CN112961777A - 一种微生物酶制剂的制备方法 - Google Patents
一种微生物酶制剂的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112961777A CN112961777A CN202110278411.7A CN202110278411A CN112961777A CN 112961777 A CN112961777 A CN 112961777A CN 202110278411 A CN202110278411 A CN 202110278411A CN 112961777 A CN112961777 A CN 112961777A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- membrane
- solution
- enzyme preparation
- enzyme
- microbial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
一种微生物酶制剂的制备方法，特别是提供一种细菌液体发酵法制备微生物酶制剂的方法，采用膜浓缩过滤的方法，并加入洗涤液除去发酵液中的小分子可溶性杂质和无机盐，再经过匀浆破壁、分离提纯及冻干，得到相应的粗制酶制剂或精制酶制剂。该方法工艺简单，设备投资低，操作方便，适用于工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，特别是提供了一种微生物酶制剂的制备方法。
背景技术
酶是由活细胞产生的，对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质。酶作为一种生物催化剂，具有高效性、专一性、反应条件温和等特点，广泛应用于食品、纺织、医药卫生、能源开发、环境工程、化工等各个生产领域。
酶的种类繁多，来源及用途各不相同，因而对酶制品的纯度要求也不同。工业上用酶有的只需要粗制品，一般无需高度纯化，如洗涤剂用的蛋白酶，只需经过简单的提取分离即可。食品工业用酶，则需经过适当的分离纯化，以确保安全和卫生。医药用酶，特别是注射用酶及分析测试用酶，则需要经过高度的分离纯化过程。
酶的制备主要有两种方法，即直接提取法和微生物发酵生产法。早期酶制剂是以动植物作为原料，从中直接提取获得。由于动植物生长周期长，有受地理、气候和季节等因素的影响，原料来源受到限制，一般不适用于大规模工业化生产。目前，人们越来越多地转向以微生物作为酶的主要来源。
采用微生物发酵法制备酶，具有很多优势：①微生物种类繁多，几乎自然界中存在的所有酶，都可以在微生物中找到。②微生物生长繁殖快，生活周期短，因而酶的产量高。③用于培养微生物的原料来源丰富，价格低，酶的制备成本低。④可以通过诱变等方法培育出高产菌种。⑤结合基因工程、细胞工程等现代生物技术手段，可以完全按照人类的需要使微生物产出目的酶。
由于微生物发酵法生产酶具有以上独特优点，目前工业上使用的酶制剂，绝大多数来自于微生物，如淀粉酶类的α一淀粉酶、β一淀粉酶、葡萄糖淀粉酶以及异淀粉酶等都是从微生物中生产的。
尽管微生物发酵法生产酶制剂存在上述优点，但仍存在一些问题需要解决。①消除毒性：微生物发酵法生产的酶制品中会带有一些细菌自身的生理活性物质，这些生理活性物质往往对人体有害，因此需要更高的分离纯化技术以保证安全。②优良产酶菌种的筛选培育：大多数工业微生物制酶生产采用的菌种较少，目前仅局限于11种真菌、8种细菌和4种酵母菌。只有不断寻找更多的适用的产酶菌种，才可能使越来越多的酶采用微生物发酵法进行工业化生产。
酶的微生物发酵生产方式有两种，一种是固体发酵法，另一种是液体发酵法。
固体发酵法是利用麸皮和米糠为主要原料，添加谷糠、豆饼等，加水搅拌成半固体状态，供微生物生长和产酶，主要用于真菌来源的商业酶的生产。其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在中国和日本已有悠久的历史。
液体发酵法又分液体表面发酵和液体深层发酵法两种。其中液体深层发酵法是现在普遍采用的方法。以细菌为来源的酶的工业化生产均采用此种方法。
细菌液体发酵法得到的细菌培养液，多采用离心设备分离菌体，如专利CN110527673A葡萄糖脱氢酶的制备方法中基因工程菌（大肠杆菌）培养液通过离心设备分离菌体。专利CN110819610A极耐热甘露聚糖酶基因工程菌（大肠杆菌BL21）培养液采用离心收集菌体，专利CN108315315A制备阿魏酸脱羧酶的方法，将产阿魏酸脱羧酶的微生物培养，得细胞培养液，离心，制得菌体细胞。
使用离心设备处理微生物培养液的方法适用于实验室小规模处理，工业放大规模比较困难，操作复杂，收率低，具有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物酶制剂的制备方法，特别是提供一种细菌液体发酵法制备微生物酶制剂的方法，采用膜浓缩过滤的方法，并加入洗涤液除去发酵液中的小分子可溶性杂质和无机盐，再经过匀浆破壁、分离提纯及冻干，得到相应的粗制酶制剂或精制酶制剂。该方法工艺简单，设备投资低，操作方便，适用于工业化大规模生产。
本发明采取以下技术方案：
一种微生物酶制剂的制备方法，包括以下步骤：
第一步，微生物培养液经过膜浓缩处理，得到初步菌体浓缩液；
第二步，初步菌体浓缩液中加入洗涤液进行洗滤，继续经过膜浓缩处理，得到纯化菌体浓缩液；
第三步，纯化菌体浓缩液匀浆破壁，得到粗酶溶液；
第四步，粗酶溶液进行分离提纯，得到精制酶溶液；
第五步，粗酶溶液或精制酶溶液进行干燥处理，得到对应的粗制酶制剂或精制酶制剂。
以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中膜浓缩处理所使用的膜为管式膜、平板膜、卷式膜或中空纤维膜，所用膜的材质包括金属膜、陶瓷膜、有机膜或其它无机膜，所用膜的分离精度为0.005-0.2微米之间或者膜的切割分子量为10-500kD之间。
作为优化，以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中膜浓缩处理所使用的膜为有机管式膜、无机管式膜、有机平板膜或无机平板膜，所用膜的分离精度为0.01-0.2微米之间或者膜的切割分子量为100-500kD之间。
作为优化，以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中膜浓缩处理所使用的膜为管式金属烧结膜、管式陶瓷膜或管式有机烧结膜，所用膜的分离精度为0.05-0.2微米之间或者膜的切割分子量为150-500kD之间。
以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中洗涤液为水、无机盐溶液或有机盐溶液中的任意一种或两种或两种以上的组合。
作为优化，以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中洗涤液为水或纯水。
作为优化，以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中洗涤液为质量百分比浓度为0.2-1.0%的氯化钠溶液或者pH范围为2-12之间的pH缓冲液。
以上方法得到的粗酶溶液可以直接用于工业生产。也可以将粗酶溶液直接干燥处理，得到粗酶制剂，用于环保、日化等对酶纯度要求不高的行业使用。还可以将粗酶溶液进行分离提纯及干燥处理，得到高纯度酶制剂，用于医疗诊断等行业使用。
以上所述的一种微生物酶制剂的制备方法，适用于微生物发酵法制备微生物酶制剂，同时也适用于直接提取法从植物或动物细胞提取酶制剂。该方法工艺简单，设备投资低，操作方便，适用于工业化大规模生产。
具体实施方式
以下结合实例进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1
某酶发酵液100升，菌体含量（体积比）11.5%，首先用过滤精度为50纳米陶瓷膜浓缩至50升，然后加入2倍体积的工艺水进行洗滤，最后再浓缩至40升，得到的菌体浓缩液中菌体含量27.7%（体积比）。将该菌体浓缩液匀浆处理，得到粗酶溶液。测试该粗酶溶液酶活为22.3u/ml。
实施例2
某酶发酵液100升，菌体含量（体积比）11.5%，首先用过滤精度为50纳米陶瓷膜浓缩至50升，然后加入2倍体积的质量百分比浓度为0.9%氯化钠溶液进行洗滤，最后再浓缩至40升，得到的菌体浓缩液中菌体含量28.2%（体积比）。将该菌体浓缩液匀浆处理，得到粗酶溶液。测试该粗酶溶液酶活为23.9u/ml。
实施例3
某酶发酵液100升，菌体含量（体积比）11.5%，首先用过滤精度为50纳米陶瓷膜浓缩至50升，然后加入2倍体积的pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液进行洗滤，最后再浓缩至40升，得到的菌体浓缩液中菌体含量28.5%（体积比）。将该菌体浓缩液匀浆处理，得到粗酶溶液。测试该粗酶溶液酶活为25.7u/ml。
实施例4
实施例1中的粗酶溶液进行冻干处理，得到固体粗酶制剂。测试该粗酶溶液酶活为223u/g。
实施例5
实施例2中的粗酶溶液进行冻干处理，得到固体粗酶制剂。测试该粗酶溶液酶活为229.6u/g。
实施例6
实施例3中的粗酶溶液进行冻干处理，得到固体粗酶制剂。测试该粗酶溶液酶活为232.9u/g。
实施例7
某复合酶，A发酵液50升，菌体含量（体积比）11.2%，B发酵液50升，菌体含量（体积比）12.8%，在混合罐中搅拌混合均匀。
用过滤精度为100纳米的陶瓷膜进行浓缩至50升，平均陶瓷膜通量58.6LMH，得到初步菌体浓缩液。
在初步菌体浓缩液中缓慢加入2倍体积的pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液进行等浓度洗滤，最后再继续浓缩至40升，平均陶瓷膜通量39.1LMH，得到纯化菌体浓缩液。取样离心测试该纯化浓缩液中菌体含量27.6%（体积比）。
将该纯化菌体浓缩液匀浆处理，得到粗酶溶液。
Claims (7)
1.一种微生物酶制剂的制备方法，包括以下步骤：
第一步，微生物培养液经过膜浓缩处理，得到初步菌体浓缩液；
第二步，初步菌体浓缩液中加入洗涤液进行洗滤，继续经过膜浓缩处理，得到纯化菌体浓缩液；
第三步，纯化菌体浓缩液匀浆破壁，得到粗酶溶液；
第四步，粗酶溶液进行分离提纯，得到精制酶溶液；
第五步，粗酶溶液或精制酶溶液进行干燥处理，得到对应的粗制酶制剂或精制酶制剂。
2.根据权利要求1所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中膜浓缩处理所使用的膜为管式膜、平板膜、卷式膜或中空纤维膜，所用膜的材质包括金属膜、陶瓷膜、有机膜或其它无机膜，所用膜的分离精度为0.005-0.2微米之间或者膜的切割分子量为10-500kD之间。
3.根据权利要求1所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中膜浓缩处理所使用的膜为有机管式膜、无机管式膜、有机平板膜或无机平板膜，所用膜的分离精度为0.01-0.2微米之间或者膜的切割分子量为100-500kD之间。
4.根据权利要求1所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中膜浓缩处理所使用的膜为管式金属烧结膜、管式陶瓷膜或管式有机烧结膜，所用膜的分离精度为0.05-0.2微米之间或者膜的切割分子量为150-500kD之间。
5.根据权利要求1所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中洗涤液为水、无机盐溶液或有机盐溶液中的任意一种或两种或两种以上的组合。
6.根据权利要求1所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中洗涤液为水或纯水。
7.根据权利要求1所述的一种微生物酶制剂的制备方法，其中洗涤液为质量百分比浓度为0.2-1.0%的氯化钠溶液或者pH范围为2-12之间的pH缓冲液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110278411.7A CN112961777A (zh) | 2021-03-16 | 2021-03-16 | 一种微生物酶制剂的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110278411.7A CN112961777A (zh) | 2021-03-16 | 2021-03-16 | 一种微生物酶制剂的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112961777A true CN112961777A (zh) | 2021-06-15 |
Family
ID=76279387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110278411.7A Withdrawn CN112961777A (zh) | 2021-03-16 | 2021-03-16 | 一种微生物酶制剂的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112961777A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE868714A (fr) * | 1977-07-04 | 1978-11-03 | Ferrari Lorenzo | Procede de production de lysozyme |
| CN101863822A (zh) * | 2010-06-17 | 2010-10-20 | 河南巨龙淀粉实业有限公司 | 用一步精制法提取发酵液中色氨酸的生产方法 |
| CN102816746A (zh) * | 2011-12-29 | 2012-12-12 | 西藏俪阳科技有限公司 | 发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法 |
| CN104450634A (zh) * | 2014-12-12 | 2015-03-25 | 邢台怡通生物科技有限公司 | 一种从大肠杆菌中提取纯化sod的方法 |
-
2021
- 2021-03-16 CN CN202110278411.7A patent/CN112961777A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE868714A (fr) * | 1977-07-04 | 1978-11-03 | Ferrari Lorenzo | Procede de production de lysozyme |
| CN101863822A (zh) * | 2010-06-17 | 2010-10-20 | 河南巨龙淀粉实业有限公司 | 用一步精制法提取发酵液中色氨酸的生产方法 |
| CN102816746A (zh) * | 2011-12-29 | 2012-12-12 | 西藏俪阳科技有限公司 | 发酵法制取乙醛脱氢酶的一种方法 |
| CN104450634A (zh) * | 2014-12-12 | 2015-03-25 | 邢台怡通生物科技有限公司 | 一种从大肠杆菌中提取纯化sod的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 凤权等: "粘杆菌素发酵液微滤膜分离处理过程研究", 《生物学杂志》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US3806416A (en) | Creatine amidohydrolase and process for its preparation | |
| CN105886573B (zh) | 一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法 | |
| CN101679936B (zh) | 通过葡糖醛酸发酵来制造葡糖醛酸的方法 | |
| CN104630166A (zh) | 微生物发酵生产低温葡萄糖氧化酶的方法 | |
| CN105695340A (zh) | 一种米曲霉及其应用 | |
| Paranthaman et al. | Optimization of various culture media for tannase production in submerged fermentation by Aspergillus flavus | |
| Nandi et al. | Extraction, partial purification and application of tannase from Aspergillus niger MTCC 2425 | |
| CN109161556B (zh) | 一种海带中的m1pdh基因、其蛋白质及用途 | |
| CN112961777A (zh) | 一种微生物酶制剂的制备方法 | |
| GARG et al. | Continuous production of citric acid by immobilized whole cells of Aspergillus niger | |
| Sani et al. | Isolation, partial purification and characterization of α-amylase from Bacillus subtilis | |
| RU2500811C1 (ru) | Рекомбинантный штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент фосфолипазы с | |
| CN109136313A (zh) | 利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧腺苷的方法 | |
| CN104830744A (zh) | 利用sd-as序列偶联(r)-羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶制备(r)-苯乙二醇的方法 | |
| Parashar et al. | Production of Microbial Enzyme Triacylglycerol Acyl Hydrolases by Aspergillus Sydowii Jpg01 in Submerged Fermentation Using Agro-residues | |
| Pogaku et al. | The effect of de-oiled rice bran for single cell protein production using fungal cultures under solid state fermentation | |
| Aunstrup | Industrial approach to enzyme production | |
| CN105331597A (zh) | 一种高纯度琼胶酶的制备工艺 | |
| CN107814440A (zh) | 一种用于污水处理的菌藻复合剂及其制备方法 | |
| Sushma et al. | Isolation, production and purification of lipase from Aspergillus niger using gingerly oil cake as substrate | |
| CN112662596B (zh) | 一株产耐碱耐金属离子耐有机溶剂酯类水解酶的中温细菌及其应用 | |
| CN112779188B (zh) | 一株产高盐度耐受性酯类水解酶的中温细菌及其应用 | |
| CN112375699B (zh) | 一株表达脂肪酶的地衣芽孢杆菌及其发酵产酶方法 | |
| JPH0121957B2 (zh) | ||
| Lateef et al. | Study the Effect of Some Growth Factor on the Production of Pectinase Enzyme by Locally Isolation Bacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20210615 |