CN1666784A - 组氨酸在血液净化亲合吸附介质中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血液净化亲合吸附介质，具体地说是组氨酸在血液净化亲合吸附介质中的应用。L－组氨酸亲合吸附介质是一种可以取代蛋白A免疫吸附柱用于血液净化的新型亲合吸附介质；通过共价键合的方法，将L－组氨酸键合到亲合载体上，即可用于免疫系统疾病患者血液中异常增多的免疫球蛋白G的清除；由于组氨酸化学物理稳定性高，因而这种亲合吸附介质不仅制备过程简单，对人免疫球蛋白G的吸附量高，而且价格低廉、性能稳定、可多次反复使用，具有良好的社会和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及血液净化亲合吸附介质中，具体地说是组氨酸在血液净化亲合吸附介质中的应用。
背景技术
蛋白A是从金黄色葡萄球菌的细胞壁中提取的一种单肽链蛋白(R.H.Clemmitt et.al.，Biotechnol.Bioeng.，2000，67，206)，它对多种免疫球蛋白，特别是免疫球蛋白G(IgG)的Fc区有较强的结合能力(Pierce Catalog & Handbook，T-78，1994-1995)。同时，蛋白A对循环免疫复合物(Circulating immune complexes)也有很强的特异性相互作用(T.M.Phillips，Analytical Techniques inImmunochemistry；New York：Marcel Dekker，Inc.，1992，p.75)。自身免疫系统疾病如系统性红斑狼疮、自免疫溶血性贫血、免疫血小板减少性紫癜和初级抗磷脂综合征(Primary antiphospholipid syndrome)等的发生会导致患者体内抗体和循环免疫复合物的增加。目前固载蛋白A的免疫吸附材料已被用于临床清除上述疾病患者体内的抗体和循环免疫复合物(T.Burnouf et.al.，J.Chromatogr.B，1998，715，65)，相关的免疫吸附医疗器械已获得美国FDA的认证，在欧洲也获得相关管理部门的认证。
血液免疫吸附治疗是近年来新兴的一种临床医疗技术，对一些药物没有明显疗效的疑难病症如自身免疫系统疾病、肾移植排析、冠状动脉硬化、黄疸病、重型乙肝患者进行免疫吸附体外血液净化，往往可以获得很好的效果(H.Hashimoto et.al.，J.Rheum.，1991，18，646)(R.M Hakim et.al.，Am.J.Kidny Dis.，1990，16，429)。免疫吸附治疗技术正受到医学工作者越来越多的重视，血液净化免疫吸附柱的研制和生产也已成为一个重要的高技术产业。
蛋白A的选择性好，对免疫球蛋白G的特异性作用强，但蛋白A价格昂贵且易变性失活。因此不仅制备和保存蛋白A免疫吸附柱比较困难而且还会增加患者的治疗费用。
发明内容
本发明的目的在于将组氨酸用于血液净化亲合吸附介质中，其所制成的亲合吸附介质价格低廉、性能稳定、使用寿命长。
组氨酸在血液净化亲合吸附介质中的应用。
所述血液净化是指用于清除免疫系统疾病患者血浆中异常增多的免疫球蛋白G；组氨酸最好为L-组氨酸；
载体基质和配体L-组氨酸分子之间的反应是基于基质化合物的环氧环基团和配体上氨基、羧基或羟基的取代反应。
在亲合载体上共价键合组氨酸有两种方法：
一种是利用组氨酸的伯氨基与载体上的环氧活性官能团直接反应；其化学合成路线是将组氨酸共价键合在亲合载体上，具体过程为：
在浓度为5mM-500mM的磷酸钾或磷酸钠盐缓冲液中，加入组氨酸溶解后，加入亲和载体，调PH值10-14，将反应体系升温至60℃-80℃，反应时间24h-48h，即制得组氨酸亲合吸附介质。
另一种方法是首先在亲合载体上连接已二胺间隔臂，然后采用羰基二咪唑法共价键合组氨酸；其化学合成路线是采用羰基二咪唑法将组氨酸共价键合在亲合载体上，具体过程为：
1)在亲合载体上共价键合间隔臂己二胺，键合反应条件为：
在浓度为10mM-500mM的碳酸钾或碳酸钠盐缓冲液中，加入己二胺(亲合载体与己二胺摩尔比为1∶2)溶解后，加入亲和载体，调PH值10-14，将反应体系升温至60℃-80℃，反应时间4h-24h，除去未反应的己二胺；
2)亲合载体间隔臂的己二胺与咪唑基连接，反应条件为：用无水二氧六环冲洗连接了己二胺间隔臂的亲合载体，然后加入羰基二咪唑，10℃-40℃反应4-12h，反应后用二氧六环和25mM Tris-HCL缓冲液反复冲洗；
3)己二胺与L-组氨酸连接，反应条件为：将组氨酸溶于5mM-500mM Tris-HCL缓冲液中，调节其pH值为6.5-8.5，10℃-40℃反应8h-20h，即制得组氨酸亲合吸附介质。
所述亲合载体为聚丙烯酸缩水甘油酯整体材料和经活化已连接环氧活性官能团的纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖或硅胶等。
本发明具有如下优点：
1.性能稳定、使用寿命长。组氨酸是一种简单的小分子，化学和物理稳定性高且价格低廉。它不仅与蛋白质之间具有很好的生物兼容性而且由于组氨酸分子中同时含有氨基和羧基活性官能团，使其更利于与亲合载体相连接。特别是组氨酸对免疫球蛋白G也有较好的特异性吸附，因而它是取代蛋白A用于血液净化治疗免疫系统疾病的理想选择。
2.价格低廉。与蛋白A免疫吸附柱相比，组氨酸亲合吸附介质不仅制备过程简单、键合量高(对人免疫球蛋白G的吸附量高)，而且对人免疫球蛋白G的吸附量也与蛋白A免疫吸附柱相当。通过共价键合的方法，将组氨酸键合到亲合载体上，即可用于免疫系统疾病患者血液中过量免疫球蛋白G的清除。由于组氨酸化学物理稳定性高，制备过程简单(通过共价键合的方法，将L-组氨酸键合到亲合载体上，即可用于免疫系统疾病患者血液中异常增多的免疫球蛋白G的清除)，因而不仅可以在反应时选择最优化的反应条件以提高配体的键合量，而且与蛋白A免疫吸附柱相比，这种亲合吸附介质稳定性更高、使用寿命更长，有可能多次反复使用，而且价格低廉，因而可以大幅度地降低免疫吸附治疗的费用，具有更高的经济效益和社会效益。
3.应用效果好。模拟配体(L-组氨酸)亲合吸附介质是一种可以取代蛋白A免疫吸附柱用于血液净化的新型亲合吸附介质。采用组氨酸亲合吸附介质吸附人免疫球蛋白G的标准样品和血浆样品中的人免疫球蛋白G，并用基体辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测组氨酸亲合吸附介质对血浆中的人免疫球蛋白G有很好的特异性吸附。
附图说明
图1为不含间隔臂和含有己二胺间隔臂的L-组氨酸亲合吸附介质对人血清白蛋白(HSA)非特异性吸附图；(a)不含间隔臂；(b)含有己二胺间隔臂的L-组氨酸亲合吸附介质；
图2为L-组氨酸亲合吸附介质对人免疫球蛋白G标准样品的特异性吸附图；(a)流动相为磷酸盐缓冲液；(b)流动相为Tris-HCL缓冲液；
图3为L-组氨酸亲合吸附介质对人免疫球蛋白G的特异性吸附图；色谱峰：1.杂蛋白；2.人免疫球蛋白G。
具体实施方式
亲合载体可以为聚丙烯酸缩水甘油酯整体材料和经活化已连接环氧活性官能团的纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖或硅胶等；本发明在亲合载体上共价键合组氨酸反应前应在载体上连接环氧活性官能团(聚丙烯酸缩水甘油酯整体材料本身已具有环氧活性官能团，不需此步反应)，其具体过程为：
载体基质上连接环氧活性官能团的反应是基于基质化合物的羟基和3-氯-1，2-环氧丙烷的活化反应。
载体基质和配体L-组氨酸分子之间的反应是基于基质化合物的环氧环基团和配体上氨基、羧基或羟基的取代反应。
一.利用组氨酸的伯氨基与载体上的环氧活性官能团直接反应：
将L-组氨酸共价键合在亲合载体上，具体过程为：
在浓度为5mM-500mM的磷酸钾或磷酸钠缓冲液中，加入过量的(载体基质和配体L-组氨酸分子之间的反应是基于基质化合物的环氧环基团和配体上氨基、羧基或羟基的取代反应)L-组氨酸溶解后，加入亲和载体，用碱(氢氧化钠)调节PH值10-14，将反应体系升温至60℃-80℃，反应时间24h-48h，即制得组氨酸亲合吸附介质。
实施例1-5，按上述反应条件操作，其不同之处在于(参见下表1)：
表1.
| 实施例 | 缓冲液 | pH值 | 反应温度 | 反应时间 |
| 1 | 25mM磷酸钠 | 13 | 60℃ | 24小时 |
| 2 | 5mM磷酸钠 | 10 | 65℃ | 48小时 |
| 3 | 100mM磷酸钾 | 11 | 70℃ | 45小时 |
| 4 | 300mM磷酸钠 | 12 | 75℃ | 36小时 |
| 5 | 500mM磷酸钠 | 14 | 80℃ | 32小时 |
二.亲合吸附介质的化学合成路线是采用羰基二咪唑法将L-组氨酸共价键合在亲合载体上，具体过程为：
1)在亲合载体上共价键合间隔臂己二胺，键合反应条件为：
在浓度为10mM-500mM的碳酸钾或碳酸钠盐缓冲液中，加入己二胺(亲合载体与己二胺摩尔比为1∶2)溶解后，加入亲和载体，用碱(氢氧化钠)调节PH值10-14，将反应体系升温至60℃-80℃，反应时间4h-24h，反应完成后用一定体积的有机溶剂(例如乙醇或乙腈)和水冲洗除去未反应的己二胺。
2)亲合载体间隔臂的己二胺与咪唑基连接，反应条件为：用无水1，4-二氧六环冲洗连接了己二胺间隔臂的亲合载体，然后加入过量的羰基二咪唑，10℃-40℃反应4-12h，反应后用二氧六环和25mM Tris-HCL缓冲液反复冲洗；
3)己二胺与L-组氨酸连接，反应条件为：将L-组氨酸溶于5mM-500mM Tris-HCL缓冲液中，调节其pH值为6.5-8.5，10℃-40℃反应8h-20h，即制得组氨酸亲合吸附介质。
无水二氧六环获取：取一定体积的二氧六环于圆底烧瓶内，加入适量新鲜的纳丝及批示剂二苯甲酮，加热回流，直至溶液呈明显深蓝色。迅速取下冷凝管，换成蒸馏装置，蒸出的二氧六环立即使用。
实施例6-10，按上述反应条件操作，其不同之处在于(参见下表2)：
表2.
| 实例 | 步骤1 | 步骤2 | 步骤3 | |||||||
| 缓冲液 | pH值 | 温度 | 时间(小时) | 温度 | 时间(小时) | Tris-HCL缓冲液(mM) | 温度℃ | 时间(小时) | pH值 | |
| 6 | 10mM碳酸钾 | 11 | 80℃ | 24 | 40℃ | 4 | 5 | 80 | 20 | 7.4 |
| 7 | 50mM碳酸钠 | 10 | 75℃ | 4 | 30℃ | 6 | 25 | 75 | 10 | 8.5 |
| 8 | 100mM碳酸钾 | 12 | 70℃ | 8 | 25℃ | 8 | 200 | 70 | 8 | 8.0 |
| 9 | 300mM碳酸钠 | 13 | 65℃ | 12 | 20℃ | 10 | 400 | 65 | 12 | 7.2 |
| 10 | 500mM碳酸钾 | 14 | 60℃ | 18 | 10℃ | 12 | 500 | 60 | 18 | 6.5 |
应用例：L-组氨酸亲合吸附介质对人血清白蛋白的非特异性吸附
由于己二胺本身具有一定的疏水性，另外己二胺分子中的氨基与样品间也存在着一定的非特异性的离子交换作用，因而含有己二胺间隔臂的L-组氨酸亲合吸附介质的非特异性吸附也较大。图1分别是不含间隔臂和含有己二胺间隔臂的L-组氨酸亲合吸附介质对人血清白蛋白(HSA)非特异性吸附的色谱图。可以看出，含有己二胺间隔臂的L-组氨酸亲合吸附介质HSA有一定的非特异性吸附，而不含间隔臂的L-组氨酸亲合吸附介质BSA的非特异性吸附很低，基本没有检测出来。图2为L-组氨酸亲合吸附介质对人免疫球蛋白G标准样品的特异性吸附；(a)流动相为磷酸盐缓冲液；(b)流动相为Tris-HCL缓冲液；图3为L-组氨酸亲合吸附介质对人免疫球蛋白G的特异性吸附，其中峰：1.蛋白；2.免疫球蛋白G。
比较例：蛋白A免疫吸附柱与L-组氨酸亲合吸附介质的比较
蛋白A免疫吸附介质的制备过程采用反应路线如下：
表3 L-组氨酸亲合吸附介质与蛋白A免疫吸附柱性能的比较
| 配体 | L-组氨酸 | 蛋白A | ||
| 制备过程采用反应路线(2) | 制备过程采用反应路线(3) | 制备过程采用反应路线(4) | 制备过程采用反应路线(5) | |
| 配体键合量(μmol/g) | 81.806 | 53.290 | 0.144 | 0.067 |
| 附量(μmolhIgG/g | 0.075 | 0.072 | 0.064 | 0.091 |
| 反应条件 | 最优化 | 有限制 | ||
| 成本 | 低 | 高 | ||
| 使用寿命 | 长 | 短 | ||
| 洗脱条件 | 温和 | 苛刻 | ||
| 特异性 | 较高 | 高 | ||
Claims (6)
1.组氨酸在血液净化亲合吸附介质中的应用。
2.按照权利要求1所述组氨酸在血液净化亲合吸附介质中的应用，其特征在于：所述血液净化是指用于清除免疫系统疾病患者血浆中异常增多的免疫球蛋白G。
3.按照权利要求1所述组氨酸在血液净化亲合吸附介质中的应用，其特征在于：所述组氨酸为L-组氨酸。
4.按照权利要求1所述组氨酸在血液净化亲合吸附介质中的应用，其特征在于：所述亲合吸附介质的化学合成路线是将组氨酸共价键合在亲合载体上，具体过程为：
在浓度为5mM-500mM的磷酸钾或磷酸钠缓冲液中，加入组氨酸溶解后，加入亲和载体，调PH值10-14，将反应体系升温至60℃-80℃，反应时间24h-48h，即制得组氨酸亲合吸附介质。
5.按照权利要求1所述组氨酸在血液净化亲合吸附介质中的应用，其特征在于：所述亲合吸附介质的化学合成路线是采用羰基二咪唑法将组氨酸共价键合在亲合载体上，具体过程为：
1)在亲合载体上共价键合间隔臂己二胺，键合反应条件为：
在浓度为10mM-500mM的碳酸钾或碳酸钠盐缓冲液中，加入己二胺溶解后，加入亲和载体，调PH值10-14，将反应体系升温至60℃-80℃，反应时间4h-24h，除去未反应的己二胺；
2)亲合载体间隔臂的己二胺与咪唑基连接，反应条件为：用无水二氧六环冲洗连接了己二胺间隔臂的亲合载体，然后加入羰基二咪唑，10℃-40℃反应4-12h，反应后用二氧六环和25mM Tris-HCL缓冲液反复冲洗；
3)己二胺与组氨酸连接，反应条件为：将组氨酸溶于5mM-500mMTris-HCL缓冲液中，调节其pH值为6.5-8.5，10℃-40℃反应8h-20h，即制得组氨酸亲合吸附介质。
6.按照权利要求4或5所述组氨酸在血液净化亲合吸附介质中的应用，其特征在于：所述亲合载体为纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖或硅胶。
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