FI63674B - Foerfarande foer isolering och rening av immunologiskt aktivt polyribosylribitolfosfat - Google Patents
Foerfarande foer isolering och rening av immunologiskt aktivt polyribosylribitolfosfat Download PDFInfo
- Publication number
- FI63674B FI63674B FI783269A FI783269A FI63674B FI 63674 B FI63674 B FI 63674B FI 783269 A FI783269 A FI 783269A FI 783269 A FI783269 A FI 783269A FI 63674 B FI63674 B FI 63674B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- prp
- haemophilus influenzae
- influenzae type
- phosphate buffer
- known per
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/099—Bordetella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
E3F*1 M (11) ^ U U L UTUSJ U LKAISU ί-7,ηΔ LJ ' ' utlAqgninosskrift 000 /4 (51) Kv.ik.3/ι«.α3 A 61 K 39/102, C 12 P 19/04 SUOMI —FINLAND (21) P»Mntclh«kemu»-PM«i*M*ekiiln* 783269 (22) Hakemiiptlvl —AMBknint^tg 26.10.78 (23) AlkupUvft—GUtlghtadti 26.10.78 (41) Tullut {ulkMal — Bllvlt off«ntH| 29. Ol. 79 _ ^ , . (44) NihUvikalpanon |t kuuL)ulk^*un pvm. — , „
Patent- och registarstyrelsen Amekw utiagd och uti^kriftwi puuic«rad 29· 0^. 83 (32)(33)(31) Pyydetty Muoikeu* -B*jtrd prtortm 28.10.77 22.12.77 USA(US) 81+6166, 816188 (71) American Cyanamid Company, Wayne, New Jersey, USA(US) (72) Joseph S.-C. Kuo, Orangeburg, New York, USA(US) (7l) Oy Kolster Ab.
(51) Menetelmä immunologisesti aktiivisen polyribosyyliribitolifosfaatin (PRP) eristämiseksi ja puhdistamiseksi - Förfarande för isolering och rening av immunologiskt aktivt polyribosylribitolfosfat (PRP)
Keksintö koskee menetelmää immunologisesti aktiivisen polyribosyyliribitolifosfaatin (PRP), Haemophilus influenza b-tyypin kapseli-polysakkaridin, eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Polyribosyyliribi-tolifosfaattia voidaan käyttää immunointiin Haemophilus influenzae b-tyypin infektioita, kuten meningiittiä vastaan. Keksinnön mukaisesti valmistettuna PRP:tä voidaan käyttää yhdistelmänä rokotteissa yhdessä B. pertussis - antigeenin kanssa. PRP lienee myös tehokas käytettynä yhdessä muiden, ei patogeenisten bakteerikantojen, kuten kantojen E. Coli, B. subtilis, S. aureus, B. pumilis ja L. plantarum, kanssa vasta-ainereaktion aikaansaamiseksi lämminverisillä eläimillä.
Haemophilus influenzae b-tyypistä saatua puhdistettua polyri-bosyyliribitolifosfaattia (PRP) tutkitaan nykyisin suojainmunogeeni-na. Aktiivista antigeenireaktiota ei nuorilla eläimillä ja lapsilla ole kuitenkaan saatu. Aikaisemmin tunnetusta puhdistusmenetelmässä käytettiin etanolia ja Cetavlonia (heksadekyylitrimetyyliammoniumbro-midi). Epäpuhtaudet, endotoksiinit ja pyrogeeniset aineet poistettiin kylmän fenolin tai kloroformin ja tert.-butanolin avulla, mistä saattoi olla seurauksena tämän polysakkaridin antigeenisen luonteen muuttuminen .
2 63674
Nyt on kehitetty uusi menetelmä immunologisesti aktiivisen PRP:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi Haemophilus influenzae b-tyy-pistä.
Esillä olevalla keksinnöllä on selviä etuja aikaisemmin tunnettuihin menetelmiin verrattuna siinä, että kaikki epäpuhtaudet (nukleiinihapot ,proteiinit ja endotoksiinit) poistetaan erittäin hyvin käsittelemällä hydroksyyliapatiitilla. Tässä kuvatulla menetelmällä saadun polysakkaridin molekyylipaino on korkeampi kuin tunnetuilla menetelmillä saatujen polysakkaridien.
Lisäksi on suurta merkitystä sillä, että tällä uudelle menetelmällä valmistettu PRP on erittäin immunogeeninen lämminveristen eläinten suhteen päinvastoin kuin aikaisemmin tunnetuilla menetelmillä valmistettu PRP.
Epäpuhtauksien (proteiinien, nukleiinihappojen jaendotoksii-nien) poistaminen polysakkaridista PRP suoritetaan käsittelemällä osittain puhdistettua polysakkaridia fosfaattipito.i sella adsorbentilla, joka ei ilmoitetuissa olosuhteissa absorboi polysakkaridia.
(I) Polyribosyyliribitoli-fosfaatin, Haemophilus influenzae b-tyypin kapselipolysakkaridin, eristäminen ja puhdistaminen Organismit, viljelyväliaineet ja viljelmät Käytettiin kahta Haemophilus influenzae b-tyypin kantaa. Rab-kanta saatiin sairaalasta Grace Leidy, Babies Hospital, Colombia University, New York City, New York. CK-kanta eristettiin sairaalassa Waterbury Hospital Waterbury, Conn, olevasta potilaasta. Niillä suoritettiin useita pasasointeja hiirissä virulenssin takaamiseksi. Organismit eristetiin tapettujen hiirien aivokudoksesta, niitä viljeltiin edelleen joko 3,7-% aivo-sydän-infuusioväliaineella (BHI) (Difco Lab., Detroit, Mich.) tai 5-%BHI-agarilla, jossa oli täydennyksenä 0,01 % nikotinamidi-adeniinidinukleotidia (NAD) (P-L Biochemicals, Milwaukee, Wis.) ja 1 % (tilav./tilav.) defibrinoitua hevosen verta (Animal Blood Center, Syracuse, N.Y.) ja ne jaettiin sitten annoksina 1 ml:n ampulleihin, lyofilisoitiin ja säilytettiin -70°C:ssa.
Organismien viljelyssä käytetty perusväliaine oli 3,7-%:inen BHI. Perusväliainetta täydennettiin lOmgrlla NAD ja 20 mg:11a hemii-niä (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) 1 litraa kohti. Ymppiviljelmän 50 ml:aa kohti lisättiin 1 % (tilav./tilav.) defibrinoitua hevosen verta. Ennen käyttöä valmistetaan tuore komplementti, joka suodatetaan 0,45 pm:n Nalgene-suodatinyksiköllä (Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y.). Viljeltäessä organismia 14 litran fermenttorissa väli-
II
3 63674 aineeseen lisätään täydennykseksi vielä 0,5 % glukoosia.
Ymppiviljelmän valmistamiseksi organismeista 1 ml jäädytettyä varastoviljelmää sulatetaan ja viedään 50 mitään rikastettua BHI-väliainetta, jossa on täydennyksenä difibrinoitua hevosen verta ja NADtia. Viljelmää kasvatetaan kahdeksan tunnin ajan 37°C:ssa gyroravistuslaitteessa 150 kierr./min. Organismit lisätään sitten l-%:isena ymppinä 500 ml tn annoksiin 2 litran pulloissa olevaa rikastettua BHI-viljelyväliainetta, ja viljelmiä inkuboidaan 37°C:ssa kohtuullisesti ravistellen gyroravistuslaitteessa kahdeksan tuntia (PRPtn eristämiseksi) tai 14 tuntia (ymppiviljelmiksi).
Kunkin annoksen fermentointi 14 litran fermenttorissa aloitetaan viemällä aseptisesti 700 ml ymppiviljelmää 7 litraan rikastettua BHI-viljelyväliainetta, jossa on täydennyksenä hemiiniä de-fibrinoidun hevosen veren sijasta. Viljelmän lämpötila pidetään jatkuvasti 37 - l°C:ssa. Tankkia sekoitetaan nopeudella 150 kierr./min ja siihen johdetaan ilmavirta 0,25 litraa ilmaa/min/1 litra vilhely-seosta. Viljelyn aikana lisätään tarvittaessa 0,001 % silikonivaah- donestoainetta (FD-82, Hodag Chemical Corp.). Viljelyä jatketaan g myöhäisen logaritmisen kasvun vaiheeseen (8-10 x 10 elävää solua/ ml), tavallisesti noin kahdeksan tuntia, minkä jälkeen viljely lopetetaan lisäämällä 0,4 % formaldehydiä ja viemällä viljelmät yök-• «o si 4 Crseen.
Polyribosyyliribitoli-fosfaatin (PRP) eristäminen
Edellä esitetyllä tavalla valmistettu viljelyväliaine sentri-fugoidaan 27 000 g:ssa 30 minuutin ajan 4°C:ssa. Soluvapaa superna-tantti otetaan talteen, ja sitä käsitellään seuraavasti:
Vaihe 1, etanolisaostus
Viljelmän supernatanttiinlisätään natriumasetaattia (lopullinen väkevyys 4%). Liuoksen pH säädetään arvoon 6,0-6,2 ja siihen lisätään hitaasti 44 litraa 3A-etanolia voimakkaasti sekoittaen 4°C:ssa. Seoksen pH säädetään jääetikalla 6,8:ksi ja seosta säilytetään sitten 12 tuntia 3°C:ssa. Muodostunut sakka otetaan talteendekantoimal-la ja sentrifugoimalla, jolloin saadaan epäpuhdasta PRP:tä.
4 63674
Vaihe 2, Cetavlon (heksadekyylitrimetyyliammoniumbromidi)-käsittely
Vaiheesta 1 saatu sakka liuotetaan pyrogeenivapaaseen tislattuun veteen ja sentrifugoidaan liukenemattoman osan erottamiseksi. Kirkkaanruskea liuos lisätään sitten sekoittaen hitaasti 1Ό0 ml:aan 10-%:ista Cetavlon-vesiliuosta (lopullinen pitoisuus 0,5 %). Seosta sekoitetaan tunnin ajan, sitten se sentrifugoidaan. Nukleiinihapoista ia PRP-Cetavlon -kompleksista koostuva sakka sekoitetaan 2 litraan 0,3-m natriumkloridiliuosta. Samea liuos sentrifugoidaan liukenemattoman aineksen, kuten nukleiini-Cetavlon -suolan poistamiseksi.
Supernatantti laimennetaan yhtä suurella tilavuusmäärällä vettä, jolloin PRP-Cetavlon -suola saostuu. Seosta sekoitetaan tunnin ajan. sakka otetaan talteen sentrifugoimalla ja liuotetaan sit-te 2 litraan 0.3-m natriumkloridiliuosta.
Vaihe 3. etanolisaostus
Cetavlonia ja nukleiinihappo- ja proteiiniepäpuhtauksia poistetaan edelleen etanolisaostuksella (vähintään kaksi kertaa). PRP saostetaan vaiheen 1 mukaisesti, kun taas Cetavlon liuotetaan alko-holiliuokseen. PRP otetaan talteen sentrifugoimalla, liuotetaan 2 litraan pyrogeenivapaata tislattua vettä ja saostetaan sitten uudelleen scimoin kuin edellä. Lopullinen PRP-sakka liuotetaan 20-mmolaari-seen natriumfosfaattiin, pH 6,8.
Vaihe 4, hydroksyyliapatiittikä.sittely
Osittain puhdistetuissa PRP-preparaateissa olevat epäpuhtaudet (kuten nukleiinihapot, proteiinit ja endotoksiinit poistetaan adsorboimalla selektiivisesti kalsiumfosfaattipitoiselle adsorbentil-le, kuten hydroksyy liapatiitille /”3Ca (PO^) ^ *Ca (OH) .
Keksintö perustuu havaintoon, että polysakkaridi PRP ei adsorboidu kalsiumfosfaattiadsorbentille joka sisältää fosfaattipuskuria wmolaarinen), jonka pH on noin 6,7 - 6,9, tai fosfaattipuskuria (50 mmolaarinen), jonka pH on noin 5,8; epäpuhtaudet (kuten nukleiinihapot, proteiinit ja endotoksiinit) sen sijaan adsorboituvat näissä olosuhteissa. Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa panoksittain tai kolonniajona. Panoksittaisessa menetelmäsuoritukses-sa hydroksyyliapatiitti lisätään osittain puhdistettuunPRP -preparaat-tiin (20-mmolaarisessa fosfaattipuskurissa, pH6,9).
63674
Seosta sekoitetaan huolella ja se sentrifugoidaan ei-toivottujen kiinteiden aineiden poistamiseksi (adsorbentti ja adsorbentin adsor-boimat yhdisteet). Supernatantille suoritetaan tämä toimenpide vielä vähintään kaksi kertaa. Muodostunut liuos suodatetaan millipore-suotimella, dialysoidaan pyrogeenivapaata tislattua vettä vastaan ja lyofilisoidaan.
Kolonniajossa viedään osittain puhdistettu PRP 20-mmolaari-sessa fosfaattipuskurissa (pH vähintään 5,8) kolonniin, joka sisältää adsorbenttihydroksyyliapatiittia tasapainotettuna 20-mmolaari-sella fosfaattipuskurilla, pH 5,8 ja eluoidaan asteittain natrium-fosfaattipuskurin (pH 5,8) gradientilla 20 mmolaarisesta 100-mmo-laariseen. Kootuista fraktioista analysoidaan pentoosi (ja siten po-lyribosyyliribitolifosfaatti). Pentoosipitoiset fraktiot dialysoidaan pyrogeenivapaata tislattua vettä vastaan ja lyofilisoidaan.
(II) -Menetelmä H. influenzae b-tyypistä saadusta PRPzstä ja B. pertussis - antigeeneistä koostuvan yhdistelmärokotteen valmistamiseksi PRP-rokotteen valmistamiseksi lyofilisoitu PRP (valmistettu edellä kuvatulla tavalla) liuotetaan pitoisuudeksi 20mg/ml fosfaat-tipuskuroituun natriumkloridiliuokseen (PBS) (0,113 g kaliumfosfaattia, 0,83 g dinatriumfosfaattia ja 8,5 g natriumkloridia litrassa, pH 7,0, sisältää 0,01 % timerosaliä. Pokote steriilisuodatetaan 0,45 pm millipore-suodinyksikön lävitse, täytetään lasipulloihin ja säilytetään 4°C:ssa.
PRP:n väkevä liuos valmistetaan punnitsemalla etukäteen määrätty määrä polysakkaridia ja liuottamalla se fosfaattipuskuroituun natriumkloridiliuokseen (0,113 g kaliumdifosfaattia, 0,83 g dinatriumfosf aattia ja 8,5 g natriumkloridia litraa kohti, pH 7,0, sisältää 0f01 % timerosolia). Tämä väkevä PRP-liuos sekoitetaan sitten varastoliuoksen valmistamiseksi sopivan tilavuusmäärän kanssa tuoretta B pertussis -solususpensiota.
B. pertussis kannan 138 tunnusmerkit on kuvattu teoksessa Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8. painos, Bushanan & Gibbons Editors, Williams & Wilkins Co., Maryland, Yhdysvallat. Tätä kantaa on saatavissa laitoksesta American Type Culture Collection, Maryland, Yhdysvallat, deponointitunnuksella 10380.Yhdistelmärokotteen varastoliuos sisältää 200 pg PRP:tä ja noin 70 opasiteettiyksik-köä (op) soluja per ml.
63674
Varastoliuosta pidetään 4°C:ssa 90 vrk pertussis-antigeenien myrkyttömäksi tekemiseksi ennen lopullisen tuotteen (rokotteen) valmistusta (joka sisältää 10 pg PRPrtä ja 3,5 op-yksikköä pertussis-soluja/ 0.5, ml:n annos).
Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavien esimerkkien avulla, joissa ilmoitetut lämpötilat ovat Celsius-asteina.
Esimerkki 1 2,5 g hydroksyyliapatiittia (esim. Bio-gel HTP, Bio-Rad laboratories, Richmond, California) lisätään 250 ml:aan osittain puhdistettua PRP-preparaattia (Cetavlon- ja etanolikäsittelyn jälkeen) (joka sisältää noin 1,0 mg PRP/ml) 20-mmolaarisessa natrium-fosfaattipuskurissa, pH 6,9, ja seosta sekoitetaan jäävesihauteessa (1-4°C) tunnin ajan. Seos sentrifugöidaan SörvallRC2-B sentrifugil-la 30 minuutin ajan 16 000 g:ssä. Supernatantti johdetaan sitten 0,65 pm milliporesuotimen lävitse ja tämä toistetaan (joka kerralla suoritetaan käsittely 2,5 g:11a hydroksyyliapatiittia) vielä kaksi kertaa. Saatu liuos suodatetaan 0,65 pm ja 0.45 pm millipore-suoti-mella, dialysoidaan pyrogeenivapaata tislattua vettä vastaan ja lyo-filisoidaan. Lyofilisoidulla tuotteella on vahva immunogeeninen aktiviteetti ja se sisältää erittäin vähäisen määrän epäpuhtauksia (kuten nukleiinihappoja, proteiineja ja endotoksiineja) (katso taulukko I). Saadaan noin 170 mg lyofilisoitua PRP:tä. PRP-saanto tällä menetelmällä on noin 70 % lähtöainesakkaridista laskien. PRP on säilytettävä sopivissa olosuhteissa, kuten 4°C:ssa eksikaattorissa fos-foripentoksidin tai silikageelin päällä.
Esimerkki 2
Osittain puhdistettua PRPrtä (300 mg PRP) liuotetaan 100 ml:aan20 mmolaarista natriumfosfaattipuskuria, pH 5,8 (3 mg PRP/ml). Tämä liuos viedään huoneen lämpötilassa kolonniin (5,0 x 45 cm), joka sisältää hydroksyyliapatiittia (noin 250 ml täytetilavuus) tasapainotettuna 20-mmolaarisella natriumfosfaattipuskurilla, pH 5,8 ja eluoidaan asteittain 20-mmolaarisen, 50 mmolaarisen ja 100 mmolaari-sen natriumfosfaattipuskurin (pH 5,8) gradientilla. Yksittäiset 20-mmolaarisella ja 50-mmolaarisella natriumfosfaattipuskurilla (pH 5,8) eluoidut fraktiot (200 ml), jotka sisältävät pentoosia (pentoosimää-ritys orsinaali-menetelmällä), otetaan talteen, dialysoidaan pyrogeenivapaata tislattua vettä vastaan ja lyofilisoidaan.
7 63674
Saadaan noin 206 mg lyofilisoitua PRP:tä.
Polysakkaridin, PRP:n, puhtaus analysoidaan määrittämällä siinä epäpuhtautena olevat nukleiinihapot, proteiinit ja endotoksii-nit. Proteiinipitoisuus määritetään Lowry'n et ai., J. Biol. Chem. 193:265 (1951) menetelmällä käyttäen härän seerumialbumiinia standardina. Nukleiinihapot määritetään mittaamalla PRP-liuoksen absorb-tio aaltopituudella 260 nm. Liuoksen, jossa on 50 μg nukleiinihappoa 1 ml:ssa vettä, absorbanssi mitataan kyvetissä, jonka lävitse valo kulkee 1 cm:n matkan ja sen oletetaan olevan 1,0. Molekyylien ko- (6) ko arvioidaan Sepharose^ 4B- tai 2B-geelisuodatuksella 1,5 x 90 cm pylväällä (Pharmacia-Fine Chemicals, Piscatway, N.J.). Jakautumis-kerroin (Kd) määritetään orsinaali-reaktiossa saadusta eluointimal-lista (Herbert et ai., Methode in Microbiology, voi. 5B, 285-291).
63674 8 n c
O I
•H CO
£ H W £ I 0) O £ £ -H d) <D r-l £ £ ·· rH «H £
£ V rH Λ -H
[0 W O & >, O O ^ rH /-> o tn S <
I £ O O O O) 0) CO
tn o o -H £ £ D
£ d- 1- bO £ tn
•H H <U \ ^ O H
C £ O v- ιΗ rH £ Λί •H £ Λί f~ O £ £ £
H ·Η Ή O *H O O
tn -Q H T- CQ £ Sm
rX dj X
O X Ή Pj 5 -H I O >i cm 0)
O O ^ CM HS
TD £ υ £ £ ·Η C >1 O -H £ CS" H Pj d) £ -HO) £ S >, •ho o o -h o) £ υ £ h
£ S " ” £ £ £ ·Η d) *H
·Η·Η O O Pj £ CQ fj ε tl) •H £ t— t— Ή £ Cl) ·Η , £ £0) rH S £ S tn d) £ Cl) >, C < W > M M >, £ £ w ·η -- X H H · £ 0) £ H £ :£ £> •H »H d) £ £ ·γ j £ O ,£ £ £ d) £ M *H £ *H £ £ Λί ·Η •H ch t~~ £<D £ ><: Ä O d)r-^ " * > M ίι £ X o o :£ ·Η l d> £
,¾ O ^ H d) ^ S £ i—I
£ £ ·· rH O tn O
|H Ph CQ :£ £ £ O
£ J- £ ^ Λ £ £ -W :£ Qh £ Λ
H QJ I :£ :£ S d) £ H
£1 ·Η H S Ph £ -P £
g £ Hl N -P
3 ·Η (1) £ b0 £ r-v .h W <H oo oo SU d)T-p, -<-< φ o ^ Λ *> »0 Oj £ tn
£ rH P,dP OOH O rH H· O
C λ; Ρ,μ/ .. £ o H v- S
·" £ £ CQ S r- £ oo § Z ,£ cm O w ·Η tn
Cl :£ ·η W (1) . *h <D H en tn 3 *h
M tn i en ·· * £ £ ζ ,Q
m >, O CQ £ £ rH P £
A >, Otlf O 00 £ zf O £ -h£cQ
•HiHH^ " *> (fl £ <D ·Η ,£ H v_h H £ C toco ,£ d) -H S TD Pj 7) H C d) ·Η coco £ ω £ H £ O "2 £ £| < O. tn d)OPj£££P£ H· OD £ £ H TD d) H £ SI £ -H -H £ £ Q e Φ: io :£S£S£DCÖ£ J4 >,X X Pj *H S H 0,¾ I >, O ^ dJ d) ·Η O tn £ H i W S S TD ^ Λ to en £ O H £0/3 •h tu s £ zr £ £ £ > •O £
H rH £ m_/ O z± KtJatJSPj'H £ " S
£ O *H i—1 i—I ·Η ·Η X <C
£ 2 H o rHrHbOtntn co/3
X :£ :£ S dJ C* t- S
•h e e -s. £ o o) V) tn :£ :£ Ph h ·Η " £ >> £ HH«£O^TDN:£ H +j h cm HHPj”TDS££to
tn >, >, Oh £ £ £ QJ QJ
C Ή · :£:£W)0h(D d) rH £ S
·· 6 SE ssa.Qj'-'E^rH.y
Oh rH ·Η ·Η ·Η £ ·Ρ £
Cm nö C/DC0 (/) it) e dj
Oh > WW £ Λ O TD W 2 ·Η £ 63674 9
Yhdistelmärokotteen valmistus
Esimerkki a H. ingluenzae b-tyypistä saatua PRP:tä ja B. pertussis-anti-geeneja sisältävää yhdistelmärokotetta valmistettiin seuraavasti: 140 mg PPP (valmistettu esimerkin 2 mukaan) liuotetaan 350 ml:aan steriiliä fosfaattipuskuroitua natriumkloridiliuosta (PBS) (0,113 g kaliumfosfaattia, 0,83 g dinatriumfosfaattia ja 8,5 g natriumklori-dia litrassa, pH 7,0, sisältää 0,01 % timerosalia), ja liuos suodatetaan 0,45 pm millipore-suotimella. Tätä väkevää PRP-liuosta (400 pg)ml) käytetään PRP:tä ja B. pertussis-antigeeneja sisältävän yhdistelmärokotteen valmistamiseen.
150 ml:aan väkevää PRP-liuosta (400 pg/ml) lisätään 150 ml tuoretta B. pertussis-solususpensiota (kanta 138) PBS:ssä, pH 7,0 (sameus 149 op-yksikköä soluja/ml) yhdistelmärokotteen varastoliuok-sen valmistamiseksi. Tätä varastoliuosta (300 ml) pidetään 4°C:ssa, kunnes pertussis-endotoksiinitaso on laskenut (vähintään 90 vrk). Steriiliys kokeillaan tioglykolaattiväliaineilla (32-33°C:ssa). varas toliuoksenpH mitataan 90 vrk inkuboinnin jälkeen ja säädetään arvoon pH 7,0-1, Lopullinen tuote (rokote), jota käytetään eläinkokeissa, valmistetaan laimentamalla yhdistelmärokotteen varastolluos PBS:llä siten, että laimennus sisältää 10 μσ PRP:tä ja 3,5 op-yksikköä pertussis-soluja/0,5 ml (annos).
Yhdistelmärokotteella saatu vasta-ainereaktio nuorilla rotilla on esitetty kuviossa 1 ja 2.
Esimerkki b PRP:n varastoliuos (400 pg/ml ) valmistetaan liuottamalla 30 mg PRP:tä (valmistettu esimerkin 1 mukaisesti) 75 ml:aan steriiliä fosfaattipuskuroitua natriumkloridiliuosta (PBS) , ja liuos suodatetaan 0,45 pm millipore-suotimella. 25 ml:aan tätä väkevää PFP-liuos-ta lisätään yhtä suuri tilavuusmäärä (so. 25 ml) tuoretta B. pertussis (kanta 138)-solususpensiota PBS:ssä, pH 7,0 (sisältää 149 op-yksikköä soluja/ml) yhdistelmärokotteen varastoliuoksen valmistamiseksi. Tätä varastoliuosta pidetään vähintään 90 vrk 4°C:ssa. Varastoliuoksen steriiliys kokeillaan edellä esitetyllä tavalla tioglykolaattiväliaineilla. Varastoliuksen pH on 7,0-1. Lopullinen, eläinkokeissa käytetty tuote (rokote) valmistetaan laimentamalla yhdistelmärokotteen varastoliuos PBS:llä, siten, että se sisältää 10 pg PRP:tä ja 3,7 op-yksikköä pertussis-soluja/0,5 ml (annos).
10 63674
Esimerkki c
Valmistetaan PRP-varastoliuos (200 pg/ml) PBS:ään (pH 7,0) samoin kuin esimerkissä b. Pertussis-varastoliuos (sisältää 75 op-yksikköä/ml) valmistetaan laimentamalla 25 ml tuoretta B. pertussis-solususpensiota (149 op-yksikköä) yhtä suurella tilavuudella PBS:ää. Kumpaakin varastoliuosta inkuboidaan erikseen 4°C:ssa 90 vrk tai jonkin verran kauemmin. Yhdistelmärokote valmistetaan ottamalla 14 ml PRP-varastoliuosta (200 pg/ml) ja 14 ml (myrkyttömäksi käsiteltyä) pertussis-varastoliuosta (75 op-yksikköä/ml) ja laimentamalla 112 ml:lla PBS:ää (lopullinen tilavuus 140 ml). Eläinkokeissa käytetty valmis rokote sisältää 10 pg PRP:tä ja 3,7 op-yksikköä pertussis-soluja/0,5 ml (annos).
Vasta-aineen muodostus nuorilla rotilla käytettäessä yhdistelmärokotetta nähdään kuviossa 3 ja taulukossa II.
II
11 63674 3
Sh 3 rö CU +->
CO CO
•H
«H C
3 3
•H
o CO
<o cu c \ (U 3 nj λ e
CHS
3 :3 -H
+-> ·π I <000 00:3- LO LO 00 | i rs rs rs rs rs rs rs _ O 3 3 T-T-T-t- r^T-T- (β Ό o 3 T- v-
nj 'H -H
^ co -μ =
CU CU CO
i) ps *i ) 3
O 1¾ 3 CU
u I Ή ft H CE O
ro 00 o c M X -H ~ ^ B X 3 -, ft ·Η 3 Φ O ·Η I—I ·Η ο ^ > ο -μ Μ ^3 c Ή ~ :γΟ h COvhH ^ _< μ H o 4j CU 6 Ή jj cu -μ m -μ ^ * O -H * « +» > ° '7? H Ή O ^3 I—| c -μ -μ CO CD CN Γ" r-OO ·Η
S Λ! CO 00 LOJ-3-3- t^J-r- CO
O »·κ 3 O r— t— r— t— r— t-* c3- 03
,¾ o CU ·Η V-T-3CU
β 3 -μ 3 3 3 3 ·μ X (3 ·μ r-ί g 3 3 O' Ο- CO CM Μ in r ^3 3 g I ·ΓΟ CM Ot-J-OO O 00 LO (Ο-μ 3 5 33 h— t— h— t— o v- Ή ft H -μ -h v- co o rt CD CO Ai
n 3 3 3 -H
Tj > -ro CO 00 LO LO LOLDJ- +JCX
"ft I O T- T- O 00 00 OOJ-LO ft Ei
Il CU fti T— T-T— T— T- T— t— CU 3
rt X x 3- CU
5 CL, -H 3 {rt I ·Η o :3 3 rt-H> cd oo o oo T-oocn :θ—
m -μ o σΐτ-r-o o cd v- X
WC x-v-v-^-^^O
< ·Η X
3 CO X
rH fti -H
<—l »H ^-ι ·Η •μ I Cu I >
3 3 3 3 6 3 Λ Ό CU O
x ο-μο 30 ^ ^ ^ o · > CU 3 ft 3 Ή (U 3 T. X X CO X ω X ooft r—C C 3 C 3 3 C \-r—r w s-' w LO 3
CU<ftC3-ft33 rfs •'H -H
E II .ft OO 3 X
0 ·η ·η ^ w μ 3
,Υ ΟΌ h— /-m CD οί .H 3 O
1 ft -H x 3 Λ en · X ·Η 3 ft · ^ ^ -μ +Jcsi μ co ,y o e ä ft* ex •H COi—I ·Η Y 00 3 6 0-c I 3 3 co 3 γ 3 wp^.HOi-μ·)—i co (¾ 6 3 oo to O, ft O 3 3 ·η3 ω^'^ω^+3 3 ft ή μ +J ·Η ·Η + ·Η ϋ ^ Μ μ 3 ft -ftSHCO—'o-^cO'-' :1 3 3 μ 33 3 μ ιο κ ^ ίο · i<! ο, ο·· ft CU -μ 3 3 3 3 ^-^- 3 ε ν Λ 0003 ιο ΐμ 3 ο μ μ ·η γ ,- m <- γ: CU Υ 3 3ft OhOh ft 3 Dh X Ο Ο 3 ·Η 3 PS Ρί 3 3 Κ οο CUDS μμπ3 ftft 3 Λ Ο Ό
Claims (3)
1. Menetelmä immunologisesti aktiivisen polyribosyyliribito-lifosfaatin (PRP), Haemophilus influenzae b-tyypin kapselipolysakkaridin, eristämiseksi ja puhdistamiseksi, jolloin PRP on saatu fermen-toimalla organismin Haemophilus influenzae b-tyypin kantoja sinänsä tunnetuissa olosuhteissa, minkä jälkeen PRP on eristetty tavanomaisella etanolisaostuksella ja lisäksi sinänsä tunnetulla tavalla heksa-dekyylitrimetyyliammoniumbromidikompleksina, tunnettu siitä, että PRP puhdistetaan lisäämällä hydroksyyliapatiittia /3 Ca3(P04)2 Ca (OK) 2·/ 0,02-M natriumfosfaattipuskurissa pH-arvossa noin 6,7-6,9, sekoittamalla noin 2-10° C:ssa, sentrifugoimalla, ottamalla superna-tantti talteen ja toistamalla sama menettely vähintään kaksi kertaa, suodattamalla supernatantti sopivilla suotimilla, dialysoimalla pyro-geenivapaata, tislattua vettä vastaan ja lyofilisoimalla.
2. Menetelmä immunologisesti aktiivisen polyribosyylijribitQli.-______- fosfaatin (PRP) , Haemophilus influenzae b-tyypin kapselipolysakkaridin., eristämiseksi ja puhdistamiseksi, jolloin PRP on saatu fermentoimal- la organismin Haemophilus influenzae b-tyypin kantoja sinänsä tunnetuissa olosuhteissa, minkä jälkeen PRP on eristetty tavanomaisella etanolisaostuksella ja lisäksi sinänsä tunnetulla tavalla heksadekyy-litrimetyyliammoniumbromidikompleksina, tunnettu siitä, että PRP puhdistetaan pylväskromatografoimalla 0,02-M natriumfosfaattipuskurissa pH-arvossa noin 5,8 käyttämällä hydroksyyliapatiittia
/3 Ca3 (PO^)2 Ca (OH) 2//eluoimalla 0,02-M ja 0,05-M natriumfosfaattipuskurin asteittaisella gradientilla pH-arvossa noin 5,8, eristämällä fraktiot PRP-analyysin perusteella, dialysoimalla fraktiot pyrogeenivapaata, tislattua vettä vastaan ja lyofilisoimalla.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84646677 | 1977-10-28 | ||
| US05/846,466 US4196192A (en) | 1977-10-28 | 1977-10-28 | Combined Haemophilus influenzae type b and pertussis vaccine |
| US84648877 | 1977-12-22 | ||
| US05/846,488 US4220717A (en) | 1977-12-22 | 1977-12-22 | Isolation and purification of polyribosyl ribitol phosphate from Haemophilus influenzae type b. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI783269A FI783269A (fi) | 1979-04-29 |
| FI63674B true FI63674B (fi) | 1983-04-29 |
| FI63674C FI63674C (fi) | 1983-08-10 |
Family
ID=27126641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI783269A FI63674C (fi) | 1977-10-28 | 1978-10-26 | Foerfarande foer isolering och rening av immunologiskt aktivt polyribosylribitolfosfat (prp) |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5480408A (fi) |
| AR (1) | AR218932A1 (fi) |
| AU (1) | AU520902B2 (fi) |
| BE (1) | BE871586A (fi) |
| CA (1) | CA1117866A (fi) |
| CH (1) | CH649781A5 (fi) |
| DD (1) | DD140701A5 (fi) |
| DE (1) | DE2845745A1 (fi) |
| DK (1) | DK154327C (fi) |
| ES (1) | ES474611A1 (fi) |
| FI (1) | FI63674C (fi) |
| FR (1) | FR2407000B1 (fi) |
| GB (1) | GB2007244B (fi) |
| GR (1) | GR73991B (fi) |
| HU (1) | HU178166B (fi) |
| IE (1) | IE47474B1 (fi) |
| IL (1) | IL55433A (fi) |
| IT (1) | IT1107570B (fi) |
| NL (1) | NL7810753A (fi) |
| NO (1) | NO149611C (fi) |
| NZ (1) | NZ188211A (fi) |
| PH (1) | PH15882A (fi) |
| PL (1) | PL210545A1 (fi) |
| SE (1) | SE430753B (fi) |
| YU (1) | YU250878A (fi) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE889979A (fr) * | 1981-08-14 | 1982-02-15 | Smith Kline Rit | Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation |
| CA1209036A (en) * | 1982-08-20 | 1986-08-05 | Joseph S.C. Kuo | Combined haemophilus influenzae and diphtheria, pertussis, tetanus vaccine |
| US4744982A (en) * | 1982-08-24 | 1988-05-17 | Hunter Kenneth W | Human monoclonal antibody reactive with polyribosylribitol phosphate |
| ATE128628T1 (de) * | 1990-08-13 | 1995-10-15 | American Cyanamid Co | Faser-hemagglutinin von bordetella pertussis als träger für konjugierten impfstoff. |
| HU9400426D0 (en) * | 1991-08-16 | 1994-05-30 | Merck & Co Inc | Process for converting lipid-containing bacterial capsular polysaccharide into lipid-free polysaccharide |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3395219A (en) * | 1964-12-11 | 1968-07-30 | Merck & Co Inc | Process for production of pertussis antigen |
| IL24946A (en) * | 1965-01-19 | 1969-05-28 | Merck & Co Inc | Process for preparing antibodies in cilus pertussis |
| US3465078A (en) * | 1965-10-21 | 1969-09-02 | Sydney Z Spiesel | Method of recovering antigens from bordetella pertussis cells |
| NL174267B (nl) * | 1969-05-20 | Roussel Uclaf | Verbetering van de werkwijze voor de bereiding van een somatisch antigeen volgens het nederlandse octrooischrift 169754 en werkwijze ter bereiding van een farmaceutisch preparaat. | |
| US3636192A (en) * | 1970-01-13 | 1972-01-18 | Us Army | Meningococcal polysaccharide vaccines |
| FR2253499B1 (fi) * | 1973-12-10 | 1977-11-04 | Fabre Sa Pierre | |
| DE2461439C3 (de) * | 1974-12-24 | 1980-03-20 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella Pertussis sowie jenes enthaltendes Mittel |
| US3978209A (en) * | 1975-03-24 | 1976-08-31 | Merck & Co., Inc. | Endotoxin free meningococcus polysaccharides |
-
1978
- 1978-08-22 NZ NZ188211A patent/NZ188211A/en unknown
- 1978-08-25 IL IL55433A patent/IL55433A/xx unknown
- 1978-08-29 CA CA000310218A patent/CA1117866A/en not_active Expired
- 1978-08-30 AR AR273492A patent/AR218932A1/es active
- 1978-08-30 GR GR57127A patent/GR73991B/el unknown
- 1978-10-20 DE DE19782845745 patent/DE2845745A1/de active Granted
- 1978-10-24 IT IT51621/78A patent/IT1107570B/it active
- 1978-10-25 PH PH21738A patent/PH15882A/en unknown
- 1978-10-26 FR FR7830517A patent/FR2407000B1/fr not_active Expired
- 1978-10-26 FI FI783269A patent/FI63674C/fi not_active IP Right Cessation
- 1978-10-26 AU AU41081/78A patent/AU520902B2/en not_active Expired
- 1978-10-27 PL PL21054578A patent/PL210545A1/xx unknown
- 1978-10-27 NO NO783635A patent/NO149611C/no unknown
- 1978-10-27 ES ES474611A patent/ES474611A1/es not_active Expired
- 1978-10-27 DK DK479578A patent/DK154327C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-10-27 YU YU02508/78A patent/YU250878A/xx unknown
- 1978-10-27 DD DD78208715A patent/DD140701A5/de unknown
- 1978-10-27 NL NL7810753A patent/NL7810753A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-10-27 CH CH11125/78A patent/CH649781A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-10-27 HU HU78AE546A patent/HU178166B/hu not_active IP Right Cessation
- 1978-10-27 GB GB7842230A patent/GB2007244B/en not_active Expired
- 1978-10-27 BE BE191385A patent/BE871586A/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-10-27 IE IE2146/78A patent/IE47474B1/en unknown
- 1978-10-27 SE SE7811192A patent/SE430753B/sv not_active IP Right Cessation
- 1978-10-28 JP JP13310978A patent/JPS5480408A/ja active Granted
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4220717A (en) | Isolation and purification of polyribosyl ribitol phosphate from Haemophilus influenzae type b. | |
| US4197290A (en) | Vaccine | |
| Frommhagen et al. | The role of aggregated γ-globulins in the anticomplementary activity of human and animal sera | |
| US4196192A (en) | Combined Haemophilus influenzae type b and pertussis vaccine | |
| Ferretti et al. | Cross-reactivity of Streptococcus mutans antigens and human heart tissue | |
| US4816253A (en) | Novel mutant strain of Listeria monocytogenes and its use in production of IgM antibodies and as an immunotherapeutic agent | |
| US4428931A (en) | Bacterial toxoids and gram-negative immune globulin therefrom | |
| US4567041A (en) | Mutant strain of Listeria monocytogenes and its use in production of IgM antibodies and as an immunotherapeutic agent | |
| US4488991A (en) | Bacterial toxoids and gram-negative immune globulin therefrom | |
| FI63674B (fi) | Foerfarande foer isolering och rening av immunologiskt aktivt polyribosylribitolfosfat | |
| Kantor et al. | Preparation and antigenicity of M protein released from group A, type 1 streptococcal cell walls by phage-associated lysin | |
| KR100266556B1 (ko) | 백일해균의 방어성분의 분리방법 | |
| US3636192A (en) | Meningococcal polysaccharide vaccines | |
| IE44943B1 (en) | Tumor antigen and process for the preparation thereof | |
| KR970002614B1 (ko) | 백일해 내독소의 제거방법, 백일해 톡소이드 및 그 제조방법 | |
| EP0080021B1 (en) | Haemophilus influenzae type b and pertussis outer membrane component combined vaccine | |
| Salaman | The combining properties of vaccinia virus with the antibodies demonstrable in anti-vaccinal serum | |
| US3674863A (en) | Polyvalent immunizing agents and methods for their production | |
| US4009257A (en) | Preparation of immunosuppressive materials | |
| US4001080A (en) | Production of immunological materials | |
| Ushiba et al. | Characterization of “Clearance” factor and “Cell-bound” antibody in experimental typhoid | |
| Hunter et al. | Response of mice to rabbit Fab′ 2 and Fab′: Thymus independence of IgM response and thymus dependence of IgG response | |
| US3208909A (en) | Anaerobic process for production of a gel-adsorbed anthrax immunizing antigen | |
| RU2456996C1 (ru) | Способ получения очищенной в-субъединицы холерного токсина из рекомбинантного штамма vibrio cholerae | |
| Pirtle | A Soluble Precipitating Antigen From Hog Cholera Virus Propagated in Tissue Culture: I. Preparation and Characterization of the Antigen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: AMERICAN CYANAMID COMPANY |