合物を押出し、空気流中で乾燥させる。
スルホン酸ナトリウム ２％カルボキシメ
チルセルロース １％カオリン
８７％酵母細胞を補助剤とともに
混合および十分に摩砕し、続いてこの混合物を水で湿ら
す。この混合物を押出し、空気流中で乾燥させる。
旦−１−被Ｉ豆Ｍ
酵母細胞 ３％ゼリエチレ
ングリコール２００ ３％カオリン
９４％細かく粉砕した酵母細胞または配
合物を、ミキサー中でポリエチレングリコールで湿らせ
たカオリンに均一に適用する。この方法により非粉塵性
破覆粒剤が得られる。
ングリコール２００ ３％カオリン
９４％細かく粉砕した酵母細胞または配
合物を、ミキサー中でポリエチレングリコールで湿らせ
たカオリンに均一に適用する。この方法により非粉塵性
破覆粒剤が得られる。
■一旦−■盃皿原撤
酵母細胞 ４０％エチレング
リコール １０％ノニルフェノールポ
リエチレングリ コール（エチレンオキシド１５モル） ６％アルキル
ベンゼンスルホン酸トリエ タノールアミン塩＊ ３％カルボ
キシメチルセルロース １％７５％水性エマ
水性エマルジョン− シリコーンオイル ０．１％水
３９％
＊アルキル基は好ましくは線状で１０ないし１４個好ま
しくは１２ないし１４個の炭素原子を含み、例工ばｎ−
ドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン塩で
ある。
リコール １０％ノニルフェノールポ
リエチレングリ コール（エチレンオキシド１５モル） ６％アルキル
ベンゼンスルホン酸トリエ タノールアミン塩＊ ３％カルボ
キシメチルセルロース １％７５％水性エマ
水性エマルジョン− シリコーンオイル ０．１％水
３９％
＊アルキル基は好ましくは線状で１０ないし１４個好ま
しくは１２ないし１４個の炭素原子を含み、例工ばｎ−
ドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン塩で
ある。
細かく粉砕した酵母細胞を補助剤とともに均一に混合し
、水で希釈して所望の濃度の懸？Ｗｉ液を得ることので
きる懸濁性濃厚物が得られる。
、水で希釈して所望の濃度の懸？Ｗｉ液を得ることので
きる懸濁性濃厚物が得られる。
本発明において使用される下記の微生物の各々の培養は
、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタ
ベスト条約の要求に従って、西ドイツ国ゲッチンゲンに
ある国際寄託機関°”微生物の西ドイツコレクション（
口ｅｕｔｓｃｈｅ ＳａｍｌＩＩｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍ
ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ） （Ｄ Ｓ Ｍ ）
に寄託し、そして生存確認が前記国際寄託機関によって
なされた： ＊上記の国際寄託機関により与えられた受託番号前記微
生物の入手に関する制限は、寄託者により要求されてい
なかった。
、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタ
ベスト条約の要求に従って、西ドイツ国ゲッチンゲンに
ある国際寄託機関°”微生物の西ドイツコレクション（
口ｅｕｔｓｃｈｅ ＳａｍｌＩＩｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍ
ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ） （Ｄ Ｓ Ｍ ）
に寄託し、そして生存確認が前記国際寄託機関によって
なされた： ＊上記の国際寄託機関により与えられた受託番号前記微
生物の入手に関する制限は、寄託者により要求されてい
なかった。
皇３プｊ對巳ｉ表
１）ニス、チャング、トレンズ イン バイオテクノロ
ジー（Ｓ、Ｃｈａｎｇ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ）第１巻（４）、第１００真（１
９８３年）２）エイチ、シー、ウォング、エイチ、イー
、シュネフおよびエイチ、アール、ホワイトレー、ザジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｉｌ、
Ｃ，Ｗｏｎｇ、）１．Ｅ、５ｃｈｎｅｐｆ ａｎｄ Ｉ
Ｉ、Ｒ，Ｗｈｉｔｅｌｅｙ。
ジー（Ｓ、Ｃｈａｎｇ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ）第１巻（４）、第１００真（１
９８３年）２）エイチ、シー、ウォング、エイチ、イー
、シュネフおよびエイチ、アール、ホワイトレー、ザジ
ャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ（Ｉｌ、
Ｃ，Ｗｏｎｇ、）１．Ｅ、５ｃｈｎｅｐｆ ａｎｄ Ｉ
Ｉ、Ｒ，Ｗｈｉｔｅｌｅｙ。
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第２５８巻（３）、第１９
６０頁（１９８３年）３）エム、ジエイ、アダング、エ
ム、ジエイ、ステイハー、ティー、ニー、ロチェチュ、
ジエイ、レイトン、アール、エフ、バーカーおよびディ
、ブイ、トンプソン、ジーン （Ｍ、Ｊ、Ａｄａｎｇ、
Ｍ、Ｊ、５ｔａｖｅｒ、Ｔ、八、Ｒｏｃｈｅｔｅａｕ、
Ｊ、Ｌｅｉｇｈｔｏｎ、Ｒ，Ｆ、Ｂａｒｋｅｒ ａｎ
ｄ Ｄ。
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第２５８巻（３）、第１９
６０頁（１９８３年）３）エム、ジエイ、アダング、エ
ム、ジエイ、ステイハー、ティー、ニー、ロチェチュ、
ジエイ、レイトン、アール、エフ、バーカーおよびディ
、ブイ、トンプソン、ジーン （Ｍ、Ｊ、Ａｄａｎｇ、
Ｍ、Ｊ、５ｔａｖｅｒ、Ｔ、八、Ｒｏｃｈｅｔｅａｕ、
Ｊ、Ｌｅｉｇｈｔｏｎ、Ｒ，Ｆ、Ｂａｒｋｅｒ ａｎ
ｄ Ｄ。
Ｖ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｇｅｎｅ ）第３６巻、第２
８９頁（１９８５年） ４）エイチ、イー、シュネフ、エイチ、シー、ウォング
およびエイチ、アール、ホワイトレー、ザジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（）１．Ｅ、５ｃ
ｈｎｅｐｆ、Ｈ，Ｃ，Ｗｏｎｇ ａｎｄ １１．Ｒ，Ｗ
ｈｉｔｅｌｅｙ。
８９頁（１９８５年） ４）エイチ、イー、シュネフ、エイチ、シー、ウォング
およびエイチ、アール、ホワイトレー、ザジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（）１．Ｅ、５ｃ
ｈｎｅｐｆ、Ｈ，Ｃ，Ｗｏｎｇ ａｎｄ １１．Ｒ，Ｗ
ｈｉｔｅｌｅｙ。
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第２６０巻（１０）、第６
２６４頁（１９８５年）５）ニー、ニー、ヨーステンお
よびエム、エイチ。
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第２６０巻（１０）、第６
２６４頁（１９８５年）５）ニー、ニー、ヨーステンお
よびエム、エイチ。
ロゴフ、ジャーナル オブ バクテリオロジー（Ａ、＾
、Ｙｏｕｓｔｃｎ ａｎｄ Ｍ、１１．Ｒｏ（Ｈｏｆｆ
、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｊｏｌｏｇｙ
）第１００巻、第１２２９頁（１９６９年）６）ティー
、マニアチス、イー、エフ、フリンジュおよびジエイ、
サム、プルツク、モレキュラークローニングニア ラボ
ラトリ−マニュアル。
、Ｙｏｕｓｔｃｎ ａｎｄ Ｍ、１１．Ｒｏ（Ｈｏｆｆ
、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｊｏｌｏｇｙ
）第１００巻、第１２２９頁（１９６９年）６）ティー
、マニアチス、イー、エフ、フリンジュおよびジエイ、
サム、プルツク、モレキュラークローニングニア ラボ
ラトリ−マニュアル。
コールド スプリング ハーバ−研究所、コールド ス
プリング ハーバ−１米国、アペンデックスＣ：コモン
リー ニースト バクチリアル ストレインズ（Ｔ、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ
、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ。
プリング ハーバ−１米国、アペンデックスＣ：コモン
リー ニースト バクチリアル ストレインズ（Ｔ、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ
、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ！Ｉａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉｎ６１！ａｒｂｏｒ、
ＵＳＡ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｃ：Ｃｏｍｍｏｎｌｙ
ｕｓｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｓ ）
第５０４ 、５０６頁（１９８２年）７）エフ、エフ、
ホワイトおよびイー、ダブリュ。
ａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ ５ｐｒｉｎ６１！ａｒｂｏｒ、
ＵＳＡ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｃ：Ｃｏｍｍｏｎｌｙ
ｕｓｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌｓｔｒａｉｎｓ ）
第５０４ 、５０６頁（１９８２年）７）エフ、エフ、
ホワイトおよびイー、ダブリュ。
ネスター、ジャーナル オプ バクテリオロジー（Ｆ、
Ｆ、Ｗｈｉｔｅ ａｎｄ Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５ｔｅｒ、
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）第１４１巻（３）、第１１３４頁（１９８０年３月
）８）ピー、トリュムピ、ツエントラルブラット エフ
、バクテリオロギー アプト、 ｎ （Ｂ、Ｔｒｉ
ｉｍｐｉ。
Ｆ、Ｗｈｉｔｅ ａｎｄ Ｅ、Ｗ、Ｎｅ５ｔｅｒ、
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）第１４１巻（３）、第１１３４頁（１９８０年３月
）８）ピー、トリュムピ、ツエントラルブラット エフ
、バクテリオロギー アプト、 ｎ （Ｂ、Ｔｒｉ
ｉｍｐｉ。
Ｚｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔ ｆ、 Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｉｅ Ａｂｔ、 ＩＩ）第３０５頁（１９７６年） ９）エフ、ピー、デラフィールド、エイチ、ジエイ。
ｏｇｉｅ Ａｂｔ、 ＩＩ）第３０５頁（１９７６年） ９）エフ、ピー、デラフィールド、エイチ、ジエイ。
ソマービイレおよびニス、シー、リッテンベルグ。
ジャーナル オブ パクテリオロジー（Ｆ、Ｐ、Ｄｅｌ
ａｆｉｅｌｄ、１１．Ｊ、Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｃ ａ
ｎｄ Ｓ、Ｃ，ＲｉｔＬｅｎｂｅｒｇ、 Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ（Ｈｙ ）第９６巻
、第７１３頁（１９６８年） １０）ジー、ジー、チェツキナ、アイ、ニー、ザルニン
、エル、アイ、コスチナ、ティー、ニス、コトバ、ニス
、ピー、力トルッカ、エル、ニー、リュプリンスカヤお
よびブイ、エム、ステバッフ。
ａｆｉｅｌｄ、１１．Ｊ、Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｃ ａ
ｎｄ Ｓ、Ｃ，ＲｉｔＬｅｎｂｅｒｇ、 Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ（Ｈｙ ）第９６巻
、第７１３頁（１９６８年） １０）ジー、ジー、チェツキナ、アイ、ニー、ザルニン
、エル、アイ、コスチナ、ティー、ニス、コトバ、ニス
、ピー、力トルッカ、エル、ニー、リュプリンスカヤお
よびブイ、エム、ステバッフ。
プロクリニーヤ（Ｇ、Ｇ、Ｃｈｅｓｔｕｋｈｔｎａ、１
．Δ、Ｚａｌｕｎｉｎ。
．Δ、Ｚａｌｕｎｉｎ。
Ｌ、１．Ｋｏｓｔｉｎａ、Ｔ、Ｓ、Ｋｏｔｏｂａ、Ｓ、
Ｐ、Ｋａｔｒｕｋｈａ、Ｌ、八、Ｌｙｕｂｌｉｎｓｋａ
ｊａ ａｎｄ Ｖ、Ｍ、５ｔｅｐａｎｏｖ、Ｂｒｏｋｌ
ｉｎｉｙａ ）第４３巻。
Ｐ、Ｋａｔｒｕｋｈａ、Ｌ、八、Ｌｙｕｂｌｉｎｓｋａ
ｊａ ａｎｄ Ｖ、Ｍ、５ｔｅｐａｎｏｖ、Ｂｒｏｋｌ
ｉｎｉｙａ ）第４３巻。
第８５７頁（１９７８年）
１１）オー、オクテルロニー、ハンドブック オブイム
ノデフィージジン アンド イムノエレクトロホレシス
、アン アーバー サイエンス社刊。
ノデフィージジン アンド イムノエレクトロホレシス
、アン アーバー サイエンス社刊。
アン アーバー、ミシガン州、米国（０，０ｕｃｈｔｅ
ｒｌｏｎｙ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｄ
ｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｅｌｃｃｔｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ＋Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ ５ｃｉｅｎｃ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ＋Δｎｎ Ａｒｂｏｒ
、Ｍｉｃｈ、、ＵＳＡ ）（１９６８年）１２）エイ
チ、ヒューバーールカック 博士論文スイス国立技術研
究所チューリッヒ、スイス国（Ｈ。
ｒｌｏｎｙ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｄ
ｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｅｌｃｃｔｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ＋Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ ５ｃｉｅｎｃ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ＋Δｎｎ Ａｒｂｏｒ
、Ｍｉｃｈ、、ＵＳＡ ）（１９６８年）１２）エイ
チ、ヒューバーールカック 博士論文スイス国立技術研
究所チューリッヒ、スイス国（Ｈ。
１１ｕｂｅｒ−Ｌｕｋａｃ、ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ ５
ｗ１ｓｓ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｚｕｒｉｃｈ 、５ｗ１ｔｚ
ｅｒｌａｎｄ ）第７０５０号（１９８２年） １３）アメルシャム ブフラー レビュー、１１８号（
１９７９年）（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｌ１ｕｃｈｌｅｒ
Ｇｍｂｌｌ＆Ｃｏ、ＫＧ ） ＋ブラウンシュベイク、
西ドイツ国 １４）ティー、マニアチス、イー、エフ、フリンシュお
よびジエイ、サム、プルツク、モレキュラークローニン
グニア ラボラトリ−マニュアル。
ｗ１ｓｓ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｚｕｒｉｃｈ 、５ｗ１ｔｚ
ｅｒｌａｎｄ ）第７０５０号（１９８２年） １３）アメルシャム ブフラー レビュー、１１８号（
１９７９年）（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｌ１ｕｃｈｌｅｒ
Ｇｍｂｌｌ＆Ｃｏ、ＫＧ ） ＋ブラウンシュベイク、
西ドイツ国 １４）ティー、マニアチス、イー、エフ、フリンシュお
よびジエイ、サム、プルツク、モレキュラークローニン
グニア ラボラトリ−マニュアル。
コールド スプリング ハーバ−研究所、コールド ス
プリング ハーバ−５米国、 （Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ
。
プリング ハーバ−５米国、 （Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ
。
Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：八 しａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ ５ｐｒ
ｉｎ（Ｈｌ１ａｒｂｏｒ １．ａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＩｌａｒｂａｒ、ＩＪＳＡ ）
第２８２頁（１９８２年） １５）ティー、マニアチス、イー、エフ、フリッシュお
よびジエイ、サム、プルツク、モレキュラークローニン
グニア ラボラトリ−マニュアル。
ｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：八 しａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ ５ｐｒ
ｉｎ（Ｈｌ１ａｒｂｏｒ １．ａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＩｌａｒｂａｒ、ＩＪＳＡ ）
第２８２頁（１９８２年） １５）ティー、マニアチス、イー、エフ、フリッシュお
よびジエイ、サム、プルツク、モレキュラークローニン
グニア ラボラトリ−マニュアル。
コールド スプリング ハーバ Ｈ突所、コールド ス
プリング ハーバ−１米国、 （Ｔ０Ｍａｎｉａｔｉｓ
＋Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ、ＵＳＡ
＞ 第 ２５２頁（１９８２年） １６）エイチ、イー、シュネフおよびエイチ、アール、
ホワイトレー、プロシーディング ナチュラル アカデ
ミ−ソサイアティー（１，Ｅ、５ｃｈｎｅｐｆａｎｄ
１１．Ｒ，Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）第７８巻、第２８９３頁（１９８
１年） １７）エル、クラーク、アール、ヒツツエマンおよびジ
エイ、カーボン、メソッド イン エンザイモロジー（
Ｌ、Ｃ１ａｒｋｅ、Ｒ，Ｈｉｔｚｅｍａｎ ａｎｄ Ｊ
、Ｃａｒｂｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ ）第６８巻、第４３６ 頁（１９７９年） １８）イー、エム、サザン、ジャーナル オブ モレキ
ュラー バイオロジー（Ｅ８Ｍ、５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ
、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、 ）第９８巻、第５０３頁（
１９７５年）１９）ティー、マニアチス、イー、エフ、
フリッシュおよびジエイ、サム、プルツク、モレキュラ
ークローニングニア ラボラトリ−マニュアル。
プリング ハーバ−１米国、 （Ｔ０Ｍａｎｉａｔｉｓ
＋Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ、ＵＳＡ
＞ 第 ２５２頁（１９８２年） １６）エイチ、イー、シュネフおよびエイチ、アール、
ホワイトレー、プロシーディング ナチュラル アカデ
ミ−ソサイアティー（１，Ｅ、５ｃｈｎｅｐｆａｎｄ
１１．Ｒ，Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）第７８巻、第２８９３頁（１９８
１年） １７）エル、クラーク、アール、ヒツツエマンおよびジ
エイ、カーボン、メソッド イン エンザイモロジー（
Ｌ、Ｃ１ａｒｋｅ、Ｒ，Ｈｉｔｚｅｍａｎ ａｎｄ Ｊ
、Ｃａｒｂｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ ）第６８巻、第４３６ 頁（１９７９年） １８）イー、エム、サザン、ジャーナル オブ モレキ
ュラー バイオロジー（Ｅ８Ｍ、５ｏｕｔｈｅｒｎ、Ｊ
、Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、 ）第９８巻、第５０３頁（
１９７５年）１９）ティー、マニアチス、イー、エフ、
フリッシュおよびジエイ、サム、プルツク、モレキュラ
ークローニングニア ラボラトリ−マニュアル。
コールド スプリング ハーバ−研究所１ コールド
スプリング ハーバ−１米国、 （ＴｏＭａｎｉａｔｉ
ｓ。
スプリング ハーバ−１米国、 （ＴｏＭａｎｉａｔｉ
ｓ。
Ｅ、Ｐ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ＋Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ｔｌａｒｂｏｒ、ＵＳＡ）第３８３頁（
１９８２年） ２０）ティー、マニアチス、イー、エフ、フリツシュお
よびジェイ、サム、プルツク、モレキュラークローニン
グニア ラボラトリ−マニュアル。
ｋ＋Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ｔｌａｒｂｏｒ、ＵＳＡ）第３８３頁（
１９８２年） ２０）ティー、マニアチス、イー、エフ、フリツシュお
よびジェイ、サム、プルツク、モレキュラークローニン
グニア ラボラトリ−マニュアル。
コールド スプリング ハーバ−研究所＋ コールド
スプリング ハーバ−９米国＋ （Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ。
スプリング ハーバ−９米国＋ （Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ。
Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ、ＵＳＡ ）第３８７
頁（１９８２年） ２１） エフ、 ？イゼルズ、セル（Ｎ、Ｍａｉｚｅｌ
ｓ、Ｃｅ１ｌ）第９巻、第４３１頁（１９７６年） ２２）エム、グルンスタインおよびディ、ホグネス。
ｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ ｌ１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ、ＵＳＡ ）第３８７
頁（１９８２年） ２１） エフ、 ？イゼルズ、セル（Ｎ、Ｍａｉｚｅｌ
ｓ、Ｃｅ１ｌ）第９巻、第４３１頁（１９７６年） ２２）エム、グルンスタインおよびディ、ホグネス。
ピイーエフエーエス（Ｍ、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ
Ｄ、１Ｉｏ６ｎｅｓｓ 、ＰＡＮＳ ）第７２巻、第
３９６頁（１９７５年）２３）ティー、マニアチス、イ
ー６エフ、フリッシュおよびジエイ、サム、プルツク、
モレキュラークローニングニア ラボラトリ−マニュア
ル。
Ｄ、１Ｉｏ６ｎｅｓｓ 、ＰＡＮＳ ）第７２巻、第
３９６頁（１９７５年）２３）ティー、マニアチス、イ
ー６エフ、フリッシュおよびジエイ、サム、プルツク、
モレキュラークローニングニア ラボラトリ−マニュア
ル。
コールド スプリング ハーバ−研究所、コールド ス
プリング ハーバ−１米国、 （Ｔ０Ｍａｎｉａｔｉｓ
＋Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｈｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ、ＵＳＡ）第３１
８頁（１９８２年） ２４）エフ、サンガー、ニス、ニックルンおよびニー、
アール、コールソン、プロシーディング ナチュラル
アカデミ−ソサイアティー（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ、Ｎ
１ｃｋｌｅｎ ａｎｄ Ａ、Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ 、Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）第７４巻、
第５４６３頁（１９７７年）２５）ジェイ、メッシング
、メソッド オブ エンザイモロジー（Ｊ、Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
第１０１巻、第２０頁（１９８３年）２６）エム、ポン
ク、ディ、ソロビークチク、エム。
プリング ハーバ−１米国、 （Ｔ０Ｍａｎｉａｔｉｓ
＋Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｈｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏｒ、ＵＳＡ）第３１
８頁（１９８２年） ２４）エフ、サンガー、ニス、ニックルンおよびニー、
アール、コールソン、プロシーディング ナチュラル
アカデミ−ソサイアティー（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ、Ｎ
１ｃｋｌｅｎ ａｎｄ Ａ、Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ 、Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）第７４巻、
第５４６３頁（１９７７年）２５）ジェイ、メッシング
、メソッド オブ エンザイモロジー（Ｊ、Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
第１０１巻、第２０頁（１９８３年）２６）エム、ポン
ク、ディ、ソロビークチク、エム。
バランチン、イー、シュワルツおよびニス、スレー、プ
ロシーディング ナチュラル アカデミーソサイアティ
ー（Ｍ、Ｐｏｎｃｚ、Ｄ、Ｓｏｌｏｗｉｅｃｚｙｋ、Ｍ
、Ｂａ１ｌａｎｔｉｎｅ、Ｅ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａ
ｎｄ Ｓ、５ｕｒｒｅｙ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
ロシーディング ナチュラル アカデミーソサイアティ
ー（Ｍ、Ｐｏｎｃｚ、Ｄ、Ｓｏｌｏｗｉｅｃｚｙｋ、Ｍ
、Ｂａ１ｌａｎｔｉｎｅ、Ｅ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａ
ｎｄ Ｓ、５ｕｒｒｅｙ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）第７９巻、第４２９８頁（１９
８２年）２７）エム、ジェイ、シーラーおよびエム、ス
ミス。
８２年）２７）エム、ジェイ、シーラーおよびエム、ス
ミス。
ヌクレイツクアシッド リサーチ（Ｍ、Ｊ’、Ｚｏｌｌ
ｅｒ ａｎｄ Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ＋Ｎｕｃ１．Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、）第１０巻、第６４８７頁（１９８２年） ２８）ティー、マニアチス、イー、エフ、フリッシュお
よびジエイ、サム、プルツク、モレキュラークローニン
グニア ラボラトリ−マニュアル。
ｅｒ ａｎｄ Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ＋Ｎｕｃ１．Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、）第１０巻、第６４８７頁（１９８２年） ２８）ティー、マニアチス、イー、エフ、フリッシュお
よびジエイ、サム、プルツク、モレキュラークローニン
グニア ラボラトリ−マニュアル。
コールド スプリング ハーバ−Ｈ突所、コールド ス
プリング バー バー 、米国＋（Ｔ、ｔ’１ａｎｉａ
ｔｉｓ。
プリング バー バー 、米国＋（Ｔ、ｔ’１ａｎｉａ
ｔｉｓ。
Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ
５ｐｒｉｎ（Ｈ１ｌａｒｂｏｒ、ＵＳＡ ）第３９４
頁（１９８２年） ２９）ティー、マニアチス、イー、エフ、フリンシュお
よびジェイ、サム、プルツク、モレキュラークローニン
グニア ラボラトリ−マニュアル。
ｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ １ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ
５ｐｒｉｎ（Ｈ１ｌａｒｂｏｒ、ＵＳＡ ）第３９４
頁（１９８２年） ２９）ティー、マニアチス、イー、エフ、フリンシュお
よびジェイ、サム、プルツク、モレキュラークローニン
グニア ラボラトリ−マニュアル。
コールド スプリング ハーバ−研究所＋ コールド
スプリング ハーバ−１米国＋（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ
。
スプリング ハーバ−１米国＋（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ
。
Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｈｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ、ＵＳＡ ）
第 ３９２頁（１９８２年） ３０）ワイ、シパノ、ニー、ヤマガタ、エフ、ナカムラ
、ティー、イイヅカ、エイチ、スギサキおよびエム、タ
カナミ、ジーン（Ｙ、５ｉｂａｎｏ、Ａ、Ｙａｍａｇａ
ｔａ、Ｎ、Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｔ、ｌ１ｚｕｋａ＋Ｉ１
．Ｓｕｇｉｓａｋｉ ａｎｄ Ｍ、Ｔａｋａｎａｍｉ、
Ｇｅｎｅ ）第３４巻、第２４３ 頁（１９８５年）３
１）エイ・ クリーブ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｃ
ｓ、ａ ｈａｎｄｂｏ。
ｋ、Ｍｏ１ｅｋｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｈｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒ、ＵＳＡ ）
第 ３９２頁（１９８２年） ３０）ワイ、シパノ、ニー、ヤマガタ、エフ、ナカムラ
、ティー、イイヅカ、エイチ、スギサキおよびエム、タ
カナミ、ジーン（Ｙ、５ｉｂａｎｏ、Ａ、Ｙａｍａｇａ
ｔａ、Ｎ、Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｔ、ｌ１ｚｕｋａ＋Ｉ１
．Ｓｕｇｉｓａｋｉ ａｎｄ Ｍ、Ｔａｋａｎａｍｉ、
Ｇｅｎｅ ）第３４巻、第２４３ 頁（１９８５年）３
１）エイ・ クリーブ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｃ
ｓ、ａ ｈａｎｄｂｏ。
ｋ ｏｆ ｈａｂｉｔａｔｓ＋１ｓｏｌａｔｉｏｎ
ａｎｄ １ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ 。
ａｎｄ １ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ 。
ｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ （Ｅｄｓ、５ｔａｒｒ、Ｐ、
Ｍ、、５ｔｏｌｐ、Ｈ，、Ｔｒｕｅｐｅｒ。
Ｍ、、５ｔｏｌｐ、Ｈ，、Ｔｒｕｅｐｅｒ。
Ｇ、Ｉｌ、、Ｂａ１ｏｉｖｓ、Ａ、ａｎｄ Ｓｃｈｌｅ
ｇｅｌ、Ｈ，Ｇ、） ＋ スプリンガー 社用（Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ） ユ１−ヨーク。
ｇｅｌ、Ｈ，Ｇ、） ＋ スプリンガー 社用（Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ） ユ１−ヨーク。
ハイデルベルグ、ベルリン、 第１７４３ｉ（１９８１
年）
年）
第１図は、本発明の実施例に示すクローン化の工程の説
明図である。 図中、 Ｘ、Ｃ・・プラント端 Ａ ・・・付着端
明図である。 図中、 Ｘ、Ｃ・・プラント端 Ａ ・・・付着端
Claims (54)
- （１）下記のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有することを特徴とするＤＮＡ断片。
- （２）殺虫性のタンパク質物質をコードするバチルス
スリンギエンシスの変種クルスタキから得られるＨｐａ
I （０）からＰｓｔ I （４３５５）のＤＮＡ断片およ
び殺虫性を失わないという条件で該ＤＮＡ断片の先端を
切断されたＤＮＡ断片。 - （３）殺虫性タンパク質ＭＧＥ１をコードする特許請求
の範囲第１項記載のＤＮＡ断片および殺虫性を失わない
という条件で該ＤＮＡ断片の先端を切断された特許請求
の範囲第１項記載のＤＮＡ断片。 - （４）下記のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片により少なくとも一部エンコードさ
れたタンパク質物質。 - （５）殺虫性のタンパク質物質をコードするバチルス
スリンギエンシスの変種クルスタキから得られるＨｐａ
I （０）からＰｓｔ I （４３５５）のＤＮＡ断片また
は殺虫性を失わないという条件で該ＤＮＡ断片の先端を
切断されたＤＮＡ断片により少なくとも一部エンコード
されたタンパク質物質。 - （６）下記のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有するタンパク質断片を含有するタンパク質物質。
- （７）下記のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片によりエンコードされたタンパク質
ＭＧＥ１。 - （８）殺虫性のタンパク質物質をコードするバチルス
スリンギエンシスの変種クルスタキから得られるＨｐａ
I （０）からＰｓｔ I （４３５５）のＤＮＡ断片また
は殺虫性を失わないという条件で該ＤＮＡ断片の先端を
切断されたＤＮＡ断片によりエンコードされたタンパク
質ＭＧＥ１。 - （９）下記のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 を有することを特徴とするタンパク質ＭＧＥ１。
- （１０）下記のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片によりエンコードされたタンパク質
ＭＧＥ１およびタンパク質ＭＧＥ１とはことなる別のタ
ンパク質からなる融合タンパク質。 - （１１）タンパク質ＭＧＥ１とはことなる別のタンパク
質が有害生物防除性を有するタンパク質である特許請求
の範囲第１０項記載の融合タンパク質。 - （１２）タンパク質ＭＧＥ１とはことなる別のタンパク
質が殺虫性を有するタンパク質である特許請求の範囲第
１１項記載の融合タンパク質。 - （１３）殺虫性のタンパク質物質をコードするバチルス
スリンギエンシスの変種クルスタキから得られるＨｐ
ａ I （０）からＰｓｔ I （４３５５）のＤＮＡ断片ま
たは殺虫性を失わないという条件で該ＤＮＡ断片の先端
を切断されたＤＮＡ断片によりエンコードされたタンパ
ク質ＭＧＥ１およびタンパク質ＭＧＥ１とはことなる別
のタンパク質からなる融合タンパク質。 - （１４）タンパク質ＭＧＥ１とはことなる別のタンパク
質が有害生物防除性を有するタンパク質である特許請求
の範囲第１３項記載の融合タンパク質。 - （１５）タンパク質ＭＧＥ１とはことなる別のタンパク
質が殺虫性を有するタンパク質である特許請求の範囲第
１４項記載の融合タンパク質。 - （１６）下記のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片を含有するＤＮＡベクター。
- （１７）プラスミドである特許請求の範囲第１６項記載
のベクター。 - （１８）ファージである特許請求の範囲第１６項記載の
ベクター。 - （１９）殺虫性のタンパク質物質をコードするバチルス
スリンギエンシスの変種クルスタキから得られるＨｐ
ａ I （０）からＰｓｔ I （４３５５）のＤＮＡ断片ま
たは殺虫性を失わないという条件で該ＤＮＡ断片の先端
を切断されたＤＮＡ断片を含有するＤＮＡベクター。 - （２０）プラスミドである特許請求の範囲第１９項記載
のベクター。 - （２１）ファージである特許請求の範囲第１９項記載の
ベクター。 - （２２）下記のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片を含有する微生物であり、ただし該
微生物がバチルス スリンギエンシスの群に属する場合
には、該バチルスは前記ＤＮＡ断片で形質転換された微
生物。 - （２３）該微生物がサッカロマイセス セレビシアエ種
に属する特許請求の範囲第２２項記載の微生物。 - （２４）殺虫性のタンパク質物質をコードするバチルス
スリンギエンシスの変種クルスタキから得られるＨｐ
ａ I （０）からＰｓｔ I （４３５５）のＤＮＡ断片ま
たは殺虫性を失わないという条件で該ＤＮＡ断片の先端
を切断されたＤＮＡ断片を含有する微生物であり、ただ
し該微生物がバチルス スリンギエンシスの群に属する
場合には、該バチルスは前記ＤＮＡ断片で形質転換され
た微生物。 - （２５）該微生物がサッカロマイセス セレビシアエ種
に属する特許請求の範囲第２４項記載の微生物。 - （２６）生物学的起源の二次物質に完全に取り囲まれた
一次物質からなるバイオエンカプセル系であって、該一
次物質は、下記ヌクレオチド配列：【遺伝子配列があり
ます】 を有するＤＮＡ断片により発現されたものであり、そし
て該二次物質は微生物全体により発現されたものである
が、ただし該微生物がバチルス スリンギエンシスに属
する場合には、該バチルスは前記のＤＮＡ断片で形質転
換されたものである該バイオエンカプセル系。 - （２７）該微生物がサッカロマイセス セレビシアエ種
に属する特許請求の範囲第２６項記載のバイオエンカプ
セル系 - （２８）生物学的起原の二次物質に完全に取り囲まれた
一次物質からなるバイオエンカプセル系であって、該一
次物質は、殺虫性のタンパク質物質をコードするバチル
ス スリンギエンシスの変種クルスタキから得られるＨ
ｐａ I （０）からＰｓｔ I （４３５５）のＤＮＡ断片
または殺虫性を失わないという条件で該ＤＮＡ断片の先
端を切断されたＤＮＡ断片により発現されたものであり
、そして該二次物質は微生物全体により発現されたもの
であるが、ただし該微生物がバチルススリンギエンシス
に属する場合には、該バチルスは前記のＤＮＡ断片で形
質転換されたものである該バイオエンカプセル系。 - （２９）該微生物がサッカロマイセス セレビシアエ種
に属する特許請求の範囲第２８項記載のバイオエンカプ
セル系。 - （３０）下記の工程： ａ）バチルス スリンギエンシスの変種クルスタキ Ｈ
Ｄ１の細胞を分離および溶菌し、そして公知の方法によ
りこのように得られた成分からプラスミドを分離し、こ
のように得られたプラスミド成分を精製、透析し、； ｂ）バチルス スリンギエンシスの変種クルスタキ Ｈ
Ｄ１プラスミドＤＮＡのＤＮＡライブラリィを調製し； ｃ）ｂ）工程により得られた断片化プラスミドＤＮＡを
適当なベクターにクローニングし；ｄ）抗原／抗体試験
に適用することによりタンパク質ＭＧＥ１の存在をスク
リーニングする、ことからなる下記のヌクレオチド配列
： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片を製造する方法。 - （３１）前記ｄ）工程が下記の工程： ｅ）バチルス スリンギエンシスの変種クルスタキの結
晶タンパク質に対して調製された抗体と反応する抗原の
存在するクローンをスクリーニングし、 ｆ）ヤギ抗血清と特異的に反応するクローンを選択する
；そして ｇ）ｆ）工程により得られた該クローンの抽出物の殺虫
有効性を試験する、 ことからなる特許請求の範囲第３０項記載の製造方法。 - （３２）前記ｃ）工程において、ベクターがプラスミド
である特許請求の範囲第３０項記載の製造方法。 - （３３）下記の工程： ａ）バチルス スリンギエンシスの変種クルスタキ Ｈ
Ｄ１の細胞を分離および溶菌し、そして公知の方法によ
りこのように得られた成分からプラスミドを分離し、こ
のように得られたプラスミド成分を精製、透析し、； ｂ）バチルス スリンギエンシスの変種クルスタキ Ｈ
Ｄ１プラスミドＤＮＡのＤＮＡライブラリィを調製し； ｃ）ｂ）工程により得られた断片化プラスミドＤＮＡを
適当なベクターにクローニングし；ｄ）抗原／抗体試験
に適用することによりタンパク質ＭＧＥ１の存在をスク
リーニングする、ことからなる殺虫性のタンパク質物質
をコードするバチルス スリンギエンシスの変種クルス
タキから得られるＨｐａ I （０）からＰｓｔ I （４３
５５）のＤＮＡ断片または殺虫性を失わないという条件
で該ＤＮＡ断片の先端を切断されたＤＮＡ断片を製造す
る方法。 - （３４）前記ｄ）工程が下記の工程： ｅ）バチルス スリンギエンシスの変種クルスタキの結
晶タンパク質に対して調製された抗体と反応する抗原の
存在するクローンをスクリーニングし、 ｆ）ヤギ抗血清と特異的に反応するクローンを選択する
；そして ｇ）ｆ）工程により得られた該クローンの抽出物の殺虫
有効性を試験する、 ことからなる特許請求の範囲第３３項記載の製造方法。 - （３５）前記ｃ）工程において、ベクターがプラスミド
である特許請求の範囲第３３項記載の製造方法。 - （３６）昆虫またはその生育地に、下記のヌクレオチド
配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片により少なくとも一部エンコードさ
れたタンパク質物質の殺虫有効量を施用することからな
る昆虫を防除する方法。 - （３７）レピドプテラ目の昆虫を防除する特許請求の範
囲第３６項記載の方法。 - （３８）昆虫またはその生育地に、殺虫性のタンパク質
物質をコードするバチルス スリンギエンシスの変種ク
ルスタキから得られるＨｐａ I （０）からＰｓｔ I （
４３５５）のＤＮＡ断片または殺虫性を失わないという
条件で該ＤＮＡ断片の先端を切断されたＤＮＡ断片によ
り少なくとも一部エンコードされたタンパク質物質の殺
虫有効量を施用することからなる昆虫を防除する方法。 - （３９）レピドプテラ目の昆虫を防除する特許請求の範
囲第３８項記載の方法。 - （４０）昆虫またはその生育地に、下記のヌクレオチド
配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片によりエンコードされたタンパク質
ＭＧＥ１の殺虫有効量を施用することからなる昆虫を防
除する方法。 - （４１）レピドプテラ目の昆虫を防除する特許請求の範
囲第４０項記載の方法。 - （４２）昆虫またはその生育地に、殺虫性のタンパク質
物質をコードするバチルス スリンギエンシスの変種ク
ルスタキから得られるＨｐａ I （０）からＰｓｔ I （
４３５５）のＤＮＡ断片または殺虫性を失わないという
条件で該ＤＮＡ断片の先端を切断されたＤＮＡ断片によ
りエンコードされたＭＧＥ１タンパク質の殺虫有効量を
施用することからなる昆虫を防除する方法。 - （４３）レピドプテラ目の昆虫を防除する特許請求の範
囲第４２項記載の方法。 - （４４）下記のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片により少なくとも一部エンコードさ
れたタンパク質物質の殺虫有効量を含有する殺虫剤組成
物。 - （４５）殺虫性のタンパク質物質をコードするバチルス
スリンギエンシスの変種クルスタキから得られるＨｐ
ａ I （０）からＰｓｔ I （４３５５）のＤＮＡ断片ま
たは殺虫性を失わないという条件で該ＤＮＡ断片の先端
を切断されたＤＮＡ断片により少なくとも一部エンコー
ドされたタンパク質物質の殺虫有効量を含有する殺虫剤
組成物。 - （４６）昆虫またはその生育地に、下記のヌクレオチド
配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片を含有する微生物であってただし該
微生物がバチルス スリンギエンシスの群に属する場合
には、該バチルスは前記ＤＮＡ断片で形質転換されたも
のの殺虫有効量を施用することからなる昆虫を防除する
方法。 - （４７）昆虫またはその生育地に、殺虫性のタンパク質
物質をコードするバチルス スリンギエンシスの変種ク
ルスタキから得られるＨｐａ I （０）からＰｓｔ I （
４３５５）のＤＮＡ断片または殺虫性を失わないという
条件で該ＤＮＡ断片の先端を切断されたＤＮＡ断片を含
有する微生物であって、ただし該微生物がバチルス ス
リンギエンシスの群に属する場合には、該バチルスは前
記ＤＮＡ断片で形質転換されたものの殺虫有効量を施用
することからなる昆虫を防除する方法。 - （４８）昆虫またはその生育地に、生物学的起原の二次
物質に完全に取り囲まれた一次物質からなるバイオエン
カプセル系であって、該一次物質は、下記ヌクレオチド
配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片により発現されたものであり、そし
て該二次物質は微生物全体により発現されたものである
が、ただし該微生物がバチルス スリンギエンシスに属
する場合には、該バチルスは前記のＤＮＡ断片で形質転
換されたものである該バイオエンカプセル系の殺虫有効
量を施用することからなる昆虫を防除する方法。 - （４９）昆虫またはその生育地に、生物学的起原の二次
物質に完全に取り囲まれた一次物質からなるバイオエン
カプセル系であって、該一次物質は、殺虫性のタンパク
質物質をコードするバチルススリンギエンシスの変種ク
ルスタキから得られるＨｐａ I （０）からＰｓｔ１（
４３５５）のＤＮＡ断片または殺虫性を失わないという
条件で該ＤＮＡ断片の先端を切断されたＤＮＡ断片によ
り発現されたものであり、そして該二次物質は微生物全
体により発現されたものであるが、ただし該微生物がバ
チルス スリンギエンシスに属する場合には、該バチル
スは前記のＤＮＡ断片で形質転換されたものである該バ
イオエンカプセル系の殺虫有効量を施用することからな
る昆虫を防除する方法。 - （５０）酵母酸ホスファターゼプロモーターＰＨ０５お
よび該プロモーターによりコントロールされている下記
のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片から成るハイブリッドベクター。 - （５１）酵母酸ホスファターゼプロモーターＰＨ０５お
よび該プロモーターによりコントロールされている殺虫
性のタンパク質物質をコードするバチルス スリンギエ
ンシスの変種クルスタキから得られるＨｐａ I （０）
からＰｓｔ I （４３５５）のＤＮＡ断片または殺虫性
を失わないという条件で該ＤＮＡ断片の先端を切断され
たＤＮＡ断片からなるハイブリッドベクター。 - （５２）酵母酸ホスファターゼプロモーターＰＨ０５お
よび該プロモーターによりコントロールされている下記
のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片からなるハイブリッドベクターで形
質転換された酵母サッカロマイセスセレビシアエＧＲＦ
１８。 - （５３）酵母酸ホスファターゼプロモーターＰＨ０５お
よび該プロモーターによりコントロールされている殺虫
性のタンパク質物質をコードするバチルス スリンギエ
ンシスの変種クルスタキから得られるＨｐａ I （０）
からＰｓｔ I （４３５５）のＤＮＡ断片または殺虫性
を失わないという条件で該ＤＮＡ断片の先端を切断され
たＤＮＡ断片からなるハイブリッドベクターで形質転換
された酵母サッカロマイセス セレビシアエＧＲＦ１８
。 - （５４）形質転換した大腸菌ＨＢ１０１株（ｐＫ３６）
、例えば寄託番号ＤＳＭ３６６８並びに該株の特徴を依
然有する全ての誘導体または突然変異体。
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