CN103788219A - 一种从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海藻化学领域,具体地说是一种从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法。具体对泡叶藻(Ascophyllum mackaii)分别采用稀盐酸和水浸泡提取,浸泡液通过发泡机净化提取液,分别收集上层漂浮物以及底层沉淀物并采用过滤收集和细胞破碎提取的方法充分提取收集泡叶藻中的多糖。超滤技术除去盐分并获得20000道尔顿之内的分级产物。乙醇沉淀法获得岩藻聚糖硫酸酯粗品。DEAE-Sepharose F.F.的阴离子交换树脂色谱柱进行纯化,分级。8-14KD透析袋再次分级、浓缩,低温浓缩和冷冻干燥获得岩藻聚糖硫酸酯产品。
Description
技术领域
本发明涉及海藻化学领域,具体地说是一种从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法。
背景技术
岩藻聚糖硫酸酯(fucoidan),又名岩藻多糖或褐藻糖胶,是一种水溶性的硫酸杂多糖,普遍存在于褐藻和一些棘皮动物中。研究发现岩藻聚糖硫酸酯具有抗凝血、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等多种生物学活性,并且随着其应用价值的不断提升,需求量也在增加。因此如何提高岩藻聚糖硫酸酯中主要成分的提取率是对其进行产业化利用的关键。
岩藻聚糖硫酸酯的主要成分除了L-岩藻糖和硫酸根外,还含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白质等,越来越多的研究表明,其活性与硫酸根含量和位置密切相关。不同的提取方法、提取工艺条件对岩藻聚糖硫酸酯得率有很大影响,而且对其多糖含量与硫酸根含量的影响不同。虽然刘红英等和李兆新等对岩藻聚糖硫酸酯的含量测定进行了一些探讨,但由于其组成复杂还没有标准方法。因此在提取纯化过程中,评价指标也各不相同,大部分用粗多糖质量、粗多糖中多糖含量来表示。
由于岩藻聚糖硫酸酯主要由岩藻糖和硫酸根组成,这两者的成分含量对岩藻聚糖硫酸酯的活性起很重要的作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
一种从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法:
1)将泡叶藻原料于40-60℃下浸泡提取在泡叶藻原料干藻重量6-10倍的稀盐酸溶液中1.3-4.8h,稀酸浸泡液待用,保留上层漂浮物;酸浸泡后的泡叶藻固体继续加入其体积3-6倍的水溶液,搅拌浸泡4-7h,收集水浸泡液,将稀酸浸泡和水浸泡液合并待用;
2)将上层漂浮物调节至pH5.5-6.5,在经过滤或高速离心,收集过滤液A;
将上述依次经稀酸和水浸泡后固态藻体采用纳米高压均质机进行细胞破碎,破碎后进行离心分离收集上清液B;
3)将上述合并液、过滤液A和上清液B混合均匀后进行超滤去除盐分,而后超滤浓缩至原料重量的1/2体积(V/W),浓缩液进行醇沉淀,沉淀物干燥,即为岩藻聚糖硫酸酯粗干品;
4)将上述岩藻聚糖硫酸酯粗干品加入其3-5倍重量的蒸馏水中进行溶解,溶解后通过装有DEAE-Sepharose F.F.的阴离子交换树脂柱进行洗脱,收集洗脱液透析后于55-65℃低温浓缩并冷冻干燥获得,即得到原藻重量1.5-2.3%的岩藻聚糖硫酸酯。
所述泡叶藻原料为南非、智利、秘鲁的泡叶藻或大型巨藻的一种或多种。
所述泡叶藻原料浸泡在浓度为0.08-0.28mo l/L的稀盐酸溶液中。
所述步骤2)收集固态藻体,使用美国NB纳米高压均质机在300-2300r/min的转速下对底层固态藻体进行细胞破碎,破碎后以O-1600rpm速度进行离心分离,收集上清液B。
所述步骤3)合并提取液、过滤液A和上清液B混合均匀后,采用超滤技术去除盐分,获得10000-20000道尔顿的分级产物,而后进行超滤浓缩至原藻重量的1/2(V/W);所得浓缩液加入到其2-5倍体积的95%乙醇中,在5℃放置过夜使沉淀完全,收集沉淀物以1000-4000r/min,离心20min,收集沉淀用85%乙醇洗涤。
所述浓缩液加入到95%乙醇中,使浓缩液中的乙醇含量达到50-65%。
所述步骤4)溶解后依次用岩藻聚糖硫酸酯粗品重量3-5倍的蒸馏水和1-2mo l/L的氯化钠溶液作为洗脱液进行阴离子交换树脂柱洗脱,收集氯化钠洗脱液并用8-14KD的透析袋进行透析。
本发明所具有的优点:
本发明从泡叶藻中提取出的藻聚糖硫酸酯含量明显高于海带;并有效的提高和保留了岩藻聚糖硫酸酯中活性成分其中泡叶藻主要包括南非泡叶藻以及智利和秘鲁泡叶藻等。采用本发明采用DEAE-Sepharose F.F.的阴离子交换树脂色谱柱对获得的岩藻聚糖硫酸酯粗品进行纯化。具有潜在的产业化推广价值。
具体实施方式
实施例1
称取淡干南非、智利、秘鲁等泡叶藻或巨藻100千克,切割成1-2cm小块,转移到具有温度调节和分层出口的不锈钢搅拌器中,加入900千克0.1%mo l/L的盐酸溶液,调节温度到60℃,搅拌提取4h。静置2h后打开出料口分别收集底层泡叶藻固体、上层漂浮物以及稀酸提取液。底层泡叶藻固体继续加入300千克水,浸泡搅拌4h,1000r/min离心,继续保留固体藻渣并收集水提取液。合并上述酸提取液和水提取液。
上层漂浮物用NaOH调节pH5.5,100目筛绢网过滤,收集过滤液A。将上述稀酸和水提取后的固体藻渣采用美国NB型纳米高压均质机以转速1300r/min进行细胞破碎5min,破碎后用高速离心机进行离心分离(1000r/min),收集离心上清液B。合并稀酸和水提取液、过滤液A和上清液B。使用10%碳酸氢钠调节pH到6.5,采用美国联合碳化生产的MD34超滤技术除去盐分,获得15000-25000道尔顿的分级产物并超滤浓缩至50千克。浓缩液中加入150千克的95%乙醇,使超滤浓缩液中的乙醇含量达到50%,在5℃条件下静置过夜达到沉淀完全。沉淀物转移至高速离心机(4000r/min)离心20min,收集沉淀物并分别用3Kg95%乙醇和5Kg95%乙醇洗涤。向洗涤后的沉淀物中加入9Kg蒸馏水并充分搅拌溶解后通过装有DEAE-SepharoseF.F.的阴离子交换树脂柱(φ0.6×1.5m)。依次用10Kg蒸馏水和15Kg1mol/L的氯化钠溶液分别洗脱,收集氯化钠洗脱液,并用8-14KD的透析袋进行透析,去除小分子多糖和盐分。透析液在58℃温度下浓缩,冷冻干燥获得泡叶藻岩藻聚糖硫酸酯产品1.58Kg。产品得率可以达到1.6-1.7%,岩藻聚糖硫酸酯的纯度可以达到85-90%。
实施例2
称取淡干南非、智利、秘鲁等泡叶藻或巨藻100千克,切割成1-2cm小块,转移到具有温度调节和分层出口的不锈钢搅拌器中,加入600千克0.2%mo l/L的盐酸溶液,调节温度到40℃,搅拌提取1.3h。静置3h后打开出料口分别收集底层泡叶藻固体、上层漂浮物以及稀酸提取液。
底层泡叶藻固体继续加入500千克水,浸泡搅拌4h,1000r/min离心,继续保留固体藻渣并收集水提取液。
合并上述酸提取液和水提取液。
上层漂浮物用NaOH调节pH6.5,100目筛绢网过滤,收集过滤液A。将上述稀酸和水提取后的固体藻渣采用美国NB型纳米高压均质机以转速2000r/min进行细胞破碎3min,破碎后用高速离心机进行离心分离(1600r/min),收集离心上清液B。
合并稀酸和水提取液、过滤液A和上清液B。使用10%碳酸氢钠调节pH到6.5,采用美国联合碳化生产的MD34超滤技术除去盐分,获得15000-25000道尔顿的分级产物并超滤浓缩至50千克。
浓缩液中加入200千克的95%乙醇,使超滤浓缩液中的乙醇含量达到55%,在5℃条件下静置过夜达到沉淀完全。沉淀物转移至高速离心机(4000r/min)离心20min,收集沉淀物并分别用3Kg95%乙醇和5Kg95%乙醇洗涤。向洗涤后的沉淀物中加入13Kg蒸馏水并充分搅拌溶解后通过装有DEAE-Sepharose F.F.的阴离子交换树脂柱(φ0.6×1.5m)。依次用10Kg蒸馏水和15Kg1mol/L的氯化钠溶液分别洗脱,收集氯化钠洗脱液,并用8-14KD的透析袋进行透析,去除小分子多糖和盐分。透析液在58℃温度下浓缩,冷冻干燥获得泡叶藻岩藻聚糖硫酸酯产品1.63Kg。
Claims (7)
1.一种从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法,其特征在于:
1)将泡叶藻原料于40-60℃下浸泡提取在泡叶藻原料干藻重量6-10倍的稀盐酸溶液中1.3-4.8h,稀酸浸泡液待用,保留上层漂浮物;酸浸泡后的泡叶藻固体继续加入其体积3-6倍的水溶液,搅拌浸泡4-7h,收集水浸泡液,将稀酸浸泡和水浸泡液合并待用;
2)将上层漂浮物调节至pH5.5-6.5,在经过滤或高速离心,收集过滤液A;
将上述依次经稀酸和水浸泡后固态藻体采用纳米高压均质机进行细胞破碎,破碎后进行离心分离收集上清液B;
3)将上述合并液、过滤液A和上清液B混合均匀后进行超滤去除盐分,而后超滤浓缩至原料重量的1/2体积(V/W),浓缩液进行醇沉淀,沉淀物干燥,即为岩藻聚糖硫酸酯粗干品;
4)将上述岩藻聚糖硫酸酯粗干品加入其3-5倍重量的蒸馏水中进行溶解,溶解后通过装有DEAE-Sepharose F.F.的阴离子交换树脂柱进行洗脱,收集洗脱液透析后于55-65℃低温浓缩并冷冻干燥获得,即得到原藻重量1.5-2.3%的岩藻聚糖硫酸酯。
2.按权利要求1所述从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法,其特征在于:所述泡叶藻原料为南非、智利、秘鲁的泡叶藻或大型巨藻的一种或多种。
3.按权利要求1所述从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法,其特征在于:所述泡叶藻原料浸泡在浓度为0.08-0.28mol/L的稀盐酸溶液中。
4.按权利要求1所述从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法,其特征在于:所述步骤2)收集固态藻体,使用美国NB纳米高压均质机在300-2300r/min的转速下对底层固态藻体进行细胞破碎,破碎后以O-1600rpm速度进行离心分离,收集上清液B。
5.按权利要求1所述从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法,其特征在于:所述步骤3)合并提取液、过滤液A和上清液B混合均匀后,采用超滤技术去除盐分,获得10000-20000道尔顿的分级产物,而后进行超滤浓缩至原藻重量的1/2(V/W);所得浓缩液加入到其2-5倍体积的95%乙醇中,在5℃放置过夜使沉淀完全,收集沉淀物以1000-4000r/min,离心20min,收集沉淀用85%乙醇洗涤。
6.按权利要求5所述从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法,其特征在于:所述浓缩液加入到95%乙醇中,使浓缩液中的乙醇含量达到50-65%。
7.按权利要求1所述从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法,其特征在于:所述步骤4)溶解后依次用岩藻聚糖硫酸酯粗品重量3-5倍的蒸馏水和1-2mol/L的氯化钠溶液作为洗脱液进行阴离子交换树脂柱洗脱,收集氯化钠洗脱液并用8-14KD的透析袋进行透析。
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