CN103525866A

CN103525866A - 制备质粒的方法

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Publication number: CN103525866A
Application number: CN201310476324.8A
Authority: CN
Inventors: 马梵辛; 许勇; 王学海; 李�杰; 李莉娥
Original assignee: Ren Fu Pharmaceutical Group Stock Co
Current assignee: Ren Fu Pharmaceutical Group Stock Co
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2013-10-11
Publication date: 2014-01-22

Abstract

本发明提出了一种制备质粒的方法，该方法包括：对含有质粒的大肠杆菌进行液体培养，该培养是在适于该质粒复制的条件下进行的，以便获得大肠杆菌培养液；将该大肠杆菌培养液进行裂解，以便获得大肠杆菌裂解液；对该大肠杆菌裂解液进行微滤，以便对该大肠杆菌裂解液进行净化；对该经过净化的大肠杆菌裂解液进行超滤浓缩；以及利用凝胶分离法，从经过超滤浓缩处理的大肠杆菌裂解液分离该质粒。利用该方法能够有效制备质粒。

Description

制备质粒的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及制备质粒的方法。

背景技术

基因治疗具有修复天然分子功能的能力，而且可能是永久性的效果，自从20世纪90年代首次成功进行了基因治疗的临床试验以来，迄今已完成了数千例基因治疗临床试验，目前大部分的实验仍采用转染率较高的病毒载体，其缺点在于潜在的致癌性、自身免疫原性和造成细胞病理改变等。今年来非病毒基因治疗载体备受关注，和病毒载体相比非病毒载体具有低毒，低免疫反应、外援基因整合机率低、无基因插入片段大小限制，以及使用简单、之辈方便、便于保存和检验等优势。由于在实验与治疗方面非病毒载体表现出多种潜在的优越性，越来越多的研究人员开始选择非病毒载体进行基因治疗方面的研究，其中裸质粒DNA载体已成为非病毒载体临床研究中最热门的一种。

裸质粒DNA注射将目的基因连接在表达的质粒中直接进行DNA注射而不依赖其他物质的介导，是最简单的非病毒载体系统，其优点是对机体无毒无害，操作简便，缺点是基因转移率比病毒载体的感染效率要低，而且不稳定，需要多次给药。

但是，随着基因枪或电穿孔技术的出现，显著提升了裸质粒DNA的转移效率，DNA不但可穿透靶细胞的细胞膜，还可直接到达细胞核，避免了各种酶对DNA的降解。近几年的研究表明，质粒DNA作为基因治疗的一种方式，是在临床上切实可行，相对传统病毒载体来说具有更高的安全性。

普遍认为质粒载体比病毒载体安全性高，原因在于病毒载体具有毒性和免疫原性，同时，病毒载体有可能对癌基因具有激活或对抑癌基因具有失活的作用。另外，质粒载体生产工艺简便，易获得大量符合药学规格的质粒DNA。质粒DNA是双链共价闭环DNA分子，其大小范围为0.8～120kb；质粒DNA的形式有：超螺旋、开环及线性形式。由于超螺旋质粒在基因表达方面优于其他形式的质粒载体，因此在常规的质粒生产中，用超螺旋质粒的比例作为药物的质量标准已被普遍采用。基因治疗用重组质粒载体一般包括两个部分：细菌序列和真核表达序列。细菌序列中含有原核复制起点（ＣｏｌＥ1）、抗性基因(kanR、AmpR)及一些具有免疫源性的CpG基序。研究发现，细菌序列的存在对质粒载体中真核基因的表达有抑制作用。最近发展起来的新型非病毒载体微环DNA（非质粒载体）有望进入临床研究。微环DNA是通过特异性重组酶系统使亲本质粒在大肠杆菌体内发生重组得到去除细菌复制起点和选择标记等序列，而仅含编码治疗基因的小超螺旋DNA。Chen等证明微环质粒DNA的表达效率是亲本质粒的200～560倍。随着技术手段的更新，目前微环DNA的生产量能达到毫克级水平且纯度满足临床用药要求。分子生物学实验中，质粒DNA一般由大肠杆菌在摇瓶中培养获得。温度、转速和培养基是可控因素，质粒DNA产量一般在3～5μg/ml。而在发酵罐中，培养基组分、温度、溶解氧、pＨ值、搅拌速度、代谢产物等影响细菌生长及质粒DNA产量的因素都能得到监测和控制，质粒DNA的产量是摇瓶培养的10～50倍。Carnes等在发酵过程中通过控制温度等一系列措施提高质粒DNA产量，每升培养基可产出2600mg质粒DNA。尽管商业培养基广泛应用于质粒的生产，但选择培养基时需综合考虑以下几个因素，质粒的产率、质量；生物量及对分离纯化的潜在影响。质粒生产使用的任何原料需满足GMP质量要求。

但是在生产过程中固液分离成为下游放大中的一个瓶颈。细胞裂解后，释放的宿主DNA和其他杂质与细胞碎片包裹在一起形成白色固体状絮凝物。实验室常用的方法是利用

固定角转子离心机离心分离，但耗时且不适合大规模生产。工业上一般使用连续离心的方式来获得高处理量，然而高速离心产生的剪切力使宿主DNA断裂，给后续纯化增加难度，不适合大规模生产。过滤是大规模质粒生产工艺中最好的选择，利用孔径为5μｍ过滤装置，能除掉99%的沉淀杂质，质粒的回收率可达67%，其纯度达总核酸的46%。孔径＞15μm的过滤材料不能有效地除去固体颗粒，不能满足操作需求。硅藻土等助滤剂的使用能有效地提高过滤效率、降低过滤压力，避免宿主DNA受到剪切力而断裂。在分离纯化早期，在裂解液中使用各种无机盐或多聚物如：硫酸铵、氯化钙、PEG等来选择性沉淀纯化质粒。这些分离的方法有各自的优缺点，选择一个好的分离策略决定了随后的纯化工艺和终产品的质量。

尽管大多数宿主DNA在裂解过程中变性沉淀除去了，但质粒DNA仅占大肠杆菌裂解液中总核酸量的3%，大量的RNA和宿主蛋白仍然存在于裂解液中，因此，在随后的过程中需将其除去。澄清和浓缩步骤的主要目的是除去RNA和宿主蛋白，增加质粒DNA的相对含量。在澄清过程中最关注的问题是怎样除去RNA，利用内源性核酸酶有利于碱裂解后期除去RNA。Monteiro等证明将裂解液在37℃下孵育，RNA可降低40%，质粒仅降低9%。裂解液中的蛋白可通过盐析方法将其除去，常见的离子盐溶液有氯化钙、硫酸铵，在裂解液中加入离子盐有利于将RNA与蛋白共沉淀。通常在澄清后，用聚乙二醇浓缩质粒以减少后续纯化的体积。同时，聚乙二醇沉淀质粒后可以实现缓冲液的更换，为后续纯化作准备。但是以上这些方法都在澄清浓缩过程中引入了RNA酶或聚乙二醇等物质，在后续工艺中还需要进行去除和验证，不适宜药物生产的需要。本发明在未引入任何其它物质的情况下通过多种物理过滤、超滤的方法实现固液分离，实现了质粒药物的制药生产需要。

质粒DNA应用于临床的另一个挑战是质粒的浓度，临床上一般需要毫克级以上，而且要求用量体积小，特别是在应用于肌肉注射时。尽管可以通过乙醇或聚乙二醇沉淀质粒获得高浓度质粒，但这种方法存在以下三个缺陷：（1）在高速离心和强烈混合时，超螺旋质粒很容易受到破坏；（2）残留的乙醇、乙二醇难以去除；（3）使用可燃试剂增加了生产安全隐患。

因而，目前制备质粒的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效制备质粒的方法，尤其是适用于工业化生产质粒的方法。

根据本发明的实施例，本发明的提出了一种制备质粒的方法，其包括：对含有质粒的大肠杆菌进行液体培养，所述培养是在适于所述质粒复制的条件下进行的，以便获得大肠杆菌培养液；将所述大肠杆菌培养液进行裂解，以便获得大肠杆菌裂解液；对所述大肠杆菌裂解液进行微滤，以便对所述大肠杆菌裂解液进行净化；对所述经过净化的大肠杆菌裂解液进行超滤浓缩；以及利用凝胶分离法，从经过超滤浓缩处理的大肠杆菌裂解液分离所述质粒。利用该方法，能够有效地对于工业化生产质粒的过程中所产生的大肠杆菌菌体裂解液进行净化，从而降低了生产成本，提高了生产效率。

在本发明的一个实施例中，所述大肠杆菌培养液的OD₆₀₀值为20。

在本发明的一个实施例中，将所述大肠杆菌培养液进行裂解进一步包括：对所述大肠杆菌培养液进行离心，以便获得大肠杆菌菌体沉淀；利用重悬溶液对所述大肠杆菌菌体沉淀进行重悬，以便获得大肠杆菌悬浮液，其中，所述重悬溶液包含50mM葡萄糖、50mM Tris以及10mM EDTA；所述大肠杆菌悬浮液与等体积的裂解溶液混合，并在15-30rpm的转速下进行搅拌，其中，所述裂解溶液包含0.2M NaOH以及1%SDS；将经过裂解溶液处理的大肠杆菌悬浮液与等体积的3.0M醋酸钾溶液混合，并在15-30rpm的转速下进行搅拌，以便获得所述大肠杆菌裂解液。

在本发明的一个实施例中，对所述大肠杆菌裂解液进行微滤进一步包括：采用孔径为1～100微米的过滤器对所述大肠杆菌裂解液进行初步过滤；以及将经过初步过滤的大肠杆菌裂解液进行切向流过滤。

在本发明的一个实施例中，采用孔径为1微米的过滤器对所述大肠杆菌裂解液进行初步过滤。

在本发明的一个实施例中，采用选自Polysep II CGW3、Millistak CE50、F0HC和Milligard CW03的至少一种进行所述切向流过滤。

在本发明的一个实施例中，所述超滤浓缩是采用切向流超滤浓缩系统进行的，其中，所述切向流超滤浓缩系统采用分子截留量为30～300kD的再生纤维素膜或聚醚砜膜。

在本发明的一个实施例中，采用死端过滤的方式进行所述超滤浓缩。

在本发明的一个实施例中，所述切向流超滤浓缩系统采用尼龙膜过滤器、不锈钢筛网过滤器、不锈钢圆盘过滤器或硬性塑料过滤器。

在本发明的一个实施例中，所述超滤浓缩的浓缩倍数为2～20，优选5～15，更优选10。

由此，本发明提出一种适用于于大规模生物药物生产的高效质粒澄清浓缩方案。该方法包括：（i）按照特定的工艺路线进行菌体裂解后的澄清，澄清后的裂解液能够直接用于凝胶分离；以及（ii）对澄清后的裂解液进行浓缩，在基本不损失目标产物的情况下缩短产品制造时间。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂、耗材、器材均为市场上可以购得的，也均为本领域技术人员可以操作和使用的。

实施例1

首先，将含质粒的大肠杆菌采用LB培养基进行5L发酵罐进行发酵，发酵条件为：转速250rpm作为起始条件，溶氧控制在20-40%，并进行溶氧/转速关联，pH控制在6.8-7.2之间，连续发酵10小时，以便获得大肠杆菌培养液。

收获大肠杆菌培养液(OD₆₀₀:20)后，将所得到的大肠杆菌培养液进行离心。按照100g加入1升溶液I、II或III的比例，依次将离心沉淀进行：

用溶液I进行悬浮，溶液I包含50mM葡萄糖、50mM Tris以及10mM EDTA；

在15-30rpm的转速下进行搅拌，用溶液II进行裂解，溶液II包含0.2M NaOH以及1%SDS；以及

在15-30rpm的转速下进行搅拌，用溶液III沉淀杂质，溶液III为3.0M醋酸钾溶液。

最后，得到裂解液的总体积约为3L。然后用离心的方式去除碱裂解后的大量沉淀。发明人发现，所得到的裂解液有大量絮状物漂浮在内部，即使静置30min以后，可以看到絮状物开始分层，即使再次进行离心，仍然不能得到澄清的裂解液，从而无法直接进行凝胶分离质粒。因此后续需要进行裂解液澄清。

实施例2

按照以下步骤，将实施例1中所得到的约3L大肠杆菌裂解液进行微滤：

首先，利用1μm不锈钢过滤器和Polygard CR50μm对所述大肠杆菌裂解液进行初步过滤；

然后，分别采用Polysep II CGW3和Millistak CE50，F0HC及Milligard CW03将经过初步过滤的大肠杆菌裂解液进行切向流过滤，以便实现对大肠杆菌裂解液进行净化。

其中，在初步过滤和切向流过滤步骤时均测定并比较采用各过滤器的过滤效果，结果总结在表1中。

表1

在上表1中的第二列中列出的是首先进行初步过滤澄清所采用的滤器类型，在第二列中列出的是在进行初步澄清之后进行第二级澄清过滤（即切向流过滤）所采用的滤器类型。即，如表1所示，其中“预过滤器”表示初步过滤步骤所采用的过滤器，“过滤器”表示切向流过滤步骤所采用的过滤器。

根据表1的实验结果，可以看出对于大肠杆菌裂解液，通过1μm不锈钢过滤器（SSfilter）可以获得很好的澄清效果，但载量偏低。经1μm不锈钢过滤器过滤后，再采用PolysepII CGW3进行切向流过滤，可获得较高的载量，达到了306L/m²，而且可以获得非常好的滤液质量。由此表明，在本发明的制备质粒的方法中，对大肠杆菌裂解液进行微滤，优选地，采用1μm不锈钢过滤器进行初步过滤过滤，以及采用Polysep II CGW3进行切向流过滤。

实施例3

采用Millpore的Millistak+Mini滤器配合100kD再生纤维素膜包，对前面实施例2中各组经过净化的大肠杆菌裂解液分别进行超滤浓缩，流速为200ml/min，浓缩10倍。在浓缩10倍以后，利用凝胶分离法即琼脂糖凝胶电泳法，从经过超滤浓缩处理的大肠杆菌裂解液分离质粒并检测其质量。结果显示，质粒的损失低于10%。

此外，发明人还发现，在上述实验中，采用再生纤维素膜包对经过净化的大肠杆菌裂解液进行浓缩后不仅可以缩短上样的时间，减少下游纯化的设备和耗材投入，而且大大提高了整体工艺效率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种制备质粒的方法，其特征在于，包括：

对含有质粒的大肠杆菌进行液体培养，所述培养是在适于所述质粒复制的条件下进行的，以便获得大肠杆菌培养液；

将所述大肠杆菌培养液进行裂解，以便获得大肠杆菌裂解液；

对所述大肠杆菌裂解液进行微滤，以便对所述大肠杆菌裂解液进行净化；

对所述经过净化的大肠杆菌裂解液进行超滤浓缩；以及

利用凝胶分离法，从经过超滤浓缩处理的大肠杆菌裂解液分离所述质粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌培养液的OD₆₀₀值为20。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述大肠杆菌培养液进行裂解进一步包括：

对所述大肠杆菌培养液进行离心，以便获得大肠杆菌菌体沉淀；

利用重悬溶液对所述大肠杆菌菌体沉淀进行重悬，以便获得大肠杆菌悬浮液，其中，所述重悬溶液包含50mM葡萄糖、50mM Tris以及10mM EDTA；

所述大肠杆菌悬浮液与等体积的裂解溶液混合，并在15-30rpm的转速下进行搅拌下，其中，所述裂解溶液包含0.2M NaOH以及1%SDS；

将经过裂解溶液处理的大肠杆菌悬浮液与等体积的3.0M醋酸钾溶液混合，并在15-30rpm的转速下进行搅拌，以便获得所述大肠杆菌裂解液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述大肠杆菌裂解液进行微滤进一步包括：

采用孔径为1～100微米的过滤器对所述大肠杆菌裂解液进行初步过滤；以及

将经过初步过滤的大肠杆菌裂解液进行切向流过滤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用孔径为1微米的过滤器对所述大肠杆菌裂解液进行初步过滤。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用选自Polysep II CGW3、MillistakCE50、F0HC和Milligard CW03的至少一种进行所述切向流过滤。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超滤浓缩是采用切向流超滤浓缩系统进行的，其中，所述切向流超滤浓缩系统采用分子截留量为30～300kD的再生纤维素膜或聚醚砜膜。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用死端过滤的方式进行所述超滤浓缩。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述切向流超滤浓缩系统采用尼龙膜过滤器、不锈钢筛网过滤器、不锈钢圆盘过滤器或硬性塑料过滤器。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述超滤浓缩的浓缩倍数为2～20，优选5～15，更优选10。