DE69032806T2

DE69032806T2 - Verfahren zur isolierung und reinigung von rezeptoren für transferrin und lactoferrin von bakterien und herstellung von impfstoffen, die sie enthalten

Info

Publication number: DE69032806T2
Application number: DE69032806T
Authority: DE
Inventors: Anthony Bernard Calgary Alberta T3A 3A3 Schryvers
Original assignee: University Technologies International Inc
Current assignee: University Technologies International Inc
Priority date: 1989-04-27
Filing date: 1990-04-26
Publication date: 1999-08-05
Anticipated expiration: 2010-04-27
Also published as: IL94228A0; NZ233471A; ATE173935T1; US5292869A; AU649950B2; AU5526190A; CA2051808C; WO1990012591A1; DE69032806D1; KR920700688A; IL94228A; KR100240974B1; EP0528787A1; EP0528787B1; CA2051808A1; NZ247967A; ES2127184T3; IL144973A0; DK0528787T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung der Transferrin- und Lactoferrin-Rezeptorproteine aus bakteriellen Pathogenen, einen Transferrin-Rezeptor in im wesentlichen reiner Form und Vakzine, die gereinigte Transferrin- und/oder Lactoferrin-Rezeptorproteine und/oder ihre Derivate enthalten.
Es gibt eine Reihe wichtiger bakteriellen Pathogene, die Erkrankungen in Menschen und Tieren hervorrufen, für die es entweder keine wirksamen oder nicht zufriedenstellende Vakzine gibt. Eine Reihe dieser Pathogene ist relativ wirtsspezifisch bezüglich ihrer Fähigkeit, eine natürliche Infektion hervorzurufen. Bakterien, wie Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae und Neisseria gonorrhoeae, sind immer noch eine wichtige Ursache für endemische und epidemische Erkrankungen bei Menschen, wie Meningitis, Otitis, Epiglottitis, Gonorrhoe und Urethritis. Ebenso sind Pasteurella haemolytica, Haemophilus somnus und Pasteurella multocida wichtige verursachende Agentien der pneumonischen Pasteurellose und der infektiösen thromboembolischen Meningoenzephalitis beim Vieh. Bei Schweinen ist Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae ein wichtiges verursachendes Agens der infektiösen Pneumonie. Bei Geflügel sind die Vogel-Haemophili, insbesondere Haemophilus paragallinarum, für die infektiöse Coryza verantwortlich.
Haemophilus influenzae und Neisseria meningitidis sind die häufigste Ursache bakterieller Meningitis bei Kleinkindern. Trotz einer verfügbaren wirksamen Antibiotikatherapie resultiert aus der Meningokokkeninfektion eine signifikante Mortalität und Morbidität. Die plötzlich ausbrechende Art der Infektion, zusammen mit den wenig charakteristischen klinischen Anzeichen bei Kindern unter zwei Jahren können der zur andauernden Mortalität und Morbidität beitragende hauptsächliche Faktor sein.
Vakzine auf der Basis der Kapselpolysaccharide des Bakteriums Neisseria meningi-tidis wurden entwickelt, nachdem eine Korrelation zwischen dem Vorliegen eines Anti-Kapsel-Antikörpers und einer Resistenz gegen systemische Meningokokkeninfektionen beobachtet wurde. Die Kapselpolysaccharid-Vakzine sind gegen Infektionen wirksam, die von Organismen der Meningokokken-Kapselserogruppen A, C, Y und W-135 hervorgerufen werden. Es gibt jedoch keine wirksame Vakzine gegen die Meningokokken der häufigsten Serogruppe B. Bei Kindern unter zwei Jahren, bei denen das größte Risiko einer Infektion mit einer endemischen Erkrankung besteht, gibt es eine schwache humorale Antwort auf die Kapselpolysaccharid-Vakzine. Die Kapselvakzine führen außerdem nicht zu einem immuno-logischen Gedächtnis, und die Dauer der Immunität ist relativ kurz. Versuche, die schlechte Immunogenität durch chemische Modifikation und Bindung an Tetanustoxoid zu überwinden, waren zwar vielversprechend, aber die Ergebnisse müssen im Hinblick auf die nachgewiesene serologische Kreuzreaktivität der Kapsel der Serogruppe B mit Nervengewebe der menschlichen Föten und Kinder betrachtet werden. Unter dieser Überlegung scheint die Entwicklung einer polyvalenten Polysaccharidvakzine, die eine ausreichend breite Abdeckung zur Verhinderung der endemischen Meningokokkenerkrankung bereitstellt, unwahrscheinlich.
Neisseria gonorrhoeae verursacht Gonorrhoe, die weltweit epidemische Ausmaße annimmt. Die Entwicklung einer Gonokokken-Vakzine ist von hoher Priorität.
Die pneumonische Pasteurellose des Rinds, eine Hauptursache für ökonomische Verluste in der Viehwirtschaft, wird hauptsächlich von Pasteurella haemolytica verursacht. Experimentelle Studien und Feldversuche mit Vakzinen, die P. haemolytica enthalten, verringerten in unterschiedlichem Maße das Auftreten und die Schwere der Erkrankung. Die infektiöse thromboembolische Meningoenzephalitis, eine bedeutende Ursache für die Sterblichkeit von Weidevieh, wird von Haemophilus somnus hervorgerufen. Zur Zeit gibt es keine wirksame Vakzine zur Verhinderung dieser Erkrankung. Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumonia verursacht eine ansteckende Pneumonie bei Schweinen, die ein Hauptproblem für die Schweineindustrie auf der ganzen Welt darstellt. Die Impfung mit Vakzinrohpräparaten war aufgrund eines beschränkten Schutzes bei heterologen Serotypen nicht erfolgreich. Die infektiöse Coryza beim Geflügel, die hauptsächlich von Haemophilus paragallinarum hervorgerufen wird, führt zu einer signifikanten Verringerung der Produktivität in der Geflügelindustrie.
Die Eisenaufnahme ist wesentlich für das Wachstum und das Überleben bakterieller Pathogene im Wirt und für die Verursachung der Infektion. Bakterielle Pathogene im Säugerwirt werden mit einer Umgebung konfrontiert, in der der Eisenspiegel extrem niedrig ist. Im extrazellulären Kompartiment wird Eisen durch die Proteine Transferrin und Lactoferrin aufgenommen, die in den Serum- bzw. Schleimhautsekreten vorwiegen. Die Fähigkeit, mit Lactoferrin und Transferrin um Eisen zu konkurrieren, ist für die Pathogenese vieler bakterieller Infektionen wesentlich. Viele Bakterien stellen Eisen-chelatisierende Verbindungen her, die als Siderophore bekannt sind, um die Eisenaufnahme aus ihrer Umgebung zu erleichtern. Mehrere pathogene Bakterien, wie Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae und Haemophilus influenzae, erzeugen keine Siderophore, sondern nehmen Lactoferrin-Eisen und Transferrin-Eisen in vitro direkt für das Wachstum auf.
Frühe Beobachtungen an Meningokokken und Gonokokken von B. E. Holbein, I. W. DeVoe und F. P. Sparling und Mitarbeitern zeigten, daß diese Bakterien in Gegenwart der Transferrin- oder Lactoferrin-Proteine wachsen und Eisen aus diesen Proteinen als einzige Eisenquelle zum Wachstum verwenden können. Ferner wurde bestätigt, daß die Trennung der Proteine von den Zellen mit einer Dialysemembran die Verwendung von Transferrin- oder Lactoferrin-Eisen ausschloß, was zeigt, daß die das Eisen von Lactoferrin oder Transferrin entfernenden löslichen Faktoren nicht beteiligt sind, und andeutet, daß ein Zellkontakt notwendig ist. Studien von F. P. Sparling und D. W. Dyer zeigten, daß Mutamen mit einer spezifischen Defizienz in der Eisenaufnahme aus Transferrin nicht binden können.
Schryvers et al., Molecular Microbiology 2(2), (1988) 281-288 versuchten, den Transferrinrezeptor aus N. meningitidis zu reinigen und zu charakterisieren. Das Dokument zeigt, wieviele eisenregulierte Proteine von verschiedenen Laboratorien beobachtet wurden. Kein besonderes Protein wurde jedoch schlüssig als der Transferrinrezeptor identifiziert. Das in diesem Dokument identifizierte Protein mit einem Molekulargewicht von 71.000 war nicht der Transferrinrezeptor, wie später von Ala'Aleen et al., FEMS Microbiol. Lett. 69 (1990) 37-42, enthüllt wurde.
Schryvers et al., Infection and Immunity 56 (1988) 1144-1149, offenbaren die Isolierung eisenregulierter Proteine aus N. meningitidis-Stämmen. Die Spuren C und G der Fig. 5 zeigen 3 mittels Transferrin-Affinitätsimmobilisierung isolierte Proteine: 1) ein niedermolekulares Protein mit einer Größe von etwa 60.000 bis etwa 85.000 Dalton, je nach dem Bakterienstamm; 2) ein höhermolekulargewichtiges Protein von etwa 100.000 Dalton und 3) eine Transferrin-Verunreinigung (Molekulargewicht von 80.000). Nur vom 60.000-85.000-Dalton-Protein wurde berichtet, daß es nach SDS-PAGE und Elektroblot die Transferrinbindungsaktivität beibehielt. Das 100.000-Dalton-Protein wurde als Verunreinigung in dieser Zubereitung und nicht als Teil des Transferrinrezeptors per se angesehen. Eine homogene oder gereinigte Zubereitung des 100.000-Dalton-Proteins wird nicht offenbart.
Eine allgemeine Übersicht über den Eisenmetabolismus wird in Iron and Infection, herausgegeben von J. J. Bullen und E. Griffiths (1987), John Wiley & Sons Ltd., S. 283- 317 vorgestellt. Die Seiten 293-295 betreffen Vakzine, aber der Transferrinrezeptor wird nicht identifiziert und charakterisiert.
Schryvers et al., "Comparative Analysis of the Transferrin and Lactoferrin Binding Proteins in the family of Neisseriaceae", Can. J. Microbiology, Bd. 35, Nr. 3 (1989), testeten mittels eines Festphasen-Bindungstests intakte Zellen verschiedener Bakterienarten auf ihre Fähigkeit, menschliches Transferrin und Lactoferrin zu binden. In diesem Dokument wurden die Proteine mit 94.000-106.000 Dalton nicht in homogener Form präpariert und behielten nicht ihre Transferrinbindungsaktivität nach SDS-PAGE und Elektroblotten. Nur die Proteine mit 68.000-86.000 Dalton behielten diese Aktivität.
Der Mechanismus der Eisenaufnahme von Transferrin und Lactoferrin wurde bisher in den Bakterien Pasteurella haemolytica, Haemophilus somnus, Pasteurella multocida, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae, Haemophilus suis, Haemophilus paragallinarum oder Haemophilus avium nicht untersucht.
Aufgrund ihrer Funktionen befinden sich die Transferrin- und Lactoferrin- Rezeptorproteine auf der Oberfläche von Bakterien, wenn diese sich im Wirt befinden, und sind für große Proteine zugänglich. Somit wären die Rezeptoren zugänglich für eine antikörpervermittelte Wirtsabwehr. Die Rezeptoren des Transferrin- und des Lactoferrin- Proteinrezeptors sind für die Gewinnung von Eisen für das Wachstum und Überleben wesentlich. So kann das Pathogen seine Transferrin- und/oder Lactoferrinrezeptoren nicht verlieren, um einer Immunität zu entkommen, die durch Vakzinantigene, die diese Rezeptorproteine enthalten, bereitgestellt wird. Jeder Versuch einer solchen Ausweichtechnik würde zur Unfähigkeit führen, in dem Wirt zu überleben.
Die Art des Eisenaufnahmeprozesses war bisher nicht bekannt, und die vollständige Identifizierung der Lactoferrin- und Transferrin-Rezeptorproteine war zuvor nicht möglich. Auch das Transferrin-Rezeptorprotein wurde zuvor nicht isoliert und gereinigt. Ferner wurde bisher keine Vakzine entwickelt, die die Lactoferrin- und/oder Transferrin-Rezeptorproteine enthält.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung überwindet die Probleme und Nachteile des Standes der Technik, indem sie ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung der Lactoferrin- und Transferrin-Rezeptorproteine bereitstellt, wodurch die Herstellung von Vakzinen, die das Lactoferrin- und/oder Transferrin-Rezeptorprotein enthalten, erleichtert wird.
Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Identifizierung von Transferrin- Rezeptorproteinen in bakteriellen Pathogenen und zu ihrer Isolierung und Reinigung bereitzustellen.
Es ist auch ein Ziel der Erfindung, Einzelkomponentenvakzin-Antigene bereitzustellen, die zur Verhinderung von Erkrankungen wirksam sind, die durch Lactoferrin- und Transferrin-Rezeptorproteine enthaltende bakterielle Pathogene hervorgerufen werden.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Vakzinantigene bereitzustellen, die zur Verhinderung von Erkrankungen durch bakterielle Pathogene bei Kleinkindern wirksam sind.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Vakzinantigenen, die ein besseres immunologisches Gedächtnis als gegenwärtige Polysaccharidkapselvakzine aufweisen.
Weitere Ziele und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der nachstehenden Beschreibung dargestellt und werden zum Teil aus der Beschreibung deutlich oder durch die Ausführung der Erfindung erlernt. Die Ziele und Vorteile der Erfindung sind aus den Instrumentarien und Kombinationen, die besonders in den beigefügten Patentansprüchen hervorgehoben werden, ersichtlich und erzielbar.
Zum Erreichen der Ziele und gemäß dem Zweck der Erfindung, wie er hier ausgeführt und allgemein beschrieben ist, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen der Lactoferrin- und Transferrin-bindenden Proteine mittels eines hier beschriebenen Affinitätschromatographieverfahrens in Membranzubereitungen aus Stämmen bereit, die eine Lactoferrin- und/oder Transferrinbindungsaktivität exprimieren.
Die Erfindung stellt somit einen Transferrinrezeptor in im wesentlichen reiner Form bereit, wobei der Transferrinrezeptor ein hochmolekulargewichtiges Protein im Bereich von etwa 94.000 bis etwa 106.000 Dalton umfaßt und wobei das Molekulargewicht durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wird.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen eines Transferrinrezeptors mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 94.000 bis etwa 106.000 Dalton aus bakteriellen Pathogenen bereit, die diesen enthalten, wobei das Verfahren das Isolieren einer Membranzubereitung aus einem die Transferrin-bindende Aktivität exprimierenden Bakterienstamm, das Binden eines biotinylierten Derivats von Transferrin an die Membranzubereitung und das Isolieren des Transferrinrezeptors mit einem Molekulargewicht von 94.000 bis 106.000 Dalton durch Affinitätschromatographie mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus immobilisiertem Streptavidin und immobilisiertem Avidin, umfaßt.
Die Erfindung stellt auch einen Transferrinrezeptor, der ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 94.000 bis etwa 106.000 Dalton hat, die Verwendung des Transferrin- Rezeptorproteins zur Herstellung einer Vakzine und eine Vakzine bereit, die eine Transferrinrezeptor-Zubereitung umfaßt, insbesondere eine Vakzine, die eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen bereitstellt und eine zur Bereitstellung einer schützenden Immunität gegen ein bakterielles Pathogen wirksame Menge eines Transferrinrezeptors umfaßt, umfassend
(a) ein Protein mit einem niedrigeren Molekulargewicht im Bereich von etwa 58.000 bis etwa 98.000 Dalton; oder
(b) ein Protein mit einem höheren Molekulargewicht im Bereich von etwa 94.000 bis etwa 106.000 Dalton; oder
(c) sowohl (a) als auch (b);
wobei das Molekulargewicht durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wird,
und einen pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür.
Die Erfindung stellt auch eine Vakzine bereit, die eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen bereitstellt, wobei die Vakzine eine wirksame Menge eines Transferrinrezeptors, wie hier beschrieben, um eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen bereitzustellen, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür umfaßt.
Die Erfindung stellt auch eine Vakzine bereit, die eine Lactoferrinrezeptor- Zubereitung und eine Transferrinrezeptor-Zubereitung umfaßt, insbesondere eine Vakzine, die eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen bereitstellt und eine zur Bereitstellung einer schützenden Immunität gegen ein bakterielles Pathogen wirksame Menge eines Lactoferrinrezeptors und eines Transferrinrezeptors umfaßt, wobei der Transferrinrezeptor umfaßt
(a) ein Protein mit einem niedrigeren Molekulargewicht im Bereich von etwa 58.000 bis etwa 98.000 Dalton; oder
(b) ein Protein mit einem höheren Molekulargewicht im Bereich von etwa 94.000 bis etwa 106.000 Dalton; oder
(c) sowohl (a) als auch (b);
wobei das Molekulargewicht durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wird,
und einen pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür.
Die Erfindung stellt auch eine Vakzine bereit, die eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen bereitstellt, wobei die Vakzine eine wirksame Menge eines Lactoferrinrezeptors, eines Transferrinrezeptors, wie hier beschrieben, um eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen bereitzustellen, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür umfaßt.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung des Lactoferrin-Rezeptorproteins zur Herstellung einer Vakzine und eine Vakzine bereit, umfassend eine Lactoferrinrezeptor- Zubereitung, insbesondere eine Vakzine, die eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen bereitstellt und die eine wirksame Menge eines Lactoferrinrezeptors, umfassend ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 105.000, wobei das Molekulargewicht durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wird, um eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen bereitzustellen, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür umfaßt.
Ein Lactoferrinrezeptor-Vakzinantigen wird bereitgestellt, umfassend eine Zubereitung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (1) einem gereinigten Lactoferrin- Rezeptorprotein, das aus einem Bakterium oder einem Organismus isoliert ist, der ein cloniertes Lactoferrinrezeptor-Gen exprimiert, (2) einem Derivat eines gereinigten Lactoferrin-Rezeptorproteins, (3) einem Fusionsprotein, das die gesamte oder einen Teil einer codierenden Sequenz eines Lactoferrinrezeptor-Gens enthält, und (4) einem synthetischen Peptid, dessen Aminosäuresequenz auf der Aminosäuresequenz eines gereinigten Lactoferrinrezeptors oder auf der Nucleotidsequenz eines clonierten Rezeptorgens beruht. Die Zubereitung wird gewöhnlich in 0,15 M Natriumchlorid, 0,05 M Natriumphosphat, einem Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,4, Thimerosal und gegebenenfalls einem Hilfsstoff suspendiert.
Die Erfindung stellt auch ein Transferrinrezeptor-Vakzinantigen bereit, umfassend eine Zubereitung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (1) einem oder mehreren gereinigten Transferrin-Rezeptorprotein(en), das/die aus einem Bakterium oder einem Organismus isoliert ist/sind, der mindestens ein cloniertes Transferrinrezeptor-Gen exprimiert, (2) einem Derivat eines gereinigten Transferrin-Rezeptorproteins, (3) einem Fusionsprotein, das die gesamte oder einen Teil einer codierenden Sequenz mindestens eines Transferrinrezeptor-Gens enthält, und (4) einem synthetischen Peptid, dessen Aminosäuresequenz auf der Aminosäuresequenz eines gereinigten Transferrin- Rezeptorproteins oder auf der Nucleotidsequenz eines clonierten Rezeptorgens beruht. Die Zubereitung kann in 0,15 M Natriumchlorid, 0,05 M Natriumphosphat, einem Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,4, Thimerosal und gegebenenfalls einem Hilfsstoff suspendiert werden.
Die erfindungsgemäßen Einzelkomponentenvakzin-Antigene sind gegen bakterielle Pathogene wirksam, die Eisen direkt durch Transferrin- und/oder Lactoferrinrezeptoren aufnehmen. Die Vakzinantigene eignen sich auch zur Bereitstellung einer Immunität für Kleinkinder.
Die beigefügte Zeichnung, die eingeschlossen ist und einen Teil dieser Beschreibung darstellt, veranschaulicht eine Ausführungsform der Erfindung und dient zusammen mit der Beschreibung zur Erklärung der Prinzipien der Erfindung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Zeichnung ist ein Fließdiagramm eines erfindungsgemäßen Affinitätschromatographieverfahrens.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Nachstehend wird eingehend auf die vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen.
Der Lactoferrinrezeptor ist ein an der Oberfläche zugängliches Außenmembranprotein. Es wurde gefunden, daß es in Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis ein Molekulargewicht von etwa 106.000 besitzt. Der Rezeptor ist spezifisch für die Bindung von Lactoferrin. Es bindet nicht Transferrin oder andere eisenbindende Proteine. Ferner bindet der Rezeptor der Neisseria- und Branhamella-Arten menschliches Lactoferrin mit hoher Affinität, bindet aber Lactoferrin aus anderen Arten nicht spezifisch. Die Expression des Rezeptors wird durch den Eisenspiegel reguliert, der Bakterien, die den Rezeptor besitzen, zur Verfügung steht. In Gegenwart von viel Eisen wird sehr wenig Protein erzeugt. Wenn das Eisen beschränkt ist, gibt es einen großen Anstieg in der hergestellten Menge an Rezeptorprotein. Der Rezeptor vermittelt nicht die Eisenaufnahme oder das eisenabhängige Wachstum von aus anderen Arten erhaltenem Lactoferrin. Er bindet eisengesättigtes menschliches Lactoferrin und menschliches Apolactoferrin mit gleicher Affinität. Es wurde gefunden, daß der Lactoferrinrezeptor in Neisseria meningitidis die nachstehenden, für den Lactoferrinrezeptor spezifischen monoclonalen Antikörper bindet: Nr. 33-15-4, 33-188-2, 33-75-6, 33-36-16 und 33-19-3.
Der Transferrinrezeptor besteht aus Proteinen, deren Expression ebenfalls durch den Eisenspiegel reguliert wird, der den Bakterien, die den Rezeptor besitzen, zur Verfügung steht. In Gegenwart von viel Eisen wird sehr wenig Protein erzeugt. Wenn das Eisen beschränkt ist, gibt es einen drastischen Anstieg in der hergestellten Menge an Rezeptorproteinen. Der Transferrinrezeptor in den menschlichen Pathogenen Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae und Branhamella catarrhalis vermittelt die Eisenaufnahme und das eisenabhängige Wachstum von menschlichem Transferrin aber nicht von aus anderen Arten erhaltenen Transferrinen. Bei den Rinderpathogenen Pasteurella haemolytica, Haemophilus somnus und Pasteurella multocida vermittelt der Transferrinrezeptor das eisenabhängige Wachstum von Rindertransferrin, aber nicht von aus anderen Arten erhaltenen Transferrinen. Bei den Schweinepathogenen Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis und Haemophilus suis vermittelt der Transferrinrezeptor das eisenabhängige Wachstum von Schweinetransferrin, aber nicht von aus anderen Arten erhaltenen Transferrinen. Beim Geflügel besitzen die Pathogene Haemophilus paragallinarum (Haemophilus gallinarum) und Haemophlius avium Transferrinrezeptoren, die das eisenabhängige Wachstum mit Vogel- (Hühner- oder Truthahn-) Transferrin, aber nicht mit Transferrinen von Säugerarten, d. h. von Mensch, Schwein oder Rind, vermitteln.
Der Transferrinrezeptor besteht aus zwei Außenmembranproteinen: (1) einem Protein mit höherem Molekulargewicht von etwa 100.000 in Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae und Haemophilus influenzae, und (2) einem Protein mit niedrigerem Molekulargewicht von etwa 65.000 bis etwa 90.000 in verschiedenen Stämmen und Arten. Bei einigen Arten, wie Neisseria meningitidis, kann das Protein mit niedrigerem Molekulargewicht die Transferrinbindungsaktivität nach Natriumdodecylsulfat-Polyacryl-amidelektrophorese und Elektroblotten teilweise wiederherstellen. Beide gereinigten Rezeptorproteine aus Neisseria meningitidis können die Transferrinbindungsaktivität nach der Elution von einer Affinitätssäule mit Guanidiniumhydrochlorid und Entfernung des Guanidiniumhydrochlorids teilweise wiederherstellen.
Der Transferrinrezeptor bindet Transferrin, aber keine anderen eisenbindenden Proteine. Bei den menschlichen Pathogenen Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Branhamella catarrhalis und Haemophilus influenzae binden die Rezeptoren menschliches Transferrin mit hoher Affinität, aber binden nicht spezifisch an Transferrin aus anderen Arten. Bei den Rinderpathogenen Pasteurella haemolytica, Haemophilus somnus und Pasteurella multocida binden die Rezeptoren Rindertransferrin, aber keine Transferrine aus anderen Arten. Bei den Schweinepathogenen Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis und Haemophilus suis binden die Rezeptoren Schweinetransferrin, aber keine Transferrine aus anderen Arten. Bei den Geflügelpathogenen Haemophilus paragallinarum (Haemophilus gallinarum) und Haemophilus avium binden die Rezeptoren Vogel- (Hühner- oder Truthahn-) Transferrine, aber keine Transferrine aus Säugerarten. Die Transferrinrezeptoren aus menschlichen Pathogenen binden eisengesättigtes menschliches Transferrin mit etwa zehnfach höherer Affinität als menschliches Apotransferrin und binden an teilweise und vollständig deglycosyliertes menschliches Transferrin mit gleicher Affinität, aber sie binden nicht an menschliches Transferrin, das mit leichter Periodat-Oxidation behandelt wurde. Der Transferrinrezeptor bindet die nachstehenden monoclonalen Antikörper: Nr. 36-4, 36-6, 36-104 und 32-58-5.
Die Lactoferrinbindungsaktivität in mehreren Neisseria meningitidis-Stämmen, in N. gonorrhoeae, N. lactamica und B. catarrhalis wurde unter Verwendung eines Festphasenbindungstests mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem menschlichem Lactoferrin oder alternativ unter Verwendung von biotinyliertem menschlichem Lactoferrin, gefolgt von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Streptavidin bestimmt. Es wurde gefunden, daß die Lactoferrinbindungsaktivität bei allen getesteten Meningokokkenstämmen vorhanden ist. Die Expression der Lactoferrinbindungsaktivität ist eng mit der Expression der Transferrinbindungsaktivität korreliert. Die Bindung ist spezifisch für menschliches Lacto-ferrin. Weder Rinderlactoferrin, menschliches Transferrin, noch menschliches Hämoglobin blockieren die Bindung von Meerrettich- Peroxidase-konjugiertem menschlichem Lacto-ferrin. Die Bindung von Lactoferrin hängt nicht vom Eisensättigungsspiegel ab, da eisengesättigtes Lactoferrin und Apolactoferrin bei der Blockierung der Bindung von HRP-Lactoferrin in kompetitiven Bindungstests gleich wirksam sind.
Das Lactoferrinbindungsprotein wurde durch Chargenaffinitätschromatographie mit biotinyliertem menschlichem Lactoferrin und Streptavidin-Agarose in mehreren Bakterienstämmen identifiziert. Es wurde gefunden, daß das biotinylierte Lactoferrin an intakte Gesamtmembranen gebunden und dann durch Zentrifugation von freiem Lactoferrin getrennt wurde. Der Lactoferrinrezeptorkomplex wurde dann von den Membranen solubilisiert, von nicht solubilisiertem Material getrennt und mittels der an Lactoferrin gebundenen Biotin-Einheit an ein Streptavidinagarose-Harz gebunden. Nach dem Waschen des Harzes wurden die gebundenen Proteine durch Kochen in Probenpuffer eluiert und mittels SDS-PAGE analysiert. Alternativ kann das Lactoferrin-Rezeptorprotein durch Erhöhen der Konzentrationen an Guanidiniumhydrochlorid eluiert werden.
Ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 105.000 wurde an das Lactoferrin-Affinitätsharz gebunden, wenn die Gesamtmembranen von an Eisen verarmten N. meningi-tidis B16B6, Gruppe X und Gruppe W 135 verwendet wurden.
Der Mechanismus der Eisenaufnahme von Transferrin in Meningokokken beinhaltet die Bindung durch einen Rezeptor an der Oberfläche des Bakteriums, und das Fehlen einer ¹²&sup5;I-Transferrin-Akkumulation zeigt, daß die Aufnahme nicht durch die Internalisierung eines Transferrin-Rezeptor-Komplexes verläuft. Es wird angenommen, daß die Entfernung von Eisen vom Transferrin und die Freisetzung von Apotransferrin aufeinanderfolgende Schritte beim Aufnahmemechanismus sind. Es liegt eine höhere Affinität des Transferrinrezeptors für eisengesättigtes Transferrin als für Apotransferrin vor. Da an der Eisenaufnahme von Lactoferrin auch ein Oberflächenrezeptor beteiligt ist, wird angenommen, daß für Lactoferrinrezeptoren ein ähnlicher Aufnahmemechanismus existiert.
Eine Transferrinbindungsaktivität wurde in allen getesteten Stämmen von Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, N. gonorrhoeae, N. lactamica und B. catarrhalis nachgewiesen. Die Transferrinbindungsaktivität in allen getesteten Isolaten war spezifisch für menschliches Transferrin, so daß nur menschliches Transferrin effektiv die Bindung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem menschlichem Transferrin blockieren konnte.
Der Transferrinrezeptor wurde zuvor durch SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse als Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 75.000 bis etwa 88.000 identifiziert. Ein reiner Transferrinrezeptor wurde jedoch durch dieses Verfahren nicht isoliert. Auch das höhermolekulargewichtige Transferrin-bindende Protein wurde durch dieses Verfahren nicht identifiziert. Der Erfinder entwickelte ein Affinitätsisolationsverfahren unter Verwendung von biotinyliertem Transferrin und Streptavidinagarose, was zur Isolierung eines reinen Transferrinrezeptors führte. Transferrin-bindende Proteine mit einem niedrigeren Molekulargewicht im Bereich von etwa 58.000 bis etwa 98.000 und einem Protein mit einem höheren Molekulargewicht von etwa 94.000 bis etwa 105.000 wurden aus den vorstehenden Stämmen isoliert. In der Familie der Neisseriaceae ergab die Affinitätsisolation mit biotinyliertem Transferrin mindestens zwei Proteine in allen getesteten Arten, wobei das Protein mit dem höheren Molekulargewicht in allen Neisseria- Isolaten bei etwa 98 kd und in B. catarrhalis bei 105 kd lag.
Der Erfinder hat gefunden, daß der Rezeptor für menschliches Transferrin in allen getesteten Haemophilus influenzae-Isolaten vorliegt, aber in anderen Haemophilus-Arten oder in den repräsentativen Isolaten der Gattungen Pasteurella oder Actinobacillus nicht nachweisbar war. Das Fehlen des Rezeptors für menschliches Transferrin in anderen Haemophilus-Arten und in Actinobacillus und Pasteurella kann der Grund dafür sein, warum diese Bakterien selten invasive Erkrankungen in Menschen verursachen. Ebenso hat der Erfinder einen Rindertransferrinrezeptor in allen getesteten Isolaten von Pasteurella haemolytica Typ A1 und Haemophilus somnus und in einigen Isolaten von Pasteurella multocida nachgewiesen. Der Erfinder hat ebenfalls eine Schweinetransferrinbindung in allen getesteten Actinobacillus pleuropneumoniae-Isolaten nachgewiesen. Daher korreliert das Vorliegen des Rezeptors gut mit der Fähigkeit dieser Organismen, in ihren jeweiligen Wirten Erkrankungen zu erzeugen.
Das erfindungsgemäße Vakzinantigen kann aus dem Lactoferrin- und/oder Transferrin-Rezeptorprotein hergestellt werden, das aus Erkrankungen verursachenden bakteriellen Pathogenen isoliert worden ist. Wenn gefunden wird, daß eine Zubereitung nicht ausreichend immunogen ist, kann ein geeignetes Adjuvans, wie Aluminiumhydroxid, in der Vakzinzubereitung eingeschlossen werden.
Die Lactoferrin- und/oder Transferrin-Rezeptorproteinisolate werden in den erfindungsgemäßen Vakzinantigenen in einer pharmazeutisch wirksamen Menge eingeschlossen, um eine ausreichende Immunogenität zu erzielen.
Die erfindungsgemäßen Vakzinantigene können durch einen wirksamen, dem Fachmann bekannten Verabreichungsweg, beispielsweise subkutan oder intramuskulär, verabreicht werden.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele, die die Erfindung ausschließlich veranschaulichen sollen, weiter erklärt.

Beispiel 1: Identifizierung und Charakterisierung des Bindungsproteins für menschliches Lactoferrin von Neisseria meningitidis

Bakterienstämme und Wachstumsbedingungen

N. meningitidis B16B6, ein Standardstamm zur Serotypisierung, wurde von C. Frasch erhalten. Meningokokkenstämme der Gruppen X und W135 wurden vom Foothills Hospital, Calgary, Alberta erhalten. Die Meningokokken wurden auf Schokoladenagar- Platten, angereichert mit CVA (Gibco Laboratories, Grand Island, N. Y.), in einer Atmosphäre mit 5% CO&sub2; gezüchtet. Frisch gezüchtete Zellen von den Schokolade-Platten wurden routinemäßig zum Animpfen von flüssiger Mueller-Hinton-Brühe (MHB) auf eine Anfangs-A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,04 verwendet und vor der Ernte 16 Stunden unter Schütteln inkubiert. Eisenverarmungs-MHB enthielt gewöhnlich 35 uM EDDA (Ethylendiamindiorthohydroxy-phenylessigsäure). Die für die Expressionsexperimente verwendeten Brühen und Kulturbedingungen sind in der Tabelle 1 angegeben.

Chemikalien

Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes menschliches Lactoferrin wurde von Jackson Immunoresearch Laboratories, Avondale, Pa. erhalten. Rinderlactoferrin stammte von Accurate Chemicals, Westbury, N. Y. Menschliches Lactoferrin (L-8010), menschliches Transferrin (T2252) und menschliches Hämoglobin (H7379) stammten von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. Biotin-X-NHS (Biotinyl-&epsi;-aminocapronsäure-N- hydroxysuccinimid-ester) stammte von Calbiochem, San Diego, Kalif. Streptavidinagarose stammte von Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Md. Die Acrylamidgel- Ausschlußsäule stammte von Beckman Instruments, Fullerton, Kalif

Präparation eisenbindender Proteine

Die Eisensättigung von menschlichem Transferrin und Lactoferrin und die Präparation der Apoproteine wurden durch zuvor beschriebene Verfahren (A. B. Schryvers und L. Morris, Molecular Microbiology 2, 281-288) erzielt, ausgenommen, daß eine zusätzliche Präparation von Apolactoferrin mit den von Mazurier und Spik (Biochim. Biophys. Acta 629, 399-408) verwendeten Puffern hergestellt wurde. Die Proteinzubereitungen wurden durch Ultrafiltration mit einem Amicon-Centriflo-Membranconus (Amicon Corporation, Danvers, MA) eingeengt und anschließend durch eine 0,2 um- Membran sterilfiltriert. Die Eisensättigung der Zubereitungen wurde durch Messen der Extinktion bei 465 nm überprüft.

Biotinylierung von Lactoferrin

Zubereitungen von eisengesättigtem menschlichem Lactoferrin wurden mit 50 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5) durch Zyklen von Gelfiltration und Ultrafiltration äquilibriert und auf 1 mg/ml verdünnt. 250 ug Biotin-X-NHS, gelöst in 16 ul Dimethylformamid, wurden zu jedem Miniliter der Proteinlösung gegeben, und das Gemisch wurden unter leichtem Schütteln bei 4ºC 2 Stunden inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 100 ul 10 mg/ml Glycin zu jeder 1 ml-Portion beendet, und das Gemisch wurde weitere 2 Stunden unter Schütteln bei 4ºC inkubiert. Die Proben wurden gegen drei Wechsel von 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 100 mM NaCl und einen Wechsel von 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 7,5 dialysiert, durch Ultrafiltration mit einem Amicon-Centriflo-Membranconus eingeengt und bei 4ºC aufbewahrt.

Präparation von Membranen

Die Zellen wurden geerntet und in 50 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer, pH 7,5 gewaschen und in einer Konzentration von 0,2 g Zellen pro ml in einem Puffer, der 50 ug Phenylmethylsulfonylfluorid pro ml enthielt, resuspendiert. Nach der Lyse der Zellen durch zweimaliges Durchleiten durch eine French-Druckzelle bei 16000 Pfd./Inch² wurden Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 8000 · g für 15 min entfernt. Rohe Gesamtmembranen wurden durch Zentrifugation bei 140000 · g für 1 Stunde gewonnen und im vorstehenden Puffer suspendiert. Die Außenmembranen wurden von den rohen Gesamtmembranen durch selektive Extraktion mit Sarkosyl NL97 präpariert. Die Gesamtmembranen wurden auf 5 mg Protein pro ml verdünnt, und das Sarkosyl wurde auf 0,5% zugegeben. Das Gemisch wurde 30 min auf Eis inkubiert, und die Außenmembranen wurden durch Zentrifugation bei 180000 · g für 10 min gesammelt. Das Sediment wurde in Puffer resuspendiert und wie vorstehend erneut extrahiert, und das endgültige gewaschene Sediment wurde nur in Puffer resuspendiert.

Chargen-Affinitätsisolation des Bindungsproteins

20 ug biotinyliertes menschliches Lactoferrin oder Transferrin wurden mit 0,75 mg Gesamtmembranprotein in 1 ml Puffer aus 50 mM Tris-Hydrochlorid, 100 mM NaCl, pH 8,0 gemischt und unter leichtem Schütteln 60 min bei 37ºC inkubiert. Die Membranen wurden durch Zentrifugation bei 16000 · g für 10 min in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge sedimentiert und in 1 ml Puffer resuspendiert. EDTA wurde auf 10 mM zugegeben, und Sarkosyl wurde auf 0,75% zugegeben, gefolgt von 100 ul einer 1/2-Verdünnung von Streptavidinagarose (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Md.). Nach einer Inkubation bei 22ºC für 60 min wurde das Gemisch 3 min bei 750 · g zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Das Affinitätsharz-Sediment wurde einer von drei verschiedenen Waschprozeduren unterworfen, bei denen Puffer mit unterschiedlichen Zusammensetzungen zu Sediment gegeben und 10 min bei 22ºC inkubiert wurden, das Gemisch wurde wie vorstehend zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Anzahl der Waschschritte und die Pufferzusammensetzungen für die verschiedenen Waschverfahren waren wie nachstehend. Waschverfahren 1: Dreimal mit einem Puffer aus 50 mM Tris-Hydrochlorid, 100 mM NaCl, pH 8,0, der 10 mM EDTA und 0,5% Sarkosyl enthielt, waschen, dann zweimal mit dem Puffer ohne EDTA und Detergens waschen. Waschverfahren 2: Dreimal mit einem Puffer aus 50 mM Tris-Hydrochlorid, 1 M NaCl, pH 8,0, der 10 mM EDTA und 0,5% Sarkosyl enthielt, waschen, dann einmal mit dem vorstehenden Puffer ohne EDTA oder Detergens und schließlich mit 50 mM Tris- Hydrochlorid, 100 mM NaCl, pH 8,0 waschen. Waschverfahren 3: Dreimal mit einem Puffer aus 50 mM Tris-Hydrochlorid, 1 M NaCl, 250 mM Guanidiniumhydrochlorid, pH 8,0, der 10 mM EDTA und 0,5% Sarkosyl enthielt, waschen, dann einmal mit dem vorstehenden Puffer ohne EDTA oder Detergens und schließlich mit einem Puffer aus 50 mM Tris-Hydrochlorid, 100 mM NaCl, pH 8,0 waschen. Nach dem endgültigen Waschschritt wurde das Sediment in 200 ul Probenpuffer (0,2 M Tris-Hydrochlorid, pH 6,81, 2% Natriumdodecylsulfat, 30% Glycerin, 0,1% Bromphenolblau) ohne Reduktionsmittel suspendiert und 5 min bei 100ºC erhitzt, um gebundene Protein zu eluieren. Nach dem Kochen wurde die Probe schnell 1 min auf Eis abgekühlt und dann 3 min bei 750 · g zentrifugiert. Der Überstand wurde sofort in ein getrenntes Röhrchen überführt, und Betamercaptoethanol wurde auf eine Endkonzentration von 1,4 M zugegeben. Eine 50 ul-Portion dieser Probe wurde auf ein 10%iges SDS-PAGE-Gel aufgetragen, und die Elektrophorese wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli (Nature 227 (1970) 680-685) durchgeführt. Das SDS-PAGE-Gel wurde gemäß dem Verfahren von Oakley et al. (Anal. Biochem. 105 (1980) 361-363) mit den nachstehenden geringfügigen Modifikationen mit Silber gefärbt. Das Gel wurde zuerst über Nacht mit einer Lösung von 25% Isopropanol, 7% Essigsäure fixiert. Nach dem Entfernen der Entwicklerlösung wurde die Entwicklung mit einer Lösung aus 0,35% Essigsäure für 1 Stunde gestoppt, und dann wurde das Gel mit Wasser gewaschen.

Lactoferrinbindungstest

Der Dot-Bindungstest für Lactoferrin wurde im wesentlichen durchgeführt, wie zuvor für die Transferrinbindungsaktivität beschrieben (A. B. Schryvers und L. Morris, Molecular Microbiology 2 (1988) 281-288), ausgenommen, daß konjugiertes Lactoferrin (250 bis 500 ng/ml) zum Bindungsgemisch gegeben wurde. Das kommerziell hergestellte menschliche Lactoferrin hat ein Verhältnis von Peroxidase zu Lactoferrin von 1 : 1,5. Daher reichte die routinemäßig verwendete Konzentration von konjugiertem Lactoferrin von etwa 1,8 bis 3,6 nM (das durchschnittliche Molekulargewicht von konjugiertem Lactoferrin ist 140.000). Bei Kompetitionsexperimenten wurden Gemische aus unkonjugierten Proteinen und konjugiertem menschlichem Lactoferrin vor der Anwendung auf die Membran hergestellt.
Für Expressionsexperimente, die eine Quantifizierung erforderten, wurden Zellsuspensionen auf eine A&sub6;&sub0;&sub0; von 10 eingestellt, und eine Reihe von neun Zweifach- Verdünnungen wurde hergestellt und auf Papier getropft. In Proben, in denen eine signifikante Expression des Bindungsproteins erwartet wurde, war die erste Verdünnung eine Zehnfach-Verdünnung. Eine Verdünnungsreihe des konjugierten menschlichen Lactoferrins wurde ebenfalls direkt auf das gleiche Papier aufgetragen. Nach dem Entwickeln mit Substrat und Trocknen des Papiers wurden die Flecken mit einem Modell- 620-Videodensitometer von BioRad gemessen, wobei die Reflexionseinstellung verwendet wurde und ein Mikrocomputer mit dem 1-D-Analyst-Softwarepaket von BioRad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalif.) angeschlossen wurde. Eine Standardkurve wurde aus den Flächen unter den Peaks für die Konjugatverdünnungen konstruiert. Die gemessenen Flächen unter dem Peak für die Verdünnung von Proben wurden zur Bestimmung der Menge an gebundenem Konjugat verwendet. Nur Peaks, deren Flächen in den Bereich der zur Konstruktion der Standardkurve verwendeten Werte fielen, wurden für Berechnungen verwendet. Die Proteinkonzentration der Zensuspensionen, die durch den Test von Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193 (1951) 265-275) bestimmt wurde, wurde zur Berechnung der Menge an pro Milligramm Gesamtzellprotein gebundenem Bindungsprotein verwendet, und der anfängliche A&sub6;&sub0;&sub0;-Wert wurde zur Berechnung der Menge an Bindungsprotein, das pro Milliliter Kulturvolumen exprimiert wurde, verwendet.

Bestimmung der Proteinkonzentration

Das Protein wurde durch das Verfahren von Lowry et al. mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Eine vorläufige Proteinkonzentration wurde durch das von Rylatt et al. (Anal. Biochem. 121 (1982) 213-214) beschriebene Schnellverfahren mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt und später mit dem Test von Lowry et al. bestätigt. Tabelle 1: Expression der Lactoferrinbindungsaktivität
a. Das Wachstumsmedium bestand aus Gehirn-Herz-Infusionsbrühe mit den angegebenen Zugaben, HHb: menschliches Hämoglobin, HTr: eisengesättigtes menschliches Transferrin.
b. Die Kulturen wurden mit Zellen angeimpft, die aus frischem Bewuchs auf Schokoladen- Platten auf eine Anfangs-A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,04 resuspendiert worden waren, und 16 Std. bei 37ºC inkubiert. Die endgültige A&sub6;&sub0;&sub0; wurde nach 16stündigem Wachstum mit Medium, das die angegebenen Zugaben enthielt, als Leerwert gemessen.
c. Die Bindungsaktivität, ausgedrückt als Nanogramm konjugiertes Lactoferrin, das pro Milligramm Gesamtzellprotein oder pro Milliliter ursprünglichem Kulturvolumen gebunden wurde, wurde wie im Text beschrieben bestimmt.

ERGEBNISSE

Expression der Lactoferrinbindungsaktivität

Zur Bestimmung der Regulation der Expression der Lactoferrinbindungsaktivität in N. meningitidis wurde der Stamm B16B6 in einer Brühe gezüchtet, die eine Vielzahl verschiedener Zugaben enthielt. Das an Peroxidase konjugierte menschliche Lactoferrin (HRP-Lactoferrin) wurde zum Nachweis der Lactoferrinbindungsaktivität in intakten Meningokokkenzellen verwendet. Wie in Tabelle 1 gezeigt, war die Menge an Expression der Lactoferrinbindungsaktivität in Zellen niedrig, die nur in Brühe gezüchtet wurden, wurde aber durch Zugabe des synthetischen Eisenchelators EDDA deutlich erhöht. Es wurde gezeigt, daß die erhöhte Expression auf die verringerten Eisenmengen zurückzuführen war, da die Zugabe eines Überschusses an Eisen zu einer Rückkehr zu den ursprünglichen niedrigen Expressionsspiegeln führte. Die Expression der Lactoferrinbindungsaktivität korrelierte eng mit der Expression der Transferrinbindungsaktivität.
Das in einer früheren Studie (Fig. 1 in A. B. Schryvers und L. Morns, Molecular Microbiology 2 (1988) 281-288) beschriebene Experiment zum Zeitverlauf der Expression der Transferrinbindungsaktivität wurde doppelt durchgeführt, und der Lactoferrinbindungs-test ergab im wesentlichen identische Ergebnisse (Daten nicht gezeigt). Unter diesen Bedingungen wurde die maximale Bindungsaktivität nach 12 bis 16 Stunden Inkubation erzielt.
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen auch, daß fast maximale Mengen an Expression mit mittleren EDDA-Mengen erzielt wurden. Die in diesem Experiment beobachtete Menge an Lactoferrinbindungsaktivität war mit der vergleichbar, die unter stringenteren eisenbeschränkenden Bedingungen, wie sie auftraten, wenn die Zellen einem zweiten eisenbeschränkenden Wachstumszyklus unterworfen wurden, erzielt wurden (Daten nicht gezeigt). Wie in der Tabelle 1 gezeigt, hob die Bereitstellung von Komplex-Eisen in Form von Hämoglobin oder menschlichem Transferrin teilweise die Wachstumsbeschränkung auf, die durch die hohen EDDA-Mengen auferlegt wurde, ohne die Bindungsaktivität drastisch zu verringern. Wenn jedoch höhere Hämoglobinmengen zugegeben wurden, war die Expression der Bindungsaktivität auf nicht nachweisbare Mengen gehemmt.
Die Lactoferrinbindungsaktivität wurde in 20 von 20 getesteten Meningokokkenstämmen nachgewiesen (Daten nicht gezeigt), was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt, daß alle getesteten Meningokokkenstämme Lactoferrin-Eisen für ihr Wachstum verwenden können.

Identifizierung des Lactoferrinbindungsproteins

Ein Affinitätschromatographie-Chargenverfahren mit biotinyliertem menschlichem Lactoferrin und Streptavidinagarose wurde zur Identifizierung des Lactoferrinbindungsproteins in mehreren verschiedenen Meningokokkenstämmen verwendet. Ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 105.000 wurde spezifisch an das Lactoferrinaffinitätsharz gebunden, wenn Gesamtmembranen aus eisenverarmten N. meningitidis B16B6 verwendet wurden. Wenn biotinyliertes Lactoferrin aus dem Verfahren weggelassen wurde, trat die Bande nicht auf, was anzeigt, daß eine spezifische Bindung an Lactoferrin beteiligt war. Die Bande fehlte auch, wenn Gesamtmembranen aus eisengesättigten Zellen verwendet wurden, was mit der Beobachtung übereinstimmt, daß die Expression der Lactoferrinbindungsaktivität durch Eisen stark reprimiert wird (Tabelle 1). Obwohl beobachtet wurde, daß Proteine mit einem Molekulargewicht von 70.000 und 3 8.000 zusammen mit der Bande mit einem Molekulargewicht von 105.000 gereinigt wurden, wenn leichtes Waschen durchgeführt wurde, wurden sie durch ausgiebigere Waschverfahren nach und nach entfernt. Unter den Elutionsbedingungen wurde sehr wenig biotinyliertes Lactoferrin (Molekulargewicht von 80.000) vom Harz freigesetzt, aber die Zugabe eines Reduktionsmittels zum Probengemisch vor dem Kochen führte zu einer durch SDS-PAGE beobachteten Zunahme dieser Bande. Eine schwächere Bande bei einem Molekulargewicht von 37.000 wurde in praktisch allen Proben beobachtet. Die Affinitätschromatographie unter Verwendung von Gesamtmembranen aus Meningokokkenstämmen der Gruppen X und W135 identifizierte ein Lactoferrinbindendes Protein mit ähnlichem Molekulargewicht. Die bei 70.000 beobachtete Bande M&sub1; in diesen Proben rührte von unzureichendem Waschen her, und die Bande bei 37.000 war die übliche verunreinigende Bande, die in allen Proben, einschließlich der Kontrollen, gefunden wurde.
Das Protein mit einem Molekulargewicht von 105.000, das aus Gesamtmembranen durch Affinitätschromatographie isoliert wurde, entsprach einem hochmolekulargewichtigen Protein, das in Außenmembranen beobachtet wird, die aus eisenverarmten B16B6 präpariert werden. Das Protein war in B16B6 und in Gruppe X eisenreguliert. Das 70 Kilodalton- (kDa-) Protein, das zusammen mit dem 105 kDa-Lactoferrinbindungsprotein gereinigt wurde, wanderte an der Position eines vorherrschenden Proteins, das in Außenmembranen aus eisenverarmten B16B6 gefunden wird. Das Protein war in B16B6 und in Gruppe X eisenreguliert. Dieses Protein unterschied sich von dem zuvor in B16B6 identifizierten Transferrinbindungsprotein, das eine unter Verwendung von biotinyliertem Transferrin isolierte untere Proteinbande war. Das Molekulargewicht des Transferrinbindungsproteins mit niedrigerem Molekulargewicht variierte zwischen unterschiedlichen Meningokokkenstämmen und war das einzige Protein, das die Bindungsaktivität nach SDS-PAGE und Elektroblotten beibehielt. Zusätzlich zum Bindungsprotein mit niedrigerem Molekulargewicht, das mit biotinyliertem Transferrin isoliert wurde, enthielten diese Proben ein hochmolekulargewichtiges Protein und biotinyliertes Transferrin (Bande bei 80 kDa), das während des Kochschritts freigesetzt wurde. Die Auftrennung des 70 kDa-Proteins und des Transferrinbindungsproteins mit niedrigerem Molekulargewicht im Stamm B16B6 wurde in einem 8%-10%igen Gradientengel optimiert, aber diese Proteine liefen auf Standard-10%-Acrylamid-SDS- PAGE-Gelen in einer Bande.

Beispiel 2: Reinigung der Rezeptoren für menschliches Transferrin und menschliches Lactoferrin und Einschluß in Vakzinzubereitungen

(a) Präparation eisenverarmter Gesamtmembranen

Aus frischen Kulturen auf Schokoladenplatten resuspendierte Meningokokkenzellen wurden zum Animpfen von vorgewärmter Gehirn-Herz- Infusionsbrühe, die 100 uM EDTA enthielt, auf eine Anfangs-A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,02 verwendet. Die erhaltene Kultur wurde bei 37ºC unter Schütteln 16 Stunden vor der Ernte durch Zentrifugation bei 9000 · g für 15 min inkubiert. Die Zellen wurden auf 0,2 g/ml in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, der 50 ug/ml Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden durch Durchleiten der Suspension durch eine French- Druckzelle bei 16000 Pfd./Inch² lysiert, und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 9000 · g für 15 min entfernt. Die rohen Gesamtmembranen wurden durch Zentrifugation bei 140000 · g für 1 Std. gesammelt und in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8 resuspendiert.

(b) Affinitätsisolation von Rezeptorproteinen

0,9 mg biotinyliertes menschliches Transferrin oder biotinyliertes menschliches Lactoferrin, die wie im Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden mit 72 mg Protein aus rohen Gesamtmembranen in 60 ml Puffer aus 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8 gemischt und 1 Std. bei 22ºC inkubiert. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 9000 · g zentrifugiert, um die Membranen zu sammeln, und das Sediment wurde in 60 ml des vorstehenden Puffers resuspendiert und 10 Minuten bei 22ºC inkubiert. EDTA wurde auf 10 mM zugegeben, und Sarkosyl wurde auf 0,75% zugegeben, und das Gemisch wurde weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann bei 9000 · g 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 5 ml Streptavidinagarose (1-2 mg Streptavidin pro ml Harz) gemischt und bei Raumtemperatur unter leichtem Mischen 1 Std. inkubiert. Das Harz wurde durch Zentrifugation bei 500 · g für 10 Minuten gesammelt und in 80 ml Puffer mit 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,75% Sarkosyl, pH 8 resuspendiert. Das Harz wurde wiederum durch Zentrifugation gesammelt und weitere zweimal im vorstehenden Puffer gewaschen. Nach dem endgültigen Waschen wurde das Harz in 20 ml des vorstehenden Puffers resuspendiert und in eine Chromatographiesäule von 1 cm Durchmesser gegossen. Das eingefüllte Harz wurde mit weiteren 10 ml 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl gewaschen, und die Rezeptorproteine wurden durch Anlegen eines 60 ml-Gradienten von 0 bis 3 M Guanidiniumhydrochlorid in 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,05% Sarkosyl eluiert. Die Fraktionen, die Rezeptorproteine enthielten, wurden vereinigt und gegen zwei Wechsel von 3 Litern 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 und einem Wechsel phosphatgepufferter Kochsalzlösung (50 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4) dialysiert und durch Ultrafiltration auf ein Endvolumen von 1 ml eingeengt.

(c) Herstellung der Vakzine

100 ug der gereinigten Rezeptorproteine in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurden auf 2,5 ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt, die 0,01% Thimerosal enthielt, durch Leiten durch ein 0,2 um-Filter sterilisiert und aseptisch in ein steriles Gefäß überführt. Eine sterile Zubereitung von 20 mg Aluminiumhydroxid in phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurde vor dem Gebrauch zu jedem Gefäß gegeben. Alternativ wurden für Tieruntersuchungen 50 ug Muramyl-Dipeptid in 50 ul normaler Kochsalzlösung zugegeben.

Beispiel 3: Erster Nachweis, daß der bakterielle Rezeptor für menschliches Transferrin von Neisseria meningitidis ein wirksames Vakzinantigen ist

Sechzehn weibliche Swiss-Webster-Mäuse mit einem Gewicht von etwa 20 Gramm und einem Alter von 6-7 Wochen, wurden zufallgemäß in vier Behandlungsgruppen aufgeteilt und den in der nachstehenden Tabelle 3 dargestellten Immunisierungsprotokollen unterworfen. 1 ml sterile Kochsalzlösung (150 mM NaCl), die die angegebenen Substanzen enthielt, wurde intraperitoneal an Tag 1, Tag 9, Tag 16 und Tag 26 injiziert. An Tag 30 wurden 1 · 10&sup7; Meningokokken, die aus einem Über-Nacht- Bewuchs auf Mueller-Hinton-Agarplatten mit 35 uM EDDA resuspendiert wurden, intraperitoneal in jede Maus injiziert. Nach zwanzig Minuten wurden 20 mg vollständig eisenbeladenes menschliches Transferrin in 1 ml steriler Kochsalzlösung intraperitoneal in die gleichen Mäuse injiziert, die zuvor den Anregungsbakterien ausgesetzt wurden. Die Mäuse wurden Ihr einen Zeitraum von insgesamt 72 Stunden beobachtet, und die Anzahl toter und überlebender Mäuse wurde aufgezeichnet. Tabelle 3
* MDP - 50 ug Muramyl-Dipeptid, Rezeptor - etwa 10 ug Transferrinrezeptor, isoliert aus dem Neisseria meningitidis-Stamm B16B6, wie im Beispiel 2 beschrieben, OM - 50 ug eisenverarmte Außenmembranen, isoliert aus Neisseria meningitidis durch selektive Detergensextraktion mit Sarkosyl.
* * Die Mäuse wurden mit 1 · 10&sup7; Zellen des Meningokokkenstamms B16B6, gezüchtet auf Mueller-Hinton-Agarplatten mit 35 uM EDDA, angeregt. Zwanzig Minuten nach der Injektion der Anregungsbakterien wurden 20 mg vollständig eisenbeladenes menschliches Transferrin intraperitoneal als Quelle für exogenes Eisen injiziert.
Andere Ausführungsformen der Erfindung werden dem Fachmann aus der Betrachtung der Beschreibung und der Ausführung der hier offenbarten Erfindung ersichtlich.

Claims

1. Transferrinrezeptor mit einem Molekulargewicht von etwa 94.000 bis etwa 106.000 Dalton.

2. Transferrinrezeptor nach Anspruch 1 in im wesentlichen reiner Form, wobei der Transferrinrezeptor ein Protein mit einem hohen Molekulargewicht von etwa 94.000 bis etwa 106.000 Dalton umfaßt und wobei das Molekulargewicht durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wird.

3. Transferrinrezeptor nach Anspruch 2, der ein Rezeptor eines bakteriellen Pathogens ist.

4. Transferrinrezeptor nach Anspruch 3, wobei das bakterielle Pathogen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Neissseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, Pasteurella haemolytica, Haemophilus somnus, Pasteurella multocida und Actinobacillus pleuropneumoniae.

5. Verfahren zum Isolieren und Reinigen eines Transferrinrezeptors mit einem Molekulargewicht von etwa 94.000 bis etwa 106.000 Dalton aus bakteriellen Pathogenen, die diesen Rezeptor enthalten, wobei das Verfahren das Isolieren einer Membranzubereitung aus einem die Transferrin-binden de Aktivität exprimierenden Bakterienstamm, das Binden eines biotinylierten Derivats von Transferrin an die Membranzubereitung und das Isolieren des Transferrinrezeptors mit einem Molekulargewicht von 94.000 bis 106.000 Dalton durch Affinitätschromatographie mit einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus immobilisiertem Streptavidin und immobilisiertem Avidin, umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Affinitätsverfahren eine Affinitätschromatographie ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei ein biotinyliertes Derivat des Transferrins an die Membran des bakteriellen Pathogens gebunden ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Immobilisierung durch Hindung des biotinylierten Transferrins durch Streptavidin-Agarose durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei die Solubilisierung unter Verwendung eines Detergens durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei der Bakterienstamm ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus den Stämmen Neisseria meningitidis " Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Branhamella catarrhalis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Haemophilus somnus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus suis, Haemophilus paragallinarum, Haemophilus gallinarum und Haemophilus avium.

11. Verwendung eines Transferrin-Rezeptorproteins zur Herstellung einer Vakzine.

12. Vakzine, umfassend eine Zubereitung mit einem Transferrin rezeptor.

13. Vakzine nach Anspruch 12, die eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen ermöglicht, wobei die Vakzine eine wirksame Menge eines Transferrin-Rezeptors aufweist, um eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen zu ermöglichen, umfassend

(a) ein Protein mit einem niedrigeren Molekulargewicht von etwa 58.000 bis etwa 98.000 Dalton; oder

(b) ein Protein mit einem höheren Molekulargewicht von etwa 94.000 bis etwa 106.000 Dalton; oder

(c) sowohl (a) als auch (b);

wobei das Molekulargewicht durch Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wird, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür.

14. Vakzine, die eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen ermöglicht, wobei die Vakzine eine wirksame Menge eines Transferrin-Rezeptors nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist, um eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen zu ermöglichen, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür.

15. Vakzine nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der Transferrinrezeptor hergestellt wird aus wenigstens einem Stamm, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Stämmen Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica, Branhamella catarrhalis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Haemophilus somnus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus suis, Haemophilus paragallinarum, Haemophilus gallinarum und Haemophilus avium.

16. Vakzine, die gegen ein bakterielles Pathogen eine schützende Immunität ermöglicht, wobei die Vakzine eine wirksame Menge eines Lactoferrinrezeptors und eines Transferrinrezeptors aufweist, um eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen zu ermöglichen, wobei der Transferrinrezeptor umfaßt:

(c) sowohl (a) als auch (b);

17. Vakzine, die eine schützende Immunität gegen ein bakterielle Pathogen ermöglicht, wobei die Vakzine eine wirksame Menge eines Lactoferrinrezeptors, eines Transferrinrezeptors nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür aufweist, um eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen zu ermöglichen.

18. Vakzine, umfassend eine Zubereitung mit einem Lactoferrinrezeptor.

19. Vakzine, umfassend eine Zubereitung mit einem Lactoferrinrezeptor und eine Zubereitung mit einem Transferrinrezeptor.

20. Vakzine nach einem der Ansprüche 16, 17 und 19, wobei der Lactoferrinrezeptor in im wesentlichen reiner Form vorliegt und ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 105.000 umfaßt, wobei das Molekulargewicht durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt wird.

21. Vakzine nach einem der Ansprüche 16, 17, 19 und 20, wobei der Laktoferrinrezeptor ein Rezeptor eines bakteriellen Pathogens ist und das bakterielle Pathogen ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria lactamica und Branhamella catarrhalis.

22. Verwendung eines Lactoferrin-Rezeptorproteins zur Herstellung eine Vakzine.

23. Vakzine nach Anspruch 18, die eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen ermöglicht, wobei die Vakzine eine wirksame Menge eines Lactoferrinrezeptors aufweist, umfassend ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 105.000, wobei das Molekulargewicht durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylgelelektrophorese bestimmt wird, um eine schützende Immunität gegen ein bakterielles Pathogen zu ermöglichen, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür.

24. Vakzine nach einem der Ansprüche 12 bis 21 und 23, weiterhin umfassend Natriumchlorid, Natriumphosphat, Puffer und Thimersol.

25. Vakzine nach einem der Ansprüche 12 bis 21 und 23, weiterhin umfassend ein Adjuvans.

26. Vakzine nach Anspruch 25, wobei das Adjuvans Aluminiumhydroxid ist.

27. Vakzine nach Anspruch 18 oder 23, wobei der Lactoferrinrezeptor hergestellt wird aus wenigstens einem Stamm, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Neisseria meningitidis-, Neisseria gonorrhoeae-, Neisseria lactamica-, und Branhamella catarrhalis-Stämmen.