CH649781A5

CH649781A5 - Verfahren zur herstellung eines polyribosylribitolphosphats und einer dieses enthaltenden kombinationsvakzine.

Info

Publication number: CH649781A5
Application number: CH11125/78A
Authority: CH
Inventors: Joseph S-C Kuo
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1977-10-28
Filing date: 1978-10-27
Publication date: 1985-06-14
Also published as: DK154327C; GR73991B; NO149611B; BE871586A; FR2407000B1; AU4108178A; DK479578A; GB2007244A; PL210545A1; IL55433A0; ES474611A1; JPS5480408A; AU520902B2; IE47474B1; NL7810753A; DD140701A5; NZ188211A; FI783269A; CA1117866A; FI63674B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Isolierung und Reinigung des antigenen Polysaccharids Polyribosyl-ribi-tol-phosphat (PRP) aus Haemophilus-influenzae-Typ-b-Kul-turen und ein Verfahren zur Herstellung einer Kombinationsvakzine, die PRP- und Bordetella-pertussis-Antigene enthält. Diese Vakzine kann zur Immunisierung gegen Infektionen durch Haemophilus influenzae Typ b, wie Meningitis, verwendet werden. Das PRP ist auch in Verbindung mit anderen nichtpathogenen Stämmen von Bakterien, wie Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, B. punilus und L. plantarum, zur Auslösung einer Antikörperreaktion bei Warmblütern wirksam.

Das gereinigte Polyribitol-phosphat (PRP) aus Haemophilus influenzae Typ b wird als Schutzimmunogen untersucht. Eine wirksame Antigenreaktion ist jedoch bei jungen Tieren und Kindern noch nicht erreicht worden. Bei dem bekannten Verfahren zur Reinigung werden Ethanol und Hexadecyltri-methylammoniumbromid (Cetavlon) verwendet. Die Verunreinigungen, Endotoxine und pyrogenen Substanzen werden durch Verwendung von kaltem Phenol oder Chloroform und t-Butanol entfernt, die zum Verlust der Antigennatur dieses Polysaccharids führen können.

Es wurden nun neue Verfahren für die Isolierung und Reinigung von immunologisch aktivem PRP aus Haemophilus influenzae Typ b gefunden.

Die noch zu beschreibenden Verfahren haben gegenüber den bekannten Arbeitsweisen eindeutige Vorteile, da alle Verunreinigungen (Nucleinsäuren, Proteine und Endotoxine) durch eine Behandlung mit Hydroxylapatit entfernt werden. Die erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung von PRP führen zu einem Polysaccharid mit höherem Molekulargewicht als die bisher bekannten Verfahren.

Das nach den neuen Verfahren hergestellte PRP ist ausserdem, was noch wichtiger ist, im Gegensatz zu dem nach bekannten Arbeitsweisen hergestellten PRP, für Warmblüter in hohem Masse immunogen.

Die Entfernung von Verunreinigungen (Proteinen, Nucleinsäuren und Endotoxinen) des Polysaccharids PRP wird durch Behandlung des teilweise gereinigten Polysaccharids mit einem phosphathaltigen Adsorbens erreicht, das unter den angegebenen Bedingungen das Polysaccharid nicht adsorbiert.

Die weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung einer kombinierten PRP-und Pertussis-Vaccine, die bei jungen Tieren in hohem Masse immunogen wirkt.

Die Isolierung und Reinigung von Polyribosylribitolphosphat, dem Hüllenpolysaccharid von Haemophilus influenzae Typ b, erfolgt erfindungsgemäss nach dem Verfahren der Ansprüche 1 und 4. Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben.

Organismen, Züchtungsmedium und Kultur

Es werden vorzugsweise zwei Stämme von Haemophilus

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influenzae Typ b verwendet. Der Rab-Stamm ist seit längerer Zeit bekannt und frei zugänglich, wie u.a. aus The Journal of Immunology 107 (1971), 1071-1080 und Infection and Immu-nity 13 (1976), 581-589, insbesondere aus der Bezugnahme auf frühere, veröffentlichte Studien mit demselben Stamm, hervorgeht. Zusätzlich ist er bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 (USA) unter der Nr. ATCC 31512 hinterlegt worden. Im vorliegenden Fall ist der Stamm von Grace Leidy, Babies Hospital, Columbia University, 630 West 168 Street, New York, NY 10032 (USA) erhalten worden. Der CK-Stamm ist am 3. Oktober 1978 bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 31441 hinterlegt worden. Dieser Stamm ist von einem Patienten im Waterbury Hospital, Waterbury (CT, USA) isoliert worden.

Die Organismen werden mehreren Passagen durch Mäuse unterworfen, um ihre Virulenz zu gewährleisten. Sie werden bei der Autopsie aus dem Gehirngewebe von Mäusen isoliert, und zu ihrer Weiterzüchtung wird eines der folgenden Medien verwendet: 3,7prozentiges Gehirnherzinfusions-(BHI) (Difco Lab., Detroit, Mich.)-Medium oder 5prozentiger BHI-Agar, ergänzt durch 0,01% Nicotinamid-Adenin-Dinu-cleotid (NAD) (P-L Biochemicals, Milwaukee, Wis.) und 1% (Volumen/Volumen) defibriniertes Pferdeblut (Animal Blood Center, Syracuse, N.Y.). Zur Weiterzüchtung werden Anteile von 1 ml auf Ampullen verteilt, lyophilisiert und bei — 70 °C gelagert.

Für die Züchtung der Organismen verwendetes Grundmedium ist 3,7prozentiges BHI. Das Grundmedium wird mit 10 mg NAD und 20 mg Hemin (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) je Liter ergänzt. Je 50 ml Impfkultur wird 1% (Volumen/Volumen) defibriniertes Pferdeblut zugesetzt. Die Ergänzungsstoffe werden frisch zubereitet und durch eine 0,45 |j. Nalgene-Filter-Einheit (Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y.) vor Verwendung filtriert. Für die Züchtung des Organismus in einem 14-1-Fermentationsgefäss wird das Medium ausserdem noch mit 0,5% Glucose ergänzt.

Zur Herstellung von Organismen zum Impfen wird 1 ml gefrorene Stammkultur aufgetaut und zu 50 ml des angereicherten BHI-Mediums, das mit defibriniertem Pferdeblut und NAD ergänzt ist, gegeben. Die Kultur wird 8 Stunden bei 37 °C auf einer Rundschüttelvorrichtung mit 150 Umdrehungen/Minute gezüchtet. Die Organismen werden als lprozenti-ges Inokulum zu Anteilen von je 500 ml des angereicherten BHI-Mediums in 2-1-Kolben gegeben, die dann bei 37 °C unter mässigem Schütteln auf einer Rundschüttelvorrichtung 8 Stunden (zur Isolierung von PRP) oder 14 Stunden (als Saatkulturen) inkubiert werden. Die Fermentation eines jeden Anteils in einem 14-1-Fermentationsgefäss wird durch aseptische Überführung von 700 ml der Saatkultur zu 71 des angereicherten BHI-Mediums, das mit Hemin anstelle von defibriniertem Pferdeblut ergänzt ist, eingeleitet. Die Kultur wird ständig bei 37+ I °C gehalten. Unter Rühren mit 150 Umdrehungen/Minute wird ein Luftstrom von 0,25 1 Luft je Liter Medium und Minute aufrechterhalten. Während der Züchtung werden 0,001% eines Siliconentschäumers (FD-82, Hodag Chemical Corp.) je nach Bedarf zugegeben. Die Züchtung der Kulturen wird fortgesetzt, bis nur noch exponentielles Wachstum (8 bis 10 x 109 lebende Zellen/ml) erfolgt, gewöhnlich etwa 8 Stunden, und dann wird die Züchtung durch Zugabe von 0,4% Formaldehyd und Stehenlassen über Nacht bei 4 °C beendet.

Isolierung von Polyribosyl-ribitol-phosphat (PRP)

Die wie oben beschrieben erhaltene Maische wird bei 4 °C 30 Minuten bei 27 000-g zentrifugiert. Die zellfreie überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und folgendermassen behandelt:

Stufe 1, Ethanolfällung

Die überstehende Flüssigkeit der Kultur wird bis zu einer Endkonzentration von 4% mit Natriumacetat versetzt. Nach Einstellen des pH-Werts der Lösung auf 6,0 bis 6,2 werden 44 1 3A-Ethanol unter kräftigem Rühren bei 4 °C langsam zugegeben. Die Mischung wird mit Eisessig auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und dann 12 Stunden bei 3 ° C stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wird durch Dekantieren und Zentrifugieren gewonnen, wodurch rohes PRP erhalten wird.

Stufe 2, Behandlung mit Hexadecyltrimethylammonium-bromid (Cetavlon)

Der nach Stufe 1 erhaltene Niederschlag wird in pyrogen-freiem destilliertem Wasser gelöst und zur Entfernung des Rückstands zentrifugiert. Die klare braune Lösung wird dann langsam zu 100 ml einer lOprozentigen wässrigen Lösung von Hexadecyltrimethylammoniumbromid bis zu einer Endkonzentration von 0,5% unter Vermischen gegeben. Die Mischung wird 1 Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Der Niederschlag aus Nucleinsäuren und PRP-Hexadecyltrime-thylammoniumbromid-Komplex wird mit 2 1300 mM Natriumchlorid vermischt. Die trübe Lösung wird zur Entfernung unlöslicher Stoffe, wie der Nuclein-Hexadecyltrimethylam-moniumbromid-Salze zentrifugiert.

Die überstehende Flüssigkeit wird mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt, wodurch das PRP-Hexadecyltri-methylammoniumbromid-Salz ausfällt. Die Mischung wird 1 Stunde gerührt, und der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen und dann in 2 1300 mM Natriumchloridlösung gelöst.

Stufe 3, Freisetzung des PRP aus dem Komplex

Hexadecyltrimethylammoniumbromid und die verunreinigenden Nucleinsäuren und Proteine werden durch wenigstens zweimalige Ethanolfällung weiter entfernt. Das PRP wird, wie in Stufe 1 beschrieben, gefällt, während Hexadecyl-trimethylammoniumbromid in der alkoholischen Lösung gelöst wird. Das PRP wird abzentrifugiert, in 21 pyrogen-freiem destillierten Wasser gelöst und dann wie oben beschrieben wieder gefällt. Der schliesslich erhaltene PRP-Niederschlag wird in 20 millimolarem Natriumphosphat, pH 6,8, gelöst.

Stufe 4, Hydroxylapatit-Behandlung

Die Verunreinigungen (zum Beispiel Nucleinsäuren, Proteine und Endotoxine) in den teilweise gereinigten PRP-Prä-paraten werden selektiv durch Adsorption an einem Calcium-phosphat enthaltenden Adsorbens, nämlich Hydroxylapatit 3Ca3(P04)2-Ca(0H)2, entfernt.

Die erfindungsgemässe Verbesserung ist in den Ansprüchen 1 und 4 definiert.

Die Erfindung beruht also auf der Wahrnehmung, dass das Polysaccharid PRP durch das Calciumphosphatadsor-bens, das Phosphatpuffer (20 mM) mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0 bzw. 5,8 enthält, im Gegensatz zu den Verunreinigungen, wie Nucleinsäure, Proteinen und Endotoxinen, unter diesen Bedingungen nicht adsorbiert wird. Das erfindungsgemässe Verfahren kann absatzweise oder im Säulenbetrieb durchgeführt werden.

Beim absatzweisen Arbeiten wird der Hydroxylapatit zu dem teilweise gereinigten PRP-Präparat (in 20 mM Phosphat, pH z.B. 6,9) gegeben. Nach gründlichem Vermischen wird zur Entfernung nicht erwünschter Feststoffe (Adsorbens und die daran adsorbierten Verunreinigungen) zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise wenigstens zwei weitere Male unterworfen. Die erhaltene Lösung wird durch Milliporfilter filtriert, gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert.

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Beim Säulenbetrieb wird das teilweise gereinigte PRP in 20 mM Phosphatpuffer (pH 5,8) auf eine Säule aufgegeben, die das Adsorbens Hydroxylapatit enthält, das mit 20 mM Phosphatpuffer, pH 5,8, equilibriert worden ist, und mit einem stufenweise abgeänderten Natriumphosphatpuffer (pH 5,8) von 20 mM bis 100 mM eluiert. Die aufgefangenen Fraktionen werden auf Pentose (Polyribosylribitolphosphat) geprüft. Diejenigen Fraktionen, die bezüglich Pentose positiv sind, werden gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialy-siert und lyophilisiert.

Zur Herstellung einer PRP-Vakzine kann wie oben beschrieben hergestelltes lyophilisiertes PRP in einer Konzentration von 20 Lig/ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (0,113 g Kaliumdiphosphat, 0,83 g Dinatriumphosphat und 8,5 g Natriumchlorid pro Liter, pH 7,0, enthaltend 0,01% Thimerosal) gelöst werden. Die Vakzine wird durch 0,45-ji-Milliporfiltereinheiten steril filtriert, in Glasphiolen eingebracht und bei 4 °C gelagert.

Die Verfahren zur Herstellung einer Kombinationsvakzine aus PRP aus Haemophilus influenzae Typ b und Borde-tella-pertussis-Antigenen sind in den Ansprüchen 9 und 10 definiert. Vorzugsweise wird eine konzentrierte Lösung des PRP durch Lösen abgewogener vorbestimmter Mengen des Polysaccharids in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (0,113 g Kaliumdiphosphat, 0,83 g Dinatriumphosphat und 8,5 g Natriumchlorid pro Liter, pH 7,0, enthaltend 0,01% Thimerosal) hergestellt. Diese konzentrierte Lösung von PRP wird dann mit frischen Bordetella-pertussis-Zellsuspensionen vermischt, wodurch die Stammlösung erhalten wird. Die Kennzeichen von B. pertussis Stamm 138 sind in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, VIII, Herausgeber Buchanan and Gibbons, WMS and Wilkins Co., Maryland, USA, 1974, auf Seite 283 angegeben. Dieser Stamm ist bei der American Type Culture Collection, Maryland, V.St.A. unter der Hinterlegungsnummer ATCC 10380 erhältlich. Die Kombinationsvakzine in dieser Stammlösung enthält 200 ug PRP und etwa 70 Opacitätseinheiten (op) Zellen/ml. Die Stammlösung wird zur Enttoxifizierung von Pertussis-Antigenen 90 Tage bei 4 °C stehengelassen, ehe das fertige Produkt (Vakzine) hergestellt wird, das 10 (ig PRP und 3,5-op-Einheiten Pertussis-Zellen/0,5 ml Dosis enthält.

Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.

Beispiel 1

2,5 g Hydroxylapatit (z.B. Bio. Gel HTP, Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.) werden zu 250 ml teilweise gereinigten PRP-Präparaten (nach Hexadecyltrimethylammonium-

bromid- und Ethanolbehandlungen), die etwa 1,0 mg PRP/ml enthalten, in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,9, gegeben und 1 Stunde in einem eiskalten Wasserbad (1 bis 4 °C) vermischt. Die Mischung wird im Sorvall RC2-B 30 Minuten 5 bei 1600-g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dann durch ein 0,65-u-Milliporfilter geleitet und zwei weitere Male der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise unterworfen, wobei jedes Mal mit 2,5 g Hydroxylapatit behandelt wird. Die erhaltene Lösung wird durch 0,65 Li und 0,45 u. Millo liporfilter filtriert, gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt zeigt eine starke immunogene Wirksamkeit (vgl. weiter unten, Kombinationsvakzine und Tierversuch) und enthält nur äusserst wenig Verunreinigungen, wie Nucleinsäuren, Proteine 15 und Endotoxine (vgl. Tabelle I). Es werden etwa 170 mg lyophilisiertes PRP erhalten, was etwa 70% des eingesetzten Polysaccharids entspricht. Das PRP muss unter geeigneten Bedingungen, zum Beispiel bei 4 ° C, in einem Exsikkator über Phosphorpentoxid und Kieselgel gelagert werden.

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Beispiel 2

Ein teilweise gereinigtes PRP mit einem PRP-Gehalt von 300 mg wird in 100 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,8 (d.h. 3 mg PRP/ml) gelöst. Diese Lösung wird bei Zim-25 mertemperatur auf eine Säule (5,0 x 45 cm) Hydroxylapatit (Bettvolumen etwa 250 ml, mit 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,8, equilibriert) aufgegeben und mit 20 mM, 50 mM und 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,8, eluiert. Die mit 20 mM und 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 5,8) eluier-3o ten Fraktionen (200 ml), die pentosepositiv sind (Pentosebestimmung nach der Orcin-Methode) erhaltenen Fraktionen werden gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Es werden etwa 206 mg lyophilisiertes Produkt, PRP, erhalten.

35 Die Reinheit des Polysaccharids PRP wird durch Bestimmung des Masses der Verunreinigung mit Nucleinsäuren, Proteinen und Endotoxinen geprüft. Die Proteinkonzentration wird nach der Methode von Lowry et al. in J. Biol.

Chem. 193:265 (1951) mit Rinderserumalbumin als Standard 40 ermittelt. Nucleinsäure wird durch die Absorption der PRP-Lösung bei 260 nm bestimmt. Die Absorption von 50 ug Nucleinsäure in 1 ml Wasser in einer Zelle mit einem Lichtweg von 1 cm wird 1,0 gleichgesetzt. Das Molekulargewicht wird mittels Sepharose 4B- oder 2B-Gelfiltration an Säulen 45 von 1,5 x 90 cm (Pharmacia-Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) ermittelt. Die Werte des Verteilungskoeffizienten (Kd) werden aus dem durch die Orcinreaktion (Herbert et al., Methods in Microbiology, Bd. 5B, 285-291) entwickelten Elu-tionsbild berechnet.

Tabelle 1

Physikalisch-chemische Eigenschaften von PRP

Prüfung Endotoxin

Arbeitsweise Mol. Grösse (Kd) Pentose (%) Nucleinsäure (%) Protein (%) Kaninchen-Pyrogen- Limulus-Lysat-Testd

Testc

Beispiel 1 0a 36,0 0,8 0,7 10,0 lAoo

Beispiel 2 0,44b 33,8 0,3 0,7 10,0 '/iooo a Unter Verwendung von Sepharose 2B und 4B, Molekulargewicht 2 x 107.

b Unter Verwendung von Sepharose 4B.

c jj.g PRP/kg Körpergewicht (Kaninchen), die kein Fieber verursachen.

d Reziproke Verdünnung von PRP (100 ug PRP/ml) verglichen mit Bureau of Biologics El (Endotoxin-Standard).

Beispiel 1 bezieht sich auf die Merkmale von Haemophilus influenzae Typ b CK-Stamm, ACC 31441.

Beispiel 2 bezieht sich auf die Merkmale von Haemophilus influenzae Typ b Rab-Stamm, erhältlich von Babies Hosp. Columbia Univ. New York, N.Y., USA.

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Beispiel 3

Eine Kombinationsvakzine, die PRP aus H. influenzae Typ b und B.-pertussis-Antigenen enthält, wird folgendermas-sen hergestellt: 140 mg PRP (wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt) werden in 350 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (0,113 g Kaliumdiphosphat, 0,83 g Dinatriumphosphat und 8,5 g Natriumchlorid pro Liter, pH 7,0, enthaltend 0,01% Thimerosal) gelöst und durch 0,45-u-Millipor-filter filtriert. Diese konzentrierte PRP-Lösung (400 ug/ml) wird zur Herstellung einer Kombinationsvakzine verwendet, die aus PRP- und B.-pertussis-Antigenen besteht.

150 ml der konzentrierten PRP-Lösung (400 |ig/ml) werden mit 150 ml einer frischen Zellsuspension von B. pertussis (Stamm 138) in PBS, pH 7,0 (enthaltend 149 Opacitäts(op)-Einheitszellen/ml) versetzt, wodurch die Stammlösung der Kombinationsvakzine erhalten wird. Diese Stammlösung, 300 ml, wird bei 4 ° C gehalten, bis der Endotoxingrad von Pertussis vermindert ist (wenigstens 90 Tage). Die Sterilität der Stammlösung wird mit Thioglycollatmedien bei 32 bis 33 °C geprüft. Der pH-Wert der Stammlösung nach einer Inkubation von 90 Tagen wird geprüft und auf 7,0+ 1 eingestellt. Das für Tierversuche verwendete Fertigprodukt (Vakzine)

wird durch Verdünnen der vereinigten Stammlösung mit PBS hergestellt und enthält 10 ug PRP und 3,5 op-Einheiten Per-tussiszellen/0,5 ml (dosis).

Die Ergebnisse der Antikörperreaktion auf diese Kombinationsvakzine bei jungen Ratten sind in den Fig. 1 und 2 wiedergegeben.

Beispiel 4

Die Stammlösung von PRP (400 jig/ml) wird durch Auflösen von 30 mg des wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten PRP in 75 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Filtrieren durch 0,45-ji-Milliporfïlter hergestellt. Zu 25 ml dieser konzentrierten PRP-Lösung wird ein gleiches Volumen, d.h. 25 ml Frischzellensuspension von B. pertussis 5 (Stamm 138) in PBS, pH 7,0 (enthaltend 149 op-Einheiten Zellen/ml) gegeben, wodurch die Stammlösung der Kombinationsvakzine erhalten wird. Diese Stammlösung (50 ml) wird wenigstens 90 Tage bei 4 °C stehengelassen. Die Sterilität der Stammlösung wird wie oben erwähnt, mit Thioglykol-io latmedien geprüft. Der pH-Wert der Stammlösung beträgt 7,0+1. Das für Tierversuche verwendete Fertigprodukt (Vakzine) wird durch Verdünnen der Kombinationsstammlösung mit PBS hergestellt und enthält 10 jxg PRP und 3,7 op-Einhei-ten Pertussiszellen/0,5 ml (Dosis).

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Beispiel 5

Die PRP-Stammlösung (200 ug/ml in PBS, pH 7,0) wird wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Die Pertussisstamm-lösung (enthaltend 75 op-Einheiten/ml) wird durch Verdün-20 nen von 25 ml Frischzellensuspension von B. pertussis (149 op-Einheiten/ml) mit einem gleichen Volumen PBS hergestellt. Beide Stammlösungen werden voneinander getrennt 90 Tage oder etwas länger bei 4 °C inkubiert. Die Kombinationsvakzine wird unter Verwendung von 14 ml PRP-Stamm-25 lösung (200 (ig/ml), 14 ml (enttoxifizierter) Stammlösung von Pertussis-Antigenen (75 op-Einheiten/ml) und 112 ml PBS hergestellt (Endvolumen 140 ml). Diese für Tierversuche verwendete Vakzine enthält 10 [ig PRP und 3,7 op-Einheiten B. pertussis/0,5 ml (Dosis).

3o Die Ergebnisse der Antikörperreaktion auf diese Kombinationsvakzine bei jungen Ratten erscheinen in Fig. 3 und in Tabelle II.

Tabelle II

Immunogenizität von PRP-Pertussis-Komplex bei jungen Ratten3

Anti-PRP-Antikörper-Aktivität (cpm 3H-PRP gebunden/50 |il Serum)

Dosis ein- oder Woche nach Injektion 3. Woche nach Injektion

Vakzine mehrfach 0 1 2 3 .. .-fache Erhöhung durch

Vorimmunisierung

Phosphatgepufferte

(M)b

99c

116

107

158

1,6

Salzlösung

Pertussis

(M)

113

108

117

149

1,3

PRP(K) (Beispiel 1)

(M)

110

136

148

142

1,3

PRP (K) (3 mo) + Pertussis

(S)d

108

136

132

147

1,4

(3 mo) (Beispiel 5)

(M)

101

135

1002

1771

17,5

PRP (K) + Pertussis (3 mo)

(S)

93

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135

140

1,5

(Beispiel 4)

(M)

119

154

751

1410

11,8

a 10 (ig PRP oder 3,5 op Einheiten Pertussis/Dosis (0,5 ml) b bester Wert 2. und 3. Woche (Mehrfachinjektion) c Mittelwert von 10 Ratten d Einfachinjektion

G

3 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von immunologisch wirksamem Polyribosylribitolphosphat, PRP genannt, durch Fermentation von Stämmen des Organismus Haemophilus influenzae Typ b, Isolierung des PRP durch Ethanol-fällung, anschliessende Isolierung des PRP als Hexadecyltri-methylammoniumbromidkomplex, Freisetzung des PRP aus dem Komplex und Reinigung des erhaltenen PRP, dadurch gekennzeichnet, dass das teilweise gereinigte PRP durch Zugabe von Hydroxylapatit, d.h. 3Ca3(PO<i)2 ■ Ca(OH)2, in einem 20-mM-Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0, Vermischen bei einer Temperatur von 2 bis

2. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von immunologisch wirksamem Polyribosylribitolphosphat, PRP genannt, durch Fermentation von Stämmen des Organismus Haemophilus influenzae Typ b, Isolierung des PRP durch Ethanol-fällung, anschliessende Isolierung des PRP als Hexadexyltri-methylammoniumbromidkomplex, Freisetzung des PRP aus dem Komplex und Reinigung des erhaltenen PRP, dadurch gekennzeichnet, dass das PRP durch Säulenchromatographie in einem 20 mM Natriumpuffer bei einem pH-Wert von 5,8 unter Verwendung von Hydroxylapatit, d.h. 3Ca3(P04)2-Ca(0H)2, Elution mit einem abgestuften 20-mM-bis 50-mM-Natriumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,8, Isolierung von Fraktionen durch Analyse auf PRP, Dialyse dieser Fraktionen gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser und Lyophilisieren gereinigt wird.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Rab-Stamm von Haemophilus influenzae Typ b für die Fermentation verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der CK-Stamm vom Haemophilus influenzae Typ b ATCC 31441 für die Fermentation verwendet wird.

5. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 isoliertes und gereinigtes, immunologisch wirksames Polyribosylribitolphosphat.

6. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 2 isoliertes und gereinigtes, immunologisch wirksames Polyribosylribitolphosphat.

7. Polyribosylribitolphosphat nach Anspruch 5 oder 6, isoliert und gereinigt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 3.

8. Polyribosylribitolphosphat nach Anspruch 5 oder 6, isoliert und gereinigt nach dem Verfahren gemäss Anspruch 4.

9. Verfahren zur Herstellung einer Kombinationsvakzine zur Bildung von Anti-PRP-, d.h. Anti-Polyribosylribitolphos-phat- und Antipertussis-Antikörpern in jungen Warmblütern, dadurch gekennzeichnet, dass man Polyribosylribitolphosphat, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1, mit Bordetella-pertussis-Antigenen versetzt.

10. Verfahren zur Herstellung einer Kombinationsvakzine zur Bildung von Anti-PRP-, d.h. Anti-Polyribosylribitolphos-phat- und Antipertussis-Antikörpern in jungen Warmblütern, dadurch gekennzeichnet, dass man Polyribosylribitolphosphat, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 2, mit Bordetella-pertussis-Antigenen versetzt.

10 °C, Zentrifugieren, Abtrennen der überstehenden Flüssigkeit und wenigstens zweimaliges Wiederholen dieser Massnahmen, Filtrieren der überstehenden Flüssigkeit und anschliessendes Dialysieren gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser und Lyophilisieren gereinigt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Bordetella-pertussis-Antigene aus Bordetella pertussis ATCC 10380 erhalten worden sind.

12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyribosylribitolphosphat aus dem Rab-Stamm von Haemophilus influenzae Typ b erhalten worden ist.

13. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Bordetella-pertussis-Antigene aus Bordetella pertussis ATCC 10380 und das Polyribosylribitolphosphat aus dem Rab-Stamm von Haemophilus influenzae Typ b erhalten worden sind.

14. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Bordetella-pertussis-Antigene aus Bordetella pertussis ATCC 10380 und das Polyribosylribitolphosphat aus dem CK-Stamm von Haemophilus influenzae Typ b ATCC 31441 erhalten worden sind.