CN104450634A - 一种从大肠杆菌中提取纯化sod的方法 - Google Patents

一种从大肠杆菌中提取纯化sod的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提取纯化SOD的方法，尤其涉及一种从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法；其包括下述操作步骤：菌体收集、菌体匀浆、粗酶液制备、超滤、层析以及脱盐。本发明可有效纯化非修饰的SOD蛋白，保持SOD的原始活性；且纯化出的高纯度SOD用邻苯三酚氧化法测得的比活高达13000U/g，整个过程收率较高；操作简单、可实现工业化大生产。

Description

一种从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法
技术领域
本发明涉及一种提取纯化SOD的方法，尤其涉及一种从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法。
背景技术
超氧化物歧化酶（SOD），是英文Superoxide Dismutase的缩写，是体内对抗自由基的第一道防线。当我们身体吸入氧气进行新陈代谢，就会产生超氧阴离子自由基，若不予以消除，会在体内产生连锁反应破坏细胞。正常情况下，体内自由基的产生和清除处于动态平衡。SOD在年轻人的血液中很多，人们过了30岁以后，人体内的“SOD”随着人体组织的老化而产生率逐渐降低。由于体内的SOD随着年龄的增加而渐减，再加上环境的恶化，大量的自由基超过身体所能应付的程度，因此借助外来的补充是必需的。
SOD的来源极为广泛，目前已从细菌、真菌、藻类、鱼类、昆虫、植物和哺乳类动物等各种生物体分离得到。国内已开发的SOD资源有：动物血液（牛、猪等），菌类发酵（酵母菌、大肠杆菌等），高等植物（藻类、刺梨等）等。动物提取SOD的主要原料可以是各种哺乳动物血液、肝脏、脑等，然而一些人畜共患病的原因使得许多国家禁止在食品、化妆品、医疗等领域使用动物来源的SOD。
相对于植物来源的SOD，微生物来源的SOD具有比活力高，含量高的优点，微生物的生长也远远快于植物，此外，各种微生物技术属国家重点支持行业，目前也发展迅速，这些因素都对微生物来源的SOD实现产业化具有重大的推动作用。例如，专利号为2011100503115报道了一种用大肠杆菌生产重组人源SOD的方法，但是这个专利集中在重组大肠杆菌的构建，并未公开SOD纯化方法，而从细胞内获取SOD时更是采用超声法，不适合大规模工业化生产；又如专利号为201310103919.9报道了一种酿酒酵母菌株及其在制备耐热超氧化物歧化酶中的应用，这项专利主要集中在酿酒酵母菌种的筛选以及发酵上，对于SOD的纯化并未深入研究；再如，专利号为2011103369936的专利中，公布了一种从酿酒酵母中同时提取S-腺苷-L-甲硫氨酸和SOD的方法，然而这种方法纯化的SOD纯度较低，而且在破壁时采用有机溶剂法，纯化时也采用丙酮沉淀法，这对于环境有一定的污染，也使得SOD酶活有一定得损失。目前，可以通过在重组蛋白上加上标签（例如His标签或GST标签），在微生物发酵、细胞裂解后，通过亲和层析得到较高纯度的蛋白。然而，这种带标签的蛋白存在纯化成本高、纯化结束后标签的切除等后续工艺，使得纯化过程变得昂贵，工艺也变得复杂。专利号为200810061168.8的专利中，报道了从重组大肠杆菌中提取耐高温超氧化物歧化酶的方法，由于该专利产品为耐高温SOD，因此需用80℃水浴处理细胞，用有机溶剂——乙醇沉淀，但是这对于人源SOD的酶活损害极大，最后透析也会影响工艺工业化时的放大。因此这项工艺并不适合人源SOD纯化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、可实现工业化大生产的从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法，并且所提取纯化的SOD具有较高活性。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：本发明从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法包括下述操作步骤：
1）菌体收集：采用离心法收集湿大肠杆菌细胞；
2）菌体匀浆：将上述大肠杆菌细胞中加入2~30倍体积的水，搅拌使大肠杆菌均匀分散为悬浮液，用高压均质机在100~1500bar匀浆2~8次；
3）粗酶液制备：向匀浆后产物加入pH7~9的聚醚酰亚胺溶液，使聚醚酰亚胺的终浓度为0.5~25g/L；搅拌均匀后加入硅藻土，硅藻土的加入量为每升100~300克；混合均匀后用板框过滤器过滤收集滤液，即为SOD粗酶液；
或将匀浆后产物以10000~16000rpm离心，上清液用陶瓷膜微滤系统过滤得到SOD粗酶液；
4）超滤：将上述SOD粗酶液用1000~40000 Da超滤膜处理，超滤膜两侧压力不大于0.4MPa；
5）层析：将上述超滤后所得滤液通过阳离子层析柱层析，用去离子水冲洗后用5~70mM的pH4.0~9.0磷酸缓冲溶液进行洗脱，收集富含SOD的洗脱液；所述阳离子层析柱选自Q-sepharose或DEAE-sepharose层析填料；
6）脱盐：将上述富含SOD的洗脱液通过超滤或凝胶排阻层析脱盐。
进一步的，本发明通过重复步骤4）和5）2~5次获得高纯度的富含SOD的洗脱液。
进一步的，本发明步骤2）中所述水的温度为1~15℃。
进一步的，本发明步骤5）中所述磷酸缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明提供了一种从重组大肠杆菌细胞中提取Cu-Zn型rhSOD的方法。从细胞中提取高纯度的蛋白具有一定得困难，因为细胞内含有数千种蛋白且蛋白对pH、温度以及各类有机溶剂等都较敏感，极易失去生物学活力。本发明公开的方法有效地解决了上述的问题，可有效纯化非修饰的SOD蛋白，保持SOD的原始活性；且纯化出的高纯度SOD用邻苯三酚氧化法测得的比活高达13000U/g，整个过程收率较高；操作简单、可实现工业化大生产。
本发明的工艺流程用高压均质机对大肠杆菌进行破碎。相对有机溶剂法破坏细胞壁以及细胞膜，具有环保以及酶活损失小等优点；相对超声破碎法，具有破壁率高、处理量大、易于工业化的优点。
本发明通过合适的层析法以及合理的层析工艺纯化SOD，相较于用高温、有机溶剂、盐析和透析等方法纯化SOD，具有酶活损失小以及SOD产品纯度高的优势。
本发明中的层析方法可以重复数次，逐步提高SOD产品的纯度，也可根据要求生产不同纯度的SOD冻干粉及溶液。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
为使本发明的上述目的，特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所选用的大肠杆菌为用pTrc99A-rhSOD质粒转染的BL21(DE3)菌。本发明的方法对所选用的大肠杆菌没有具体的限制，只要表达SOD的菌株均可以使用本发明的方法进行SOD的提取和纯化，尤其适用于重组大肠杆菌中SOD的提取与纯化。
本发明适用于离子型的SOD的提取，尤其适用Cu-Zn型的rhSOD的提取，对于不同离子型的SOD，可以通过变换层析柱、洗脱液、洗脱顺序等实施，原则上属于与本发明方法相同或相近的方法，亦属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的板框过滤器的厂家为大张过滤有限公司，型号为BMY4/450-30U；醋酸纤维素超滤膜的厂家为赛多利斯（Sartorius）公司，型号为SartoconHydrosart，截留分子量为10KDa；Q-sepharose层析柱的厂家为GE Healthcare Life Sciences，型号为Q Sepharose Fast Flow；DEAE-sepharose层析柱的厂家为GE Healthcare Life Sciences，型号为DEAE-sepharose Fast Flow；陶瓷膜的厂家为南京艾宇琦膜科技有限公司，型号为AYQ-3019-1040。
实施例1
将200L发酵罐中发酵得到的大肠杆菌发酵液用管式离心机离心，出料口出料速率为30L/h。将得到约26kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入60升4~15℃去离子水并搅拌使得酵母细胞均匀分散，继续加水至终体积99L。将上述大肠杆菌悬浊液先用300bar压力进行匀浆，匀浆产物用1200bar再次匀浆。
在匀浆产物中加入1升200g/L的pH7.9的聚醚酰亚胺（PEI）溶液，使PEI在匀浆产物中的终浓度为2g/L，用约50rpm的速度搅拌10min，在其中加入15kg硅藻土混合均匀，而后用板框过滤器再次过滤收集滤液。为了提高SOD收率，滤饼可以用50升去离子水洗涤。
将滤液用分离效率为10000 Da的醋酸纤维素超滤膜浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水，重复上述浓缩步骤，反复加水3次后，浓缩到5L。将所得的粗酶液通过装有Q-sepharose Fast Flow（Q-琼脂糖凝胶）层析柱，先用10倍柱床体积的去离子水冲洗，而后用25mM的pH 6.5磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
将收集的SOD可以用分离效率为10000 Da的醋酸纤维素超滤膜浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后将SOD溶液再次通过装有Q-sepharose Fast Flow（Q-琼脂糖凝胶）层析柱，先后用10倍柱床体积的去离子水冲洗，而后用25mM的pH 6.5磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
上述高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到颜色为浅蓝绿色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性测定第一法（邻苯三酚法）测定，SOD的纯度约11300 U/mg。经一次层析处理得到的SOD产品经冷冻干燥后，纯度为3600 U/mg。
实施例2
将200L发酵罐中发酵得到的大肠杆菌发酵液用14000rpm的管式离心机离心，离心出料量为40L/h，将得到约26kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入48升4~15℃去离子水并搅拌使得大肠杆菌均匀分散。将上述大肠杆菌悬浊液用1500bar压力进行匀浆。
将匀浆产物用管式离心机在14000rpm离心，出料口速率约30L/h条件下离心。离心后的液体用陶瓷膜进行过滤，将滤液用分离效率为10000 Da的醋酸纤维素超滤膜处理，将上述粗酶液浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水继续浓缩，反复加水3次后，浓缩到5L。将粗酶液通过装有DEAE-sepharose层析柱，将收集的SOD可以用分离效率为10000 Da的醋酸纤维素处理，浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后，将SOD溶液再次通过装有DEAE-sepharose层析柱，先后用10倍柱床体积的去离子水冲洗，而后用25mM的pH 6.5磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
第三次重复浓缩-层析步骤后得到的高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到颜色为浅蓝绿色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性测定第一法（邻苯三酚法）测定，SOD的纯度约13500 U/mg。
实施例3
将200L发酵罐中发酵得到的大肠杆菌发酵液用管式离心机离心，出料口出料速率为30L/h。将得到约15kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入38升10℃去离子水并搅拌使得酵母细胞均匀分散，加入去离子水至68L。将上述大肠杆菌悬浊液先用100bar压力进行匀浆，匀浆产物用500bar匀浆三次。
在匀浆产物中加入2升140g/L的pH7.0的聚醚酰亚胺（PEI）溶液，使PEI在匀浆产物中的终浓度为4g/L，用约50rpm的速度搅拌10min，在其中加入11kg硅藻土混合均匀，而后用板框过滤器再次过滤收集滤液。为了提高SOD收率，滤饼可以用50升去离子水洗涤。
将滤液用分离效率为8000 Da的醋酸纤维素超滤膜（超滤膜两侧压力为0.3MPa）浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水，重复上述浓缩步骤，反复加水3次后，浓缩到5L。将所得的粗酶液通过装有Q-sepharose Fast Flow（Q-琼脂糖凝胶）层析柱，先用10倍柱床体积的去离子水冲洗，而后用70mM的pH 9.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
将收集的SOD活力组分用分离效率为8000 Da的醋酸纤维素超滤膜浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后将SOD溶液再次通过装有Q-sepharose Fast Flow（Q-琼脂糖凝胶）层析柱，先后用10倍柱床体积的去离子水冲洗，而后用70mM的pH 9.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
上述高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到颜色为浅蓝绿色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性测定第一法（邻苯三酚法）测定，SOD的纯度约9100U/mg。经一次层析处理得到的SOD产品纯度为3500 U/mg。
实施例4
将200L发酵罐中发酵得到的大肠杆菌发酵液用管式离心机离心，出料口出料速率为30L/h。将得到约18kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入60升4℃去离子水并搅拌使得酵母细胞均匀分散，加水定容到90L。将上述大肠杆菌悬浊液先用800bar压力进行匀浆，匀浆产物用1000bar匀浆。
在匀浆产物中加入10升200g/L的pH8.5的聚醚酰亚胺（PEI）溶液，使PEI在匀浆产物中的终浓度为10g/L，用约50rpm的速度搅拌10min，在其中加入30kg硅藻土混合均匀，而后用板框过滤器再次过滤收集滤液。为了提高SOD收率，滤饼可以用100升去离子水洗涤。
将滤液用分离效率为15000 Da的醋酸纤维素超滤膜（超滤膜两侧压力为0.2MPa）浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水，重复上述浓缩步骤，反复加水3次后，浓缩到5L。将所得的粗酶液通过装有Q-sepharose Fast Flow（Q-琼脂糖凝胶）层析柱，先用10倍柱床体积的去离子水冲洗，而后用20mM的pH 5.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
将收集的SOD活力组分用分离效率为15000 Da的醋酸纤维素超滤膜浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后将SOD溶液再次通过装有Q-sepharose Fast Flow（Q-琼脂糖凝胶）层析柱，先后用10倍柱床体积的去离子水冲洗，而后用20mM的pH 5.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
上述高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到颜色为浅蓝绿色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性测定第一法（邻苯三酚法）测定，SOD的纯度约11900U/mg。经一次层析处理得到的SOD产品纯度为3650 U/mg。
实施例5
将100L发酵罐中发酵得到的大肠杆菌发酵液用14000rpm的管式离心机离心，离心出料量为40L/h，将得到约10kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入200升15℃去离子水并搅拌使得大肠杆菌均匀分散。将上述大肠杆菌悬浊液用1500bar压力进行匀浆。
将匀浆产物用管式离心机在14000rpm离心，出料口速率约30L/h条件下离心。离心后的液体用陶瓷膜进行过滤，将滤液用分离效率为15000Da的醋酸纤维素超滤膜处理，超滤膜两侧压力为0.4MPa，将上述粗酶液浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水继续浓缩，反复加水3次后，浓缩到5L。将粗酶液通过装有Q-sepharose Fast Flow（Q-琼脂糖凝胶）层析柱，将收集的SOD可以用分离效率为40000Da的醋酸纤维素处理，浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后，将SOD溶液再次通过装有Q-sepharose Fast Flow（Q-琼脂糖凝胶）层析柱，先后用10倍柱床体积的去离子水冲洗，而后用40mM的pH 7.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
第三次重复浓缩-层析步骤后得到的高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到颜色为浅蓝绿色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性测定第一法（邻苯三酚法）测定，SOD的纯度约12300 U/mg。
实施例6
将100L发酵罐中发酵得到的大肠杆菌发酵液用管式离心机离心，出料口出料速率为30L/h。将得到约10kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入230升4℃去离子水并搅拌使得大肠杆菌细胞均匀分散，向其中加入去离子水至248L。将上述大肠杆菌悬浊液先用300bar压力进行匀浆，匀浆产物用800bar再次匀浆。
在匀浆产物中加入1升250g/L的pH9.0的聚醚酰亚胺（PEI）溶液，使PEI在匀浆产物中的终浓度为1g/L，用约50rpm的速度搅拌10min，在其中加入90kg硅藻土混合均匀，而后用板框过滤器再次过滤收集滤液。为了提高SOD收率，滤饼可以用100升去离子水洗涤。
将滤液用分离效率为20000Da的醋酸纤维素超滤膜（超滤膜两侧压力为0.3MPa）浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水，重复上述浓缩步骤，反复加水3次后，浓缩到5L。将所得的粗酶液通过装有Q-sepharose Fast Flow（Q-琼脂糖凝胶）层析柱，先用10倍柱床体积的去离子水冲洗，而后用5mM的pH 4.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
将收集的SOD活力组分用分离效率为20000Da的醋酸纤维素超滤膜浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后将SOD溶液再次通过装有Q-sepharose Fast Flow（Q-琼脂糖凝胶）层析柱，先后用10倍柱床体积的去离子水冲洗，而后用5mM的pH 4.0磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
上述高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到颜色为浅蓝绿色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性测定第一法（邻苯三酚法）测定，SOD的纯度约13300U/mg。经一次层析处理得到的SOD产品纯度为3300 U/mg。

Claims (4)

1.一种从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法，其特征在于其包括下述操作步骤：
1）菌体收集：采用离心法收集湿大肠杆菌细胞；
2）菌体匀浆：将上述大肠杆菌细胞中加入2~30倍体积的水，搅拌使大肠杆菌均匀分散为悬浮液，用高压均质机在100~1500bar匀浆2~8次；
3）粗酶液制备：向匀浆后产物加入pH7~9的聚醚酰亚胺溶液，使聚醚酰亚胺的终浓度为0.5~25g/L；搅拌均匀后加入硅藻土，硅藻土的加入量为每升克；混合均匀后用板框过滤器过滤收集滤液，即为SOD粗酶液；
或将匀浆后产物以10000~16000rpm离心，上清液用陶瓷膜微滤系统过滤得到SOD粗酶液；
4）超滤：将上述SOD粗酶液用1000~40000 Da超滤膜处理，超滤膜两侧压力不大于0.4MPa；
5）层析：将上述超滤后所得滤液通过阳离子层析柱层析，用去离子水冲洗后用5~70mM的pH4.0~9.0磷酸缓冲溶液进行洗脱，收集富含SOD的洗脱液；所述阳离子层析柱选自Q-sepharose或DEAE-sepharose层析填料；
6）脱盐：将上述富含SOD的洗脱液通过超滤或凝胶排阻层析脱盐。
2.根据权利要求1所述的一种从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法，其特征在于重复步骤4）和5）2~5次获得高纯度的富含SOD的洗脱液。
3.根据权利要求1或2所述的一种从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法，其特征在于步骤2）中所述水的温度为1~15℃。
4.根据权利要求1所述的一种从大肠杆菌中提取纯化SOD的方法，其特征在于步骤5）中所述磷酸缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液。
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