CN107236054A - 一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法及应用 - Google Patents

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    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan

Abstract

本发明公开了一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法及其应用，其方法为采用纤维素酶水解泡叶藻聚糖，得到不同分子量片段的泡叶藻聚糖水溶液，再通过超滤膜分离得到低分子量泡叶藻聚糖。本发明的酶法制备低分子量泡叶藻聚糖生产工艺的反应条件温和，可控性强，制备出的低分子量聚糖片段具有很好的免疫诱导活性。将制备的低分子量泡叶藻聚糖应用于调节机体免疫是一种安全、绿色的产品，可用于功能性食品和药品原料的开发。

Description

一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及低分子量海藻多糖制备的技术领域，尤其涉及一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法及应用。
背景技术
泡叶藻(Ascophyllum nodosum)，又称岩衣藻，是一种大型的海洋褐藻,主要在北大西洋沿岸生长繁殖。和其他褐藻(比如海带)相似。泡叶藻含有丰富的褐藻胶(alginateacid)(约占藻体所含总糖质的79％)，是工业生产褐藻胶、碘和甘露醇的主要原料之一。除褐藻胶外，泡叶藻还含有约占藻体总糖质的13％的泡叶藻聚糖(ascophyllan)和8％的岩藻聚糖(fucoidan)。在我国，泡叶藻在工业上主要被用作提取褐藻胶的原料；农业生产上用来制作化肥、饲料等；在食品行业中主要用来制作海藻粉。
高分子量泡叶藻聚糖分子量大(平均分子量约390kDa)且结构复杂，其免疫诱导活性与糖分子结构的关系尚不明确，与此同时,大分子多糖不利于人体消化吸收。目前,国内外用于制备低分子量海藻聚糖的技术主要采用酸、碱水解法及氧化法。这些方法虽然能够降低海藻聚糖的分子量,但化学反应强烈,其后果是改变了多糖的立体结构，同时引起活性基团的部分脱落,最终降低了产品的生物活性甚至活性完全丧失。
有鉴于此，本发明人研究和设计了一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法及应用，本案由此产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法及应用，以获得高纯度且具有强免疫诱导活性的低分子量泡叶藻聚糖，用以提高其在人体消化吸收效率及免疫诱导活性。
为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法,包括以下步骤：
步骤一、泡叶藻粉的制备：
将泡叶藻洗净、烘干后、粉碎，过60目标准筛，制得泡叶藻粉；
步骤二、泡叶藻聚糖干粉的制备：
称量30g泡叶藻粉，按重量体积比1:30g/mL的比例加入去离子水，100℃下提取，提取过程中不断搅拌2h，冷却后5000×g离心20min，取上清液，加入3M HCL使之终浓度为pH1.3，离心去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为体积50％，过夜离心，取沉淀物，透析冻干后，制得泡叶藻聚糖干粉；
步骤三、酶解泡叶藻聚糖：
将0.5g泡叶藻聚糖干粉溶于0.02M的pH为3-7的醋酸盐缓冲液，纤维素酶按照3-7U/mL添加到上述溶液中混合均匀，45-65℃下水解1-20h，在100℃灭活15min，终止水解反应，制得不同分子量片段的泡叶藻聚糖水溶液；
步骤四、分离：将制得的不同分子量片段的泡叶藻聚糖水溶液经过分子截留量为10kDa的超滤膜分离，再经分子量截留1kDa的透析袋透析冻干，再经凝胶色谱柱分离收集多糖组分，冷冻干燥后，制得泡叶藻聚糖片段As-C。
优选地，所述纤维素酶添加量5U/mL。
优选地，所述纤维素酶最适pH为6。
优选地，所述纤维素酶最适温度为55℃。
一种低分子量泡叶藻聚糖的应用，所述泡叶藻聚糖具有免疫诱导活性，可用于功能性食品与药品原料。
由于本发明采用了上述的技术方案，即通过纤维素酶降解泡叶藻聚糖，得到的小分子片段泡叶藻聚糖片段As-C的免疫诱导活性较原多糖活性，在特定浓度范围内提高了20％，同时酶降解法反应条件温和，切割位点固定，对产物结构及其生物活性的破坏作用弱。
附图说明
图1温度对纤维素酶降解泡叶藻聚糖的影响；
图2酶浓度对纤维素酶降解泡叶藻聚糖的影响；
图3pH对纤维素酶降解泡叶藻聚糖的影响；
图4酶解片段对RAW264.7细胞免疫活性诱导NO含量测定的结果。
具体实施方式
实施例1
本发明揭示了一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法,包括以下步骤：
步骤一、泡叶藻粉的制备：
将泡叶藻洗净、烘干后、粉碎，过60目标准筛，制得泡叶藻粉；
步骤二、泡叶藻聚糖干粉的制备：
称量30g泡叶藻粉，按重量体积比1:30g/mL的比例加入去离子水，100℃下提取，提取过程中不断搅拌2h，冷却后5000×g离心20min，取上清液，加入3M HCL使之终浓度为pH1.3，离心去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为体积50％，过夜离心，取沉淀物，透析冻干后，制得泡叶藻聚糖干粉；
步骤三、酶解泡叶藻聚糖：
将0.5g泡叶藻聚糖干粉溶于0.02M的pH为3-7的醋酸盐缓冲液，纤维素酶按照3-7U/mL添加到上述溶液中混合均匀，45-65℃下水解1-20h，在100℃灭活15min，终止水解反应，制得不同分子量片段的泡叶藻聚糖水溶液；
步骤四、分离：
将制得的不同分子片段的泡叶藻聚糖水溶液经过分子截留量为10kDa的超滤膜分离，再经分子量截留1kDa的透析袋透析冻干，再经凝胶色谱柱分离收集多糖组分，冷冻干燥后，制得泡叶藻聚糖片段As-C。
实施例2单因素酶解实验
2.1温度对纤维素酶降解泡叶藻聚糖的影响
在实施例1的步骤三中，考查不同温度45℃，50℃，55℃，60℃，65℃对纤维素酶降解泡叶藻聚糖的影响，如图1所示，在55℃时，还原糖浓度最高，即酶解效率最高。
2.2酶浓度对纤维素酶降解泡叶藻聚糖的影响
在实施例1的步骤三中，考查不同酶浓度3U/ml，4U/ml，5U/ml，6U/ml，7U/ml对纤维素酶降解泡叶藻聚糖的影响，如图2所示，在酶浓度5U/ml时，还原糖浓度最高，即酶解效率最高。
2.3pH对纤维素酶降解泡叶藻聚糖的影响
在实施例1的步骤三中，考查pH为3,pH为4，pH为5，pH为6，pH为7对纤维素酶降解泡叶藻聚糖的影响，如图2所示，在pH为6时，还原糖浓度最高，即酶解效率最高。
实施例3
将实施例1步骤二制得的0.5g泡叶藻聚糖干粉分别通过纤维素酶、褐藻胶裂解酶、木聚糖酶降解得到低分子量泡叶藻聚糖片段，分别将含有所述不同分子片段的低聚泡叶藻聚糖水溶液采用小型超滤膜分离装置进行不同分子量低聚泡叶藻聚糖的分离，蠕动泵以5.3L/min的流量将所述不同分子片段的低聚泡叶藻聚糖水溶液输送到分子截留量为10kDa的中空改性聚氯乙烯膜进行分离，压力，当溶液体积浓缩至1/6时，停止超滤，收集分子截留量10kDa以下的溶液，旋蒸浓缩至1/6时，停止浓缩，并收集浓缩液，得到分子截留量为10kDa以下的低聚泡叶藻聚糖组分，将该浓缩液经(100Da分子量截留透析膜)透析冻干后经凝胶色谱柱进行纯化得到低分子量泡叶藻聚糖As-C、As-A、As-X，分别用As-C、As-A、As-X对RAW264.7细胞进行诱导并测定细胞产生NO含量。
将RAW264.7细胞按3×104cell/well，100μL加入到96孔板，6-8h贴壁后弃上清，将As-C、As-A、As-X、As(泡叶藻聚糖)分别用细胞培养基配制成0～200μg/mL的浓度样品溶液，按照100μL/孔加到上述96孔板每个浓度设置4个重复孔。培养24h后取50μL上清，加入Griess试剂100μL，避光反应20min后540nm下测其吸光度。以已知浓度的NO2 -标准溶液绘制标准曲线，计算培养上清中NO2 -的含量。
实验结果表明，As-X对RAW264.7细胞几乎没有NO诱导活性，其上清中NO2 -浓度为9.2μM，As-A、As在200μg/mL浓度下诱导RAW264.7细胞产生的NO(37.5μM、40.2μM)含量明显低于As-C(47.6μM)。进而，筛选出As-C作为理想的免疫诱导活性片段
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (5)

1.一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法,其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、泡叶藻粉的制备：
将泡叶藻洗净、烘干后、粉碎，过60目标准筛，制得泡叶藻粉；
步骤二、泡叶藻聚糖干粉的制备：
称量30g泡叶藻粉，按重量体积比1:30g/mL的比例加入去离子水，100℃下提取，提取过程中不断搅拌2h，冷却后5000×g离心20min，取上清液，加入3M HCL使之终浓度为pH1.3，离心去除褐藻酸沉淀后收集上清液，加入无水乙醇使之终浓度为体积50%，过夜离心，取沉淀物，透析冻干后，制得泡叶藻聚糖干粉；
步骤三、酶解泡叶藻聚糖：
将0.5g泡叶藻聚糖干粉溶于0.02M的pH为3-7的醋酸盐缓冲液，纤维素酶按照3-7U/mL添加到上述溶液中混合均匀，45-65℃下水解1-20h，在100℃灭活15min，终止水解反应，制得不同分子量片段的泡叶藻聚糖水溶液；
步骤四、分离：
将制得的不同分子量片段的泡叶藻聚糖水溶液经过分子截留量为10kDa的超滤膜分离，再经分子量截留1kDa的透析袋透析冻干，再经凝胶色谱柱分离收集多糖组分，冷冻干燥后，制得泡叶藻聚糖片段As-C。
2.如权利要求1所述的一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法,其特征在于：在所述步骤三中，所述纤维素酶添加量5U/mL。
3.如权利要求1所述的一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法,其特征在于：在所述步骤三中，所述纤维素酶最适pH为6。
4.如权利要求1所述的一种低分子量泡叶藻聚糖的制备方法,其特征在于：在所述步骤三中，所述纤维素酶最适温度为55℃。
5.一种低分子量泡叶藻聚糖的应用，其特征在于：所述泡叶藻聚糖具有免疫诱导活性，可用于功能性食品及药品原料。
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