CN101955920A

CN101955920A - 一种基因重组耐热锰超氧化物歧化酶的分离工艺

Info

Publication number: CN101955920A
Application number: CN 201010504477
Authority: CN
Inventors: 朱虎; 刘建国; 曲剑波; 吕建仁
Original assignee: China University of Petroleum East China
Current assignee: China University of Petroleum East China
Priority date: 2010-10-13
Filing date: 2010-10-13
Publication date: 2011-01-26

Abstract

本发明提供了一种基因重组耐热锰超氧化物歧化酶的分离工艺，属于生物分离工程技术领域，主要是应用超滤分离技术，经过破碎、离心和超滤三个简单步骤，即可从重组大肠杆菌(E.coli)中分离出高纯度的耐热锰超氧化歧化酶，在分离制备过程中，未使用层析及电泳离心技术，大幅度缩短了提取周期，实现了重组耐热锰超氧化歧化酶的快速大规模制备。

Description

一种基因重组耐热锰超氧化物歧化酶的分离工艺

技术领域

本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术从重组大肠杆菌分离耐热锰超氧化歧化酶的方法，产品纯度达92％以上。

背景技术

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是生物体内一种重要的氧自由基清除剂，它是保护机体免受这些自由基伤害的一道重要防线，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当生物体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，因此，SOD在医药、食品和化妆品等领域都有广阔的应用前景。由于应用前景广阔，对SOD的研究一直是热点。主要在两个方面，第一是SOD新来源的发现，尤其是能够产生SOD的极端微生物的发现。第二是提高SOD产量和质量的生物工艺学研究。目前，从极端微生物自身或重组大肠杆菌分离耐热锰超氧化物歧化酶的主要方法有：层析法和等电聚焦法等。然而这些技术均存在一定的局限性，如成本昂贵，且难于工业放大等。

膜分离法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组份或多组分的混合物进行分离、提纯和富集的方法。膜分离技术是20世纪50年代发展起来的一项高效分离技术，与传统的分离技术相比，具有分离效率高、能耗低、可连续操作、易于放大、无污染等优点。

超滤膜是指膜孔径在1-100nm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化。超滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，同时使小分子溶质透过；有时也可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术常用于蛋白质的纯化与浓缩，在工业上已有较多应用，但由于自然体系中蛋白质种类复杂，且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的成功实例极少。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单，易于放大的重组耐热锰超氧化物歧化酶的超滤提取方法。

本发明采取的技术路线是：

1.以嗜热栖热菌(T.thermophilus HB27)基因组DNA为模板，采用PCR技术克隆SOD基因，PCR产物经EcoR I和Sal I双酶切后，连接到经同样处理的pET28a⁽⁺⁾克隆/表达载体上，产生重组质粒p28ASOD，将重组载体p28ASOD导入大肠杆菌(E.coli)，获得基因重组工程菌E.coli/p28ASOD。

2.将重组大肠杆菌培养至OD₆₀₀约为0.6(37℃，250rpm)，加入诱导剂IPTG至浓度为1mM；继续培养8小时。

3.取步骤2得到的发酵液30ml，离心15min(离心条件为4℃，离心力为1000×g)，用1M的TE Buffer(pH 8.0)5-10ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入1M的TEBuffer(pH 8.0)5ml，混合均匀；用超声波细胞粉碎机对其进行菌体破碎(超声条件：声波时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液备用。

4.利用截留分子量为30-70kDa的超滤膜对步骤2得到的上清液进行超滤分离，分离条件为：溶液pH值5-7，离子强度0-1M。

5.利用截留分子量为100-300kDa的超滤膜对步骤3得到的截留液进行超滤分离，分离条件为：溶液pH值5-7，离子强度0-1M。滤出液为锰超氧化物歧化酶的终产品。

本发明直接应用超滤分离技术从重组大肠杆菌中分离获取高纯度的耐热锰超氧化物歧化酶，由于超滤膜是指膜孔径在1-100nm，具有不对称结构的复合膜。其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质、酶等的分离与纯化。本发明工艺仅涉及破碎、离心和超滤三个简单步骤，相对目前的实验室提取工艺，具有操作简单、分离浓缩同步进行、活性损失小、回收率高、能耗低、分离效率高、产品纯度可调控、控制因素单一，便于工业放大等特点。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明。

实施例1，提取基因重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法，步骤：

取基因重组工程菌E.coli/p28ASOD的发酵液200ml，离心15min(离心条件：4℃，1000g)，用1M的TE Buffer(pH 8.0)100ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入1M的TEBuffer(pH 8.0)20ml，混合均匀；用超声波细胞粉碎机对菌体进行破碎(超声条件：声波时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液(16ml)。

利用截留分子量为30kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0.09m²)对上清液进行分离，分离条件：溶液pH值6.0，NaCl浓度30mM，流速0.2ml/min，超滤时间2小时，取截留液(16ml)；利用100kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0.09m²)对截留液进行二次超滤分离，分离条件：溶液pH值6.0，NaCl浓度30mM，流速0.2ml/min，超滤时间2小时，滤出液(24ml)即为耐热锰超氧化物歧化酶溶液，纯度为93％。

实施例2，因重组耐热锰超氧化物歧化酶的分离纯化工艺，步骤：

取基因重组工程菌E.coli/p28ASOD的发酵液100ml，离心15min(离心条件：4℃，1000g)，用1M的TE Buffer(pH 8.0)100ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入1M的TEBuffer(pH 8.0)20ml，混合均匀；用超声波细胞粉碎机对菌体进行破碎(超声条件：声波时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液(18ml)。

利用截留分子量为50kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0.09m²)对上清液进行分离，分离条件：溶液pH值6.8，NaCl浓度50mM，流速0.2ml/min，超滤时间2小时，取截留液(16ml)；利用100kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0.09m²)对截留液进行二次超滤分离，分离条件：溶液pH值6.8，NaCl浓度50mM，流速0.2ml/min，超滤时间2小时，滤出液(24ml)即为耐热锰超氧化物歧化酶溶液，纯度为92％。

实施例3，提取基因重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法，步骤：

取基因重组工程菌E.coli/p28ASOD的发酵液250ml，离心15min(离心条件：4℃，1500g)，用1M的TE Buffer(pH 8.0)150ml清洗菌体，再离心15min，弃去上清液，加入1M的TEBuffer(pH 8.0)30ml，混合均匀；用超声波细胞粉碎机对菌体进行破碎(超声条件：声波时间2s，间隔3s，次数99次)；超声之后离心15min，取上清液(25ml)。

利用截留分子量为30kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0.09m²)对上清液进行分离，分离条件：溶液pH值6.5，NaCl浓度10mM，流速0.2ml/min，超滤时间4小时，取截留液(16ml)；利用100kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0.09m²)对截留液进行二次超滤分离，分离条件：溶液pH值6.5，NaCl浓度10mM，流速0.2ml/min，超滤时间4小时，滤出液(48ml)即为耐热锰超氧化物歧化酶溶液，纯度为95％。

Claims

1.一种分离重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法，是以截留分子量为30-70kDa的超滤膜处理锰超氧化物歧化酶的粗酶液，获得的截留液再用截留分子量为100-300kDa的超滤膜进行处理，最终获得高纯度的锰超氧化物歧化酶；所述粗酶液是将表达耐热锰超氧化物歧化酶的大肠杆菌(E.coli)菌体超声破碎、离心后得到的上清液。

2.根据权利要求1所述的分离锰超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：用超滤膜处理时，溶液pH值5-7，离子强度0-1M。

3.根据权利要求1或2所述的分离重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法，其特征在于：所用截留分子量为30-70kDa和100-300kDa的超滤膜的组件形式为中空纤维素膜、平板膜或卷式膜。