FI63674B - FOERFARANDE FOER ISOLERING OCH RENING AV IMMUNOLOGISKT AKTIVT POLYRIBOSYLRIBITOLFOSFAT - Google Patents

FOERFARANDE FOER ISOLERING OCH RENING AV IMMUNOLOGISKT AKTIVT POLYRIBOSYLRIBITOLFOSFAT Download PDF

Info

Publication number
FI63674B
FI63674B FI783269A FI783269A FI63674B FI 63674 B FI63674 B FI 63674B FI 783269 A FI783269 A FI 783269A FI 783269 A FI783269 A FI 783269A FI 63674 B FI63674 B FI 63674B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
prp
haemophilus influenzae
influenzae type
phosphate buffer
known per
Prior art date
Application number
FI783269A
Other languages
Finnish (fi)
Other versions
FI783269A (en
FI63674C (en
Inventor
Joseph S-C Kuo
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US05/846,466 external-priority patent/US4196192A/en
Priority claimed from US05/846,488 external-priority patent/US4220717A/en
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of FI783269A publication Critical patent/FI783269A/en
Publication of FI63674B publication Critical patent/FI63674B/en
Application granted granted Critical
Publication of FI63674C publication Critical patent/FI63674C/en

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/099Bordetella
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/102Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70Multivalent vaccine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

E3F*1 M (11) ^ U U L UTUSJ U LKAISU ί-7,ηΔ LJ ' ' utlAqgninosskrift 000 /4 (51) Kv.ik.3/ι«.α3 A 61 K 39/102, C 12 P 19/04 SUOMI —FINLAND (21) P»Mntclh«kemu»-PM«i*M*ekiiln* 783269 (22) Hakemiiptlvl —AMBknint^tg 26.10.78 (23) AlkupUvft—GUtlghtadti 26.10.78 (41) Tullut {ulkMal — Bllvlt off«ntH| 29. Ol. 79 _ ^ , . (44) NihUvikalpanon |t kuuL)ulk^*un pvm. — , „E3F * 1 M (11) ^ UUL UTUSJ U UKAISU ί-7, ηΔ LJ '' utlAqgninosskrift 000/4 (51) Kv.ik.3 / ι «.α3 A 61 K 39/102, C 12 P 19/04 FINLAND —FINLAND (21) P »Mntclh« kemu »-PM« i * M * ekiiln * 783269 (22) Hakemiiptlvl —AMBknint ^ tg 26.10.78 (23) AlkupUvft — GUtlghtadti 26.10.78 (41) Tullut {ulkMal - Bllvlt off «NTH | 29. Ol. 79 _ ^,. (44) NihUvikalpanon | t kuL) ulk ^ * un pvm. -, "

Patent- och registarstyrelsen Amekw utiagd och uti^kriftwi puuic«rad 29· 0^. 83 (32)(33)(31) Pyydetty Muoikeu* -B*jtrd prtortm 28.10.77 22.12.77 USA(US) 81+6166, 816188 (71) American Cyanamid Company, Wayne, New Jersey, USA(US) (72) Joseph S.-C. Kuo, Orangeburg, New York, USA(US) (7l) Oy Kolster Ab.Patent and registration authorities Amekw utiagd och uti ^ kriftwi puuic «rad 29 · 0 ^. 83 (32) (33) (31) Requested Muoikeu * -B * jtrd prtortm 28.10.77 22.12.77 USA (US) 81 + 6166, 816188 (71) American Cyanamid Company, Wayne, New Jersey, USA (US) ( 72) Joseph S.-C. Kuo, Orangeburg, New York, USA (7l) Oy Kolster Ab.

(51) Menetelmä immunologisesti aktiivisen polyribosyyliribitolifosfaatin (PRP) eristämiseksi ja puhdistamiseksi - Förfarande för isolering och rening av immunologiskt aktivt polyribosylribitolfosfat (PRP)(51) Method for isolation and purification of immunologically active polyribosyl ribitol phosphate (PRP) - Förfarande för isolering och rening av immunologiskt aktivt polyribosylribitolfosfat (PRP)

Keksintö koskee menetelmää immunologisesti aktiivisen polyribosyyliribitolifosfaatin (PRP), Haemophilus influenza b-tyypin kapseli-polysakkaridin, eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Polyribosyyliribi-tolifosfaattia voidaan käyttää immunointiin Haemophilus influenzae b-tyypin infektioita, kuten meningiittiä vastaan. Keksinnön mukaisesti valmistettuna PRP:tä voidaan käyttää yhdistelmänä rokotteissa yhdessä B. pertussis - antigeenin kanssa. PRP lienee myös tehokas käytettynä yhdessä muiden, ei patogeenisten bakteerikantojen, kuten kantojen E. Coli, B. subtilis, S. aureus, B. pumilis ja L. plantarum, kanssa vasta-ainereaktion aikaansaamiseksi lämminverisillä eläimillä.The invention relates to a process for the isolation and purification of immunologically active polyribosyl ribitol phosphate (PRP), a Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide. Polyribosyl rib toliphosphate can be used for immunization against Haemophilus influenzae type b infections such as meningitis. PRP prepared according to the invention can be used in combination in vaccines together with B. pertussis antigen. PRP may also be effective when used in combination with other non-pathogenic bacterial strains, such as E. coli, B. subtilis, S. aureus, B. pumilis and L. plantarum, to elicit an antibody response in warm-blooded animals.

Haemophilus influenzae b-tyypistä saatua puhdistettua polyri-bosyyliribitolifosfaattia (PRP) tutkitaan nykyisin suojainmunogeeni-na. Aktiivista antigeenireaktiota ei nuorilla eläimillä ja lapsilla ole kuitenkaan saatu. Aikaisemmin tunnetusta puhdistusmenetelmässä käytettiin etanolia ja Cetavlonia (heksadekyylitrimetyyliammoniumbro-midi). Epäpuhtaudet, endotoksiinit ja pyrogeeniset aineet poistettiin kylmän fenolin tai kloroformin ja tert.-butanolin avulla, mistä saattoi olla seurauksena tämän polysakkaridin antigeenisen luonteen muuttuminen .Purified polyribosylribitol phosphate (PRP) from Haemophilus influenzae type b is currently being studied as a protective immunogen. However, no active antigen response has been obtained in young animals and children. Ethanol and Cetavlon (hexadecyltrimethylammonium bromide) were used in the previously known purification method. Impurities, endotoxins and pyrogens were removed with cold phenol or chloroform and tert-butanol, which could result in a change in the antigenic nature of this polysaccharide.

2 636742 63674

Nyt on kehitetty uusi menetelmä immunologisesti aktiivisen PRP:n eristämiseksi ja puhdistamiseksi Haemophilus influenzae b-tyy-pistä.A new method for isolating and purifying immunologically active PRP from Haemophilus influenzae type b has now been developed.

Esillä olevalla keksinnöllä on selviä etuja aikaisemmin tunnettuihin menetelmiin verrattuna siinä, että kaikki epäpuhtaudet (nukleiinihapot ,proteiinit ja endotoksiinit) poistetaan erittäin hyvin käsittelemällä hydroksyyliapatiitilla. Tässä kuvatulla menetelmällä saadun polysakkaridin molekyylipaino on korkeampi kuin tunnetuilla menetelmillä saatujen polysakkaridien.The present invention has clear advantages over previously known methods in that all impurities (nucleic acids, proteins and endotoxins) are removed very well by treatment with hydroxylapatite. The polysaccharide obtained by the method described here has a higher molecular weight than the polysaccharides obtained by known methods.

Lisäksi on suurta merkitystä sillä, että tällä uudelle menetelmällä valmistettu PRP on erittäin immunogeeninen lämminveristen eläinten suhteen päinvastoin kuin aikaisemmin tunnetuilla menetelmillä valmistettu PRP.In addition, it is of great importance that the PRP prepared by this new method is highly immunogenic in warm-blooded animals in contrast to the PRP prepared by the previously known methods.

Epäpuhtauksien (proteiinien, nukleiinihappojen jaendotoksii-nien) poistaminen polysakkaridista PRP suoritetaan käsittelemällä osittain puhdistettua polysakkaridia fosfaattipito.i sella adsorbentilla, joka ei ilmoitetuissa olosuhteissa absorboi polysakkaridia.Removal of impurities (proteins, nucleic acids and endotoxins) from the polysaccharide PRP is accomplished by treating the partially purified polysaccharide with a phosphate-containing adsorbent that does not absorb the polysaccharide under the conditions reported.

(I) Polyribosyyliribitoli-fosfaatin, Haemophilus influenzae b-tyypin kapselipolysakkaridin, eristäminen ja puhdistaminen Organismit, viljelyväliaineet ja viljelmät Käytettiin kahta Haemophilus influenzae b-tyypin kantaa. Rab-kanta saatiin sairaalasta Grace Leidy, Babies Hospital, Colombia University, New York City, New York. CK-kanta eristettiin sairaalassa Waterbury Hospital Waterbury, Conn, olevasta potilaasta. Niillä suoritettiin useita pasasointeja hiirissä virulenssin takaamiseksi. Organismit eristetiin tapettujen hiirien aivokudoksesta, niitä viljeltiin edelleen joko 3,7-% aivo-sydän-infuusioväliaineella (BHI) (Difco Lab., Detroit, Mich.) tai 5-%BHI-agarilla, jossa oli täydennyksenä 0,01 % nikotinamidi-adeniinidinukleotidia (NAD) (P-L Biochemicals, Milwaukee, Wis.) ja 1 % (tilav./tilav.) defibrinoitua hevosen verta (Animal Blood Center, Syracuse, N.Y.) ja ne jaettiin sitten annoksina 1 ml:n ampulleihin, lyofilisoitiin ja säilytettiin -70°C:ssa.(I) Isolation and purification of polyribosyl ribitol phosphate, Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide Organisms, culture media and cultures Two Haemophilus influenzae type b strains were used. The rab strain was obtained from Grace Leidy Hospital, Babies Hospital, Colombia University, New York City, New York. The CK strain was isolated from a patient at Waterbury Hospital in Waterbury, Conn. They underwent several passages in mice to ensure virulence. The organisms were isolated from the brain tissue of killed mice and further cultured with either 3.7% brain-heart infusion medium (BHI) (Difco Lab., Detroit, Mich.) Or 5% BHI agar supplemented with 0.01% nicotinamide. adenine dinucleotide (NAD) (PL Biochemicals, Milwaukee, Wis.) and 1% (v / v) defibrinated horse blood (Animal Blood Center, Syracuse, NY) and then dispensed in 1 ml ampoules, lyophilized and stored - 70 ° C.

Organismien viljelyssä käytetty perusväliaine oli 3,7-%:inen BHI. Perusväliainetta täydennettiin lOmgrlla NAD ja 20 mg:11a hemii-niä (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) 1 litraa kohti. Ymppiviljelmän 50 ml:aa kohti lisättiin 1 % (tilav./tilav.) defibrinoitua hevosen verta. Ennen käyttöä valmistetaan tuore komplementti, joka suodatetaan 0,45 pm:n Nalgene-suodatinyksiköllä (Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y.). Viljeltäessä organismia 14 litran fermenttorissa väli-The basic medium used for culturing the organisms was 3.7% BHI. The stock medium was supplemented with 10 mg NAD and 20 mg hemin (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) per liter. For 50 ml of inoculum, 1% (v / v) defibrinated horse blood was added. Prior to use, fresh complement is prepared and filtered through a 0.45 μm Nalgene filter unit (Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y.). When culturing the organism in a 14-liter fermentor,

IIII

3 63674 aineeseen lisätään täydennykseksi vielä 0,5 % glukoosia.An additional 0.5% glucose is added to 3,63674.

Ymppiviljelmän valmistamiseksi organismeista 1 ml jäädytettyä varastoviljelmää sulatetaan ja viedään 50 mitään rikastettua BHI-väliainetta, jossa on täydennyksenä difibrinoitua hevosen verta ja NADtia. Viljelmää kasvatetaan kahdeksan tunnin ajan 37°C:ssa gyroravistuslaitteessa 150 kierr./min. Organismit lisätään sitten l-%:isena ymppinä 500 ml tn annoksiin 2 litran pulloissa olevaa rikastettua BHI-viljelyväliainetta, ja viljelmiä inkuboidaan 37°C:ssa kohtuullisesti ravistellen gyroravistuslaitteessa kahdeksan tuntia (PRPtn eristämiseksi) tai 14 tuntia (ymppiviljelmiksi).To prepare an inoculum from the organisms, 1 ml of a frozen stock culture is thawed and 50 of any enriched BHI medium supplemented with difibrinated horse blood and NAD are added. The culture is grown for eight hours at 37 ° C in a gyro shaker at 150 rpm. The organisms are then added in 1% inocula to 500 ml tn portions of enriched BHI culture medium in 2 liter flasks, and the cultures are incubated at 37 ° C with gentle shaking in a gyro shaker for eight hours (to isolate PRP) or 14 hours (inocula).

Kunkin annoksen fermentointi 14 litran fermenttorissa aloitetaan viemällä aseptisesti 700 ml ymppiviljelmää 7 litraan rikastettua BHI-viljelyväliainetta, jossa on täydennyksenä hemiiniä de-fibrinoidun hevosen veren sijasta. Viljelmän lämpötila pidetään jatkuvasti 37 - l°C:ssa. Tankkia sekoitetaan nopeudella 150 kierr./min ja siihen johdetaan ilmavirta 0,25 litraa ilmaa/min/1 litra vilhely-seosta. Viljelyn aikana lisätään tarvittaessa 0,001 % silikonivaah- donestoainetta (FD-82, Hodag Chemical Corp.). Viljelyä jatketaan g myöhäisen logaritmisen kasvun vaiheeseen (8-10 x 10 elävää solua/ ml), tavallisesti noin kahdeksan tuntia, minkä jälkeen viljely lopetetaan lisäämällä 0,4 % formaldehydiä ja viemällä viljelmät yök-• «o si 4 Crseen.Fermentation of each batch in a 14-liter fermentor is initiated by aseptically introducing 700 ml of inoculum into 7 liters of enriched BHI culture medium supplemented with hemin instead of de-fibrinated horse blood. The culture temperature is kept constant at 37-1 ° C. The tank is agitated at 150 rpm and an air flow of 0.25 liters of air / min / 1 liter of vilhely mixture is introduced. During culture, 0.001% silicone antifoam (FD-82, Hodag Chemical Corp.) is added as needed. The culture is continued to g late logarithmic growth phase (8-10 x 10 viable cells / ml), usually for about eight hours, after which the culture is stopped by adding 0.4% formaldehyde and taking the cultures overnight at 4 ° C.

Polyribosyyliribitoli-fosfaatin (PRP) eristäminenIsolation of polyribosyl ribitol phosphate (PRP)

Edellä esitetyllä tavalla valmistettu viljelyväliaine sentri-fugoidaan 27 000 g:ssa 30 minuutin ajan 4°C:ssa. Soluvapaa superna-tantti otetaan talteen, ja sitä käsitellään seuraavasti:The culture medium prepared as described above is centrifuged at 27,000 g for 30 minutes at 4 ° C. The cell-free supernatant is recovered and treated as follows:

Vaihe 1, etanolisaostusStep 1, ethanol precipitation

Viljelmän supernatanttiinlisätään natriumasetaattia (lopullinen väkevyys 4%). Liuoksen pH säädetään arvoon 6,0-6,2 ja siihen lisätään hitaasti 44 litraa 3A-etanolia voimakkaasti sekoittaen 4°C:ssa. Seoksen pH säädetään jääetikalla 6,8:ksi ja seosta säilytetään sitten 12 tuntia 3°C:ssa. Muodostunut sakka otetaan talteendekantoimal-la ja sentrifugoimalla, jolloin saadaan epäpuhdasta PRP:tä.Sodium acetate (final concentration 4%) is added to the culture supernatant. The pH of the solution is adjusted to 6.0-6.2 and 44 liters of 3A-ethanol are slowly added with vigorous stirring at 4 ° C. The pH of the mixture is adjusted to 6.8 with glacial acetic acid and the mixture is then stored for 12 hours at 3 ° C. The precipitate formed is recovered by decantation and centrifugation to give crude PRP.

4 636744,63674

Vaihe 2, Cetavlon (heksadekyylitrimetyyliammoniumbromidi)-käsittelyStep 2, Cetavlo (hexadecyltrimethylammonium bromide) treatment

Vaiheesta 1 saatu sakka liuotetaan pyrogeenivapaaseen tislattuun veteen ja sentrifugoidaan liukenemattoman osan erottamiseksi. Kirkkaanruskea liuos lisätään sitten sekoittaen hitaasti 1Ό0 ml:aan 10-%:ista Cetavlon-vesiliuosta (lopullinen pitoisuus 0,5 %). Seosta sekoitetaan tunnin ajan, sitten se sentrifugoidaan. Nukleiinihapoista ia PRP-Cetavlon -kompleksista koostuva sakka sekoitetaan 2 litraan 0,3-m natriumkloridiliuosta. Samea liuos sentrifugoidaan liukenemattoman aineksen, kuten nukleiini-Cetavlon -suolan poistamiseksi.The precipitate from step 1 is dissolved in pyrogen-free distilled water and centrifuged to separate the insoluble matter. The light brown solution is then added slowly with stirring to 1 to 0 ml of 10% aqueous Cetavlon solution (final concentration 0.5%). The mixture is stirred for one hour, then centrifuged. The precipitate consisting of the nucleic acids and the PRP-Cetavlon complex is mixed with 2 liters of 0.3 M sodium chloride solution. The cloudy solution is centrifuged to remove insoluble material such as the nucleic acid Cetavlon.

Supernatantti laimennetaan yhtä suurella tilavuusmäärällä vettä, jolloin PRP-Cetavlon -suola saostuu. Seosta sekoitetaan tunnin ajan. sakka otetaan talteen sentrifugoimalla ja liuotetaan sit-te 2 litraan 0.3-m natriumkloridiliuosta.The supernatant is diluted with an equal volume of water to precipitate the PRP-Cetavlon salt. The mixture is stirred for one hour. the precipitate is collected by centrifugation and then dissolved in 2 liters of 0.3 M sodium chloride solution.

Vaihe 3. etanolisaostusStep 3. Ethanol precipitation

Cetavlonia ja nukleiinihappo- ja proteiiniepäpuhtauksia poistetaan edelleen etanolisaostuksella (vähintään kaksi kertaa). PRP saostetaan vaiheen 1 mukaisesti, kun taas Cetavlon liuotetaan alko-holiliuokseen. PRP otetaan talteen sentrifugoimalla, liuotetaan 2 litraan pyrogeenivapaata tislattua vettä ja saostetaan sitten uudelleen scimoin kuin edellä. Lopullinen PRP-sakka liuotetaan 20-mmolaari-seen natriumfosfaattiin, pH 6,8.Cetavlon and nucleic acid and protein impurities are further removed by ethanol precipitation (at least twice). PRP is precipitated according to step 1, while Cetavlon is dissolved in an alcoholic solution. The PRP is recovered by centrifugation, dissolved in 2 liters of pyrogen-free distilled water and then reprecipitated as before. The final PRP precipitate is dissolved in 20 mM sodium phosphate, pH 6.8.

Vaihe 4, hydroksyyliapatiittikä.sittelyStep 4, Treatment of hydroxylapatite

Osittain puhdistetuissa PRP-preparaateissa olevat epäpuhtaudet (kuten nukleiinihapot, proteiinit ja endotoksiinit poistetaan adsorboimalla selektiivisesti kalsiumfosfaattipitoiselle adsorbentil-le, kuten hydroksyy liapatiitille /”3Ca (PO^) ^ *Ca (OH) .Impurities in partially purified PRP preparations (such as nucleic acids, proteins, and endotoxins are removed by selective adsorption to a calcium phosphate-containing adsorbent such as hydroxyl lipatite / 3Ca (PO2) ^ * Ca (OH)).

Keksintö perustuu havaintoon, että polysakkaridi PRP ei adsorboidu kalsiumfosfaattiadsorbentille joka sisältää fosfaattipuskuria wmolaarinen), jonka pH on noin 6,7 - 6,9, tai fosfaattipuskuria (50 mmolaarinen), jonka pH on noin 5,8; epäpuhtaudet (kuten nukleiinihapot, proteiinit ja endotoksiinit) sen sijaan adsorboituvat näissä olosuhteissa. Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa panoksittain tai kolonniajona. Panoksittaisessa menetelmäsuoritukses-sa hydroksyyliapatiitti lisätään osittain puhdistettuunPRP -preparaat-tiin (20-mmolaarisessa fosfaattipuskurissa, pH6,9).The invention is based on the finding that the polysaccharide PRP is not adsorbed to a calcium phosphate adsorbent containing a phosphate buffer (molar) (pH 6.7 to 6.9) or a phosphate buffer (50 mmol) having a pH of about 5.8; impurities (such as nucleic acids, proteins, and endotoxins) are instead adsorbed under these conditions. The process according to the invention can be carried out batchwise or as a column run. In a batch process, hydroxylapatite is added to a partially purified PRP preparation (in 20 mM phosphate buffer, pH 6.9).

6367463674

Seosta sekoitetaan huolella ja se sentrifugoidaan ei-toivottujen kiinteiden aineiden poistamiseksi (adsorbentti ja adsorbentin adsor-boimat yhdisteet). Supernatantille suoritetaan tämä toimenpide vielä vähintään kaksi kertaa. Muodostunut liuos suodatetaan millipore-suotimella, dialysoidaan pyrogeenivapaata tislattua vettä vastaan ja lyofilisoidaan.The mixture is mixed thoroughly and centrifuged to remove unwanted solids (adsorbent and compounds adsorbed by the adsorbent). The supernatant is subjected to this operation at least twice more. The resulting solution is filtered through a Millipore filter, dialyzed against pyrogen-free distilled water and lyophilized.

Kolonniajossa viedään osittain puhdistettu PRP 20-mmolaari-sessa fosfaattipuskurissa (pH vähintään 5,8) kolonniin, joka sisältää adsorbenttihydroksyyliapatiittia tasapainotettuna 20-mmolaari-sella fosfaattipuskurilla, pH 5,8 ja eluoidaan asteittain natrium-fosfaattipuskurin (pH 5,8) gradientilla 20 mmolaarisesta 100-mmo-laariseen. Kootuista fraktioista analysoidaan pentoosi (ja siten po-lyribosyyliribitolifosfaatti). Pentoosipitoiset fraktiot dialysoidaan pyrogeenivapaata tislattua vettä vastaan ja lyofilisoidaan.In the column run, partially purified PRP in 20 mM phosphate buffer (pH at least 5.8) is applied to a column containing adsorbent hydroxylapatite equilibrated with 20 mM phosphate buffer, pH 5.8, and gradually eluted with a gradient of sodium phosphate buffer (pH 5.8). 100-mmo-vascular. The collected fractions are analyzed for pentose (and thus polyribosyl ribitol phosphate). The pentose-containing fractions are dialyzed against pyrogen-free distilled water and lyophilized.

(II) -Menetelmä H. influenzae b-tyypistä saadusta PRPzstä ja B. pertussis - antigeeneistä koostuvan yhdistelmärokotteen valmistamiseksi PRP-rokotteen valmistamiseksi lyofilisoitu PRP (valmistettu edellä kuvatulla tavalla) liuotetaan pitoisuudeksi 20mg/ml fosfaat-tipuskuroituun natriumkloridiliuokseen (PBS) (0,113 g kaliumfosfaattia, 0,83 g dinatriumfosfaattia ja 8,5 g natriumkloridia litrassa, pH 7,0, sisältää 0,01 % timerosaliä. Pokote steriilisuodatetaan 0,45 pm millipore-suodinyksikön lävitse, täytetään lasipulloihin ja säilytetään 4°C:ssa.(II) -Method for the preparation of a combination vaccine consisting of H. influenzae type b PRP and B. pertussis antigens to prepare a PRP vaccine lyophilized PRP (prepared as described above) is dissolved to a concentration of 20 mg / ml in phosphate-buffered sodium chloride solution (PBS) (0 g , 0.83 g of disodium phosphate and 8.5 g of sodium chloride per liter, pH 7.0, contain 0.01% thimerosal The sterile is sterile filtered through a 0.45 μm Millipore filter unit, filled into glass vials and stored at 4 ° C.

PRP:n väkevä liuos valmistetaan punnitsemalla etukäteen määrätty määrä polysakkaridia ja liuottamalla se fosfaattipuskuroituun natriumkloridiliuokseen (0,113 g kaliumdifosfaattia, 0,83 g dinatriumfosf aattia ja 8,5 g natriumkloridia litraa kohti, pH 7,0, sisältää 0f01 % timerosolia). Tämä väkevä PRP-liuos sekoitetaan sitten varastoliuoksen valmistamiseksi sopivan tilavuusmäärän kanssa tuoretta B pertussis -solususpensiota.A concentrated solution of PRP is prepared by weighing a predetermined amount of polysaccharide and dissolving it in phosphate-buffered sodium chloride solution (0.113 g of potassium diphosphate, 0.83 g of disodium phosphate and 8.5 g of sodium chloride per liter, pH 7.0, containing 0f01% thimer). This concentrated PRP solution is then mixed with an appropriate volume of fresh B pertussis cell suspension to prepare a stock solution.

B. pertussis kannan 138 tunnusmerkit on kuvattu teoksessa Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8. painos, Bushanan & Gibbons Editors, Williams & Wilkins Co., Maryland, Yhdysvallat. Tätä kantaa on saatavissa laitoksesta American Type Culture Collection, Maryland, Yhdysvallat, deponointitunnuksella 10380.Yhdistelmärokotteen varastoliuos sisältää 200 pg PRP:tä ja noin 70 opasiteettiyksik-köä (op) soluja per ml.Characteristics of B. pertussis strain 138 are described in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition, Bushanan & Gibbons Editors, Williams & Wilkins Co., Maryland, USA. This strain is available from the American Type Culture Collection, Maryland, USA, under accession number 10380. The stock solution of the combination vaccine contains 200 pg PRP and about 70 opacity units (cr) cells per ml.

6367463674

Varastoliuosta pidetään 4°C:ssa 90 vrk pertussis-antigeenien myrkyttömäksi tekemiseksi ennen lopullisen tuotteen (rokotteen) valmistusta (joka sisältää 10 pg PRPrtä ja 3,5 op-yksikköä pertussis-soluja/ 0.5, ml:n annos).The stock solution is maintained at 4 ° C for 90 days to detoxify pertussis antigens prior to preparation of the final product (vaccine) (containing 10 pg PRPr and 3.5 op units pertussis cells / 0.5 ml dose).

Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavien esimerkkien avulla, joissa ilmoitetut lämpötilat ovat Celsius-asteina.The invention is further illustrated by the following examples in which the temperatures indicated are in degrees Celsius.

Esimerkki 1 2,5 g hydroksyyliapatiittia (esim. Bio-gel HTP, Bio-Rad laboratories, Richmond, California) lisätään 250 ml:aan osittain puhdistettua PRP-preparaattia (Cetavlon- ja etanolikäsittelyn jälkeen) (joka sisältää noin 1,0 mg PRP/ml) 20-mmolaarisessa natrium-fosfaattipuskurissa, pH 6,9, ja seosta sekoitetaan jäävesihauteessa (1-4°C) tunnin ajan. Seos sentrifugöidaan SörvallRC2-B sentrifugil-la 30 minuutin ajan 16 000 g:ssä. Supernatantti johdetaan sitten 0,65 pm milliporesuotimen lävitse ja tämä toistetaan (joka kerralla suoritetaan käsittely 2,5 g:11a hydroksyyliapatiittia) vielä kaksi kertaa. Saatu liuos suodatetaan 0,65 pm ja 0.45 pm millipore-suoti-mella, dialysoidaan pyrogeenivapaata tislattua vettä vastaan ja lyo-filisoidaan. Lyofilisoidulla tuotteella on vahva immunogeeninen aktiviteetti ja se sisältää erittäin vähäisen määrän epäpuhtauksia (kuten nukleiinihappoja, proteiineja ja endotoksiineja) (katso taulukko I). Saadaan noin 170 mg lyofilisoitua PRP:tä. PRP-saanto tällä menetelmällä on noin 70 % lähtöainesakkaridista laskien. PRP on säilytettävä sopivissa olosuhteissa, kuten 4°C:ssa eksikaattorissa fos-foripentoksidin tai silikageelin päällä.Example 1 2.5 g of hydroxylapatite (e.g., Bio-gel HTP, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) is added to 250 mL of a partially purified PRP preparation (after Cetavlon and ethanol treatment) (containing about 1.0 mg of PRP / ml) in 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.9, and the mixture is stirred in an ice-water bath (1-4 ° C) for one hour. The mixture is centrifuged in a Sörvall RC2-B centrifuge for 30 minutes at 16,000 g. The supernatant is then passed through a 0.65 μm millipore filter and this is repeated (each time treated with 2.5 g of hydroxylapatite) two more times. The resulting solution is filtered through a 0.65 and 0.45 Millipore filter, dialyzed against pyrogen-free distilled water and lyophilized. The lyophilized product has strong immunogenic activity and contains very small amounts of impurities (such as nucleic acids, proteins, and endotoxins) (see Table I). About 170 mg of lyophilized PRP is obtained. The PRP yield by this method is about 70% based on the starting saccharide. The PRP must be stored under suitable conditions, such as 4 ° C in a desiccator over phosphorus pentoxide or silica gel.

Esimerkki 2Example 2

Osittain puhdistettua PRPrtä (300 mg PRP) liuotetaan 100 ml:aan20 mmolaarista natriumfosfaattipuskuria, pH 5,8 (3 mg PRP/ml). Tämä liuos viedään huoneen lämpötilassa kolonniin (5,0 x 45 cm), joka sisältää hydroksyyliapatiittia (noin 250 ml täytetilavuus) tasapainotettuna 20-mmolaarisella natriumfosfaattipuskurilla, pH 5,8 ja eluoidaan asteittain 20-mmolaarisen, 50 mmolaarisen ja 100 mmolaari-sen natriumfosfaattipuskurin (pH 5,8) gradientilla. Yksittäiset 20-mmolaarisella ja 50-mmolaarisella natriumfosfaattipuskurilla (pH 5,8) eluoidut fraktiot (200 ml), jotka sisältävät pentoosia (pentoosimää-ritys orsinaali-menetelmällä), otetaan talteen, dialysoidaan pyrogeenivapaata tislattua vettä vastaan ja lyofilisoidaan.Partially purified PRP (300 mg PRP) is dissolved in 100 ml of 20 mM sodium phosphate buffer, pH 5.8 (3 mg PRP / ml). This solution is applied at room temperature to a column (5.0 x 45 cm) containing hydroxylapatite (ca. 250 ml pack volume) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 5.8 and gradually eluted with 20 mM, 50 mM and 100 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8). pH 5.8) with a gradient. The individual fractions (200 ml) eluted with 20 mM and 50 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8) containing pentose (pentose assay by the original method) are collected, dialyzed against pyrogen-free distilled water and lyophilized.

7 636747 63674

Saadaan noin 206 mg lyofilisoitua PRP:tä.About 206 mg of lyophilized PRP is obtained.

Polysakkaridin, PRP:n, puhtaus analysoidaan määrittämällä siinä epäpuhtautena olevat nukleiinihapot, proteiinit ja endotoksii-nit. Proteiinipitoisuus määritetään Lowry'n et ai., J. Biol. Chem. 193:265 (1951) menetelmällä käyttäen härän seerumialbumiinia standardina. Nukleiinihapot määritetään mittaamalla PRP-liuoksen absorb-tio aaltopituudella 260 nm. Liuoksen, jossa on 50 μg nukleiinihappoa 1 ml:ssa vettä, absorbanssi mitataan kyvetissä, jonka lävitse valo kulkee 1 cm:n matkan ja sen oletetaan olevan 1,0. Molekyylien ko- (6) ko arvioidaan Sepharose^ 4B- tai 2B-geelisuodatuksella 1,5 x 90 cm pylväällä (Pharmacia-Fine Chemicals, Piscatway, N.J.). Jakautumis-kerroin (Kd) määritetään orsinaali-reaktiossa saadusta eluointimal-lista (Herbert et ai., Methode in Microbiology, voi. 5B, 285-291).The purity of the polysaccharide, PRP, is analyzed by determining the nucleic acids, proteins and endotoxins present as impurities. Protein content is determined by Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265 (1951) using bovine serum albumin as a standard. Nucleic acids are determined by measuring the absorbance of the PRP solution at 260 nm. The absorbance of a solution of 50 μg of nucleic acid in 1 ml of water is measured in a cuvette through which the light passes 1 cm and is assumed to be 1,0. The co- (6) size of the molecules is evaluated by Sepharose ^ 4B or 2B gel filtration on a 1.5 x 90 cm column (Pharmacia-Fine Chemicals, Piscatway, N.J.). The partition coefficient (Kd) is determined from the elution model obtained in the original reaction (Herbert et al., Method in Microbiology, Vol. 5B, 285-291).

63674 8 n c63674 8 n c

O IO I

•H CO• H CO

£ H W £ I 0) O £ £ -H d) <D r-l £ £ ·· rH «H ££ H W £ I 0) O £ £ -H d) <D r-l £ £ ·· rH «H £

£ V rH Λ -H£ V rH Λ -H

[0 W O & >, O O ^ rH /-> o tn S <[0 W O &>, O O ^ rH / -> o tn S <

I £ O O O O) 0) COI £ O O O O) 0) CO

tn o o -H £ £ Dtn o o -H £ £ D

£ d- 1- bO £ tn£ d- 1- bO £ tn

•H H <U \ ^ O H• H H <U \ ^ O H

C £ O v- ιΗ rH £ Λί •H £ Λί f~ O £ £ £C £ O v- ιΗ rH £ Λί • H £ Λί f ~ O £ £ £

H ·Η Ή O *H O OH · Η Ή O * H O O

tn -Q H T- CQ £ Smtn -Q H T- CQ £ Sm

rX dj XrX dj X

O X Ή Pj 5 -H I O >i cm 0)O X Ή Pj 5 -H I O> i cm 0)

O O ^ CM HSO O ^ CM HS

TD £ υ £ £ ·Η C >1 O -H £ CS" H Pj d) £ -HO) £ S >, •ho o o -h o) £ υ £ hTD £ υ £ £ · Η C> 1 O -H £ CS "H Pj d) £ -HO) £ S>, • ho o o -h o) £ υ £ h

£ S " ” £ £ £ ·Η d) *H£ S "” £ £ £ · Η d) * H

·Η·Η O O Pj £ CQ fj ε tl) •H £ t— t— Ή £ Cl) ·Η , £ £0) rH S £ S tn d) £ Cl) >, C < W > M M >, £ £ w ·η -- X H H · £ 0) £ H £ :£ £> •H »H d) £ £ ·γ j £ O ,£ £ £ d) £ M *H £ *H £ £ Λί ·Η •H ch t~~ £<D £ ><: Ä O d)r-^ " * > M ίι £ X o o :£ ·Η l d> £· Η · Η OO Pj £ CQ fj ε tl) • H £ t— t— Ή £ Cl) · Η, £ £ 0) rH S £ S tn d) £ Cl)>, C <W> MM>, £ £ w · η - XHH · £ 0) £ H £: £ £> • H »H d) £ £ · γ j £ O, £ £ £ d) £ M * H £ * H £ £ ·ί · Η • H ch t ~~ £ <D £> <: Ä O d) r- ^ "*> M ίι £ X oo: £ · Η ld> £

,¾ O ^ H d) ^ S £ i—I, ¾ O ^ H d) ^ S £ i — I

£ £ ·· rH O tn O£ £ ·· rH O tn O

|H Ph CQ :£ £ £ O| H Ph CQ: £ £ £ O

£ J- £ ^ Λ £ £ -W :£ Qh £ Λ£ J- £ ^ Λ £ £ -W: £ Qh £ Λ

H QJ I :£ :£ S d) £ HH QJ I: £: £ S d) £ H

£1 ·Η H S Ph £ -P ££ 1 · Η H S Ph £ -P £

g £ Hl N -Pg £ Hl N -P

3 ·Η (1) £ b0 £ r-v .h W <H oo oo SU d)T-p, -<-< φ o ^ Λ *> »0 Oj £ tn3 · Η (1) £ b0 £ r-v .h W <H oo oo SU d) T-p, - <- <φ o ^ Λ *> »0 Oj £ tn

£ rH P,dP OOH O rH H· O£ rH P, dP OOH O rH H · O

C λ; Ρ,μ/ .. £ o H v- SC λ; Ρ, μ / .. £ o H v- S

·" £ £ CQ S r- £ oo § Z ,£ cm O w ·Η tn· "£ £ CQ S r- £ oo § Z, £ cm O w · Η tn

Cl :£ ·η W (1) . *h <D H en tn 3 *hCl: £ · η W (1). * h <D H en tn 3 * h

M tn i en ·· * £ £ ζ ,QM tn i en ·· * £ £ ζ, Q

m >, O CQ £ £ rH P £m>, O CQ £ £ rH P £

A >, Otlf O 00 £ zf O £ -h£cQA>, Otlf O 00 £ zf O £ -h £ cQ

•HiHH^ " *> (fl £ <D ·Η ,£ H v_h H £ C toco ,£ d) -H S TD Pj 7) H C d) ·Η coco £ ω £ H £ O "2 £ £| < O. tn d)OPj£££P£ H· OD £ £ H TD d) H £ SI £ -H -H £ £ Q e Φ: io :£S£S£DCÖ£ J4 >,X X Pj *H S H 0,¾ I >, O ^ dJ d) ·Η O tn £ H i W S S TD ^ Λ to en £ O H £0/3 •h tu s £ zr £ £ £ > •O £• HiHH ^ "*> (fl £ <D · Η, £ H v_h H £ C toco, £ d) -H S TD Pj 7) H C d) · Η coco £ ω £ H £ O" 2 £ £ | <O. tn d) OPj £££ P £ H · OD £ £ H TD d) H £ SI £ -H -H £ £ Q e Φ: io: £ S £ S £ DCÖ £ J4>, XX Pj * HSH 0, ¾ I>, O ^ dJ d) · Η O tn £ H i WSS TD ^ Λ to en £ OH £ 0/3 • h tu s £ zr £ £ £> • O £

H rH £ m_/ O z± KtJatJSPj'H £ " SH rH £ m_ / O z ± KtJatJSPj'H £ "S

£ O *H i—1 i—I ·Η ·Η X <C£ O * H i — 1 i — I · Η · Η X <C

£ 2 H o rHrHbOtntn co/3£ 2 H o rHrHbOtntn co / 3

X :£ :£ S dJ C* t- SX: £: £ S dJ C * t- S

•h e e -s. £ o o) V) tn :£ :£ Ph h ·Η " £ >> £ HH«£O^TDN:£ H +j h cm HHPj”TDS££to• h e e -s. £ o o) V) tn: £: £ Ph h · Η "£ >> £ HH« £ O ^ TDN: £ H + j h cm HHPj ”TDS ££ to

tn >, >, Oh £ £ £ QJ QJtn>,>, Oh £ £ £ QJ QJ

C Ή · :£:£W)0h(D d) rH £ SC Ή ·: £: £ W) 0h (D d) rH £ S

·· 6 SE ssa.Qj'-'E^rH.y·· 6 SE ssa.Qj '-' E ^ rH.y

Oh rH ·Η ·Η ·Η £ ·Ρ £Oh rH · Η · Η · Η £ · Ρ £

Cm nö C/DC0 (/) it) e djCm EC C / DC0 (/) it) e dj

Oh > WW £ Λ O TD W 2 ·Η £ 63674 9Oh> WW £ TD O TD W 2 · Η £ 63674 9

Yhdistelmärokotteen valmistusPreparation of a combination vaccine

Esimerkki a H. ingluenzae b-tyypistä saatua PRP:tä ja B. pertussis-anti-geeneja sisältävää yhdistelmärokotetta valmistettiin seuraavasti: 140 mg PPP (valmistettu esimerkin 2 mukaan) liuotetaan 350 ml:aan steriiliä fosfaattipuskuroitua natriumkloridiliuosta (PBS) (0,113 g kaliumfosfaattia, 0,83 g dinatriumfosfaattia ja 8,5 g natriumklori-dia litrassa, pH 7,0, sisältää 0,01 % timerosalia), ja liuos suodatetaan 0,45 pm millipore-suotimella. Tätä väkevää PRP-liuosta (400 pg)ml) käytetään PRP:tä ja B. pertussis-antigeeneja sisältävän yhdistelmärokotteen valmistamiseen.Example a A combination vaccine containing H. ingluenzae type b PRP and B. pertussis antigens was prepared as follows: 140 mg of PPP (prepared according to Example 2) is dissolved in 350 ml of sterile phosphate buffered saline (PBS) (0.113 g of potassium phosphate). 0.83 g of disodium phosphate and 8.5 g of sodium chloride per liter, pH 7.0, contain 0.01% thimerosal), and the solution is filtered through a 0.45 μm Millipore filter. This concentrated PRP solution (400 pg) ml) is used to prepare a combination vaccine containing PRP and B. pertussis antigens.

150 ml:aan väkevää PRP-liuosta (400 pg/ml) lisätään 150 ml tuoretta B. pertussis-solususpensiota (kanta 138) PBS:ssä, pH 7,0 (sameus 149 op-yksikköä soluja/ml) yhdistelmärokotteen varastoliuok-sen valmistamiseksi. Tätä varastoliuosta (300 ml) pidetään 4°C:ssa, kunnes pertussis-endotoksiinitaso on laskenut (vähintään 90 vrk). Steriiliys kokeillaan tioglykolaattiväliaineilla (32-33°C:ssa). varas toliuoksenpH mitataan 90 vrk inkuboinnin jälkeen ja säädetään arvoon pH 7,0-1, Lopullinen tuote (rokote), jota käytetään eläinkokeissa, valmistetaan laimentamalla yhdistelmärokotteen varastolluos PBS:llä siten, että laimennus sisältää 10 μσ PRP:tä ja 3,5 op-yksikköä pertussis-soluja/0,5 ml (annos).To 150 ml of concentrated PRP solution (400 pg / ml) is added 150 ml of a fresh B. pertussis cell suspension (strain 138) in PBS, pH 7.0 (turbidity 149 ECTS cells / ml) to prepare a stock solution of the combination vaccine. . This stock solution (300 ml) is kept at 4 ° C until the pertussis endotoxin level has decreased (at least 90 days). Sterility is tested with thioglycollate media (at 32-33 ° C). The pH of the thief toluene solution is measured 90 days after incubation and adjusted to pH 7.0-1. The final product (vaccine) used in animal experiments is prepared by diluting a stock solution of the combination vaccine with PBS to 10 μσ PRP and 3.5 cr. units of pertussis cells / 0.5 ml (dose).

Yhdistelmärokotteella saatu vasta-ainereaktio nuorilla rotilla on esitetty kuviossa 1 ja 2.The antibody response obtained with the combination vaccine in young rats is shown in Figures 1 and 2.

Esimerkki b PRP:n varastoliuos (400 pg/ml ) valmistetaan liuottamalla 30 mg PRP:tä (valmistettu esimerkin 1 mukaisesti) 75 ml:aan steriiliä fosfaattipuskuroitua natriumkloridiliuosta (PBS) , ja liuos suodatetaan 0,45 pm millipore-suotimella. 25 ml:aan tätä väkevää PFP-liuos-ta lisätään yhtä suuri tilavuusmäärä (so. 25 ml) tuoretta B. pertussis (kanta 138)-solususpensiota PBS:ssä, pH 7,0 (sisältää 149 op-yksikköä soluja/ml) yhdistelmärokotteen varastoliuoksen valmistamiseksi. Tätä varastoliuosta pidetään vähintään 90 vrk 4°C:ssa. Varastoliuoksen steriiliys kokeillaan edellä esitetyllä tavalla tioglykolaattiväliaineilla. Varastoliuksen pH on 7,0-1. Lopullinen, eläinkokeissa käytetty tuote (rokote) valmistetaan laimentamalla yhdistelmärokotteen varastoliuos PBS:llä, siten, että se sisältää 10 pg PRP:tä ja 3,7 op-yksikköä pertussis-soluja/0,5 ml (annos).Example b A stock solution of PRP (400 pg / ml) is prepared by dissolving 30 mg of PRP (prepared according to Example 1) in 75 ml of sterile phosphate buffered saline (PBS), and the solution is filtered through a 0.45 μm Millipore filter. To 25 ml of this concentrated PFP solution is added an equal volume (i.e. 25 ml) of a fresh suspension of B. pertussis (strain 138) cells in PBS, pH 7.0 (containing 149 ECTS cells / ml) of the combination vaccine. to prepare a stock solution. This stock solution is kept for at least 90 days at 4 ° C. The sterility of the stock solution is tested as described above with thioglycollate media. The pH of the storage solution is 7.0-1. The final product used in animal experiments (vaccine) is prepared by diluting the stock solution of the combination vaccine with PBS to contain 10 pg PRP and 3.7 ECTS pertussis cells / 0.5 ml (dose).

10 6367410 63674

Esimerkki cExample c

Valmistetaan PRP-varastoliuos (200 pg/ml) PBS:ään (pH 7,0) samoin kuin esimerkissä b. Pertussis-varastoliuos (sisältää 75 op-yksikköä/ml) valmistetaan laimentamalla 25 ml tuoretta B. pertussis-solususpensiota (149 op-yksikköä) yhtä suurella tilavuudella PBS:ää. Kumpaakin varastoliuosta inkuboidaan erikseen 4°C:ssa 90 vrk tai jonkin verran kauemmin. Yhdistelmärokote valmistetaan ottamalla 14 ml PRP-varastoliuosta (200 pg/ml) ja 14 ml (myrkyttömäksi käsiteltyä) pertussis-varastoliuosta (75 op-yksikköä/ml) ja laimentamalla 112 ml:lla PBS:ää (lopullinen tilavuus 140 ml). Eläinkokeissa käytetty valmis rokote sisältää 10 pg PRP:tä ja 3,7 op-yksikköä pertussis-soluja/0,5 ml (annos).Prepare a PRP stock solution (200 pg / ml) in PBS (pH 7.0) as in Example b. A Pertussis stock solution (containing 75 op units / ml) is prepared by diluting 25 ml of a fresh B. pertussis cell suspension (149 op / ml). units) with an equal volume of PBS. Each stock solution is incubated separately at 4 ° C for 90 days or somewhat longer. The combination vaccine is prepared by taking 14 ml of PRP stock solution (200 pg / ml) and 14 ml of (treated non-toxic) pertussis stock solution (75 ECTS / ml) and diluting with 112 ml of PBS (final volume 140 ml). The finished vaccine used in animal experiments contains 10 pg PRP and 3.7 ECTS pertussis cells / 0.5 ml (dose).

Vasta-aineen muodostus nuorilla rotilla käytettäessä yhdistelmärokotetta nähdään kuviossa 3 ja taulukossa II.Antibody formation in juvenile rats using the combination vaccine is shown in Figure 3 and Table II.

IIII

11 63674 311 63674 3

Sh 3 rö CU +->Sh 3 rö CU + ->

CO COCO CO., LTD

•H•B

«H C«H C

3 33 3

•H•B

o COo CO

<o cu c \ (U 3 nj λ e<o cu c \ (U 3 nj λ e

CHSCHS

3 :3 -H3: 3 -H

+-> ·π I <000 00:3- LO LO 00 | i rs rs rs rs rs rs rs _ O 3 3 T-T-T-t- r^T-T- (β Ό o 3 T- v-+ -> · π I <000 00: 3- LO LO 00 | i rs rs rs rs rs rs rs _ O 3 3 T-T-T-t- r ^ T-T- (β Ό o 3 T- v-

nj 'H -Hnj 'H -H

^ co -μ =^ co -μ =

CU CU COCU CU CO., LTD

i) ps *i ) 3i) ps * i) 3

O 1¾ 3 CUO 1¾ 3 CU

u I Ή ft H CE Ou I Ή ft H CE O

ro 00 o c M X -H ~ ^ B X 3 -, ft ·Η 3 Φ O ·Η I—I ·Η ο ^ > ο -μ Μ ^3 c Ή ~ :γΟ h COvhH ^ _< μ H o 4j CU 6 Ή jj cu -μ m -μ ^ * O -H * « +» > ° '7? H Ή O ^3 I—| c -μ -μ CO CD CN Γ" r-OO ·Ηro 00 oc MX -H ~ ^ BX 3 -, ft · Η 3 Φ O · Η I — I · Η ο ^> ο -μ Μ ^ 3 c Ή ~: γΟ h COvhH ^ _ <μ H o 4j CU 6 Ή jj cu -μ m -μ ^ * O -H * «+»> ° '7? H Ή O ^ 3 I— | c -μ -μ CO CD CN Γ "r-OO · Η

S Λ! CO 00 LOJ-3-3- t^J-r- COS Λ! CO 00 LOJ-3-3- t ^ J-r- CO

O »·κ 3 O r— t— r— t— r— t-* c3- 03O »· κ 3 O r— t— r— t— r— t- * c3- 03

,¾ o CU ·Η V-T-3CU, ¾ o CU · Η V-T-3CU

β 3 -μ 3 3 3 3 ·μ X (3 ·μ r-ί g 3 3 O' Ο- CO CM Μ in r ^3 3 g I ·ΓΟ CM Ot-J-OO O 00 LO (Ο-μ 3 5 33 h— t— h— t— o v- Ή ft H -μ -h v- co o rt CD CO Aiβ 3 -μ 3 3 3 3 · μ X (3 · μ r-ί g 3 3 O 'Ο- CO CM Μ in r ^ 3 3 g I · ΓΟ CM Ot-J-OO O 00 LO (Ο-μ 3 5 33 h— t— h— t— o v- Ή ft H -μ -h v- co o rt CD CO Ai

n 3 3 3 -Hn 3 3 3 -H

Tj > -ro CO 00 LO LO LOLDJ- +JCXTj> -ro CO 00 LO LO LOLDJ- + JCX

"ft I O T- T- O 00 00 OOJ-LO ft Ei"ft I O T- T- O 00 00 OOJ-LO ft No.

Il CU fti T— T-T— T— T- T— t— CU 3Il CU fti T— T-T— T— T- T— t— CU 3

rt X x 3- CUrt X x 3- CU

5 CL, -H 3 {rt I ·Η o :3 3 rt-H> cd oo o oo T-oocn :θ—5 CL, -H 3 {rt I · Η o: 3 3 rt-H> cd oo o oo T-oocn: θ—

m -μ o σΐτ-r-o o cd v- Xm -μ o σΐτ-r-o o cd v- X

WC x-v-v-^-^^OWC x-v-v - ^ - ^^ O

< ·Η X<· Η X

3 CO X3 CO X

rH fti -HrH fti -H

<—l »H ^-ι ·Η •μ I Cu I ><—L »H ^ -ι · Η • μ I Cu I>

3 3 3 3 6 3 Λ Ό CU O3 3 3 3 6 3 Λ Ό CU O

x ο-μο 30 ^ ^ ^ o · > CU 3 ft 3 Ή (U 3 T. X X CO X ω X ooft r—C C 3 C 3 3 C \-r—r w s-' w LO 3x ο-μο 30 ^ ^ ^ o ·> CU 3 ft 3 Ή (U 3 T. X X CO X ω X ooft r — C C 3 C 3 3 C \ -r — r w s- 'w LO 3

CU<ftC3-ft33 rfs •'H -HCU <ftC3-ft33 rfs • 'H -H

E II .ft OO 3 XE II .ft OO 3 X

0 ·η ·η ^ w μ 30 · η · η ^ w μ 3

,Υ ΟΌ h— /-m CD οί .H 3 O, Υ ΟΌ h— / -m CD οί .H 3 O

1 ft -H x 3 Λ en · X ·Η 3 ft · ^ ^ -μ +Jcsi μ co ,y o e ä ft* ex •H COi—I ·Η Y 00 3 6 0-c I 3 3 co 3 γ 3 wp^.HOi-μ·)—i co (¾ 6 3 oo to O, ft O 3 3 ·η3 ω^'^ω^+3 3 ft ή μ +J ·Η ·Η + ·Η ϋ ^ Μ μ 3 ft -ftSHCO—'o-^cO'-' :1 3 3 μ 33 3 μ ιο κ ^ ίο · i<! ο, ο·· ft CU -μ 3 3 3 3 ^-^- 3 ε ν Λ 0003 ιο ΐμ 3 ο μ μ ·η γ ,- m <- γ: CU Υ 3 3ft OhOh ft 3 Dh X Ο Ο 3 ·Η 3 PS Ρί 3 3 Κ οο CUDS μμπ3 ftft 3 Λ Ο Ό1 ft -H x 3 Λ en · X · Η 3 ft · ^ ^ -μ + Jcsi μ co, Yoe ä ft * ex • H COi — I · Η Y 00 3 6 0-c I 3 3 co 3 γ 3 wp ^ .HOi-μ ·) —i co (¾ 6 3 oo to O, ft O 3 3 · η3 ω ^ '^ ω ^ + 3 3 ft ή μ + J · Η · Η + · Η ϋ ^ Μ μ 3 ft -ftSHCO —'o- ^ cO'- ': 1 3 3 μ 33 3 μ ιο κ ^ ίο · i <! Ο, ο ·· ft CU -μ 3 3 3 3 ^ - ^ - 3 ε ν Λ 0003 ιο ΐμ 3 ο μ μ · η γ, - m <- γ: CU Υ 3 3ft OhOh ft 3 Dh X Ο Ο 3 · Η 3 PS Ρί 3 3 Κ οο CUDS μμπ3 ftft 3 Λ Ο Ό

Claims (3)

12 6367412 63674 1. Menetelmä immunologisesti aktiivisen polyribosyyliribito-lifosfaatin (PRP), Haemophilus influenzae b-tyypin kapselipolysakkaridin, eristämiseksi ja puhdistamiseksi, jolloin PRP on saatu fermen-toimalla organismin Haemophilus influenzae b-tyypin kantoja sinänsä tunnetuissa olosuhteissa, minkä jälkeen PRP on eristetty tavanomaisella etanolisaostuksella ja lisäksi sinänsä tunnetulla tavalla heksa-dekyylitrimetyyliammoniumbromidikompleksina, tunnettu siitä, että PRP puhdistetaan lisäämällä hydroksyyliapatiittia /3 Ca3(P04)2 Ca (OK) 2·/ 0,02-M natriumfosfaattipuskurissa pH-arvossa noin 6,7-6,9, sekoittamalla noin 2-10° C:ssa, sentrifugoimalla, ottamalla superna-tantti talteen ja toistamalla sama menettely vähintään kaksi kertaa, suodattamalla supernatantti sopivilla suotimilla, dialysoimalla pyro-geenivapaata, tislattua vettä vastaan ja lyofilisoimalla.A method for isolating and purifying immunologically active polyribosyl ribitophosphate (PRP), a Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide, wherein the PRP is obtained by fermentation of Haemophilus influenzae type b strains under conditions known per se and the PRP is isolated under conventional conditions. as a hexadecyltrimethylammonium bromide complex in a manner known per se, characterized in that the PRP is purified by adding hydroxylapatite / 3 Ca3 (PO4) 2 Ca (OK) 2 · / 0.02-M in sodium phosphate buffer at a pH of about 6.7-6.9, stirring for about 2 At -10 ° C, centrifuging, collecting the supernatant and repeating the same procedure at least twice, filtering the supernatant with suitable filters, dialyzing against pyrogen-free, distilled water and lyophilizing. 2. Menetelmä immunologisesti aktiivisen polyribosyylijribitQli.-______- fosfaatin (PRP) , Haemophilus influenzae b-tyypin kapselipolysakkaridin., eristämiseksi ja puhdistamiseksi, jolloin PRP on saatu fermentoimal- la organismin Haemophilus influenzae b-tyypin kantoja sinänsä tunnetuissa olosuhteissa, minkä jälkeen PRP on eristetty tavanomaisella etanolisaostuksella ja lisäksi sinänsä tunnetulla tavalla heksadekyy-litrimetyyliammoniumbromidikompleksina, tunnettu siitä, että PRP puhdistetaan pylväskromatografoimalla 0,02-M natriumfosfaattipuskurissa pH-arvossa noin 5,8 käyttämällä hydroksyyliapatiittia2. A method for isolating and purifying immunologically active polyribosylribibli-______-phosphate (PRP), a Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide, wherein the PRP is obtained by fermenting Haemophilus influenzae type b strains isolated under conditions known per se, followed by PRP. by conventional ethanol precipitation and also in a manner known per se as hexadecyltrimethylammonium bromide complex, characterized in that the PRP is purified by column chromatography in 0.02 M sodium phosphate buffer at a pH of about 5.8 using hydroxylapatite /3 Ca3 (PO^)2 Ca (OH) 2//eluoimalla 0,02-M ja 0,05-M natriumfosfaattipuskurin asteittaisella gradientilla pH-arvossa noin 5,8, eristämällä fraktiot PRP-analyysin perusteella, dialysoimalla fraktiot pyrogeenivapaata, tislattua vettä vastaan ja lyofilisoimalla./ 3 Ca3 (PO2) 2 Ca (OH) 2 // eluting with a gradual gradient of 0.02-M and 0.05-M sodium phosphate buffer at a pH of about 5.8, isolating fractions by PRP analysis, dialyzing fractions free of pyrogen-free, distilled against water and lyophilization.
FI783269A 1977-10-28 1978-10-26 PROCEDURE FOR INSULATION AND IMMUNOLOGICAL ACTIVATION OF ACTIVE POLYRIBOSYLRIBITOL PHOSPHATE (PRP) FI63674C (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84646677 1977-10-28
US05/846,466 US4196192A (en) 1977-10-28 1977-10-28 Combined Haemophilus influenzae type b and pertussis vaccine
US84648877 1977-12-22
US05/846,488 US4220717A (en) 1977-12-22 1977-12-22 Isolation and purification of polyribosyl ribitol phosphate from Haemophilus influenzae type b.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI783269A FI783269A (en) 1979-04-29
FI63674B true FI63674B (en) 1983-04-29
FI63674C FI63674C (en) 1983-08-10

Family

ID=27126641

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI783269A FI63674C (en) 1977-10-28 1978-10-26 PROCEDURE FOR INSULATION AND IMMUNOLOGICAL ACTIVATION OF ACTIVE POLYRIBOSYLRIBITOL PHOSPHATE (PRP)

Country Status (25)

Country Link
JP (1) JPS5480408A (en)
AR (1) AR218932A1 (en)
AU (1) AU520902B2 (en)
BE (1) BE871586A (en)
CA (1) CA1117866A (en)
CH (1) CH649781A5 (en)
DD (1) DD140701A5 (en)
DE (1) DE2845745A1 (en)
DK (1) DK154327C (en)
ES (1) ES474611A1 (en)
FI (1) FI63674C (en)
FR (1) FR2407000B1 (en)
GB (1) GB2007244B (en)
GR (1) GR73991B (en)
HU (1) HU178166B (en)
IE (1) IE47474B1 (en)
IL (1) IL55433A (en)
IT (1) IT1107570B (en)
NL (1) NL7810753A (en)
NO (1) NO149611C (en)
NZ (1) NZ188211A (en)
PH (1) PH15882A (en)
PL (1) PL210545A1 (en)
SE (1) SE430753B (en)
YU (1) YU250878A (en)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE889979A (en) * 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit PROCESS FOR THE PREPARATION OF PURIFIED ANTIGENIC CAPSULAR BACTERIAL POLYSACCHARIDES, PRODUCTS OBTAINED AND THEIR USE
CA1209036A (en) * 1982-08-20 1986-08-05 Joseph S.C. Kuo Combined haemophilus influenzae and diphtheria, pertussis, tetanus vaccine
US4744982A (en) * 1982-08-24 1988-05-17 Hunter Kenneth W Human monoclonal antibody reactive with polyribosylribitol phosphate
IL98715A0 (en) * 1990-08-13 1992-07-15 American Cyanamid Co Filamentous hemaglutinin of bodetella pertussis as a carrier molecule for conjugate vaccines
HU9400426D0 (en) * 1991-08-16 1994-05-30 Merck & Co Inc Process for converting lipid-containing bacterial capsular polysaccharide into lipid-free polysaccharide

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3395219A (en) * 1964-12-11 1968-07-30 Merck & Co Inc Process for production of pertussis antigen
IL24946A (en) * 1965-01-19 1969-05-28 Merck & Co Inc Process for preparing b. pertussis antigens
US3465078A (en) * 1965-10-21 1969-09-02 Sydney Z Spiesel Method of recovering antigens from bordetella pertussis cells
NL174267B (en) * 1969-05-20 Roussel Uclaf IMPROVEMENT OF THE PROCESS FOR THE PREPARATION OF A SOMATIC ANTIGEN ACCORDING TO DUTCH PATENT 169754 AND PROCESS FOR PREPARING A PHARMACEUTICAL PREPARATION.
US3636192A (en) * 1970-01-13 1972-01-18 Us Army Meningococcal polysaccharide vaccines
FR2253499B1 (en) * 1973-12-10 1977-11-04 Fabre Sa Pierre
DE2461439C3 (en) * 1974-12-24 1980-03-20 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Process for the preparation of a protective antigen from Bordetella pertussis and agent containing the same
US3978209A (en) * 1975-03-24 1976-08-31 Merck & Co., Inc. Endotoxin free meningococcus polysaccharides

Also Published As

Publication number Publication date
FR2407000B1 (en) 1983-01-21
PH15882A (en) 1983-04-13
IE782146L (en) 1979-04-28
AU520902B2 (en) 1982-03-04
PL210545A1 (en) 1980-02-25
FR2407000A1 (en) 1979-05-25
FI783269A (en) 1979-04-29
BE871586A (en) 1979-04-27
DK154327B (en) 1988-11-07
NL7810753A (en) 1979-05-02
AU4108178A (en) 1980-05-01
IL55433A (en) 1982-09-30
NZ188211A (en) 1984-09-28
IT7851621A0 (en) 1978-10-24
AR218932A1 (en) 1980-07-15
DE2845745A1 (en) 1979-05-10
JPS6231694B2 (en) 1987-07-09
CA1117866A (en) 1982-02-09
NO149611B (en) 1984-02-13
IT1107570B (en) 1985-11-25
SE7811192L (en) 1979-04-29
NO783635L (en) 1979-05-02
GB2007244B (en) 1982-03-31
JPS5480408A (en) 1979-06-27
GR73991B (en) 1984-06-06
DK154327C (en) 1989-04-03
DK479578A (en) 1979-04-29
SE430753B (en) 1983-12-12
CH649781A5 (en) 1985-06-14
DE2845745C2 (en) 1987-10-01
IE47474B1 (en) 1984-03-21
HU178166B (en) 1982-03-28
ES474611A1 (en) 1980-01-16
FI63674C (en) 1983-08-10
IL55433A0 (en) 1978-10-31
YU250878A (en) 1983-12-31
DD140701A5 (en) 1980-03-26
NO149611C (en) 1984-05-23
GB2007244A (en) 1979-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4220717A (en) Isolation and purification of polyribosyl ribitol phosphate from Haemophilus influenzae type b.
US4197290A (en) Vaccine
Frommhagen et al. The role of aggregated γ-globulins in the anticomplementary activity of human and animal sera
US4196192A (en) Combined Haemophilus influenzae type b and pertussis vaccine
Ferretti et al. Cross-reactivity of Streptococcus mutans antigens and human heart tissue
US4816253A (en) Novel mutant strain of Listeria monocytogenes and its use in production of IgM antibodies and as an immunotherapeutic agent
US4428931A (en) Bacterial toxoids and gram-negative immune globulin therefrom
US4567041A (en) Mutant strain of Listeria monocytogenes and its use in production of IgM antibodies and as an immunotherapeutic agent
US4488991A (en) Bacterial toxoids and gram-negative immune globulin therefrom
FI63674B (en) FOERFARANDE FOER ISOLERING OCH RENING AV IMMUNOLOGISKT AKTIVT POLYRIBOSYLRIBITOLFOSFAT
Kantor et al. Preparation and antigenicity of M protein released from group A, type 1 streptococcal cell walls by phage-associated lysin
KR100266556B1 (en) Method of separating protective components of bordetella pertussis
IE44943B1 (en) Tumor antigen and process for the preparation thereof
KR970002614B1 (en) Method for removing pertussis endotoxin, a pertussis and its production
EP0080021B1 (en) Haemophilus influenzae type b and pertussis outer membrane component combined vaccine
US3674863A (en) Polyvalent immunizing agents and methods for their production
Salaman The combining properties of vaccinia virus with the antibodies demonstrable in anti-vaccinal serum
US4009257A (en) Preparation of immunosuppressive materials
US4001080A (en) Production of immunological materials
Ushiba et al. Characterization of “Clearance” factor and “Cell-bound” antibody in experimental typhoid
US3208909A (en) Anaerobic process for production of a gel-adsorbed anthrax immunizing antigen
Hunter et al. Response of mice to rabbit Fab′ 2 and Fab′: Thymus independence of IgM response and thymus dependence of IgG response
RU2456996C1 (en) Method for preparing purified cholera toxin b subunit from recombinant strain vibrio cholerae
CA1137901A (en) Isolation of capsular polysaccharide of haemophilus influenzae
Pirtle A Soluble Precipitating Antigen From Hog Cholera Virus Propagated in Tissue Culture: I. Preparation and Characterization of the Antigen

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed

Owner name: AMERICAN CYANAMID COMPANY