JP2506060B2 - 赤血球及びその転換法 - Google Patents
赤血球及びその転換法Info
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- JP2506060B2 JP2506060B2 JP6104366A JP10436694A JP2506060B2 JP 2506060 B2 JP2506060 B2 JP 2506060B2 JP 6104366 A JP6104366 A JP 6104366A JP 10436694 A JP10436694 A JP 10436694A JP 2506060 B2 JP2506060 B2 JP 2506060B2
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/18—Erythrocytes
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は輸血療法に使用させるた
めに或る亜型の血液型Ａ赤血球を型Ｏ細胞に転換する方
法に関する。さらに詳細には本発明は細胞がそれらの細
胞的機能を失わない条件下で或る亜型Ａ赤血球を型Ｏ細
胞に転換する方法に関してそれらは酸素の吸着及び放出
に好適でありそれにより細胞は型Ｏ血液の方法で輸血さ
れうる。本発明は又このような赤血球亜型を型Ｏ細胞に
転換することにより得られる生成物に関する。
めに或る亜型の血液型Ａ赤血球を型Ｏ細胞に転換する方
法に関する。さらに詳細には本発明は細胞がそれらの細
胞的機能を失わない条件下で或る亜型Ａ赤血球を型Ｏ細
胞に転換する方法に関してそれらは酸素の吸着及び放出
に好適でありそれにより細胞は型Ｏ血液の方法で輸血さ
れうる。本発明は又このような赤血球亜型を型Ｏ細胞に
転換することにより得られる生成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】輸血療法において良く知られているよう
に、受血者の血液型と血液銀行で利用しうる血液の型と
を合わせる必要がある。従って例えば型Ａ血液の受血者
は型Ａの血液を安全に輸血されるに過ぎない。この例外
は型Ｏの血液である。その赤血球はＯ受血者と同じく型
Ａ、型Ｂ及び型ＡＢの受血者に安全に輸血されうる。
に、受血者の血液型と血液銀行で利用しうる血液の型と
を合わせる必要がある。従って例えば型Ａ血液の受血者
は型Ａの血液を安全に輸血されるに過ぎない。この例外
は型Ｏの血液である。その赤血球はＯ受血者と同じく型
Ａ、型Ｂ及び型ＡＢの受血者に安全に輸血されうる。
【０００３】全血液又はその少なくとも赤血球成分を蓄
える血液銀行又は他の設備の操業において各型の血液の
供給を維持する必要がある。Ｏ型の供血者が少数なので
Ｏ型の血液のみを維持することは従来不可能であった。
それ故Ｏ型の供血者の血液は主としてＯ型の受血者に用
いられてきた。一方多数の供血者はＡ、ＢまたはＡＢの
血液を有しそして時々過剰のこれらの型の血液が存在す
ることがある。そのため需要に供給を調節することが望
ましくなってきた。特にＡ、Ｂ又はＡＢ型の血液をＯ型
の血液型一普偏的な供血者に転換することが望まれてい
た。
える血液銀行又は他の設備の操業において各型の血液の
供給を維持する必要がある。Ｏ型の供血者が少数なので
Ｏ型の血液のみを維持することは従来不可能であった。
それ故Ｏ型の供血者の血液は主としてＯ型の受血者に用
いられてきた。一方多数の供血者はＡ、ＢまたはＡＢの
血液を有しそして時々過剰のこれらの型の血液が存在す
ることがある。そのため需要に供給を調節することが望
ましくなってきた。特にＡ、Ｂ又はＡＢ型の血液をＯ型
の血液型一普偏的な供血者に転換することが望まれてい
た。
【０００４】ＡＢＯ血液群系が発見された初めてのもの
でありそして血液の輸血という点から極めて重要なもの
の一つである。血液型Ａ、Ｂ及びＯの個人はそれぞれ
Ａ、Ｂ及びＨ抗原を表す。これらの抗原は赤血球のみな
らずすべての内皮細胞そして殆どの上皮細胞の表面にも
見い出される。さらにＡ、Ｂ及びＨ抗原性を有する糖蛋
白質は又メンデル優性として遺伝されたそれらが名付け
られた血液群の物質又は要素を分泌する能力を有するこ
れら個人の組織液及び分泌物に見い出される。
でありそして血液の輸血という点から極めて重要なもの
の一つである。血液型Ａ、Ｂ及びＯの個人はそれぞれ
Ａ、Ｂ及びＨ抗原を表す。これらの抗原は赤血球のみな
らずすべての内皮細胞そして殆どの上皮細胞の表面にも
見い出される。さらにＡ、Ｂ及びＨ抗原性を有する糖蛋
白質は又メンデル優性として遺伝されたそれらが名付け
られた血液群の物質又は要素を分泌する能力を有するこ
れら個人の組織液及び分泌物に見い出される。
【０００５】血液群物質は糖蛋白質であるが細胞膜より
得られたＡＢＨ活性物質は糖脂質及び糖蛋白質であると
思われる。
得られたＡＢＨ活性物質は糖脂質及び糖蛋白質であると
思われる。
【０００６】ＡＢＨ決定子の構造を決定するために多く
の作業が行われてきた。ペプチド骨格に結合された１種
以上の炭水化物鎖を含んでいるだろう全分子の血液群特
異性はこれら鎖の非還元末端に位置するこれら単糖類の
性質及び連鎖により定められることが分かった。しばし
ば免疫優性又は免疫決定性糖と呼ばれる各特異性のため
の最も重要な糖は次のものであることが分かった。Ｈ抗
原についてはフコース；Ａ抗原についてはＮ−アセチル
−ガラクトースアミン；そして型Ｂ抗原についてはガラ
クトースである。さらに最近では赤血球細胞膜から得ら
れるＡＢＨ活性糖脂質に関する研究は又同一の連鎖によ
り隣接した糖に結合された炭水化物鎖の還元末端におけ
る同一の免疫優性の糖の存在を示す。
の作業が行われてきた。ペプチド骨格に結合された１種
以上の炭水化物鎖を含んでいるだろう全分子の血液群特
異性はこれら鎖の非還元末端に位置するこれら単糖類の
性質及び連鎖により定められることが分かった。しばし
ば免疫優性又は免疫決定性糖と呼ばれる各特異性のため
の最も重要な糖は次のものであることが分かった。Ｈ抗
原についてはフコース；Ａ抗原についてはＮ−アセチル
−ガラクトースアミン；そして型Ｂ抗原についてはガラ
クトースである。さらに最近では赤血球細胞膜から得ら
れるＡＢＨ活性糖脂質に関する研究は又同一の連鎖によ
り隣接した糖に結合された炭水化物鎖の還元末端におけ
る同一の免疫優性の糖の存在を示す。
【０００７】炭水化物鎖は次に蛋白質またはセルアミド
（膜の脂質二重層に埋め込まれている）の何れかに結合
する。炭水化物部分の長さは変化してよくそしてそれは
直鎖又は枝分れ鎖の構造を有してもよい。従って今まで
血液群活性Ａ糖脂質の４変種、Ｂの２種及びＨの３種が
赤血球細胞膜から単離された。
（膜の脂質二重層に埋め込まれている）の何れかに結合
する。炭水化物部分の長さは変化してよくそしてそれは
直鎖又は枝分れ鎖の構造を有してもよい。従って今まで
血液群活性Ａ糖脂質の４変種、Ｂの２種及びＨの３種が
赤血球細胞膜から単離された。
【０００８】これらの研究により細胞にぶら下がってい
る単糖類群の一つの除去により型Ｏ細胞に対応する型Ｈ
抗原へ型Ａ又は型Ｂ抗原を転換しうるであろうことが理
論付けられた。
る単糖類群の一つの除去により型Ｏ細胞に対応する型Ｈ
抗原へ型Ａ又は型Ｂ抗原を転換しうるであろうことが理
論付けられた。
【０００９】Ｂ抗原性に関係のあるガラクトース分子が
細胞の生長性及び膜の完全性を保つ条件下で酵素的に型
Ｂ細胞から除去され従ってそれらを型Ｏ赤血球に転換し
うることが最近示された。その上１ミリリットル量のこ
の酵素的に転換された細胞が元の型Ｂ供血者に返された
ときのみならずこの量がＡ及びＢ受血者（それらの免疫
系が未転換の型Ｂ細胞には耐えられないと思われる）に
輸血されるときにも循環中に通常の如く生存しているこ
とが示された（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｓｉｖｉｇ
ｌｉａ，Ｇ．，Ｈｕｒｓｔ，Ｒ．，Ｌｅｎｎｙ Ｌ，及
びＲｅｉｃｈＬ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５ １６８，
１９８２）又米国特許第４，３３０，６１９号はα−ガ
ラクトシダーゼを用いてＢ赤血球をＯ赤血球に転換する
方法が開示されている。
細胞の生長性及び膜の完全性を保つ条件下で酵素的に型
Ｂ細胞から除去され従ってそれらを型Ｏ赤血球に転換し
うることが最近示された。その上１ミリリットル量のこ
の酵素的に転換された細胞が元の型Ｂ供血者に返された
ときのみならずこの量がＡ及びＢ受血者（それらの免疫
系が未転換の型Ｂ細胞には耐えられないと思われる）に
輸血されるときにも循環中に通常の如く生存しているこ
とが示された（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｓｉｖｉｇ
ｌｉａ，Ｇ．，Ｈｕｒｓｔ，Ｒ．，Ｌｅｎｎｙ Ｌ，及
びＲｅｉｃｈＬ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５ １６８，
１９８２）又米国特許第４，３３０，６１９号はα−ガ
ラクトシダーゼを用いてＢ赤血球をＯ赤血球に転換する
方法が開示されている。
【００１０】特にＡ抗原の場合型Ａ抗原のＮ−アセチル
ガラクトースアミン部分が酵素的に除去されそれにより
型Ａ抗原が型Ｈ抗原に転換されるのではないかと予想さ
れていた。この酵素的転換を達成させそして輸血しうる
品質の細胞を生成する試みが従来なされている。Ｌｅｖ
ｙ及びＡｎｉｍｏｆｆ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ，２５
５，Ｎｏ．２４，１９８０年１２月２５日、１１７３７
〜４２ページ参照。
ガラクトースアミン部分が酵素的に除去されそれにより
型Ａ抗原が型Ｈ抗原に転換されるのではないかと予想さ
れていた。この酵素的転換を達成させそして輸血しうる
品質の細胞を生成する試みが従来なされている。Ｌｅｖ
ｙ及びＡｎｉｍｏｆｆ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ，２５
５，Ｎｏ．２４，１９８０年１２月２５日、１１７３７
〜４２ページ参照。
【００１１】しかしこれは不成功であった。それはこれ
らの被処理細胞が未だ人間の抗Ａ抗血清により凝集され
た（１６倍迄の希釈）のでＡ抗原性の部分的な除去が用
いられた細菌性酵素により達成されただけだからであ
る。この細胞は型Ｏ及びＢの受血者への輸血には生育し
えない。それはそれらが輸血反応及び受血者の免疫系に
よる破壊を含めて未処理型Ａ赤血球と同じ効果を生じさ
せると思われるからである。
らの被処理細胞が未だ人間の抗Ａ抗血清により凝集され
た（１６倍迄の希釈）のでＡ抗原性の部分的な除去が用
いられた細菌性酵素により達成されただけだからであ
る。この細胞は型Ｏ及びＢの受血者への輸血には生育し
えない。それはそれらが輸血反応及び受血者の免疫系に
よる破壊を含めて未処理型Ａ赤血球と同じ効果を生じさ
せると思われるからである。
【００１２】その上この細菌性酵素は顕著な量（０．１
％）のシアリダーゼとして知られている他の酵素により
汚染されている。シアリダーゼによる赤血球の処理はそ
れらの早熟な老化をもたらす。即ちすべての人間の血清
によるこれらの細胞の凝集をもたらす潜在性抗原の顕在
化は輸血の次の循環からのそれらの早い除去を生じさせ
る。従ってたとえすべてのＡ抗原性が除去されたとして
も細菌性酵素に存在するシリアリダーゼはこの被処理細
胞を輸血に適さないようにする。
％）のシアリダーゼとして知られている他の酵素により
汚染されている。シアリダーゼによる赤血球の処理はそ
れらの早熟な老化をもたらす。即ちすべての人間の血清
によるこれらの細胞の凝集をもたらす潜在性抗原の顕在
化は輸血の次の循環からのそれらの早い除去を生じさせ
る。従ってたとえすべてのＡ抗原性が除去されたとして
も細菌性酵素に存在するシリアリダーゼはこの被処理細
胞を輸血に適さないようにする。
【００１３】Ａ1 ，Ａ中間体即ちＡｉｎｔ及びＡ2 とし
て知られている血液型Ａの３種の認められた主な亜型が
ある。亜型を区別する定量的及び定性的な相違がある。
Ａ1細胞はＡｉｎｔ細胞よりもより抗原的なＡ部位即ち
末端Ｎ−アセチルガラクトースアミン残基を有しそして
Ａｉｎｔ細胞は次にＡ2 赤血球よりもそうである。定性
的にＡ抗原の形成に関係のあるトランスフエラーゼ酵素
はＡ1 、Ａｉｎｔ及びＡ2 の個人において互いに生化学
的に相違する。これは３種の亜型について遺伝子的基礎
を暗示しており即ちＡ遺伝子座が３種の共通な遺伝子座
に分割されそれぞれ異なった亜型を表しそしてそれぞれ
の座はそれ自体の特異的なトランスフエラーゼ酵素にコ
ードする。
て知られている血液型Ａの３種の認められた主な亜型が
ある。亜型を区別する定量的及び定性的な相違がある。
Ａ1細胞はＡｉｎｔ細胞よりもより抗原的なＡ部位即ち
末端Ｎ−アセチルガラクトースアミン残基を有しそして
Ａｉｎｔ細胞は次にＡ2 赤血球よりもそうである。定性
的にＡ抗原の形成に関係のあるトランスフエラーゼ酵素
はＡ1 、Ａｉｎｔ及びＡ2 の個人において互いに生化学
的に相違する。これは３種の亜型について遺伝子的基礎
を暗示しており即ちＡ遺伝子座が３種の共通な遺伝子座
に分割されそれぞれ異なった亜型を表しそしてそれぞれ
の座はそれ自体の特異的なトランスフエラーゼ酵素にコ
ードする。
【００１４】Ａｉｎｔ及びＡ2 個人の数は異なった人種
において広く変化する。例えばＡ2の頻度は白人（英国
人）においてＡ1 の約３０％でありそして東洋人（日本
人）では１％より少ない。Ａｉｎｔの頻度は白人でＡの
約１〜２．５％東洋人で０．５％に過ぎないが黒人では
１〜３２％に及ぶ。
において広く変化する。例えばＡ2の頻度は白人（英国
人）においてＡ1 の約３０％でありそして東洋人（日本
人）では１％より少ない。Ａｉｎｔの頻度は白人でＡの
約１〜２．５％東洋人で０．５％に過ぎないが黒人では
１〜３２％に及ぶ。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】それ故Ａ及びＢ型細胞
の或る亜型からの基質のＡ抗原決定子の末端部分を除去
する一方赤血球をそのまま残して得られた組成物が輸血
療法に用いられうる方法を提供するのが本発明の目的で
ある。特に或る亜型Ａ及びＡＢ細胞をＯ型細胞としそれ
により細胞がそのまま残りそしてもしあるとしても殆ど
溶血素を行わずそして得られた組成物が輸血療法に用い
られうるのがのが本発明の目的である。又特にＡ及びＡ
Ｂ細胞の或る亜型をＯ型細胞に転換しそれにより細胞が
そのままで残りそしてもしあるとしても殆ど溶血素を行
わずそして得られた組成物が輸血療法に用いられうるの
が本発明の目的である。
の或る亜型からの基質のＡ抗原決定子の末端部分を除去
する一方赤血球をそのまま残して得られた組成物が輸血
療法に用いられうる方法を提供するのが本発明の目的で
ある。特に或る亜型Ａ及びＡＢ細胞をＯ型細胞としそれ
により細胞がそのまま残りそしてもしあるとしても殆ど
溶血素を行わずそして得られた組成物が輸血療法に用い
られうるのがのが本発明の目的である。又特にＡ及びＡ
Ｂ細胞の或る亜型をＯ型細胞に転換しそれにより細胞が
そのままで残りそしてもしあるとしても殆ど溶血素を行
わずそして得られた組成物が輸血療法に用いられうるの
が本発明の目的である。
【００１６】本発明はＡ（中間体）即ちＡｉｎｔ及びＡ
2 細胞及び対応するＡＢ細胞即ちＡｉｎｔＢ及びＡ 2 Ｂ
細胞のＯ細胞への転換に関する。Ｏ細胞へ転換されるこ
れらの細胞は以下「Ａｉｎｔ−Ａ2 細胞」と名付けられ
そしてこの用語は対応するＢ細胞例えばＡ2 Ｂ細胞も含
むのである。
2 細胞及び対応するＡＢ細胞即ちＡｉｎｔＢ及びＡ 2 Ｂ
細胞のＯ細胞への転換に関する。Ｏ細胞へ転換されるこ
れらの細胞は以下「Ａｉｎｔ−Ａ2 細胞」と名付けられ
そしてこの用語は対応するＢ細胞例えばＡ2 Ｂ細胞も含
むのである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明によれば （ｉ）Ａｉｎｔ又はＡ２赤血球をｐＨ５．６〜５．８に
平衡させ、 （ｉｉ）次に該Ａｉｎｔ又はＡ２赤血球中のＡ抗原をＨ
抗原に転換するのに充分な時間上述の平衡されたＡｉｎ
ｔ又はＡ２赤血球と細菌以外の酵素源から得られたα−
Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ酵素とを接触さ
せてＯ赤血球を製造し、 （ｉｉｉ）該Ｏ赤血球から該酵素を除去し、そして （ｉｖ）該Ｏ赤血球をｐＨ７．２〜７．４に再平衡させ
る方法により上述の目的は達成される。
平衡させ、 （ｉｉ）次に該Ａｉｎｔ又はＡ２赤血球中のＡ抗原をＨ
抗原に転換するのに充分な時間上述の平衡されたＡｉｎ
ｔ又はＡ２赤血球と細菌以外の酵素源から得られたα−
Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ酵素とを接触さ
せてＯ赤血球を製造し、 （ｉｉｉ）該Ｏ赤血球から該酵素を除去し、そして （ｉｖ）該Ｏ赤血球をｐＨ７．２〜７．４に再平衡させ
る方法により上述の目的は達成される。
【００１８】本方法は鳥類の肝臓から得られたα−Ｎ−
アセチルガラクトースアミニダーゼを用いて好ましくは
行われる。種々の鳥類の肝臓が用いられニワトリ、七面
鳥、鳩などのそれらを含む。これらの源から得られるα
−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼは酵素的転換
の点で優れた活性を有することが分かった。活性成分が
他の肝臓蛋白質から分離出来てそれにより反応物が他の
源例えば細菌及び哺乳動物の肝臓から得られるＮ−アセ
チルガラクトースアミニダーゼより純粋なのでこの酵素
源がさらに好ましい。その結果Ｎ−アセチルガラクトー
スアミン部分の開裂が一層良好に達成されそれにより純
粋でしかも一層生物学的に両立しうる生成物が得られ
る。本発明の転換された細胞は天然に生じたＯ型赤血球
の形で働きそして輸血療法に用いられうる。
アセチルガラクトースアミニダーゼを用いて好ましくは
行われる。種々の鳥類の肝臓が用いられニワトリ、七面
鳥、鳩などのそれらを含む。これらの源から得られるα
−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼは酵素的転換
の点で優れた活性を有することが分かった。活性成分が
他の肝臓蛋白質から分離出来てそれにより反応物が他の
源例えば細菌及び哺乳動物の肝臓から得られるＮ−アセ
チルガラクトースアミニダーゼより純粋なのでこの酵素
源がさらに好ましい。その結果Ｎ−アセチルガラクトー
スアミン部分の開裂が一層良好に達成されそれにより純
粋でしかも一層生物学的に両立しうる生成物が得られ
る。本発明の転換された細胞は天然に生じたＯ型赤血球
の形で働きそして輸血療法に用いられうる。
【００１９】原料の赤血球の抗原性に応じて異なった生
成物が得られる。従ってＡ2 Ｂ赤血球から出発するとき
型Ｂ赤血球は（ａ）Ａ抗原性の不存在、（ｂ）天然に生
ずるＡ2 Ｂ細胞より大きいＨ抗原性、（ｃ）Ｂ抗原性の
存在および（ｄ）天然に生ずるＡ2 Ｂ赤血球の６０〜９
０％のアデノシン−５′−三燐酸（ＡＴＰ）含量による
特徴をもって生成される。
成物が得られる。従ってＡ2 Ｂ赤血球から出発するとき
型Ｂ赤血球は（ａ）Ａ抗原性の不存在、（ｂ）天然に生
ずるＡ2 Ｂ細胞より大きいＨ抗原性、（ｃ）Ｂ抗原性の
存在および（ｄ）天然に生ずるＡ2 Ｂ赤血球の６０〜９
０％のアデノシン−５′−三燐酸（ＡＴＰ）含量による
特徴をもって生成される。
【００２０】この転換されたＡ2 Ｂ赤血球はさらに天然
に生ずるＡ2 Ｂ赤血球の６０〜９０％の２，３−ジホス
ホグリセリン酸（２，３ＤＰＧ）含量により特徴付けら
れうる。一般にこの転換されたＡ2 Ｂ赤血球（いまでは
Ｂ赤血球）は全細胞ヘモグロビンの重量に基づいて０．
１〜１％の範囲の天然に生ずるＡ2 Ｂ細胞のメト−ヘモ
グロビン含量に比べて赤血球中の全ヘモグロビンの２〜
６％のメト−ヘモグロビン含量を有する。好ましくはそ
れぞれのＡＴＰ及び２，３−ＤＰＧ含量は７０〜９０％
の範囲そして特に８０〜９０％である。
に生ずるＡ2 Ｂ赤血球の６０〜９０％の２，３−ジホス
ホグリセリン酸（２，３ＤＰＧ）含量により特徴付けら
れうる。一般にこの転換されたＡ2 Ｂ赤血球（いまでは
Ｂ赤血球）は全細胞ヘモグロビンの重量に基づいて０．
１〜１％の範囲の天然に生ずるＡ2 Ｂ細胞のメト−ヘモ
グロビン含量に比べて赤血球中の全ヘモグロビンの２〜
６％のメト−ヘモグロビン含量を有する。好ましくはそ
れぞれのＡＴＰ及び２，３−ＤＰＧ含量は７０〜９０％
の範囲そして特に８０〜９０％である。
【００２１】酵素的転換が又Ｂ型ではないＡｉｎｔ−Ａ
2 細胞について行われるとき生成物はさらに （ａ）末端α−フコース部分、 （ｂ）Ｏ抗原性 （ｃ）Ａ抗原性の不存在、および （ｄ）天然に生ずるＯ赤血球の６０〜９０％のアデノシ
ン−５′−三燐酸（ＡＴＰ）含量 により特徴付けられる型Ｏ赤血球である。
2 細胞について行われるとき生成物はさらに （ａ）末端α−フコース部分、 （ｂ）Ｏ抗原性 （ｃ）Ａ抗原性の不存在、および （ｄ）天然に生ずるＯ赤血球の６０〜９０％のアデノシ
ン−５′−三燐酸（ＡＴＰ）含量 により特徴付けられる型Ｏ赤血球である。
【００２２】Ａ2 Ｂ赤血球から誘導される型Ｂ赤血球の
場合のように２，３−ＤＰＧ含量は普通天然に生ずるＢ
赤血球のそれの６０〜９０％である。同様にＡＴＰ及び
２，３−ＤＰＧ含量が天然に生ずる赤血球のそれの７０
〜９０％そして特に８０〜９０％の範囲にあることが好
ましい。これらの含量は重量または容量基準の何れかで
示されることが出来そして含量は一般に生化学的方法に
より求められる。これはＡＴＰについてはＳｉｇｍａ
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．３６６
−ＵＶそして２，３−ＤＰＧについてはＳｉｇｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．３５−Ｕ
Ｖに示されている。
場合のように２，３−ＤＰＧ含量は普通天然に生ずるＢ
赤血球のそれの６０〜９０％である。同様にＡＴＰ及び
２，３−ＤＰＧ含量が天然に生ずる赤血球のそれの７０
〜９０％そして特に８０〜９０％の範囲にあることが好
ましい。これらの含量は重量または容量基準の何れかで
示されることが出来そして含量は一般に生化学的方法に
より求められる。これはＡＴＰについてはＳｉｇｍａ
Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．３６６
−ＵＶそして２，３−ＤＰＧについてはＳｉｇｍａ Ｔ
ｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．３５−Ｕ
Ｖに示されている。
【００２３】Ａ2 Ｂ赤血球から誘導されたＢ赤血球は好
ましくは天然に生ずるＡ2 Ｂ細胞よりも少なくとも２０
％大きいＨ抗原性を有する。Ｈ抗原性は植物Ｕｉｅｘ
ｅｕｒｏｐａｅｕｓの種子から得られるレクチンにより
測定されうる。
ましくは天然に生ずるＡ2 Ｂ細胞よりも少なくとも２０
％大きいＨ抗原性を有する。Ｈ抗原性は植物Ｕｉｅｘ
ｅｕｒｏｐａｅｕｓの種子から得られるレクチンにより
測定されうる。
【００２４】転換されたＡ2 Ｂ赤血球はＢ抗原性により
特徴付けられる。このＢ抗原性は人間の抗Ｂ抗血清との
反応により求められる。同様にＡｉｎｔ−Ａ2 赤血球か
ら誘導されたＯ赤血球は少なくとも２，０００，０００
個の末端α−フコース部分により特徴付けられる。Ａ抗
原性の不存在は人間の抗Ａ抗血清との反応の不存在によ
り明らかとなる。
特徴付けられる。このＢ抗原性は人間の抗Ｂ抗血清との
反応により求められる。同様にＡｉｎｔ−Ａ2 赤血球か
ら誘導されたＯ赤血球は少なくとも２，０００，０００
個の末端α−フコース部分により特徴付けられる。Ａ抗
原性の不存在は人間の抗Ａ抗血清との反応の不存在によ
り明らかとなる。
【００２５】この方法の結果として回収されるＯ細胞に
は元のＡｉｎｔ−Ａ2 細胞に存在した末端的にα−連鎖
したＮ−アセチルガラクトースアミン部分が実質的に存
在しない。
は元のＡｉｎｔ−Ａ2 細胞に存在した末端的にα−連鎖
したＮ−アセチルガラクトースアミン部分が実質的に存
在しない。
【００２６】もしＡ2 Ｂ細胞がＢ細胞に転換されるなら
ばこれらは次に米国特許第４，３３０，６１９号の方法
によりＯ細胞に転換されうる。
ばこれらは次に米国特許第４，３３０，６１９号の方法
によりＯ細胞に転換されうる。
【００２７】本発明の方法においてα−Ｎ−アセチルガ
ラクトースアミニダーゼが酵素として用いられる。それ
は遊離の酵素の形でも又は支持体上に支持されていても
よい。支持体は可溶性の支持体例えばデキストラン又は
ポリエチレングリコールであっても又は不溶性の支持体
例えばセルロース及びアクリルアミド、デキストラン、
アガロースの交叉結合重合体であってもよい。
ラクトースアミニダーゼが酵素として用いられる。それ
は遊離の酵素の形でも又は支持体上に支持されていても
よい。支持体は可溶性の支持体例えばデキストラン又は
ポリエチレングリコールであっても又は不溶性の支持体
例えばセルロース及びアクリルアミド、デキストラン、
アガロースの交叉結合重合体であってもよい。
【００２８】Ｈ抗原型における非溶血素赤血球の実現は
厳密なｐＨ５．６〜５．８へ酵素の不存在下Ａｉｎｔ−
Ａ2 赤血球の最初に平衡化することにより行われる。平
衡は望ましくは０．０５〜０．１０Ｍの濃度の二塩基性
燐酸ナトリウム及び０．１５Ｍの濃度の塩化ナトリウム
に加えて０．０２〜０．０５Ｍの濃度くえん酸を含むｐ
Ｈ５．６〜５．８のくえん酸塩・燐酸塩緩衝液を用いて
行われる。
厳密なｐＨ５．６〜５．８へ酵素の不存在下Ａｉｎｔ−
Ａ2 赤血球の最初に平衡化することにより行われる。平
衡は望ましくは０．０５〜０．１０Ｍの濃度の二塩基性
燐酸ナトリウム及び０．１５Ｍの濃度の塩化ナトリウム
に加えて０．０２〜０．０５Ｍの濃度くえん酸を含むｐ
Ｈ５．６〜５．８のくえん酸塩・燐酸塩緩衝液を用いて
行われる。
【００２９】平衡は通常少なくとも５分間好ましくは１
５分以下の時間緩衝液溶液中に赤血球を懸濁することに
より行われる。本発明の好ましい態様によれば緩衝液は
赤血球から除去されそして新しい緩衝液が再び加えられ
て少なくとも５分間そして好ましくは１５分以内の時間
接触する。望ましくは他の新しいアリコート又は緩衝液
と赤血球との第三の接触が行われそしてこの第三の接触
は又少なくとも５分間そして好ましくは１５分間以内で
ある。
５分以下の時間緩衝液溶液中に赤血球を懸濁することに
より行われる。本発明の好ましい態様によれば緩衝液は
赤血球から除去されそして新しい緩衝液が再び加えられ
て少なくとも５分間そして好ましくは１５分以内の時間
接触する。望ましくは他の新しいアリコート又は緩衝液
と赤血球との第三の接触が行われそしてこの第三の接触
は又少なくとも５分間そして好ましくは１５分間以内で
ある。
【００３０】緩衝液と赤血球との全接触時間は２時間以
内であることを生体外のテストは示しているが生体内を
考慮すると接触時間は２時間を超えず好ましくは１／２
時間より短くなくそして好ましくは１時間より長くない
ことが好ましい。目的が細胞体をそのままにしてＡ抗原
をＨ抗原に転換しそれにより輸血療法に用いられるとき
細胞がその通常の機能特に酵素の吸着及び放出を行うこ
とが出来ることを記憶しておくべきである。
内であることを生体外のテストは示しているが生体内を
考慮すると接触時間は２時間を超えず好ましくは１／２
時間より短くなくそして好ましくは１時間より長くない
ことが好ましい。目的が細胞体をそのままにしてＡ抗原
をＨ抗原に転換しそれにより輸血療法に用いられるとき
細胞がその通常の機能特に酵素の吸着及び放出を行うこ
とが出来ることを記憶しておくべきである。
【００３１】酵素による赤血球の接触が細胞が５．６〜
５．８に平衡された後にのみ生ずることは本発明の極め
て重要な他の特徴である。換言すれば赤血球はｐＨ低下
物質（緩衝液）と混合している間酵素とは最初に接触し
ない。
５．８に平衡された後にのみ生ずることは本発明の極め
て重要な他の特徴である。換言すれば赤血球はｐＨ低下
物質（緩衝液）と混合している間酵素とは最初に接触し
ない。
【００３２】５．６〜５．８への平衡は２０°〜２６℃
好ましくは室温で行われる。大気圧以下及び大気圧以上
の圧力は必要とせず大気圧が用いられる。
好ましくは室温で行われる。大気圧以下及び大気圧以上
の圧力は必要とせず大気圧が用いられる。
【００３３】赤血球が５．６〜５．８に平衡されるとＨ
型抗原へのＡ型抗原の酵素的転換は簡単になる。酵素的
反応は細胞１００〜１，０００μｌ当たり１２〜２５０
酵素単位を用い遊離又は支持された型のα−Ｎ−アセチ
ルガラクトースアミニダーゼを用いることにより行われ
る。好ましくは酵素は細胞８００〜１，０００μｌ当た
り１６０〜２００単位の量で存在する。酵素的転換は３
０〜１５０分好ましくは４５〜６０分２６〜３７℃好ま
しくは３２〜３７℃で行われる。
型抗原へのＡ型抗原の酵素的転換は簡単になる。酵素的
反応は細胞１００〜１，０００μｌ当たり１２〜２５０
酵素単位を用い遊離又は支持された型のα−Ｎ−アセチ
ルガラクトースアミニダーゼを用いることにより行われ
る。好ましくは酵素は細胞８００〜１，０００μｌ当た
り１６０〜２００単位の量で存在する。酵素的転換は３
０〜１５０分好ましくは４５〜６０分２６〜３７℃好ま
しくは３２〜３７℃で行われる。
【００３４】上述したように酵素は遊離の酵素の形又は
支持された酵素の形であり、支持体は可溶性又は不溶性
の支持体である。デキストランは好ましい可溶性の支持
体であり特に分子量の平均が２０，０００〜８０，００
０のデキストランがそうである。他の好ましい可溶性の
支持体は平均分子量が１０，０００〜８０，０００のポ
リエチレングリコールである。固体（不溶性）の支持体
は交叉結合したデキストラン、アガロース及びセルロー
スを含む。
支持された酵素の形であり、支持体は可溶性又は不溶性
の支持体である。デキストランは好ましい可溶性の支持
体であり特に分子量の平均が２０，０００〜８０，００
０のデキストランがそうである。他の好ましい可溶性の
支持体は平均分子量が１０，０００〜８０，０００のポ
リエチレングリコールである。固体（不溶性）の支持体
は交叉結合したデキストラン、アガロース及びセルロー
スを含む。
【００３５】酵素処理の次に酵素は赤血球から除去され
そして赤血球は緩衝液により洗滌されそして１５〜３０
分間緩衝液と接触させたままにしておき次に最後の洗滌
を行うことによりｐＨ７．２〜７．４に再平衡される。
洗滌はｐＨを７．２〜７．４に調節しそして酵素及び遊
離のＮ−アセチルガラクトースアミニダーゼを除去する
という二つの目的のためである。用いられうる洗滌溶液
は下記の緩衝液を含むものを含む。濃度０．９％の塩化
ナトリウムおよび３部の一塩基性塩に対する７部の二塩
基性塩の比の濃度０．０１Ｍの燐酸カリウムを含む燐酸
塩緩衝の食塩水。洗滌は２０°〜２６℃好ましくは室温
で少なくとも３回好ましくは３〜５回行われる。洗滌が
洗滌溶液中に酵素の存在をもはや認めなくなる迄行うべ
きであることを除いて洗滌の回数については何も要求さ
れない。
そして赤血球は緩衝液により洗滌されそして１５〜３０
分間緩衝液と接触させたままにしておき次に最後の洗滌
を行うことによりｐＨ７．２〜７．４に再平衡される。
洗滌はｐＨを７．２〜７．４に調節しそして酵素及び遊
離のＮ−アセチルガラクトースアミニダーゼを除去する
という二つの目的のためである。用いられうる洗滌溶液
は下記の緩衝液を含むものを含む。濃度０．９％の塩化
ナトリウムおよび３部の一塩基性塩に対する７部の二塩
基性塩の比の濃度０．０１Ｍの燐酸カリウムを含む燐酸
塩緩衝の食塩水。洗滌は２０°〜２６℃好ましくは室温
で少なくとも３回好ましくは３〜５回行われる。洗滌が
洗滌溶液中に酵素の存在をもはや認めなくなる迄行うべ
きであることを除いて洗滌の回数については何も要求さ
れない。
【００３６】次に細胞はＨ抗原の形でありそして輸血療
法に用いられうる。輸血に用いる目的のため細胞は生理
学上許容されうる媒体により希釈される。生理学上許容
しうる媒体は０．９％塩化ナトリウムよりなる滅菌等張
性食塩溶液および０．２％デトストロースを含む滅菌等
張性食塩溶液を含む。一般的に媒体中の細胞の濃度は４
０〜７０％好ましくは４０〜４５％である。これらの条
件は新しいしかも融解したパックされた赤血球の輸血に
用いられるのに等しい。本発明の細胞は公知のパックさ
れた細胞が輸血されるのと同じやり方で輸血されうる。
法に用いられうる。輸血に用いる目的のため細胞は生理
学上許容されうる媒体により希釈される。生理学上許容
しうる媒体は０．９％塩化ナトリウムよりなる滅菌等張
性食塩溶液および０．２％デトストロースを含む滅菌等
張性食塩溶液を含む。一般的に媒体中の細胞の濃度は４
０〜７０％好ましくは４０〜４５％である。これらの条
件は新しいしかも融解したパックされた赤血球の輸血に
用いられるのに等しい。本発明の細胞は公知のパックさ
れた細胞が輸血されるのと同じやり方で輸血されうる。
【００３７】処理後アデノシン−５′−三燐酸（ＡＴ
Ｐ）含量が６０％以上残り２，３−ジホスホグリセリン
酸（２，３ＤＰＧ）含量が又６０％以上残ることが細胞
代謝の研究で示される。これは細胞の形の維持及び通常
の酵素結合及び交換を行わせる。
Ｐ）含量が６０％以上残り２，３−ジホスホグリセリン
酸（２，３ＤＰＧ）含量が又６０％以上残ることが細胞
代謝の研究で示される。これは細胞の形の維持及び通常
の酵素結合及び交換を行わせる。
【００３８】本方法により用いられる緩衝液及び培養条
件は３時間以内の培養で８０〜９０％又はそれ以上の保
持のＡＴＰ含量及び７０〜９０％の２，３ＤＰＧがある
生成物をもたらす。
件は３時間以内の培養で８０〜９０％又はそれ以上の保
持のＡＴＰ含量及び７０〜９０％の２，３ＤＰＧがある
生成物をもたらす。
【００３９】酵素としてα−Ｎ−アセチルガラクトース
アミニダーゼを用いることによりＨ活性へのＡｉｎｔ−
Ａ2 細胞の完全な転換が得られた。この転換に必要な時
間は酵素に依存しそして酵素の量の増大により減少す
る。これらの細胞の顕微鏡的検査はそれらに大きな形態
学上の異常性がなくそしてそれらが球状赤血球円板赤血
球交換をしうることを示す。３膜成分、Ｒｈ及びＭおよ
びＮ抗原及びシアル酸は元のＡ細胞と転換されたＨ細胞
との間に大きな変化を示さない。又型Ａ2 Ｂ細胞がこの
酵素によりＢＨに転換されるとき細胞のＢ活性の水準に
変化がなくそしてＢ及びＯ（Ｈ）細胞が酵素により影響
を受けないそれらの活性を有することが分かっている。
転換された細胞は自己由来の血漿によりチエックされそ
して汎凝集化を示さない。
アミニダーゼを用いることによりＨ活性へのＡｉｎｔ−
Ａ2 細胞の完全な転換が得られた。この転換に必要な時
間は酵素に依存しそして酵素の量の増大により減少す
る。これらの細胞の顕微鏡的検査はそれらに大きな形態
学上の異常性がなくそしてそれらが球状赤血球円板赤血
球交換をしうることを示す。３膜成分、Ｒｈ及びＭおよ
びＮ抗原及びシアル酸は元のＡ細胞と転換されたＨ細胞
との間に大きな変化を示さない。又型Ａ2 Ｂ細胞がこの
酵素によりＢＨに転換されるとき細胞のＢ活性の水準に
変化がなくそしてＢ及びＯ（Ｈ）細胞が酵素により影響
を受けないそれらの活性を有することが分かっている。
転換された細胞は自己由来の血漿によりチエックされそ
して汎凝集化を示さない。
【００４０】酵素が支持された酵素の形で用いられると
き転換が行われるのが望まれる。好ましくは支持体は可
溶性支持体でありそして最も好ましくは分子量２０，０
００〜８０，０００のデキストランである。酵素は共有
結合材として臭化シアノゲンを用いて溶性支持体に付着
する。しかし未結合の材料から酵素デキストランの共役
を離すために粗製酵素標品をデキストランに結合する前
にセファデックスＧ−１００ゲル濾過を用いる簡単な精
製法にかける必要があろう。
き転換が行われるのが望まれる。好ましくは支持体は可
溶性支持体でありそして最も好ましくは分子量２０，０
００〜８０，０００のデキストランである。酵素は共有
結合材として臭化シアノゲンを用いて溶性支持体に付着
する。しかし未結合の材料から酵素デキストランの共役
を離すために粗製酵素標品をデキストランに結合する前
にセファデックスＧ−１００ゲル濾過を用いる簡単な精
製法にかける必要があろう。
【００４１】精製条件は完全に未結合材料のないデキス
トラン又は外の可溶性支持体に共有的に結合した酵素の
生成物の使用を可能にする。酵素・可溶性支持体の共役
例えば酵素デキストラン共役は遊離の酵素標品と同じ特
異性及び能力（赤血球の表面からのＡ決定子の除去のた
めの）を有しそして活性の損失なしに再使用されそして
貯えられうる。この共役の使用は望ましい。それはそれ
らが繰り返して用いられそしてそれらの使用が遊離の酵
素が用いられるときのような原料酵素材料中の不純物に
よる副反応により特徴付けられないからである。これら
の不純物は一層容易にコントロールされてカップリング
のために僅かに部分的に精製された標品のみの使用を可
能にする。
トラン又は外の可溶性支持体に共有的に結合した酵素の
生成物の使用を可能にする。酵素・可溶性支持体の共役
例えば酵素デキストラン共役は遊離の酵素標品と同じ特
異性及び能力（赤血球の表面からのＡ決定子の除去のた
めの）を有しそして活性の損失なしに再使用されそして
貯えられうる。この共役の使用は望ましい。それはそれ
らが繰り返して用いられそしてそれらの使用が遊離の酵
素が用いられるときのような原料酵素材料中の不純物に
よる副反応により特徴付けられないからである。これら
の不純物は一層容易にコントロールされてカップリング
のために僅かに部分的に精製された標品のみの使用を可
能にする。
【００４２】不動化された酵素は一層容易にそれらの基
質から分離されて遊離の酵素標品のグリコシダーゼ分子
又は汚染蛋白質の若干が非可逆的に細胞構造に結合しそ
れにより潜在的に抗体生成物質を導入するかまたは細胞
の膜を損ずるような厳しい洗滌条件の下においてのみ除
去されうるような可能性を最小にする。
質から分離されて遊離の酵素標品のグリコシダーゼ分子
又は汚染蛋白質の若干が非可逆的に細胞構造に結合しそ
れにより潜在的に抗体生成物質を導入するかまたは細胞
の膜を損ずるような厳しい洗滌条件の下においてのみ除
去されうるような可能性を最小にする。
【００４３】新しいニワトリの肝臓から無関係の脂肪を
取り去りそしてアセトンによる抽出により又は凍結乾燥
により脱水する。乾燥且粉末になったニワトリの肝臓
（１４０ｇ）を４℃ｐＨ４．０の０．０１Ｍ酢酸ナトリ
ウムと混合しそして沈降（２〜１６時間）させられる細
い懸濁液を得るためにブレンダー（１０〜３０分間）に
かけられる。上澄み液の回収は遠心分離により行われ
る。
取り去りそしてアセトンによる抽出により又は凍結乾燥
により脱水する。乾燥且粉末になったニワトリの肝臓
（１４０ｇ）を４℃ｐＨ４．０の０．０１Ｍ酢酸ナトリ
ウムと混合しそして沈降（２〜１６時間）させられる細
い懸濁液を得るためにブレンダー（１０〜３０分間）に
かけられる。上澄み液の回収は遠心分離により行われ
る。
【００４４】次に固体の硫酸アンモニウムを徐々に上澄
み液に加えて濃度３０％とする。得られた沈澱物を遠沈
により除去し硫酸アンモニウムを再び加えて最後の濃度
を５０％として他の酵素及び蛋白質の混合物の一部とし
て用いられる酵素α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニ
ダーゼを含む沈澱物を生ずる。沈澱物を遠心分離により
ペレットとしｐＨ５．０の０．０１Ｍ酢酸ナトリウムに
ついて透析して付着した硫酸アンモニウムを除去しそし
てペレットを溶解させる。溶解した混合物を先ずイオン
交換クロマトグラフィにかけ次にゲル濾過により汚染し
た物質を次α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ
から分ける。
み液に加えて濃度３０％とする。得られた沈澱物を遠沈
により除去し硫酸アンモニウムを再び加えて最後の濃度
を５０％として他の酵素及び蛋白質の混合物の一部とし
て用いられる酵素α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニ
ダーゼを含む沈澱物を生ずる。沈澱物を遠心分離により
ペレットとしｐＨ５．０の０．０１Ｍ酢酸ナトリウムに
ついて透析して付着した硫酸アンモニウムを除去しそし
てペレットを溶解させる。溶解した混合物を先ずイオン
交換クロマトグラフィにかけ次にゲル濾過により汚染し
た物質を次α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ
から分ける。
【００４５】特に１５００〜１８００単位のα−Ｎ−ア
セチルガラクトースアミニダーゼを含む混合物がｐＨ
５．０の０．０１Ｍ酢酸ナトリウムで平衡した陽イオン
交換剤カルボキシメチルセルローズ（ＣＭ−５２Ｗｈａ
ｔｍａｎ）のカラム（５×１６ｃｍ、３００ミリリット
ル）に適用される。０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．０）によるカラムの洗滌後０．０７Ｍ酢酸ナトリウ
ムから０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に及ぶ線
状の勾配が適用され（それぞれ７５０ミリリットル）α
−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼを含む蛋白質
フラクションの溶離をもたらす。
セチルガラクトースアミニダーゼを含む混合物がｐＨ
５．０の０．０１Ｍ酢酸ナトリウムで平衡した陽イオン
交換剤カルボキシメチルセルローズ（ＣＭ−５２Ｗｈａ
ｔｍａｎ）のカラム（５×１６ｃｍ、３００ミリリット
ル）に適用される。０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
５．０）によるカラムの洗滌後０．０７Ｍ酢酸ナトリウ
ムから０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に及ぶ線
状の勾配が適用され（それぞれ７５０ミリリットル）α
−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼを含む蛋白質
フラクションの溶離をもたらす。
【００４６】このフラクションは次に０．０１Ｍ燐酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ６．０）について透析され同一の緩
衝液により平衡にさせられた陰イオン交換剤ジエチルア
ミノエチルセファデックス（Ａ−５０Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を含むカラム（２．５×１３ｃｍ，６０ミリリット
ル）に適用される。カラムを同一の緩衝液により洗滌す
るとα−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ含有フ
ラクションが溶離しそれを濃縮しそして多孔性アガロー
ス（セファデックスＧ−１００Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を
含むカラム（２．５×１０ｃｍ）を通すゲル濾過にかけ
る。酵素を含む溶離帯は濃縮されそして今一度ゲル濾過
を行いこの時はカラム（バイオゲルＰ−１５０，Ｂｉｏ
Ｒａｄ；２．５×１５０）（多孔質のポリアクリルア
ミド・アガロース混合物含有）を用いる。得られた酵素
フラクションは記述したようにＨ抗原性へのＡｉｎｔ−
Ａ2 細胞の転換に用いられうる。
リウム緩衝液（ｐＨ６．０）について透析され同一の緩
衝液により平衡にさせられた陰イオン交換剤ジエチルア
ミノエチルセファデックス（Ａ−５０Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を含むカラム（２．５×１３ｃｍ，６０ミリリット
ル）に適用される。カラムを同一の緩衝液により洗滌す
るとα−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ含有フ
ラクションが溶離しそれを濃縮しそして多孔性アガロー
ス（セファデックスＧ−１００Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を
含むカラム（２．５×１０ｃｍ）を通すゲル濾過にかけ
る。酵素を含む溶離帯は濃縮されそして今一度ゲル濾過
を行いこの時はカラム（バイオゲルＰ−１５０，Ｂｉｏ
Ｒａｄ；２．５×１５０）（多孔質のポリアクリルア
ミド・アガロース混合物含有）を用いる。得られた酵素
フラクションは記述したようにＨ抗原性へのＡｉｎｔ−
Ａ2 細胞の転換に用いられうる。
【００４７】ｐＨ５．７及び３２℃で７．６％のα−Ｎ
−アセチルガラクトースアミニダーゼの活性で存在する
α−ガラクトーシダーゼを除いて検出しうるエキソグリ
コシダーゼ活性は見い出されない。酵素活性はｐＨ４及
び３７℃で蛋白質１ｍｇ当たり２４〜３０単位またはｐ
Ｈ５．７及び３２℃で蛋白質１ｍｇ当たり３〜４単位で
ある。４℃におけるその等電点はエレクトロフォーカシ
ングにより求めて７．５〜７．８の間である。鳥類の肝
臓からの酵素の標品は公知である（Ｗｏｎｇ及びＷｅｉ
ｓｓｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１
６，Ｎｏ．６，１９７１，１０６７〜１０７２ページ）
が、この公知の方法はこの活性水準又はこのエキソグリ
コシダーゼの不存在で所望の酵素をもたらさない。
−アセチルガラクトースアミニダーゼの活性で存在する
α−ガラクトーシダーゼを除いて検出しうるエキソグリ
コシダーゼ活性は見い出されない。酵素活性はｐＨ４及
び３７℃で蛋白質１ｍｇ当たり２４〜３０単位またはｐ
Ｈ５．７及び３２℃で蛋白質１ｍｇ当たり３〜４単位で
ある。４℃におけるその等電点はエレクトロフォーカシ
ングにより求めて７．５〜７．８の間である。鳥類の肝
臓からの酵素の標品は公知である（Ｗｏｎｇ及びＷｅｉ
ｓｓｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１
６，Ｎｏ．６，１９７１，１０６７〜１０７２ページ）
が、この公知の方法はこの活性水準又はこのエキソグリ
コシダーゼの不存在で所望の酵素をもたらさない。
【００４８】中間体−Ａ2 及びＡ2 Ｂ細胞は１９８１年
８月に発行されたそのリーフレット１−ＤＬ−Ｃ−０１
にＡｃｕｇｅｎｉｃｓにより述べられたスライド方法に
おいて抗Ａ1 レクチンを用いることによりＡ1 細胞から
区別される。本方法によれば型Ａ1 及びＡ1 Ｂは１分以
内で激しく凝集する。中間体細胞は弱く凝集しそしてＡ
2 及びＡ2 Ｂ細胞はこの間凝集を示さない。
８月に発行されたそのリーフレット１−ＤＬ−Ｃ−０１
にＡｃｕｇｅｎｉｃｓにより述べられたスライド方法に
おいて抗Ａ1 レクチンを用いることによりＡ1 細胞から
区別される。本方法によれば型Ａ1 及びＡ1 Ｂは１分以
内で激しく凝集する。中間体細胞は弱く凝集しそしてＡ
2 及びＡ2 Ｂ細胞はこの間凝集を示さない。
【００４９】本発明の本質及びそれを行う方法を一層良
く説明するために下記の実施例が示される。添付図面は
時間の関数としての凝集単位の名でＡ2 Ｂ細胞のＨＢ細
胞への転換を示しそしてＡ抗原性が完全にＨ抗原性
（「Ｏ細胞」）に転換されたこと及びＢ抗原性が一定に
保たれそしてＨ抗原がＯ細胞の水準に増大することを示
す。
く説明するために下記の実施例が示される。添付図面は
時間の関数としての凝集単位の名でＡ2 Ｂ細胞のＨＢ細
胞への転換を示しそしてＡ抗原性が完全にＨ抗原性
（「Ｏ細胞」）に転換されたこと及びＢ抗原性が一定に
保たれそしてＨ抗原がＯ細胞の水準に増大することを示
す。
【００５０】
【実施例】前述の如く作られた酵素を用いＨ活性へのＡ
ｉｎｔ−Ａ2 細胞の完全な転換及びＡ2 Ｂ細胞のそれぞ
れのＨＢ対応物への完全な転換が赤血球凝集定量により
測定される。この転換に必要な時間は再び酵素的に依存
しそして酵素の量の増加により減少し例えばＡｉｎｔ細
胞（０．１ミリリットル）のとき９０分（７単位）から
６０分（１２単位）３０分（１８単位）となる。この代
表的な細胞の酵素処理の結果は表１に示される。処理条
件は３２℃における等張性食塩水インキュベーションに
おけるくえん酸塩・燐酸塩緩衝液ｐＨ５．７（０．０２
Ｍくえん酸及び０．０６Ｍ二塩基性燐酸ナトリウム）及
び低速のロータリーミキサーの使用を含む。
ｉｎｔ−Ａ2 細胞の完全な転換及びＡ2 Ｂ細胞のそれぞ
れのＨＢ対応物への完全な転換が赤血球凝集定量により
測定される。この転換に必要な時間は再び酵素的に依存
しそして酵素の量の増加により減少し例えばＡｉｎｔ細
胞（０．１ミリリットル）のとき９０分（７単位）から
６０分（１２単位）３０分（１８単位）となる。この代
表的な細胞の酵素処理の結果は表１に示される。処理条
件は３２℃における等張性食塩水インキュベーションに
おけるくえん酸塩・燐酸塩緩衝液ｐＨ５．７（０．０２
Ｍくえん酸及び０．０６Ｍ二塩基性燐酸ナトリウム）及
び低速のロータリーミキサーの使用を含む。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【発明の効果】赤血球のＡ型細胞の或る亜型をＯ型細胞
に転換してＯ型細胞として輸血療法に用いることが出来
る。
に転換してＯ型細胞として輸血療法に用いることが出来
る。
【図１】Ａ2 Ｂ細胞のＨＢへの酵素転換を示すグラフで
ある。
ある。
Claims (15)
- 【請求項１】 （ｉ）Ａｉｎｔ又はＡ２赤血球をｐＨ
５．６〜５．８に平衡させ、 （ｉｉ）次に該Ａｉｎｔ又はＡ２赤血球中のＡ抗原をＨ
抗原に転換するのに充分な時間上述の平衡されたＡｉｎ
ｔ又はＡ２赤血球と細菌以外の酵素源から得られたα−
Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ酵素とを接触さ
せてＯ赤血球を製造し、 （ｉｉｉ）該Ｏ赤血球から該酵素を除去しそして （ｉｖ）該Ｏ赤血球をｐＨ７．２〜７．４に再平衡させ
る方法によって製造される、 （ａ）少なくとも２，０００，０００個の末端α−フコ
ース部分を含み、 （ｂ）末端α−Ｎ−アセチルガラクトースアミン部分が
実質的に存在せずそして （ｃ）天然に生ずるＡ２Ｂ赤血球の６０〜９０％のアデ
ノシン−５’−三燐酸（ＡＴＰ）含量を有するＯ赤血
球。 - 【請求項２】 該赤血球が天然に生ずるＯ赤血球の７０
〜９０％のＡＴＰ含量を有する請求項１記載の赤血球。 - 【請求項３】 該赤血球が天然に生ずるＯ赤血球の６０
〜９０％の２，３−ジホスホグリセリン酸（２，３ＤＰ
Ｇ）含量を有する請求項１記載の赤血球。 - 【請求項４】 該赤血球が天然に生ずるＯ赤血球の７０
〜９０％の２，３ＤＰＧ含量を有する請求項３記載の赤
血球。 - 【請求項５】 該赤血球がＯ抗原性の存在を特徴とする
請求項１記載の赤血球。 - 【請求項６】 （ｉ）Ａｉｎｔ又はＡ２赤血球をｐＨ
５．６〜５．８に平衡させ、 （ｉｉ）次に該Ａｉｎｔ又はＡ２赤血球中のＡ抗原をＨ
抗原に転換するのに充分な時間上述の平衡されたＡｉｎ
ｔ又はＡ２赤血球と細菌以外の酵素源から得られたα−
Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼ酵素とを接触さ
せてＯ赤血球を製造し、 （ｉｉｉ）該Ｏ赤血球から該酵素を除去しそして （ｉｖ）該Ｏ赤血球をｐＨ７．２〜７．４に再平衡させ
ることよりなる、 （ａ）少なくとも２，０００，０００個の末端α−フコ
ース部分を含み、 （ｂ）末端α−Ｎ−アセチルガラクトースアミン部分が
実質的に存在せずそして （ｃ）天然に生ずるＡ２Ｂ赤血球の６０〜９０％のアデ
ノシン−５，−三燐酸（ＡＴＰ）含量を有するＯ赤血球
を製造する方法。 - 【請求項７】 該α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニ
ダーゼが鳥類の肝臓より得られたものである請求項６記
載の方法。 - 【請求項８】 該α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニ
ダーゼがｐＨ４及び３７℃で蛋白１ミリリットル当たり
２４〜３０単位の酵素活性を有する請求項７記載の方
法。 - 【請求項９】 該α−Ｎ−アセチルガラクトースアミニ
ダーゼがｐＨ５．７及び３２℃で蛋白１ミリリットル当
たり３〜４単位の酵素活性を有する請求項７記載の方
法。 - 【請求項１０】 該酵素が４℃で７．５〜７．８の間の
等電点を有する請求項８記載の方法。 - 【請求項１１】 該酵素が遊離の酵素の形である請求項
７記載の方法。 - 【請求項１２】 該酵素が支持された形である請求項７
記載の方法。 - 【請求項１３】 該支持体が可溶性支持体である請求項
１２記載の方法。 - 【請求項１４】 該支持体が不溶性支持体である請求項
１２記載の方法。 - 【請求項１５】 Ｂ型でないＡｉｎｔ−Ａ２細胞がＨ抗
原型に転換される請求項７記載の方法。
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