SE430753B - Kombinerat haemophilus influenzae-bordetella pertussis-vaccin - Google Patents

Description

7811192-9 Eliminering av föroreningar (proteiner, nukleinsyror och endo- toxiner) i polysackariden PRP utföres genom behandling av den partiellt renade polysackariden med en fosfathaltig adsorbent, som icke absorberar polysackariden under de an- givna betingelserna.

(I) Isolering och rening av polyribosylribitol-fosfat, den kapsulära polysackariden av Haemophilus influenzae typ b Organismer, odlingsmedium och kultur Två stammar av Haemophilus influenzae typ b användes. Rab- stammen erhålles från Grace Leidy, Babies Hospital, Columbia University, New York City, New York. CK-stammen isolerades från en patient vid Waterbury Hospital Waterbury, Conn. Orga- nismerna får passera genom möss flera gånger för att tillför- säkra deras virulens. Organismerna isoleras genom autopsi från hjärnvävnad hos möss, subkultiverade på antingen 3,7%-ígt hjärn-hjärt-infusionsmedium (BHI) (Difco Lab., Detroit, Mich.) eller på 5%-ig BHI-agar kompletterad med 0,01 % nikotinamid- adenin-dinukleotid (NAD) (P-L Biochemicals, Milwaukee, Wis.) och l % (volym/volym) defibrinerat hästblod (Animal Blood Center, Syracuse, N.Y.) och fördelades sedan i portioner om l ml på ampuller, lyofiliserades och förvarades vid -70°C.

Grundmedium använt för odling av organismerna utgöres av 3,7%-ig BHI. Grundmediet kompletteras med 10 mg NAD och 20 mg hemin (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) per liter. l % (volym/ volym) defibrinerat hästblod tillsättes per 50 ml ympkultur.

Komplementen nyframställes och filtreras genom en O,45u Nalgene- 7811192-9 filterenhet (Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y.) före använd- ning. För odling av organismen i en 14-liters fermentor komplette- ras mediet ytterligare med 0,5 % glukos.

För att bereda en kolv av ymporganismer upptinas 1 ml fryst förrådskultur och överföres till 50 ml av det anrikade BHI-mediet kompletterat med defibrinerat hästblod och NAD. Kulturen odlas 8 timmar vid 37°C på en gyroskakanordning med en hastighet av 150 varv/minut. Organismerna sättes i form av ett 1%-igt ymp- ämne till 500 ml-portioner av anrikad BHI-odlingsvätska i 2-liters kolvar, vilka sedan inkuberas vid 37°C med måttlig skakning på en gyroskakanordning under 8 timmar (för isolering av PRP) eller l4 timmar (såsom ympkulturer).

Fermentationen av varje sats i en 14-liters fermentor initieras genom aseptisk överföring av 700 ml av ympkulturen till 7 liter av den anrikade BHI-odlingsvätskan kompletterad med hemin i stället för defibrinerat hästblod. Kulturen upprätthålles kontinuerligt vid 37OiloC. Tanken omröres med en hastighet av 150 varv/minut och ett luftflöde av 0,25 liter luft per liter odlingsvätska per minut upprätthålles. Under odlingen tillsättes 0,001 % av ett silikonantiskummedel (FD-82, Hodag Chemical Corp.) efter behov. Kulturer odlas till den sena logaritmtillväxten (8-10 x 109 odlingen avslutas genom att man tillsätter 0,4 % formaldehyd livsdugliga celler/ml), vanligen ungefär 8 timmar, varefter och förvarar kulturerna över natten vid 4°C.

Isolering av polyribosylribitol~fosfat (PRP) Odlingsvätska framställd enligt ovan centrifugeras vid 27.000 x g under 30 minuter vid 4oC. Den cellfria överstående vätskan tillvaratages och behandlas på följande sätt: Steg l, etanolütfällning Den överstående vätskan i kulturen försättes med natriumacetat (slutlig koncentration 4 %). Lösningen inställes på pH 6,0-6,2 och 44 liter 3A-etanol tillsättes långsamt under kraftig om- röring vid 4OC. Blandningen inställes på pH 6,8 med isättika och förvaras sedan 12 timmar vid 3°c. Den bildade fäiiningen tillvaratages genom dekantering och centrifugeras sedan för bild- 71811192-9 ning av orent PRP.

Steg 2, Cetavlon (hexadecyltrimetylammoniumbromid)-behandling Fällningen från steg l löses i pyrogenfritt destillerat vatten och centrifugeras för eliminering av återstodenf Den klarbruna lösningen sättes därefter långsamt till 100 ml 10%-ig vatten- lösning av Cetavlon under omblandning (slutlig koncentration 0,5 %). Blandningen omröres en timme och centrifugeras sedan.

Fällningen av nukleinsyror och PRP-Cetavlon-komplex blandas med 2 liter 0,3M natriumklorid. Den grumliga lösningen centri- fugeras för eliminering av olösliga material, såsom nuklein- Cetavlon-salt.

Den överstående vätskan utspädes med en lika stor volymmängd (vatten, varigenom PRP-Cetavlon-saltet utfaller. Blandningen om- röres en timme, fällningen tillvaratages genom centrifugering och löses sedan i 2 liter O,3M natriumkloridlösning. h Steg 3, etanolutfällning Cetavlon och föroreningarna av nukleinsyror och proteiner avlägsnas ytterligare genom etanolutfällning (minst två gånger).

PRP utfälles enligt steg l, medan Cetavlon löses i alkohollös- ningen. PRP tillvaratages genom centrifugering, löses i 2 liter pyrogenfritt destillerat vatten och utfälles därefter åter enligt ovan. Den slutliga PRP-fällningen solubiliseras i 20 mM natrium- fosfat, pH 6,8.

Steg 4, hydroxylapatitbehandling Föroreningar (såsom nukleinsyror, proteiner och endotoxiner) i de partiellt renade PRP-preparaten avlägsnas selektivt genom adsorption på en kalciumfosfathaltig adsorbent, såsom hydroxyl- apatit [3.Ca3(PO4)2.Ca(OH)2].

Uppfinningen bygger på upptäckten att polysackariden PRP icke adsorberas av den kalciumfosfatadsorbenthaltiga fosfatbufferten (20mM) med ett pH av ungefär 6,7-6,9; eller en fosfatbuffert (50mM) med ett pH av ungefär 5,8; föroreningarna (såsom nuklein- syror, proteiner och endotoxiner) adsorberas emellertid under dessa betingelser. Förfarandet enligt uppfinningen kan även ut- 7811192-9 föras satsvis eller i kolonndrift. Vid det satsvisa arbets- förfarandet sättes hydroxylapatiten till det partiellt renade PRP-preparatet (i 20mM fosfat; pH 6,9). Blandningen blandas om- sorgsfullt och centrifugeras för eliminering av icke önskvärda fasta substanser (adsorbent och de föroreningar som adsorberats av adsorbenten). Den överstående vätskan underkastas nämnda pro- cedur minst ytterligare två gånger. Den bildade lösningen filt- reras genom millipor-filter, dialyseras mot pyrogenfritt destille- rat vatten och lyofiliseras.

Vid kolonndrift påföres partiellt renat PRP i 20mM fosfatbuffert (pH lägst 5,8) i en kolonn, innehållande adsorbenthydroxylapa- titen, som jämviktsinställts med 20mM fosfatbuffert, pH 5,8, och eluerats med en stegvis gradient av natriumfosfatbuffert, pH 5,8, från 20mM till lOOmM. Fraktioner tillvaratages och ana- lyseras med avseende på pentos (och därmed med avseende på polyribosylribitolfosfat). De fraktioner som är positiva med avseende på pentos dialyseras mot pyrogenfritt destillerat vatten och lyofiliseras.

(II) Förfarande för framställning av ett kombinationsvaccin, bestående av PRP från H. influenzae typ b- och B. pertussis- antigener För framställning av ett PRP-vaccin löses lyofiliserat PRP (framställt enligt ovan) i en koncentration av 20 g/ml i fos- fatbuffrad natriumkloridlösning (PBS) (O,ll3 g kaliumdifosfat, 0,83 g dinatriumfosfat och 8,5 g natriumklorid per liter, pH 7,0, innehållande 0,0l % timerosal). Vaccinet sterilfilt- reras genom 0,45 millipor-filterenheter, fördelas i glasvialer och förvaras vid 4oC.

En koncentrerad lösning av PRP framställes genom att man upp- väger förutbestämda mängder av polysackariden och löser denna i fosfatbuffrad natriumkloridlösning (O,ll3 g kaliumdifosfat, 0,83 g dinatriumfosfat och 8,5 g natriumklorid per liter, pH 7,0, innehållande 0,0l % timerosal). Denna koncentrerade lös- ning av PRP blandas sedan med en lämplig volym färska B. per- tussis-cellsuspensioner för framställning av förrådslösningen. 1a11192-9 6 Éaraktäristika för B. pertussis, stam 138 beskrivas i Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, Eight Ed., Buchanan och Gibbons Editors, Williams & Wilkins Co., Maryland, USA. Denna stam är tillgänglig från the American Type Culture Collection, -Maryland, USA, depositionsnummer 10380. Det kombinerade vaccinet i denna förrådslösning innehåller 200 ng PRP och ungefär 70 opacitetsenheter (op) celler per ml. Förrådslösningen upprätt- hålles 90 dagar vid 400 för att möjliggöra avgiftning av per- tussisantigener innan den slutliga produkten (vaccinet) fram- ställes (som innehåller 10 ug PRP och 3,5 op-enheter av per- tussisceller/0,5 ml dos).

Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande exempel, vari de angivna temperaturerna avser Celsius-grader.

Exempel l. 2,5 g hydroxylapatit (såsom Bio. gel HTP, Bio~Rad Laboratories, Richmond, California) sättes till 250 ml partiellt renade PRP- preparat (efter Cetavlon- och etanolbehandlingar) (innehållande ungefär l,0 mg PRP/ml) i 20mM natriumfosfatbuffert, pH 6,9, och blandas i ett iskallt vattenbad (1-400) under en timme. _Blandningen centrifugeras i en Sorvall RC2-B under 30 minuter vid 16.000 x g. Den överstâende vätskan föres därefter genom ett 0,65 u millipore-filter och underkastas nämnda procedur (varje gång behandlad med 2,5 g hydroxylapatit) ytterligare två gånger. Den erhållna lösningen filtreras genom 0,65 u och 0,45 u millipore-filter, dialyseras mot pyrogenfritt destillerat vatten och lyofiliseras. Den lyofiliserade produkten uppvisar kraftig immunogen aktivitet (se följande beträffande djurförsök med kombinerat vaccin) och innehåller en mycket ringa mängd förore- ningar (såsom nukleinsyror, proteiner och endotoxiner) (se Tabell I nedan). Ungefär 170 mg lyofiliserat PRP erhålles. Åter- vinningen av PRP enligt detta förfarande är ungefär 70 %, räk- nat på utgångspolysackariden. PRP bör förvaras under lämpliga betingelser, såsom vid 40 i en exsickator över fosforpentoxid och silikgel. 7811192-9 Exempel 2.

Partiellt renat PRP (300 mg PRP) löses i 100 ml 20mM natrium- fosfatbuffert, pH 5,8 (dvs. 3 mg PRP/ml). Denna lösningen pä- föres en kolonn vid rumstemperatur (5,0 x 45 cm) av hydroxyl- apatit (ungefär 250 ml bäddvolym), som jämviktsinställts med 20mM natriumfosfatbuffert, pH 5,8, och eluerats med en stegvis gradient av 20mM, 50mM, lOOmM natriumfosfatbuffert, pH 5,8.

De individuella fraktionerna (200 ml), eluerade med 20mM och 50 mM natriumfosfatbuffert (pH 5,8), som är positiva med av- seende på pentos (pentosbestämning enligt orcinalmetoden) till- varatages, dialyseras mot pyrogenfritt destillerat vatten och lyofiliseras. Ungefär 206 mg av den lyofiliserade produkten, PRP, erhålles.

Renheten av polysackariden, PRP, analyseras genom att man upp- skattar i vilken mån de är förorenade med nukleinsyror, pro- teiner och endotoxiner. Proteinkoncentrationen bestämmes enligt Lowry, et al. i J. Biol. Chem. l93¿265 (1951) med bovinserumalbumin såsom standard. Nukleinsyran bestämmes genom absorptionen av PRP-lösningen vid 260 nm. Absorbansen av 50 ng nukleinsyra i l ml vatten i en cell med en ljusväg av 1 cm antages vara lika med 1,0. Molekylstorleken uppskattas med hjälp av Sepharose ÉD4B- eller 2B-gelfiltrering på pelare I 1,5 x 90 cm (Pharmacia-Fine Chemicals, Piscataway, N.J.).

Fördelningskoefficienten (Kd) bestämmas ur elueringsmönstret framkallat genom orcinalreaktionen (Herbert, et al., Methods in MicrobiolO9Yo Vol. 5B, 285-291). 7811192-9 ..4mD .xnow Bwz .>uHmHm>H:D mflnäflfiou _fimuflmmom wwfinmm cmum mflamcmmfiflflu mmñšmumxnmm Q wmuømfiflmcfl møfifismoëmmm Hmm mxflvwflumuxmnmx uw>finMmwn N Hwmâwxm .flmmfim Hmššøsmcofluflwomwø . :mmm mflfimfimmflflflu cwEEmum|Mo Q wmucwdflmflfl møaflnmoëwmw >m mxflvmfinmwxmumx nm>flHxmmQ H ammëmxm Aønmwcmuwnfixouoøcwv Hm muflmofloflm mo Dmwnøm wwñ mmflwnmwëmfi Ufl> ^HE\mmm mi OOHV mmm >m wcflcømmmuø xonmflomm Av Hwnmw Hmm wxofl Eow wxH>mmmOnxGflcmM mM\mmm mi Ao m* Üwnvhmßnmwm Nwfl .mflHflUQW>.-.~M UÜÉ AR ßOH X N uxfl>HmxwaoE .mw soc mm wmoumsmwm wøwn >m mflflGø:m>cm Uwå Am ooo-QH oöfl Éo m6 män 33.0 Nflšemxm ooïfi _ 0.3 ïo mio oém :mo Hfiwmswxm ¶ AUMV 8 B S: få S; xwfföfi.. vmmuumm>H|m5HøEfiA wmmvnwmouæmnflcmm nflmßonm mnmmcflmflxøz woucwm xaæxmfloz nøøwuonm nflxovoflcm mwflmfiá mmm wflflmflamwmmßmnmaafln Hmm mxflumflumuxmnmx ßxmflšwxlxmfiflmxflmæh H aflwfimfi 7811192-9 Exempel 3.

Ett kombinationsvaccin innehållande PRP från H. influenzae typ b och B. pertussis-antigener framställes enligt följande: 140 mg PRP (framställt enligt exempel 2) löses i 350 ml steril fosfatbuffrad natriumkloridlösning (PBS) (O,ll3 g kaliumfos- fat, 0,83 g dinatriumfosfat och 8,5 g natriumklorid per liter, pH 7,0, innehållande 0,01 % timerosal) och filtreras genom ett 0,45 u millipore-filter. Denna koncentrerade PRP-lösning (400 ug/ml) användes för framställning av ett kombinations- vaccin, som består av PRP och B. pertussis-antigener. l50 ml av den koncentrerade PRP-lösningen (400 ug/ml) försättes med 150 ml färsk B. pertussis (stam 138)-cellsuspension i PBS, pH 7,0 (uppvisande opacitet 149; op, enhetsceller/ml) för fram- ställning av förrådslösningen av det kombinerade vaccinet.

Denna förrådslösning (300 ml) upprätthålles vid 40, tills endo~ toxinnivån av pertussis har sjunkit (lägst 90 dagar). Sterili- teten av förrådslösningen testas med tioglykolatmedier (vid 32-330). pH i förrådslösningen efter 90 dagars inkubering kontrolleras och inställes på pH 7,0: 1. Slutprodukten (vaccin) använt för djurförsök framställes genom utspädning av den kombinerade förrådslösningen med PBS och den innehåller 10 ug PRP och 3,5 op-enheter av pertussisceller/0,5 ml (dos).

Resultaten från antikroppssvaret på detta kombinerade vaccin hos unga råttor visas i Fig. 1 och 2.

Exempel 4.

Förrådslösningen av PRP (400 ng/ml) framställes genom att man löser 30 mg PRP (framställt enligt exempel l) i 75 ml steril fosfatbuffrad natriumkloridlösning (PBS) och filtreras genom ett 0,45 u millipore-filter. 25 ml av detta koncentrerade PRP försättes med en lika stor volymmängd (dvs. 25 ml) färsk B. pertussis (stam 138)-cellsuspension i PBS, pH 7,0 (innehållande 149 op-enheter celler/ml) för framställning av förrådslösningen av det kombinerade vaccinet. Denna förrådslösning (50 ml) upp- rätthålles minst 90 dagar vid 40. Steriliteten av förråde- lösningen testas på ovan angivet sätt med tioglykolatmedier. 7811192-9 10 pH i förrådslösningen är 7,0: l. Den slutliga produkten (vaccin) använd för djurförsök framställes genom utspädning av den kombinerade förrådslösningen med PBS och den innehåller 10 ug PRP och 3,7 op-enheter av pertussisceller/0,5 ml (dos).

Exempel 5.

PRP-förrådslösningen (200 ug/ml) i PBS (pH 7,0) framställes enligt exempel 4. Pertussis-förrådslösningen (innehållande 75 op-enheter/ml) framställes genom utspädning av 25 ml färsk B. pertussis-cellsuspension (149 op-enheter/ml) med en lika stor volym PBS. Båda förrådslösningarna inkuberas separat vid 40 under 90 dagar eller något längre. Det kombinerade vaccinet framställes genom att man tar 14 ml PRP-förrådslös- ning (200 ng/ml) och l4 ml (avgiftad) förrådslösning av per- tussis-antigener (75 op-enheter/ml) och utspäder den med 112 ml PBS (slutlig volym 140 ml). Det färdiga vaccinet för djurförsök innehåller l0 ng PRP och 3,7 op-enheter pertussis/0,5 ml (dos).

Resultaten beträffande antikroppssvaret på detta kombinerade vaccin hos unga råttor anges i Fig, 3 och i tabell II. 7811192-*9 ll cofluxwwcfiwmcmmcm AU Houumn OH Hmm Hmßfimwwä A0 Aøøfluxmncfiawmflufißåv :mx0w> wfim .mwmn MHN 1 umumoøm An AHE m.Ov mow\wfimw5unwm uwpwsnmxmo m.m Hwfifim mmm mn OH Am w.HH ofiwfl fimß vmfl mflfl Azv ^« Hwmawxwv ^oa mv m_H o«H mmfl wwfi mm Amy wfimwøwuwm + ^Mv mmm ^m HwmEmNmv m.»H Hßßfl Noofi mmfi Hofl ^zv Aoa mv mflwwspnwm + «.H ßwfl Nmfi wmfl wofi @^mv Aoa mv ^mv mmm m~H Nqfi wwfl wmfl oflfl Azv AH flwmswxwv Amy mmm m_H mvfl »HH wofi maa Azv mfimmspuwm mcflflwßfi IUHHOHMEDHHUMC @_H wmfi ßofl wflfl omm n^zv wmuwwønpmwwom Amcfluwwflcfiñëfl m N A O ^fimmavH5E xkmw :www =mmmw»u:H øHo«=v GOHMMWWCH Hwwww GMMO0> wum GOHUMGWGH HOMMO MMOw> mmQfl¶%%% Asswww H: om\pwu:sn mmmlm amov uw»fl>fl»Mmwmmo»xfiu:m|mmm«Hpø4 0 mom =Huu«> m ^ß HH Aflmflmü MOQUWH NÜGÜ NOS NÜHWEOMIMHWWÜUMÜQINMW >fl HÜQHUHCÜUÛCÜEEH

Claims (4)

1. 7e11192-9 H.. PATENTKRAV l. Kombinerat vaccin, som framkallar effektiva nivåer av anti- PRP (polyribosyl-ribitol-fosfat) och antipertussis-antikropps- bildningar hos unga, varmblodiga djur, k ä n n e t e c k n a t därav, att det består av polyribosylribitolfosfat, isolerat och renat ur den kapsulära polysackariden av Haemophilus in- fluenzae typ b genom tillsats av hydroxylapatit i 2-20 molär fosfatbuffert med ett pH av 6,5-7,0, blandning cvid en tem- peratur av 2-lO°C, centrifugering, eliminering av den över- stående vätskan och upprepning av nämnda procedur minst två gånger, filtrering av den överstående vätskan, dialys mot pyrogenfritt destillerat vatten och lyofilisering, och Borde- tella pertussis-antigener; varvid det kombinerade vaccinet innehåller l0Äpg polyribosylribitolfosfat och 3,5 opacitets- enheter Bordetella pertussis-celler per 0,5 ml vaccin löst i fosfatbufferten.

2. Vaccin enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att Bordetella pertussis-antigenerna erhållits ur Bordetella pertussis-stammen 138.

3. Vaccin enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att polyribosylribitolfosfat erhållits ur Haemophilus influenzae typ b Rab-stammen.

4. Vaccin enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att Bordetella pertussis-antigenerna erhållits ur Bordetella pertussis-stammen 138 och polyribosylribitol- fosfatet erhållits ur Haemophilus influenzae typ b Rab- stammen.