KR100242179B1 - 디스크 드라이브 데이타경로 보전 제어구조 - Google Patents

디스크 드라이브 데이타경로 보전 제어구조 Download PDF

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스탠톤 엠. 킬러
도날드 더블류. 클레이
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토마스 에프.멀베니
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Abstract

본 발명은 트란스페린 및 락토페린 수용체 단백질을 세균성 병원체로부터 친화성 크로마토그라피에 의하여 분리 및 정제하는 방법을 제공하고 정제된 트란스페린 및 락토페린 수용체 단백질을 함유하는 백신 항원의 제법을 제공한다.

Description

[발명의 명칭]
트란스페린 수용체 단백질을 함유하는 백신{A- vaccine containing transferrin recceptor protein}
[기술분야]
본 발명은 트란스페린 및 락토페린 수용체 단백질을 세균성 병원체로부터 분리 및 정제하는 방법 및 정제된 트란스페린 및/또는 락토페린 수용체 단백질 및/또는 이들의 유도체를 함유하는 백신에 관한 것이다.
[배경기술]
유효한 백신이 존재하지 않거나 불충분한 인체 및 동물체에서 질병을 유발시키는 많은 중요한 세균성 병원체가 존재한다. 많은 이들 병원체는 자연 감염을 유발시키는 능력과 관련하여 비교적 숙주에 특이적이다. 나이세리아메닝지티디스(Neisseria meningitidis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza)및 나이세리아 고노헤아(Neisseria gonorhoeae)균과 같은 세균은 수막염, 이염, 후두개염, 임질 및 요도염과 같은 만성 및 급성 인체 질병의 중요한 원인으로 계속 존재하고 있다. 마찬가지로 파스퇴렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica), 헤모필러스 솜누스(Haemophilus somnus) 및 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida)균은 가축에서 폐렴성 파스퇴렐라 감염증 및 감염성 혈전 색전성 뇌수막염의 중요한 유발성 박테리아이다. 돼지에서는 액티노바실러스 (헤모필러스) 플루로뉴모니아(Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae)균이 감염성 폐렴의 중요한 유발 박테리아이다. 가금류에서는 조류 헤모필러스, 특히 헤모필러스 파라갈리나륨(Haemophilus paragallinarum)균이 감염성 비염의 원인이 된다.
헤모필러스 인플루엔자 및 나이세리아 메닝지티디스균은 어린아이에 있어서 가장 일반적인 세균성 수막염의 발병 원인이다. 유효한 항생제 치료에도 불구하고 메닝고코코스균의 감염으로 인하여 현저한 사망률 및 질병율이 발생한다. 2세 이하의 어린이에 있어서, 특징적인 임상 징후의 결여와 동반하여 감염이 돌발적이기 때문에 계속적인 사망률 및 발병율에 기여하는 중요한 요인이 될 수 있다.
안티캡슐 항체의 존재와 메닝고코코스균 감염 체계에 대한 내성간의 연관성이 밝혀진 후, 나이세리아 메닝지티디스균의 캡슐성 다당류에 기초한 백신이 개발되었다. 이 캡슐성 다당류 백신은 메닝고코코스균의 A, C, Y 및 W-135 캡슐성 혈청 그룹에 속하는 균에 의하여 유발된 감염에 대하여 유효하다. 그러나 가장 일반적인 혈청 그룹인 B 메닝고코코스균에 대하여 유효한 백신을 이용할 수 없다. 만성적 질병으로부터 감염 위험이 가장 높은 2세 미만의 어린이에 있어서, 캡슐성 다당류 백신에 대한 체액성 반응이 매우 빈약하다. 추가적으로 캡슐성 백신은 면역 기억을 제공하지 않으며, 면역 지속 시간도 상대적으로 짧다. 화학적인 변경 및 파상풍 독소에 대한 결합등을 통하여 빈약한 면역성을 극복하려는 시도가 약간의 가능성을 보이지만, 결과는 인체 태아 및 유아 신경조직과 혈청 그룹 B 캡슐의 입증된 혈청학적 교차 반응성의 견지에서 고려되어져야 한다. 이와 같은 고찰의 견지에서, 만성적 메닝고코코스균 질병을 충분히 넓은 범위로 예방할 수 있는 폴리다당류 백신의 개발이 어려울 것 같다.
나이세리아 고노헤아균은 전세계에 급속도로 만연되고 있는 임질을 유발시키는 병원체이다. 그러므로, 임질 구균에 대한 백신 개발이 매우 중요하다.
축산업에서 경제적 손실의 주요 원인인 소의 결핵성 파스퇴렐라균 감염증은 주로 파스퇴렐라 헤몰리티카균에 의하여 발병된다. 파스퇴렐라 헤몰리티카균을 함유하고 있는 백신을 사용한 실험 연구 및 현장 시험 결과 질병의 발병 및 약화를 감소시키지 않았다. 사육장 가축에서 중요한 사망 원인인 감염성 혈전색전성 뇌수 막염은 헤모필루스 솜누스에 의하여 발병된다. 현재 이 질병을 예방할 수 있는 효율적인 백신이 존재하지 않는다. 액티노바실러스 (헤모필러스) 플루로뉴모니아균은 전세계적으로 돼지에게 발병하는 접촉성 폐렴을 유발시킨다. 조백신제제를 사용한 예방접종은 이질성 혈청형의 제한적인 방어기작에 기인하여 성공적이지 못하였다. 주로 헤모필러스 파라갈리나륨균에 의하여 발병되는 가금류의 감염성 비염은 가금 산업의 현저한 생산성 감소를 유발시킨다.
숙주에서 병원성 세균의 증식, 생존 및 감염을 유발시키기 위하여 철 성분의 섭취가 필수적이다. 병원성 세균은 포유동물 숙주에서 철 함량이 매우 낮은 환경에 놓인다. 세포외 구획에서 철은 각각 혈청 및 점액 분비를 관장하는 단백질 트란스페린 및 락토페린에 의하여 격리된다. 철에 대하여 락토레린 및 트란스페린이 경쟁하는 능력은 많은 세균성 감염론에 필수적인 것으로 사료된다. 많은 세균은 그들이 처한 환경에서 보다 손쉽게 철을 흡수하기 위하여 사이드로포어(siderophore)로 알려진 철-킬레이팅 화합물을 생성한다. 그러나 나이세리아 메닝지티디스, 나이세리아 고로헤아 및 헤로필러스 인플루엔자균과 같은 여러 병원균 세균은 사이드로포어를 생성하지 않고, 오히려 증식을 위해 시험관내에서 직접 팔토페린 철 및 트란스페린 철을 흡수한다.
B.E. 홀바인(Holbein), I.W. 드보에(Devoe), F.P. 스팔링(Sparling) 및 공동 연구자들은 이들 박테리아가 트란스페린 또는 락토페린 단백질 존재하에서 증식할 수 있으며, 증식을 위한 유일한 철 공급원인 이들 단백질로부터 철을 사용할 수 있다는 것을 입증하였다. 추가로 투석막을 사용한 세포로부터의 단백질 분리는 트란스페린 또는 락토페린 철의 사용을 배제시킨다는 것을 입증하였으며, 이는 락토페린 또는 트란스페린으로부터 철을 제거시키는 용해성 인자가 포함되지 않으며, 결국 세포 접촉이 필수적임을 의미한다. F.P. 스팔링 및 D.W. 다이어(Dyer)에 의하여 트란스페린으로부터 철을 습득하지 못하는 돌연변이체가 철과의 결합력이 결핍되었다는 것을 입증하였다.
트란스페린 및 락토페린으로부터 철을 습득하는 메카니즘은 파스퇴렐라 헤몰리티가, 헤모필러스 솜누스, 파스퇴렐라 물토시다, 액티노바실러스 (헤모필러스) 플루로뉴모니아, 헤모필러스 수이스, 헤모필러스 파라갈리나룸 또는 헤모필러스 아비움균 등에서는 아직 연구되고 있지 않다.
이 기능들 때문에, 트란스페린 및 락토페린 수용체 단백질은 숙주내에서 및 거대 단백질과 가까운 경우 박테리아의 표면에 존재한다. 그러므로, 수용체는 항체가 관여하는 숙주의 방어기작에 쉽게 침투할 수 있다. 트란스페린 및 락토페린 단백질 수용체는 증식 및 생존을 위하여 철을 습득하는데 필수적이다. 따라서 병원체는 이들 수용체 단백질을 포함한 백신 항원에 의하여 제공되는 면역성을 피하기 위하여 이의 트란스페린 및/또는 락토페린 수용체를 상실할 수 없다. 이러한 회피 기술로 인하여 숙주내에서 더 이상 생존할 수 없는 결과를 가져올 수도 있다.
철 흡수과정의 본질이 이전에는 알려지지 않았으며, 락토페린 및 트란스페린 수용체 단백질의 동정 및 형질화 또한 과거에는 가능하지 않았다. 또한, 이전에는 락토페린 및 트란스페린 수용체 단백질이 분리 정제되지 않았다. 추가로, 이들 수용체 단백질을 함유한 백신도 이전에는 개발되지 않았었다.
[발명의 요약]
본 발명은 락토페린 및 트란스페린 수용체 단백질을 분리 및 정제하는 방법을 제공하고, 락토페린 및/또는 트란스페린 수용체 단백질의 생성을 용이하게 함으로써 선행기술의 문제점 및 단점을 극복하고자 한다.
본 발명의 목적은 병원성 세균중에서 락토페린 및 트란스페린 수용체 단백질을 동정하고, 이를 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 락토페린 및 트란스페린 수용체 단백질을 함유하는 병원성 세균에 의하여 유발된 질병 예방에 유효한 단일 성분 백신 항원을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 어린아이에 있어서 병원성 세균의 질병을 예방하는데 유효한 백신 항원을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 현재의 다당류 캡슐성 백신에 대하여 우수한 면역 기억을 보이는 백신 항원을 제공하는 것이다.
추가적인 본 발명의 목적 및 장점은 하기 명세서에 부분적으로 제시되어 있으며, 부분적으로 기재사항으로부터 명백하게 알 수 있거나 또는 본 발명의 실시에 의하여 알 수 있다. 특히, 본 발명의 목적 및 장점은 첨부된 청구범위에 나타난 수단 및 조합들에 의하여 실현되고 달성할 수 있다.
본 명세서에서 구체화되고 광범위하게 기재된 바와 같이 본 발명의 목적을 달성하고 본 발명의 의도와 일치하기 위하여, 본 발명은 본 명세서에 기재된 친화성 크로마토그래프 방법에 의하여 락토페린 및/또는 트란스페린 결합 활성을 발현하는 균주로부터 막 제제내의 락토페린 및 트란스페린 결합 단백질을 분리 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 정제된 락토페린 및/또는 트란스페린 수용체 단백질 제제를 포함하는 백신 항원을 제공한다.
락토페린 수용체 백신 항원은 (1) 클론된 락토페린 수용체 유전자를 발현시키는 박테리아 또는 미생물로부터 분리 정제된 락토페린 수용체 단백질, (2) 정제된 락토페린 수용체 단백질의 유도체, (3) 락토페린 수용체 유전자의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 함유한 융합 단백질, 및 (4) 아미노산 서열이 정제된 락토페린 수용체의 아미노산 서열 또는 클론된 수용체 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 기초로한 합성 펩티드들로 이루어진 그룹중에서 선택된 제제를 특징으로 한다. 제제는 일반적으로 0.15M 염화나트륨, 0.05M 인산나트륨, pH가 약 7.4인 완충제, 타이메로 살 및 임의의 보조제가 혼합된 용액에 현탁시킨다.
본 발명은 또한 (1) 하나 이상의 클론된 트란스페린 수용체 유전자를 발현시키는 세균 또는 미생물로부터 분리된 하나 이상의 정제된 트란스페린 수용체 단백질, (2) 정제된 트란스페린 수용체 단백질의 유도체, (3) 하나 이상의 트란스페린 수용체 유전자의 코딩서열의 전부 또는 일부를 함유한 융합 단백질 및 (4) 정제된 트란스페린 수용체 단백질의 아미노산 서열 또는 클론된 수용체 유전자의 뉴클레오 타이드 서열을 기초로한 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드로 이루어진 그룹중에서 선택된 제제를 특징으로하는 트란스페린 수용체 백신 항원을 제공한다. 제제는 0.15M 염화나트륨, 0.05M 인산나트륨, pH가 약 7.4인 완충제, 타이메로살 및 임의의 보조제가 혼합된 용액에 현탁시킨다.
본 발명의 단일 성분 백신 항원은 트란스페린 및/또는 락토페린 수용체를 통하여 직접 철 성분을 습득하는 병원성 세균에 대하여 유효하다. 백신 항원은 또한 어린아이에게 면역성을 제공하는데 적합하다.
본 명세서에 첨부된 도면은 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명의 실시양태를 예시하고, 본 발명의 원리를 설명한다.
[도면의 간단한 설명]
도면은 본 발명의 친화성 크로마토그래프 방법에 대한 공정흐름도이다.
[바람직한 구현예의 설명]
참고로 본 발명의 바람직한 구현예를 상세하게 기재하고 있다.
락토페린 수용체는 표면 근접성 외막 단백질이다. 이 수용체는 나이세리아 고노헤아 및 나이세리아 메닝지티디스균에서 분자량이 약 106,000인 것으로 밝혀졌다. 수용체는 특이적으로 락토페린과 결합한다. 반면, 트란스페린 또는 기타 철 3결합 단백질과는 결합하지 않는다. 추가로, 나이세리아 및 브란하멜라 종의 수용체는 인체 락토페린과 높은 친화력을 갖고 결합하지만, 기타 종의 락토페린과는 특이적으로 결합하지 않는다. 수용체의 발현은 수용체를 보유한 세균에게 유용한 수준의 철 함량에 의하여 조절된다. 철이 충분히 존재할 경우, 단백질은 거의 생성되지 않는다. 철이 제한된 양으로 존재할 경우, 수용체 단백질의 생성양이 크게 증가한다. 수용체는 기타 종에서 습득된 락토페린에서의 철 습득 또는 철에 의존한 증식에 관여하지 않는다. 이 수용체는 철이 포화된 인체 락토페린 및 인체 아포락토페린과 동일한 친화력으로 결합한다. 나이세리아 메닝지티디스균에 있어서 락토페린 수용체는 하기의 락토페린 수용체에 특이적인 모노클로날 항체 33-15-4, 33-188-2, 33-75-6, 33-36-16 및 33-19-3과 결합하는 것이 밝혀졌다.
트란스페린 수용체는 단백질 발현이 수용체를 보유한 세균에게 유용한 수준의 철 함량에 의하여 조절되는 단백질로 구성되어 있다. 철이 충분히 존재하는 경우, 단백질은 거의 생성되지 않는다. 철이 제한된 양으로 존재하는 경우, 수용체 단백질의 생성양이 급격하게 증가한다. 인체 병원체 나이세리아 메닝지티디스, 나이세리아, 고노헤아, 헤로필러스 인플루엔자 및 부란하멜라 카타르할리스(catarrhalis)균에 있어서 트란스페린 수용체는 철 습득 및 인체 트란스페린의 철에 의존한 증식등에는 관여하지만, 기타 종으로부터 얻어진 트란스페린 철에 의존한 증식에는 관여하지 않는다. 소의 병원체 파스퇴렐라 헤몰리티카, 헤모필러스 솜누스 및 파스퇴렐라 물토시다균에 있어서, 트란스페린 수용체는 소의 트란스페린 철에 의존한 증식에는 관여하지만 기타 종으로부터 얻어진 트란스페린의 철에 의존한 증식에는 관여하지 않는다. 돼지 병원체 악티노바실러스 플루로뉴모니아, 액티노바실러스 수이스 및 헤모필러스 수이스에 있어서, 트란스페린 수용체는 돼지 트란스페린의 철에 의존한 증식에는 관여하지만, 기타 종으로부터 얻어진 트란스페린의 철에 의존한 증식에는 관여하지 않는다. 가금류 병원체인 헤모필러스 파라갈리나(헤모필러스 갈리나룸) 및 헤모필러스 아비움균은 조류(닭 또는 칠면조)의 트란스페린을 이용한 철-의존 증식은 관여하지만 포유동물종(예를들면, 인간,돼지 또는 소)의 트란스페린을 이용한 철-의존 증식은 관여하지 않는 트란스페린 수용체를 보유한다.
트란스페린 수용체는 두 개의 외막 단백질 : (1) 나이세리아 메닝지티디스균, 나이세리아 고노헤아균 및 헤모필러스 인플루엔자균에서 분자량애 약 100,000인 고분자량 단백질 및; (2) 여러 균주 및 종에 있어서 분자량이 약 65,000 내지 약 90.000인 저분자량 단백질로 구성되어 있다. 나이세리아 메닝지티디스균과 같은 몇몇 종에서, 나트륨도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 전기영동 및 일렉트로 블로팅을 실시한 후, 저분자량 단백질이 부분적으로 트란스페린 결합 활성을 재구성할 수 있다. 나이세리아 메닝지티디스균의 두 개의 정제된 수용체 단백질은 친화성 컬럼으로부터의 구아니딘 하이드로클로라이드의 용출 및 구아니딘 하이드로클로라이드의 제거 후, 부분적으로 트란스페린 결합 활성을 재구성한다.
트란스페린 수용체는 트란스페린과 결합하지만 기타 철결합 단백질과는 결합하지 않는다. 인체 병원체인 나이세리아 메닝지티디스균, 나이세리아 고노헤아균, 브란하멜라 카타르할리스 및 헤모필러스 인플루엔자균에 있어서, 수용체는 인체 트란스페린과 높은 친화력으로 결합하지만, 기타 종의 트란스페린과는 특이적으로 결합하지 않는다. 소의 병원체 파스퇴렐라 헤몰리티카, 헤모필루스 솜누스 및 파스퇴렐라 물토시다균에 있어서, 수용체는 소의 트란스페린과 결합하지만, 다른 종의 트란스페린과는 결합하지 않는다. 돼지 병원체 악티노바실러스 플루로우뉴모니어, 악티노바실러스 수이스 및 헤모필러스 수이스균에 있어서, 수용체는 돼지 트란스페린과 결합하지만, 기타종의 트란스페린과는 결합하지 않는다. 가금류 병원체 헤모필러스 파라갈리나륨(헤모필러스 갈리나륨) 및 헤모필러스 아비움균에 있어서, 수용체는 조류의(닭 또는 칠면조) 트란스페린과 결합하지만, 포유동물 종의 트란스페린과는 결합하지 않는다. 인체 병원체에서의 트란스페린 수용체는 철이 포화된 인체 트란스페린과의 결합이 인체 아포트란스페린과 결합하는 것보다 약 10배 이상의 높은 친화력을 보이며, 부분적으로 충분하게 탈당화된 인체 트란스페린과는 동일한 친화력으로 결합하지만, 순한 과요오드산염으로 산화된 인체 트란스페린과는 결합하지 않는다. 트란스페린 수용체는 하기의 모노클로날 항체 36-4, 36-5, 36-104 및 32-58-5와 결합한다.
여러 나이세리아 메닝지티디스균, 나이세리아 고노헤아균, 나이세리아 락타미카(N. lactamica) 및 프란하멜라 카타르할리스(P. catarrhalis)균에 있어서 락토페린-결합활성은 호스레디쉬(horseradish) 퍼옥시다아제(peroxidase)-접합된 인체락토페린을 사용한 고체상 결합검정을 이용하거나 바이오티닐화된 인체 락토레린을 사용한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-접합된 스트렙타비딘(streptavidin)을 사용하여 측정한다. 락토페린-결합 활성은 시험된 모든 메닝고코코스균 군주에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 락토페린-결합 활성의 발현은 트란스페린-결합 활성의 발현과 매우 유사하다. 결합은 인체 락토페린에 특이적이다. 소의 락토페린, 인체 트란스페린, 또는 인체 헤모글로빈 모두 호스래디쉬 퍼옥시다아제-접합된 인체 락토페린의 결합을 억제시키지 않는다. 경쟁적 결합검정에서 철이 포화된 락토페린 및 아포락토페린이 HRP-락토페린의 결합을 억제시키데 동일하게 유효하므로 락토페린 결합은 철이 포화된 수준에 의존적이지 않다.
락토페린-결합 단백질은 바이오티닐화된 인체 락토페린 및 여러 가지 세균성 균주에 있는 스트렙타비딘-아가로즈를 사용한 배치(batch) 친화성 크로마토그래프에 의하여 동정된다. 바이오티닐화된 락토페린을 순수한 전체 막에 결합시킨 후, 원심분리를 통하여 유리 락토페린으로부터 분리한다. 락토페린 수용체 복합체를 막으로부터 용해시키고, 비용해된 물질로부터 분리한 후, 락토페린에 부착된 비오틴 잔기를 이용하여 스트렙타비딘-아가로스 레진(resin)과 결합시킨다. 레진을 세척한 후, 결합 단백질을 샘플 완충액에서 가열하여 용출시키고 SDS-PAGE로 분석한다. 또한 락토페린 수용체 단백질은 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도를 증가시킴으로써 용출시킬 수 있다.
철이 결핍된 나이세리아 메닝지티디스균 B16B6, 그룹 X 및 그룹 W 135의 막을 사용할 경우, 분자량이 약 105,000인 단백질을 락토페린 친화성 레진과 결합시켰다.
메닝고코코스균에 있어서, 트란스페린에서의 철 습득 메카니즘은 세균 표면의 수용체에 의한 결합을 포함하며,125I로 표지된 트란스페린이 축적되지 않는다는 것을 철 흡수가 트란스페린-수용체 복합체의 내부이행 때문이 아니라는 것을 의미한다. 트란스페린에서의 철 제거 및 아포트란스페린의 방출이 흡수 메카니즘에서 후속단계라고 사료된다. 아포트란스페린보다 철이 포화된 트란스페린에 대한 트란스페린 수용체의 친화력이 훨씬 높다. 또한, 락토페린에서의 철 습득이 표면 수용체를 포함하므로 유사한 흡수 메카니즘이 락토페린 수용체에 존재한다고 사료된다.
트란스페린-결합활성은 조사된 나이세리아 메닝지티디스균, 헤모필루스 인플루엔자균, 나이세리아 고노헤아균, 나이세리아 락타미카균 및 브란하멜라 카타르할리스균의 모든 균주에서 발견된다. 조사된 모든 분리균에서의 트란스페린 결합활성은 인체 트란스페린만이 유일하게 호스라디쉬 퍼옥시다아제-접합된 인체 트란스페린의 결합을 차단시킬 수 있는 인체 트란스페린에 대하여 특이적이다.
트란스페린 수용체는 이전에 SDS-PAGE 및 웨스턴 블록(Western blot) 분석에 의하여 분자량이 약 75,000 내지 약 88,000인 단백질로 동정되었다. 그러나 순수한 트란스페린 수용체는 이 방법에 의하여 분리되지 않는다. 또한 고분자량의 트란스페린 결합 단백질도 이 방법에 의하여 동정되지 않는다. 본 발명가는 바이오티닐화된 트란스페린 및 순수한 트란스페린 수용체의 분리과정에서 발생되는 스트랩타비딘-아가로즈를 사용한 친화성 분리 방법을 개발하였다. 상기 균주중에서 분자량이 약 58,000 내지 약 98,000 범위의 저 분자량을 갖는 트란스페린-결합 단백질 및 분자량이 약 94,000 내지 약 106,000인 고분자량 단백질을 분리하였다. 나이세리아류에서 바이오티닐화된 트란스페린을 사용한 친화성 분리는 시험된 모든 종에서 모든 나이세리아 분리균에서 분자량이 약 98kd이고 브란하멜라 카타르할리스에서 분자량이 약 105 kd인 고분자량 단백질인 최소한 2개의 단백질을 생성시켰다.
본 발명가는 인체 트란스페린 수용체가 시험된 모든 헤모필러스 인플루엔자에 존재하지만, 기타 헤모필러스 종, 파스퇴렐라 또는 액티노바실러스 속에서의 대표 분리균에서는 발견할 수 없다는 것을 밝히고 있다. 기타 헤모필러스종 및 액티노바실러스 및 파스퇴렐라에서 인체 트란스페린 수용체의 부재는 이들 세균이 인체에서 침입성 질병을 거의 야기시키지 않는다는 이유에 관한 것일 수 있다. 유사하게, 본 발명가는 소의 트란스페린 수용체를 시험된 A1형 파스퇴렐라 헤모리티카 및 헤모리티카 솜누스균의 모든 분리균중에서 및 파스퇴렐라 물토시다의 특정 분리균에서 발견했다. 또한 본 발명가는 돼지의 트란스페린 결합을 시험된 모든 액티노바실러스 플루로뉴모니아의 분리균중에서 발견했다. 따라서 수용체의 존재는 유기체를 수용하는 균주중에서 질병을 야기시키는 이들 유기체의 능력과 상호 일치한다.
본 발명의 백신 항원은 질병을 야기시키는 세균성 병원체중에서 분리된 락토페린 및/또는 트란스페린 수용체 단백질로부터 제조할 수 있다. 만일 제제가 충분한 면역성이 없는 것으로 밝혀진 경우, 수산화알루미늄과 같은 적합한 보조제를 백신 제제내에 포함시킬 수 있다.
락토페린 및/또는 트란스페린 수용체 단백질 분리균주는 본 발명의 백신 항원내에 약제학적으로 유효한 양을 함유하여 충분한 면역성을 달성할 수 있다.
본 발명의 백신 항원은 예를 들면, 피하 또는 근육내로 기술분야에서 통상적인 기술자에 의하여 잘 알려진 유효한 정기 투여에 의하여 투여할 수 있다.
본 발명은 단순한 본 발명의 실시예로 하고자 하는 하기 실시예에 의하여 더욱 분명해진다.
[실시예]
[실시예 1]
나이세리아 메닝지티디스균으로부터의 인체-락토페린 결합 단백질의 동정 및 특성화
[세균성 균주 및 증식 조건]
표준 혈청형 균주인 메닝지티디스균(N. meningitidis) B16B6은 C. 프레쉬(Frasch)로부터 수득하였다. X 그룹 및 W135 그룹의 메닝고코코스균 균주는 풋힐 병원(Foothills Hospital, 캘거기 알버타 소재)으로부터 수득하였다. 메닝고코코스균은 CVA 강화로 보충된 초코렛 한천 평판(GIBCO Lab., Grand Island, N.Y.) 상에서 5% CO2가 포함된 대기중에서 증식한다. 일반적으로, 초코렛 평판에서 새로이 증식한 세포를 초기 흡광도가 0.04일 때 액체 뮬러-힌톤(Muller-Hinton) 육즙(MHB) 배지에 접종한 후, 16시간 동안 배양하여 회수한다. 일반적으로, 철이 결핍된 MHB는 35μm EDDA(에틸렌디아민 디-오르쏘-하이드록실 페닐아세트산)을 포함한다. 발현 시험을 위하여 사용된 육즙 및 배양조건은 표 1에 나타나 있다.
[화학약품]
호스래디쉬 퍼옥시다아제가 접합된 인체 락토페린은 잭슨 면역연구실(Jackson Immunoresearch Laboratories, Avondale, Pa)로부터 수득하였다. 소의 락토페린은 어큐리트 케미칼(Accurate Chemicals, 뉴욕 Westbury 소재)로부터 수득하였다. 인체 락토페린(L-8010), 인체 트란스페린(T2252) 및 인체 헤모글로빈(h7379)은 시그마 케미칼(Sigma Chemical Co., 미국 St. Louis 소재)로부터 수득하였다. 바이오티닐 -ε- 아미노카프로익산 N- 하이드록시숙신이미드 에스테르 (Biotin-X-NHS)는 칼바이오캠(Calbiochem, 캘리포니아 산디에고 소재)에서 수득하였다. 스트렙타비딘-아가로즈는 베테스다연구소(Bethesda Research Lab., Bethesda, Md.)로부터 수득하였다. 아크릴아미드 겔 용출 컬럼은 벡만기기(Beckman Instruments, 캘리포니아 Fullerton 소재)로부터 수득하였다.
[철-결합 단백질의 제법)
인체 트란스페린 및 락토페린의 철 포화 및 아포단백질의 제법은 Mazurier 및 Spik에 의하여 사용된 완충용액으로 제조된 아포락토페린의 추가적인 제법(Biochem. Biophys. Acta. 629: 399-408)을 제외하고, 이미 기재된 방법(A. B. Schryvers and L. Morris, Molecular Microbiology, 2: 281-288)에 의하여 달성되었다. 단백질 제제는 아미콘 센트리플로 막 원추(Amicon Co., Danvers, MA)를 사용한 한외여과로 농축하고, 0.2μm 막을 통하여 멸균 여과하였다. 제제의 철포화도는 465nm에서 흡광도를 측정함으로써 체크하였다.
[락토페린의 바이오티닐화]
철이 포화된 인체 락토페린 제제는 겔여과 및 한회여과의 순환에 의하여 50mM 트리하이드로클로라이드(pH 7.5)를 사용하여 평형시킨 후, 1mg/ml에 희석시킨다. 16㎕ 디메틸포름아마이드에 용해된 250㎕의 비오틴-X-NHS를 각각 1ml 단백질 용액에 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 2시간 동안 서서히 교반시키면서 배양한다. 100㎕의 10mg/ml 글리신을 각각 1ml 용액에 첨가하여 반응을 중지시키고, 추가로 혼합물을 교반시키면서 4℃에서 2시간 동안 배양시킨다. 시료를 50mM 트리하이드로클로라이드, pH 8.0, 100mM NaCl용액 순으로 3회 변화시키고, 50mM의 트리하이드로클로라이드, pH 7.5 순으로 1회 변화시켜 투석하고, 아미콘 센트리플로 막 콘을 사용한 한외 여과로 농축시켜 4℃에서 저장한다.
[막의 제법]
세포를 회수하고 50mM 트리클로라이드, pH 7.5의 완충용액에서 세척하여, 0.2g/ml 세포 농도가 되도록 50㎕/ml 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 함유하는 완충용액중에 재현탁시킨다. 세포를 16,000 1b/in2압력에서 프렌치 압력셀을 2회 통과시켜 용해시킨 후, 세포 파편을 8,000×g에서 15분 동안 원심분리하여 제거한다. 조(crude) 전체막을 140,000×g에서 1시간 동안 원심분리하여 수집하고 상기 완충용액에 현탁시킨다. 외막을 사코실(Sarkosyl) NL97으로 선택적 세정제 추출하여 조 전체막으로부터 제조한다. 전체 막을 5mg/ml 단백질에 희석시키고, 사코실을 0.5%에 첨가한다. 혼합물을 얼음상에서 30분 동안 배양시키고, 외막을 180,000×g에서 10분 동안 원심분리하여 모은다. 펠레트를 완충용액에 재분산시키고, 상기와 같이 재추출하여 최종적으로 세척된 펠레트를 완충용액내에 단독으로 재분산시켰다.
[결합 단백질의 배치 친화성 분리]
20㎕의 바이오티닐화된 인체 락토페린 또는 트란스페린을 0.75mg의 전체 막 단백질로 1ml의 50mM 트리하이드로클로라이드, 100mM의 NaCl, pH 8.0의 완충용액에 혼합하고, 37℃에서 60분 동안 서서히 교반하면서 배양하였다. 막을 에펜도르프 원심분리기에서 16,000×g로 10분동안 원심분리에 의하며 펠리트화하고, 1ml의 완충용액내에서 재분산시켰다. EDTA를 10mM에 가하고 사코실을 0.75%에 가한 후, 여기에 스트렙타비딘-아가로즈(Bethesda Research Lab. Bethesda, Md)의 1/2희석액 100㎕를 가하였다. 22℃에서 60분 동안 배양한 후 혼합물을 750×g에서 3분간 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 친화성 레진 펠리트를 상이한 조성을 갖는 완충용액을 펠리트에 첨가한 3개의 상이한 세척법중의 하나를 사용하며, 22℃에서 10분간 배양하여 혼합물을 상기와 같이 원심분리시키고 상등액을 제거하였다. 세척 단계의 횟수 및 상이한 세척법에 대한 완충제 조성물은 하기와 같다.
세척법1 : 50mM 트리하이드로클로라이드, 100mM NaCl, 10mM EDTA를 포함하는 pH 8.0의 완충액 및 0.5%의 사코실로 3회 세척한 후, EDTA 또는 세정제가 없는 완충제로 다시 2회 세척한다.
세척법2 : 50mM 트리하이드로클로라이드, 1M NaCl, EDTA를 포함하는 pH 8.0의 완충액 및 0.5%의 사코실로 3회 세척한 후, EDTA 또는 세정제가 없는 상기 완충제로 1회 세척하고, 50mM 트리하이드로클로라이드, 100mM NaCl, pH 8.0의 완충액으로 최종 세척한다.
세척법3 : 50mM 트리하이드로클로라이드, 1M NaCl, 25mM 구아니딘 하이드로클로라이드, 10mM EDTA를 포함하는 pH 8.0의 완충액 및 0.5%의 사코실로 3회 세척한 후, EDTA 또는 세정제가 없는 완충제로 1회 세척하고, 50mM 트리하이드로클로라이드, 10mM NaCl, pH 8.0의 완충액으로 최종 세척한다. 최종적으로 세척한 후, 감소된 시약없이 200㎕의 시료 완충제(0.2M 트리하이드로클로라이드, pH 6.81, 2% 나트륨도 데실황산염, 30% 글리세롤, 0.1% 브로모페놀블루)에 펠렛을 현탁시키고, 100℃에서 1분 동안 가열하여 결합 단백질을 용출시켰다. 끓인 후, 시료를 얼음위에서 1분 동안 급냉시키고, 750×g에서 3분간 원심분리하였다. 상등액을 새시험관에 즉시 옮기고 베 타메르캅토에탄올을 1.4M 최종농도에 가한다. 이 시료의 50㎕를 10% SDS-PAGE 겔에 적용시켜 램리(Laemmli) 방법(Nature 227: 680-685, 1970)에 따라 전기영동을 수행하였다. SDS-PAGE 겔을 하기의 최소변형을 이용한 오클리(Oakley)등의 방법(Anal. Biochem. 105: 361-363, 1980)에 의하여 은염색시켰다. 젤을 먼저 25%의 이소프로판, 7%의 아세트산 용액으로 하룻밤 동안 정치시켰다. 전개 용액을 제거한 후, 전개과정을 0.35% 아세트산 용액을 사용하여 1시간 동안 중지시키고, 겔을 물로 세척하였다.
[락토페린 결합 검정]
접합 락토페린(250 내지 500 ng/ml)이 결합 혼합물에 포함되는 것을 제외한 락토페린에 대한 점-결합 검정을 트란스페린 결합활성에 대하여 상기에서 기재한 바와같이 필수적으로 수행하였다(A.B. Schryvers and L. Morris, Molecular Microbiology, 2: 281-288, 1988). 상업적으로 제조된 인체 락토페린은 퍼옥시다아제 대 락토페린의 비율이 1:1.5이다. 그러므로 접합 락토페린의 농도는 보통 약 1.8 내지 3.6nM(접합된 락토페린의 평균분자량은 140,000이다)의 범위에서 사용한다. 대조 실험으로 비접합 단백질 및 접합 인체 락토페린의 혼합물을 제조한 후 막에 적용시킨다.
정량화가 요구되는 발현실험을 위하여, 세포 현탁액을 600nm에서 흡광도가 10이 되도록 조정하고, 9개의 두배 희석액을 연속으로 제조하여 종이위에 점적하였다. 결합 단백질의 발현이 현저하게 예상되는 시료에 있어서, 첫 번째 희석액은 10배 희석하였다. 또한, 순서대로 희석한 접합 인체 락토페린 희석액을 동일한 종이에 직접 점적하였다. 기질을 공급하여 성장시키고 종이를 건조시킨 후, 바이오-래드 1-D 분석 소프트웨어 패키지를 갖추고 마이크로컴퓨터가 연결된 바이오래드 모델 620 비데오 덴지토메타의 반사율 장치를 사용하여 점을 측정하였다(Bio-Rad Lab., Richmond, 캘리포니아 소재). 접합체 희석에 해당하는 피크 아래부분의 면적을 측정하여 표준곡선을 구성하였다. 시료희석에 해당하는 피크 아래부분의 면적은 접합체의 결합량을 측정하기 위하여 사용하였다. 표준곡선을 구성하기 위하여 사용된 값의 법위안에 해당하는 면적을 갖는 피크만을 계산에 사용하였다. 로우리(Lowry)등의 검정(J. Biol. Chem. 193: 265-275, 1951)에 의하여 측정된 세포 현탁액의 단백질 농도를 사용하여 전체 세포단백질의 밀리그람당 결합 단백질양을 계산하고, 초기의 600nm 흡광도값을 사용하여 배양용적의 밀리리터 당 발현된 결합 단백질의 양을 계산하였다.
[단백질 농도의 측정]
표준물질로 소의 혈청 알부민을 사용하여 로우리 등의 방법에 의해 단백질을 측정하였다. 표준물질로 소의 혈청 알부민을 사용한 리라트(Rylatt) 등의 신속한 방법(Anal. Biochem, 121: 213-214, 1982)에 의하여 예비단백질 농도를 측정한 후, 로우리등의 검정에 의하여 증명하였다.
a. 표시된 첨가물[인체 헤모글로빈(HHb), 철-포화된 인체 트란스페린(HTr)]을 함유하는 뇌-심장 침출액 육즙으로 구성된 증식배지,
b. 배양물은 초코렛 평판상에 새로이 증식한 초기 흡광도가 600nm에서 0.04로 재현탁된 세포를 접종시키고, 37℃에서 16시간 동안 배양한다. 최종 흡광도는 공란과 같이 지시된 첨가물을 함유하는 배지로 16시간 증식시킨 후 측정하였다.
c. 전체 세포단백질 밀리그램 당 또는 초기 배양용적의 밀리리터 당 결합된 접합 락토페린의 나노그램으로 표현된 결합활성은 본 명세서에서 기술한 바와 같이 측정하였다.
[결과]
[락토페린 결합 활성의 발현]
나이세리아 메닝지티디스균에서 락토페린 결합활성 발현의 조절을 측정하기 위하여, 균주 B16B6을 여러 가지 상이한 첨가물을 포함하는 액체배지에서 증식시켰다. 퍼옥시다아제에 접합된 인체 락토페린(HRP-락토페린)을 순수한 메닝고코코스균 세포내의 락토페린-결합활성을 검출하기 위하여 사용하였다. 표 1에서 나타난 바와 같이, 액체배지에서만의 세포증식에서 락토페린 결합활성의 발현 수준이 낮지만, 합성 철 킬레이터 EDDA를 첨가하면 현저하게 증가하였다. 과량의 철을 첨가하면 본래의 낮은 발현수준으로 되돌아가므로 증가된 발현이 감소된 철 함량에 기인한다는 것을 나타내었다. 락토페린-결합활성의 발현은 트란스페린-결합활성과 근접한 평행을 이룬다.
선행된 연구(Figurel in A.B. Schryvers and L. Morris, Molecular Microbiology, 2: 281-288, 1988)에서 보고된 트란스페린-결합활성 발현의 시간 경과에대한 실험은 반복 수행되었고, 락토페린 결합 검정은 본질적으로 동일한 결과가 보였다(데이타는 나타내지 않았음). 이들 조건하에서, 최대 결합활성이 12 내지 16시간 배양 후 도달하였다.
또한, 표 1의 결과는 최대발현에 근접한 수준이 첨가한 EDDA의 중간 수준으로 달성되었다는 것을 나타낸다. 이 실험에서 관찰된 락토페린 결합활성의 수준은 세포가 2차 철-제한된 증식 사이클에 노출될 때 발생하는 것과 같은 더욱 극심한 철-제한 조건하의 수준과 비교하였다(데이타는 나타내지 않았음). 표 1에서 예시된 바와 같이, 헤모글로빈 또는 인체 트란스페린형태로 복합철을 제공하는 것이 결합활성을 급격하게 감소시키지 않고 높은 EDDA의 수준에 의하여 부과된 증식 제한을 부분적으로 복귀시켰다. 그러나 보다 높은 수준의 헤모글로빈을 가할 경우, 결합활성의 발현은 감지할 수 없는 수준까지 억제된다.
락토페린-결합활성은 시험된 20개 메닝지티디스 균주 모두에게 감지되고(데이타는 나타내지 않음), 시험된 모든 메닝고코코스균 균주는 락토페린 철을 증식에 사용할 수 있다는 선행 관찰과 일치한다.
[락토페린 결합 단백질의 동정]
바이오티닐화된 인체 락토페린 및 스트렙타비딘-아가로스를 사용한 친화성 크로마토그래프 배치 방법을 사용하여 여러 가지 상이한 메닝고코코스균 균주중에서 락토페린-결합 단백질을 동정한다. 철이 결핍된 나이세리아 메닝지티디스균 B16B6으로부터의 전체 막을 사용한 경우, 분자량이 약 105,000인 단백질은 락토페린 친화성 레진에 특이적으로 결합한다. 바이오티닐화된 락토페린을 밴드가 방법에서 생략되는 경우, 밴드가 존재하지 않으며, 이는 락토페린에 대한 특이적 결합이 포함되는 것을 의미한다. 또한 철이 충분한 세포로부터의 전체막을 사용한 경우 밴드가 존재하지 않으며, 이는 락토페린 결합 활성의 발현이 철에 의하여 강하게 억제된다는 관찰과 일치한다(표 1). 또한, 온화한 세척을 수행하는 경우, 분자량이 70,000 및 38,000인 단백질은 분자량이 105,000인 밴드를 함께 정제할 때 관찰되지만, 이들은 더욱 강화된 세척에 의하여 연속적으로 제거되었다. 용출 조건하에서, 바이오티닐화된 락토페린은 레진(분자량 80,000)에서 거의 유리되지 않지만, 끓이기 전에 시료 혼합에 환원제를 포함하면 SDS-PAGE에 의하여 관찰된 밴드의 증가를 유발하였다. 분자량이 37,000인 최소 밴드는 모든 시료에서 실질적으로 관찰되었다. X 그룹 및 W135 그룹의 메닝고코코스균 균주에서 전체 막을 사용하는 친화성 크로마토그래프는 유사한 분자량의 락토페린-결합 단백질을 동정한다. 이들 시료중에서 70,000 M1에서 관찰된 밴드는 부적합한 세척에 기인하여, 37,000에서의 밴드는 모든 시료에서 흔히 발견되는 오염된 밴드였다.
친화성 크로마토그래프로 전체막에서 분리된 분자량 105,000의 단백질은 철-결합된 B16B6으로부터 제조된 외막에서 관찰된 고분자량 단백질에 해당하였다. 단백질은 B16B6중에서 및 X 그룹중에서 철에 의해 조절되었다. 105kda 락토페린-결합 단백질과 함께 정제된 70kda 단백질은 철-결핍 B16B6의 외막에서 주로 발견되는 단백질 위치로 옮겨졌다. 단백질은 B16B6중에서 및 X 그룹중에서 철에 의해 조절된다. 이 단백질은 바이오티닐화된 트란스페린을 사용하여 분리된 경량 단백질 밴드로 미리 동정된 B16B6내 트란스페린-결합 단백질 유래인 것이 명백하다. 상이한 메닝고코코스 균주에서 저분자량 트란스페린 결합 단백질의 분자량은 매우 다양하며, SDS-PAGE 및 일렉트로블럿팅 이후에도 결합활성을 유지시키는 유일한 단백질이었다. 바이오티닐화된 트란스페린을 사용하여 분리된 저분자량 결합 단백질 이외에도, 이들 시료는 고분자량 결합 단백질 및 가열과정에서 방출되는 바이오티닐화된 트란스페린(80KDa 밴드)을 포함한다. B16B6 균주내의 70kda 단백질 및 저분자량 트란스페린-결합 단백질을 분리하는 것은 8 내지 10% 농도구배 겔에서 최적화되었지만, 이들 단백질은 표준 10% 아크릴아마이드 SDS-PAGE겔 상에서 함께 이동하였다.
[실시예 2]
인체 트란스페린 또는 인체 락토페린 수용체의 정제 및 백신 제제내로의 혼입
(a) 철-결핍된 전체 막의 제법
초코렛 평판상의 새로운 배양체로부터 재현탁된 메닝고코코스균 세포는 100μm EDTA를 포함하는 예열된 뇌 심장 침출액 액체배지에 초기 흡광도가 0.02가 되도록 접종하는데 사용하였다. 생성된 배양액을 교반하에 37℃에서 16시간 동안 배양시킨 후, 9,000×g에서 15분 동안 원심분리하여 회수하였다. 세포를 50μg/㎖의 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 함유하는 pH 8 완충용액, 5mM의 Tris-HCl에 0.2gm/㎖로 재현탁시켰다. 세포는 현탁액을 프렌치 압력셀로 16,000 lb/in2압력하에 통과시켜 용해시키고, 세포 파편을 9,000×g에서 15분간 원심분리하여 제거하였다. 조전체 막을 140,000×g에서 1시간 동안 원심분리하여 수집하고, 50mM Tris-HCl, pH 8 완충액에 재현탁시켰다.
(b) 수용체 단백질의 친화성 분리
실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 0.9mg의 바이오티닐화된 인체 트란스페린 또는 바이오티닐화된 인체 락토페린을 60㎖의 50mM Tris-HCl, 10mM NaCl, pH 8의 완충용액에 72mg의 조 전체막 단백질과 함께 혼합하고, 22℃에서 1시간 동안 배양하였다. 혼합물은 9,000×g에서 15분간 원심분리하여 막을 수집하고, 펠리트는 60㎖의 상기 완충용액중에 재현탁시켜 22℃에서 10분간 배양시켰다. EDTA를 10mM까지 가하고 사코실을 0.75%까지 가하여 혼합물을 실온에서 10분 동안 추가적로 배양시킨 후, 9,000×g에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 5㎖의 스트렙타비딘-아가로즈(1 내지 2mg 스트렙타비딘/㎖ 레진)와 혼합하고 실온에서 천천히 혼합하면서 1시간동안 배양하였다. 레진을 500×g에서 10분간 원심분리하여 수집하고, 80㎖의 50mM Tris-HCl, 1M NaCl, 10mM EDTA, 0.75% 사코실, pH 8 완충용액에 재현탁 시켰다. 레진을 다시 원심분리하여 수집하고, 상기 완충용액에서 2회 이상 세척하였다. 최종 세척 후, 레진을 20㎖의 상기 완충용액중에서 재현탁하고 1cm 직경 크로마토 그라피 컬럼내로 부었다. 채워진 레진을 추가된 10㎖ 50mM TrisHCl, 1M NaCl, 10mM EDTA, 0.05% 사코실에서 0 내지 3M 구아니딘 하이드로클로라이드 농도 구배 60㎖을 이용하여 용출시켰다. 수용체 단백질을 포함하는 단편을 수집하고, 3리터의 50mM Tris-HCl, pH 7.5 버퍼의 2회 교환 및 인산염 완충 식염수(50mM의 인산나트륨, 150mM의 NaCl, pH 7.4)의 1회 교환하여 투석시키고 한외여과에서 최종 용적을 1㎖로 농축시켰다.
(c) 백신의 제법
1㎖의 인산염 완충 식염수중에 있는 100㎍의 정제된 수용체 단백질을 0.01% 티메로살을 포함하는 인산염 완충 식염수중에서 2.5㎕로 희석시키고 0.2μm 여과기를 통과시켜 멸균하여 멸균 바이알에 멸균 이동시켰다. 인산염 완충 식염수중에 있는 200mg의 수산화알루미늄 멸균제제를 각 바이알에 가한 후 사용하였다. 또한 동물연구에 대하여 50㎕의 정상 식염수에 있는 50㎕의 무라밀 디펩티드를 첨가하였다.
[실시예 3]
나이세리아 메닝지티디스균으로부터의 인체 트란스페린에 대한 세균성 수용체가 유효한 백신 항원이라는 예비증거
약 20g 무게, 6 내지 7주 경과된 16마리의 암컷 스위스 웹스터 생쥐를 4개의 처리 그룹으로 분할하고 하기 표 3에 기재된 면역성 프로토콜(protocol)에 따르게 한다. 지시된 기질을 함유하는 1㎖의 멸균 식염수(150mM의 NaCl)를 1일, 9일, 16일 및 26일에 걸쳐서 복강내에 주사한다. 30일 경과한 후, 35μm EDTA를 포함하는 뮬러-힌톤(Mueller-Hinton) 아가 평판상에서 하룻밤동안 증식하고, 재현탁된 1 × 107의 메닝고코코스균을 각 생쥐에 복강내 주사한다. 20분 후 1㎖의 멸균 식염수중에서 충분하게 철-적재된 인체 트란스페린 20mg을 감염 세균에 미리 표출된 동일한 생쥐에 복강재 주사한다. 생쥐를 총 72시간동안 관찰하고 죽은 숫자와 생존 숫자를 기록한다.
* MDP - 50㎍의 무라밀 디펩티드
수용체 - 실시예 2에 기재된 바와 같이 나이세리아 메닝지티디스균 균주 B16B6로 부터 분리된 10㎍의 트란스페린 수용체,
OM - 사코실로 선택적 세정제 추출에 의하여 나이세리아 메닝지티디스균으로부터 분리된 50㎍의 철-결핍된 외막,
** 생쥐는 35μm EDDA를 포함하는 뮬러-힌톤 아가상에서 증식된 1 × 107세포의 메닝고코코스균 균주 B16B6로 감염되어 있다. 감염세균을 주사하여 20분 후 20mg의 충분하게 철-적재된 인체 트란스페린을 외인성 철 공급원으로서 복강내 주사한다.
본 발명의 다른 구현예는 본 명세서에서 공개된 본 발명의 상세한 설명 및 실시의 고찰로서 기술분야에서 숙련된 자에게 명백하게 된다. 이는 상세한 설명 및 실시예가 단지 예시적이고 본 발명의 범위 및 정신을 하기 청구범위에 기재되어 있다.

Claims (7)

  1. 면역성을 제공하기에 유효한 양의 트란스페린 수용체 단백질과 약제학적으로 허용되는 담체를 함유함을 특징으로 하여 병원성 세균에 대해 면역성을 제공하는 백신.
  2. 제1항에 있어서, 염화나트륨, 인산나트륨, 완충제 및 티메르솔을 추가로 함유하는 백신.
  3. 제1항에 있어서, 트란스페린 수용체가 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 나이세리아 고노르헤(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 락타미카(Neisseria lactamica), 브란하멜라 카타르할리스(Branhamella catarrhalis), 파스퇴렐라 헤몰리티카(Pasteurella haemolytica), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 헤모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 악티노바실루스 플뢰로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실루스 수이스(Actinobacillus suis), 헤모필루스 수이스(Haemophilus suis), 헤모필루스 파라갈리나룸(Haemophilus paragallinarum), 헤모필루스 갈리나룸(Haemophilus gallinarum) 및 헤모필루스 아비움(Haemophilus avium)으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 균주로부터 분리된 백신.
  4. 제1항에 있어서, 보조제(adjuvant)를 추가로 함유하는 백신.
  5. 제4항에 있어서, 보조제가 수산화 알루미늄인 백신.
  6. 제1항에 있어서, 트란스페린 수용체가 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동으로 측정했을 때 분자량이 58,000 내지 98,000 달톤의 저분자량 트란스페린 수용체 단백질, 분자량이 94,000 내지 106,000 달톤의 고분자량 트란스페린 수용체 단백질 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 백신.
  7. 제1항에 있어서, 트란스페린 수용체가 트란스페린-결합 활성을 발현하는 병원성 균주로부터 세포막을 분리한 다음, 이 세포막내의 트란스페린 수용체에 트란스페린을 결합시키고, 세포막을 용해시키며, 트란스페린을 고정시키고, 고정된 트란스페린으로부터 트란스페린 수용체를 분리하는 친화성 방법에 의해 정제된 것인 백신.
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