CH649781A5 - METHOD FOR PRODUCING A POLYRIBOSYL RIBITOL PHOSPHATE AND A COMBINATION VACCINE CONTAINING THIS. - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Isolierung und Reinigung des antigenen Polysaccharids Polyribosyl-ribi-tol-phosphat (PRP) aus Haemophilus-influenzae-Typ-b-Kul-turen und ein Verfahren zur Herstellung einer Kombinationsvakzine, die PRP- und Bordetella-pertussis-Antigene enthält. Diese Vakzine kann zur Immunisierung gegen Infektionen durch Haemophilus influenzae Typ b, wie Meningitis, verwendet werden. Das PRP ist auch in Verbindung mit anderen nichtpathogenen Stämmen von Bakterien, wie Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, B. punilus und L. plantarum, zur Auslösung einer Antikörperreaktion bei Warmblütern wirksam. The invention relates to methods for isolating and purifying the antigenic polysaccharide polyribosyl-ribotol phosphate (PRP) from Haemophilus influenzae type b cultures and a method for producing a combination vaccine, the PRP and Bordetella pertussis - Contains antigens. This vaccine can be used to immunize against Haemophilus influenzae type b infections, such as meningitis. The PRP is also effective in conjunction with other non-pathogenic strains of bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, B. punilus and L. plantarum to trigger an antibody response in warm-blooded animals.
Das gereinigte Polyribitol-phosphat (PRP) aus Haemophilus influenzae Typ b wird als Schutzimmunogen untersucht. Eine wirksame Antigenreaktion ist jedoch bei jungen Tieren und Kindern noch nicht erreicht worden. Bei dem bekannten Verfahren zur Reinigung werden Ethanol und Hexadecyltri-methylammoniumbromid (Cetavlon) verwendet. Die Verunreinigungen, Endotoxine und pyrogenen Substanzen werden durch Verwendung von kaltem Phenol oder Chloroform und t-Butanol entfernt, die zum Verlust der Antigennatur dieses Polysaccharids führen können. The purified polyribitol phosphate (PRP) from Haemophilus influenzae type b is investigated as a protective immunogen. However, an effective antigen response has not yet been achieved in young animals and children. In the known method for cleaning, ethanol and hexadecyltrimethylammonium bromide (cetavlon) are used. The contaminants, endotoxins and pyrogenic substances are removed by using cold phenol or chloroform and t-butanol, which can lead to the loss of the antigenic nature of this polysaccharide.
Es wurden nun neue Verfahren für die Isolierung und Reinigung von immunologisch aktivem PRP aus Haemophilus influenzae Typ b gefunden. New methods for the isolation and purification of immunologically active PRP from Haemophilus influenzae type b have now been found.
Die noch zu beschreibenden Verfahren haben gegenüber den bekannten Arbeitsweisen eindeutige Vorteile, da alle Verunreinigungen (Nucleinsäuren, Proteine und Endotoxine) durch eine Behandlung mit Hydroxylapatit entfernt werden. Die erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung von PRP führen zu einem Polysaccharid mit höherem Molekulargewicht als die bisher bekannten Verfahren. The processes still to be described have clear advantages over the known working methods, since all impurities (nucleic acids, proteins and endotoxins) are removed by treatment with hydroxyapatite. The processes according to the invention for the production of PRP lead to a polysaccharide with a higher molecular weight than the previously known processes.
Das nach den neuen Verfahren hergestellte PRP ist ausserdem, was noch wichtiger ist, im Gegensatz zu dem nach bekannten Arbeitsweisen hergestellten PRP, für Warmblüter in hohem Masse immunogen. The PRP produced by the new processes is, more importantly, in contrast to the PRP produced according to known procedures, highly immunogenic for warm-blooded animals.
Die Entfernung von Verunreinigungen (Proteinen, Nucleinsäuren und Endotoxinen) des Polysaccharids PRP wird durch Behandlung des teilweise gereinigten Polysaccharids mit einem phosphathaltigen Adsorbens erreicht, das unter den angegebenen Bedingungen das Polysaccharid nicht adsorbiert. The removal of impurities (proteins, nucleic acids and endotoxins) of the polysaccharide PRP is achieved by treating the partially purified polysaccharide with a phosphate-containing adsorbent which does not adsorb the polysaccharide under the specified conditions.
Die weitere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung einer kombinierten PRP-und Pertussis-Vaccine, die bei jungen Tieren in hohem Masse immunogen wirkt. The further object of the invention is to provide a method for producing a combined PRP and pertussis vaccine which has a highly immunogenic effect in young animals.
Die Isolierung und Reinigung von Polyribosylribitolphosphat, dem Hüllenpolysaccharid von Haemophilus influenzae Typ b, erfolgt erfindungsgemäss nach dem Verfahren der Ansprüche 1 und 4. Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. The isolation and purification of polyribosyl ribitol phosphate, the shell polysaccharide of Haemophilus influenzae type b, is carried out according to the invention by the method of claims 1 and 4. Preferred embodiments of the invention are described below.
Organismen, Züchtungsmedium und Kultur Organisms, culture medium and culture
Es werden vorzugsweise zwei Stämme von Haemophilus There are preferably two strains of Haemophilus
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influenzae Typ b verwendet. Der Rab-Stamm ist seit längerer Zeit bekannt und frei zugänglich, wie u.a. aus The Journal of Immunology 107 (1971), 1071-1080 und Infection and Immu-nity 13 (1976), 581-589, insbesondere aus der Bezugnahme auf frühere, veröffentlichte Studien mit demselben Stamm, hervorgeht. Zusätzlich ist er bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 (USA) unter der Nr. ATCC 31512 hinterlegt worden. Im vorliegenden Fall ist der Stamm von Grace Leidy, Babies Hospital, Columbia University, 630 West 168 Street, New York, NY 10032 (USA) erhalten worden. Der CK-Stamm ist am 3. Oktober 1978 bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 31441 hinterlegt worden. Dieser Stamm ist von einem Patienten im Waterbury Hospital, Waterbury (CT, USA) isoliert worden. influenzae type b used. The Rab tribe has been known for a long time and is freely accessible, e.g. from The Journal of Immunology 107 (1971), 1071-1080 and Infection and Immunity 13 (1976), 581-589, in particular from the reference to previous, published studies with the same strain. He has also been deposited with the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 (USA) under the number ATCC 31512. In the present case, the strain was obtained from Grace Leidy, Babies Hospital, Columbia University, 630 West 168 Street, New York, NY 10032 (USA). The CK strain was deposited on October 3, 1978 with the American Type Culture Collection under the number ATCC 31441. This strain has been isolated from a patient at Waterbury Hospital, Waterbury (CT, USA).
Die Organismen werden mehreren Passagen durch Mäuse unterworfen, um ihre Virulenz zu gewährleisten. Sie werden bei der Autopsie aus dem Gehirngewebe von Mäusen isoliert, und zu ihrer Weiterzüchtung wird eines der folgenden Medien verwendet: 3,7prozentiges Gehirnherzinfusions-(BHI) (Difco Lab., Detroit, Mich.)-Medium oder 5prozentiger BHI-Agar, ergänzt durch 0,01% Nicotinamid-Adenin-Dinu-cleotid (NAD) (P-L Biochemicals, Milwaukee, Wis.) und 1% (Volumen/Volumen) defibriniertes Pferdeblut (Animal Blood Center, Syracuse, N.Y.). Zur Weiterzüchtung werden Anteile von 1 ml auf Ampullen verteilt, lyophilisiert und bei — 70 °C gelagert. The organisms are subjected to several passages through mice to ensure their virulence. They are isolated from mouse brain tissue at autopsy and used to grow them using one of the following media: 3.7% Brain Cardiac Infusion (BHI) (Difco Lab., Detroit, Mich.) Medium or 5% BHI agar supplemented Horse blood defibrinated by 0.01% nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) (PL Biochemicals, Milwaukee, Wis.) and 1% (volume / volume) (Animal Blood Center, Syracuse, NY). For further cultivation, 1 ml portions are distributed to ampoules, lyophilized and stored at -70 ° C.
Für die Züchtung der Organismen verwendetes Grundmedium ist 3,7prozentiges BHI. Das Grundmedium wird mit 10 mg NAD und 20 mg Hemin (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) je Liter ergänzt. Je 50 ml Impfkultur wird 1% (Volumen/Volumen) defibriniertes Pferdeblut zugesetzt. Die Ergänzungsstoffe werden frisch zubereitet und durch eine 0,45 |j. Nalgene-Filter-Einheit (Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y.) vor Verwendung filtriert. Für die Züchtung des Organismus in einem 14-1-Fermentationsgefäss wird das Medium ausserdem noch mit 0,5% Glucose ergänzt. The basic medium used for the cultivation of the organisms is 3.7 percent BHI. The base medium is supplemented with 10 mg NAD and 20 mg hemin (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) per liter. 1% (volume / volume) defibrinated horse blood is added to each 50 ml inoculum. The supplements are freshly prepared and a 0.45 | j. Nalgene filter unit (Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y.) filtered before use. The medium is also supplemented with 0.5% glucose for growing the organism in a 14-1 fermentation vessel.
Zur Herstellung von Organismen zum Impfen wird 1 ml gefrorene Stammkultur aufgetaut und zu 50 ml des angereicherten BHI-Mediums, das mit defibriniertem Pferdeblut und NAD ergänzt ist, gegeben. Die Kultur wird 8 Stunden bei 37 °C auf einer Rundschüttelvorrichtung mit 150 Umdrehungen/Minute gezüchtet. Die Organismen werden als lprozenti-ges Inokulum zu Anteilen von je 500 ml des angereicherten BHI-Mediums in 2-1-Kolben gegeben, die dann bei 37 °C unter mässigem Schütteln auf einer Rundschüttelvorrichtung 8 Stunden (zur Isolierung von PRP) oder 14 Stunden (als Saatkulturen) inkubiert werden. Die Fermentation eines jeden Anteils in einem 14-1-Fermentationsgefäss wird durch aseptische Überführung von 700 ml der Saatkultur zu 71 des angereicherten BHI-Mediums, das mit Hemin anstelle von defibriniertem Pferdeblut ergänzt ist, eingeleitet. Die Kultur wird ständig bei 37+ I °C gehalten. Unter Rühren mit 150 Umdrehungen/Minute wird ein Luftstrom von 0,25 1 Luft je Liter Medium und Minute aufrechterhalten. Während der Züchtung werden 0,001% eines Siliconentschäumers (FD-82, Hodag Chemical Corp.) je nach Bedarf zugegeben. Die Züchtung der Kulturen wird fortgesetzt, bis nur noch exponentielles Wachstum (8 bis 10 x 109 lebende Zellen/ml) erfolgt, gewöhnlich etwa 8 Stunden, und dann wird die Züchtung durch Zugabe von 0,4% Formaldehyd und Stehenlassen über Nacht bei 4 °C beendet. To prepare organisms for vaccination, 1 ml of frozen stock culture is thawed and added to 50 ml of the enriched BHI medium, which is supplemented with defibrinated horse blood and NAD. The culture is grown for 8 hours at 37 ° C on a rotary shaker at 150 revolutions / minute. The organisms are added as a 1% inoculum to 500 ml portions of the enriched BHI medium in 2-1 flasks, which are then at 37 ° C with moderate shaking on a rotary shaker for 8 hours (to isolate PRP) or 14 hours (as seed cultures) are incubated. The fermentation of each portion in a 14-1 fermentation vessel is initiated by aseptically transferring 700 ml of the seed culture to 71 of the enriched BHI medium supplemented with hemin instead of defibrinated horse blood. The culture is kept constantly at 37+ I ° C. An air flow of 0.25 l of air per liter of medium and minute is maintained with stirring at 150 revolutions / minute. During growth, 0.001% of a silicone defoamer (FD-82, Hodag Chemical Corp.) is added as needed. Culturing continues until only exponential growth (8 to 10 x 109 living cells / ml) occurs, usually about 8 hours, and then cultivation is accomplished by adding 0.4% formaldehyde and allowing to stand overnight at 4 ° C ended.
Isolierung von Polyribosyl-ribitol-phosphat (PRP) Isolation of polyribosyl ribitol phosphate (PRP)
Die wie oben beschrieben erhaltene Maische wird bei 4 °C 30 Minuten bei 27 000-g zentrifugiert. Die zellfreie überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und folgendermassen behandelt: The mash obtained as described above is centrifuged at 4 ° C. for 30 minutes at 27,000 g. The cell-free supernatant liquid is separated off and treated as follows:
Stufe 1, Ethanolfällung Level 1, ethanol precipitation
Die überstehende Flüssigkeit der Kultur wird bis zu einer Endkonzentration von 4% mit Natriumacetat versetzt. Nach Einstellen des pH-Werts der Lösung auf 6,0 bis 6,2 werden 44 1 3A-Ethanol unter kräftigem Rühren bei 4 °C langsam zugegeben. Die Mischung wird mit Eisessig auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und dann 12 Stunden bei 3 ° C stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wird durch Dekantieren und Zentrifugieren gewonnen, wodurch rohes PRP erhalten wird. The supernatant liquid of the culture is mixed with sodium acetate to a final concentration of 4%. After adjusting the pH of the solution to 6.0 to 6.2, 44 1 3A ethanol are slowly added with vigorous stirring at 4 ° C. The mixture is adjusted to a pH of 6.8 with glacial acetic acid and then left to stand at 3 ° C. for 12 hours. The precipitate formed is obtained by decanting and centrifuging, whereby crude PRP is obtained.
Stufe 2, Behandlung mit Hexadecyltrimethylammonium-bromid (Cetavlon) Stage 2, treatment with hexadecyltrimethylammonium bromide (Cetavlon)
Der nach Stufe 1 erhaltene Niederschlag wird in pyrogen-freiem destilliertem Wasser gelöst und zur Entfernung des Rückstands zentrifugiert. Die klare braune Lösung wird dann langsam zu 100 ml einer lOprozentigen wässrigen Lösung von Hexadecyltrimethylammoniumbromid bis zu einer Endkonzentration von 0,5% unter Vermischen gegeben. Die Mischung wird 1 Stunde gerührt und dann zentrifugiert. Der Niederschlag aus Nucleinsäuren und PRP-Hexadecyltrime-thylammoniumbromid-Komplex wird mit 2 1300 mM Natriumchlorid vermischt. Die trübe Lösung wird zur Entfernung unlöslicher Stoffe, wie der Nuclein-Hexadecyltrimethylam-moniumbromid-Salze zentrifugiert. The precipitate obtained after step 1 is dissolved in pyrogen-free distilled water and centrifuged to remove the residue. The clear brown solution is then slowly added to 100 ml of a 10% aqueous solution of hexadecyltrimethylammonium bromide to a final concentration of 0.5% with mixing. The mixture is stirred for 1 hour and then centrifuged. The precipitate of nucleic acids and PRP-hexadecyltrimethylammonium bromide complex is mixed with 2 1300 mM sodium chloride. The cloudy solution is centrifuged to remove insoluble substances such as the nuclein-hexadecyltrimethylam monium bromide salts.
Die überstehende Flüssigkeit wird mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt, wodurch das PRP-Hexadecyltri-methylammoniumbromid-Salz ausfällt. Die Mischung wird 1 Stunde gerührt, und der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen und dann in 2 1300 mM Natriumchloridlösung gelöst. The supernatant liquid is diluted with an equal volume of water, causing the PRP-hexadecyltrimethylammonium bromide salt to precipitate. The mixture is stirred for 1 hour and the precipitate is collected by centrifugation and then dissolved in 2 1300 mM sodium chloride solution.
Stufe 3, Freisetzung des PRP aus dem Komplex Stage 3, release of the PRP from the complex
Hexadecyltrimethylammoniumbromid und die verunreinigenden Nucleinsäuren und Proteine werden durch wenigstens zweimalige Ethanolfällung weiter entfernt. Das PRP wird, wie in Stufe 1 beschrieben, gefällt, während Hexadecyl-trimethylammoniumbromid in der alkoholischen Lösung gelöst wird. Das PRP wird abzentrifugiert, in 21 pyrogen-freiem destillierten Wasser gelöst und dann wie oben beschrieben wieder gefällt. Der schliesslich erhaltene PRP-Niederschlag wird in 20 millimolarem Natriumphosphat, pH 6,8, gelöst. Hexadecyltrimethylammonium bromide and the contaminating nucleic acids and proteins are further removed by ethanol precipitation at least twice. The PRP is precipitated as described in Step 1, while hexadecyl trimethylammonium bromide is dissolved in the alcoholic solution. The PRP is centrifuged off, dissolved in 21 pyrogen-free distilled water and then precipitated again as described above. The PRP precipitate finally obtained is dissolved in 20 millimolar sodium phosphate, pH 6.8.
Stufe 4, Hydroxylapatit-Behandlung Stage 4, hydroxyapatite treatment
Die Verunreinigungen (zum Beispiel Nucleinsäuren, Proteine und Endotoxine) in den teilweise gereinigten PRP-Prä-paraten werden selektiv durch Adsorption an einem Calcium-phosphat enthaltenden Adsorbens, nämlich Hydroxylapatit 3Ca3(P04)2-Ca(0H)2, entfernt. The impurities (for example nucleic acids, proteins and endotoxins) in the partially purified PRP preparations are selectively removed by adsorption on an adsorbent containing calcium phosphate, namely hydroxylapatite 3Ca3 (P04) 2-Ca (0H) 2.
Die erfindungsgemässe Verbesserung ist in den Ansprüchen 1 und 4 definiert. The improvement according to the invention is defined in claims 1 and 4.
Die Erfindung beruht also auf der Wahrnehmung, dass das Polysaccharid PRP durch das Calciumphosphatadsor-bens, das Phosphatpuffer (20 mM) mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0 bzw. 5,8 enthält, im Gegensatz zu den Verunreinigungen, wie Nucleinsäure, Proteinen und Endotoxinen, unter diesen Bedingungen nicht adsorbiert wird. Das erfindungsgemässe Verfahren kann absatzweise oder im Säulenbetrieb durchgeführt werden. The invention is thus based on the perception that the polysaccharide PRP contains calcium phosphate adsorbent, which contains phosphate buffer (20 mM) with a pH of 6.5 to 7.0 or 5.8, in contrast to the impurities, such as nucleic acid, proteins and endotoxins, is not adsorbed under these conditions. The method according to the invention can be carried out batchwise or in column operation.
Beim absatzweisen Arbeiten wird der Hydroxylapatit zu dem teilweise gereinigten PRP-Präparat (in 20 mM Phosphat, pH z.B. 6,9) gegeben. Nach gründlichem Vermischen wird zur Entfernung nicht erwünschter Feststoffe (Adsorbens und die daran adsorbierten Verunreinigungen) zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise wenigstens zwei weitere Male unterworfen. Die erhaltene Lösung wird durch Milliporfilter filtriert, gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. When working in batches, the hydroxyapatite is added to the partially cleaned PRP preparation (in 20 mM phosphate, pH e.g. 6.9). After thorough mixing, centrifugation is carried out to remove unwanted solids (adsorbent and the impurities adsorbed thereon). The supernatant fluid is subjected to the procedure described above at least two more times. The solution obtained is filtered through Millipor filter, dialyzed against pyrogen-free distilled water and lyophilized.
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Beim Säulenbetrieb wird das teilweise gereinigte PRP in 20 mM Phosphatpuffer (pH 5,8) auf eine Säule aufgegeben, die das Adsorbens Hydroxylapatit enthält, das mit 20 mM Phosphatpuffer, pH 5,8, equilibriert worden ist, und mit einem stufenweise abgeänderten Natriumphosphatpuffer (pH 5,8) von 20 mM bis 100 mM eluiert. Die aufgefangenen Fraktionen werden auf Pentose (Polyribosylribitolphosphat) geprüft. Diejenigen Fraktionen, die bezüglich Pentose positiv sind, werden gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialy-siert und lyophilisiert. During column operation, the partially purified PRP in 20 mM phosphate buffer (pH 5.8) is applied to a column containing the hydroxylapatite adsorbent, which has been equilibrated with 20 mM phosphate buffer, pH 5.8, and with a step-wise modified sodium phosphate buffer ( pH 5.8) from 20 mM to 100 mM. The collected fractions are checked for pentose (polyribosyl ribitol phosphate). Those fractions which are positive for pentose are dialyzed against pyrogen-free distilled water and lyophilized.
Zur Herstellung einer PRP-Vakzine kann wie oben beschrieben hergestelltes lyophilisiertes PRP in einer Konzentration von 20 Lig/ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (0,113 g Kaliumdiphosphat, 0,83 g Dinatriumphosphat und 8,5 g Natriumchlorid pro Liter, pH 7,0, enthaltend 0,01% Thimerosal) gelöst werden. Die Vakzine wird durch 0,45-ji-Milliporfiltereinheiten steril filtriert, in Glasphiolen eingebracht und bei 4 °C gelagert. To prepare a PRP vaccine, lyophilized PRP prepared as described above at a concentration of 20 lig / ml in phosphate-buffered saline (PBS) (0.113 g potassium diphosphate, 0.83 g disodium phosphate and 8.5 g sodium chloride per liter, pH 7.0) containing 0.01% thimerosal). The vaccine is sterile filtered through 0.45-ji Millipor filter units, placed in glass vials and stored at 4 ° C.
Die Verfahren zur Herstellung einer Kombinationsvakzine aus PRP aus Haemophilus influenzae Typ b und Borde-tella-pertussis-Antigenen sind in den Ansprüchen 9 und 10 definiert. Vorzugsweise wird eine konzentrierte Lösung des PRP durch Lösen abgewogener vorbestimmter Mengen des Polysaccharids in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (0,113 g Kaliumdiphosphat, 0,83 g Dinatriumphosphat und 8,5 g Natriumchlorid pro Liter, pH 7,0, enthaltend 0,01% Thimerosal) hergestellt. Diese konzentrierte Lösung von PRP wird dann mit frischen Bordetella-pertussis-Zellsuspensionen vermischt, wodurch die Stammlösung erhalten wird. Die Kennzeichen von B. pertussis Stamm 138 sind in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, VIII, Herausgeber Buchanan and Gibbons, WMS and Wilkins Co., Maryland, USA, 1974, auf Seite 283 angegeben. Dieser Stamm ist bei der American Type Culture Collection, Maryland, V.St.A. unter der Hinterlegungsnummer ATCC 10380 erhältlich. Die Kombinationsvakzine in dieser Stammlösung enthält 200 ug PRP und etwa 70 Opacitätseinheiten (op) Zellen/ml. Die Stammlösung wird zur Enttoxifizierung von Pertussis-Antigenen 90 Tage bei 4 °C stehengelassen, ehe das fertige Produkt (Vakzine) hergestellt wird, das 10 (ig PRP und 3,5-op-Einheiten Pertussis-Zellen/0,5 ml Dosis enthält. The methods for producing a combination vaccine from PRP from Haemophilus influenzae type b and Borde-tella pertussis antigens are defined in claims 9 and 10. Preferably, a concentrated solution of the PRP is obtained by dissolving weighed predetermined amounts of the polysaccharide in phosphate buffered saline (PBS) (0.113 g potassium diphosphate, 0.83 g disodium phosphate and 8.5 g sodium chloride per liter, pH 7.0, containing 0.01% thimerosal ) produced. This concentrated solution of PRP is then mixed with fresh Bordetella pertussis cell suspensions, whereby the stock solution is obtained. The characteristics of B. pertussis strain 138 are given in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, VIII, editor Buchanan and Gibbons, WMS and Wilkins Co., Maryland, USA, 1974, on page 283. This strain is from the American Type Culture Collection, Maryland, V.St.A. available under the accession number ATCC 10380. The combination vaccine in this stock solution contains 200 µg PRP and about 70 opacity units (op) cells / ml. The stock solution is left to detoxify pertussis antigens at 4 ° C for 90 days before the finished product (vaccine) is prepared, which contains 10 (ig PRP and 3.5 op units of pertussis cells / 0.5 ml dose) .
Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert. The invention is further illustrated by the following examples.
Beispiel 1 example 1
2,5 g Hydroxylapatit (z.B. Bio. Gel HTP, Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.) werden zu 250 ml teilweise gereinigten PRP-Präparaten (nach Hexadecyltrimethylammonium- 2.5 g of hydroxyapatite (e.g. Bio.Gel HTP, Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.) Are made into 250 ml partially cleaned PRP preparations (according to hexadecyltrimethylammonium
bromid- und Ethanolbehandlungen), die etwa 1,0 mg PRP/ml enthalten, in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,9, gegeben und 1 Stunde in einem eiskalten Wasserbad (1 bis 4 °C) vermischt. Die Mischung wird im Sorvall RC2-B 30 Minuten 5 bei 1600-g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dann durch ein 0,65-u-Milliporfilter geleitet und zwei weitere Male der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise unterworfen, wobei jedes Mal mit 2,5 g Hydroxylapatit behandelt wird. Die erhaltene Lösung wird durch 0,65 Li und 0,45 u. Millo liporfilter filtriert, gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt zeigt eine starke immunogene Wirksamkeit (vgl. weiter unten, Kombinationsvakzine und Tierversuch) und enthält nur äusserst wenig Verunreinigungen, wie Nucleinsäuren, Proteine 15 und Endotoxine (vgl. Tabelle I). Es werden etwa 170 mg lyophilisiertes PRP erhalten, was etwa 70% des eingesetzten Polysaccharids entspricht. Das PRP muss unter geeigneten Bedingungen, zum Beispiel bei 4 ° C, in einem Exsikkator über Phosphorpentoxid und Kieselgel gelagert werden. bromide and ethanol treatments) containing about 1.0 mg PRP / ml, placed in 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.9, and mixed for 1 hour in an ice-cold water bath (1 to 4 ° C). The mixture is centrifuged in the Sorvall RC2-B for 30 minutes at 1600 g. The supernatant is then passed through a 0.65 µ millipore filter and subjected to the procedure described above two more times, each time treating with 2.5 g of hydroxyapatite. The solution obtained is by 0.65 Li and 0.45 u. Millo liporfilter filtered, dialyzed against pyrogen-free distilled water and lyophilized. The lyophilized product shows a strong immunogenic activity (see below, combination vaccine and animal experiments) and contains only very few impurities, such as nucleic acids, proteins 15 and endotoxins (see Table I). About 170 mg of lyophilized PRP are obtained, which corresponds to about 70% of the polysaccharide used. The PRP must be stored under suitable conditions, for example at 4 ° C, in a desiccator over phosphorus pentoxide and silica gel.
20 20th
Beispiel 2 Example 2
Ein teilweise gereinigtes PRP mit einem PRP-Gehalt von 300 mg wird in 100 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,8 (d.h. 3 mg PRP/ml) gelöst. Diese Lösung wird bei Zim-25 mertemperatur auf eine Säule (5,0 x 45 cm) Hydroxylapatit (Bettvolumen etwa 250 ml, mit 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,8, equilibriert) aufgegeben und mit 20 mM, 50 mM und 100 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,8, eluiert. Die mit 20 mM und 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 5,8) eluier-3o ten Fraktionen (200 ml), die pentosepositiv sind (Pentosebestimmung nach der Orcin-Methode) erhaltenen Fraktionen werden gegen pyrogenfreies destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Es werden etwa 206 mg lyophilisiertes Produkt, PRP, erhalten. A partially purified PRP with a PRP content of 300 mg is dissolved in 100 ml of 20 mM sodium phosphate buffer, pH 5.8 (i.e. 3 mg PRP / ml). This solution is applied at room temperature to a column (5.0 × 45 cm) of hydroxyapatite (bed volume approximately 250 ml, equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 5.8) and with 20 mM, 50 mM and 100 mM sodium phosphate buffer , pH 5.8, eluted. The fractions obtained with 20 mM and 50 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8) eluting 3o fractions (200 ml) which are pentose positive (pentose determination according to the orcin method) are dialyzed against pyrogen-free distilled water and lyophilized. About 206 mg of lyophilized product, PRP, are obtained.
35 Die Reinheit des Polysaccharids PRP wird durch Bestimmung des Masses der Verunreinigung mit Nucleinsäuren, Proteinen und Endotoxinen geprüft. Die Proteinkonzentration wird nach der Methode von Lowry et al. in J. Biol. 35 The purity of the polysaccharide PRP is checked by determining the degree of contamination with nucleic acids, proteins and endotoxins. The protein concentration is determined by the method of Lowry et al. in J. Biol.
Chem. 193:265 (1951) mit Rinderserumalbumin als Standard 40 ermittelt. Nucleinsäure wird durch die Absorption der PRP-Lösung bei 260 nm bestimmt. Die Absorption von 50 ug Nucleinsäure in 1 ml Wasser in einer Zelle mit einem Lichtweg von 1 cm wird 1,0 gleichgesetzt. Das Molekulargewicht wird mittels Sepharose 4B- oder 2B-Gelfiltration an Säulen 45 von 1,5 x 90 cm (Pharmacia-Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) ermittelt. Die Werte des Verteilungskoeffizienten (Kd) werden aus dem durch die Orcinreaktion (Herbert et al., Methods in Microbiology, Bd. 5B, 285-291) entwickelten Elu-tionsbild berechnet. Chem. 193: 265 (1951) with bovine serum albumin as standard 40. Nucleic acid is determined by the absorption of the PRP solution at 260 nm. The absorption of 50 µg of nucleic acid in 1 ml of water in a cell with a light path of 1 cm is equated to 1.0. The molecular weight is determined by means of Sepharose 4B or 2B gel filtration on columns 45 of 1.5 × 90 cm (Pharmacia-Fine Chemicals, Piscataway, N.J.). The values of the distribution coefficient (Kd) are calculated from the elution image developed by the orcin reaction (Herbert et al., Methods in Microbiology, Vol. 5B, 285-291).
Tabelle 1 Table 1
Physikalisch-chemische Eigenschaften von PRP Physico-chemical properties of PRP
Prüfung Endotoxin Testing endotoxin
Arbeitsweise Mol. Grösse (Kd) Pentose (%) Nucleinsäure (%) Protein (%) Kaninchen-Pyrogen- Limulus-Lysat-Testd Mode of operation Mol. Size (Kd) Pentose (%) Nucleic acid (%) Protein (%) Rabbit Pyrogen Limulus Lysate Testd
Testc Testc
Beispiel 1 0a 36,0 0,8 0,7 10,0 lAoo Example 1 0a 36.0 0.8 0.7 10.0 laoo
Beispiel 2 0,44b 33,8 0,3 0,7 10,0 '/iooo a Unter Verwendung von Sepharose 2B und 4B, Molekulargewicht 2 x 107. Example 2 0.44b 33.8 0.3 0.7 10.0 '/ iooo a Using Sepharose 2B and 4B, molecular weight 2 x 107.
b Unter Verwendung von Sepharose 4B. b Using Sepharose 4B.
c jj.g PRP/kg Körpergewicht (Kaninchen), die kein Fieber verursachen. c jj.g PRP / kg body weight (rabbits) that do not cause a fever.
d Reziproke Verdünnung von PRP (100 ug PRP/ml) verglichen mit Bureau of Biologics El (Endotoxin-Standard). d Reciprocal dilution of PRP (100 µg PRP / ml) compared to Bureau of Biologics El (endotoxin standard).
Beispiel 1 bezieht sich auf die Merkmale von Haemophilus influenzae Typ b CK-Stamm, ACC 31441. Example 1 relates to the characteristics of Haemophilus influenzae type b CK strain, ACC 31441.
Beispiel 2 bezieht sich auf die Merkmale von Haemophilus influenzae Typ b Rab-Stamm, erhältlich von Babies Hosp. Columbia Univ. New York, N.Y., USA. Example 2 relates to the characteristics of Haemophilus influenzae type b Rab strain available from Babies Hosp. Columbia Univ. New York, N.Y., USA.
5 5
649 781 649 781
Beispiel 3 Example 3
Eine Kombinationsvakzine, die PRP aus H. influenzae Typ b und B.-pertussis-Antigenen enthält, wird folgendermas-sen hergestellt: 140 mg PRP (wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt) werden in 350 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (0,113 g Kaliumdiphosphat, 0,83 g Dinatriumphosphat und 8,5 g Natriumchlorid pro Liter, pH 7,0, enthaltend 0,01% Thimerosal) gelöst und durch 0,45-u-Millipor-filter filtriert. Diese konzentrierte PRP-Lösung (400 ug/ml) wird zur Herstellung einer Kombinationsvakzine verwendet, die aus PRP- und B.-pertussis-Antigenen besteht. A combination vaccine containing PRP from H. influenzae type b and B. pertussis antigens is prepared as follows: 140 mg PRP (prepared as described in Example 2) are in 350 ml sterile phosphate buffered saline (PBS) (0.113 g Potassium diphosphate, 0.83 g disodium phosphate and 8.5 g sodium chloride per liter, pH 7.0, containing 0.01% thimerosal) dissolved and filtered through 0.45 u Millipor filter. This concentrated PRP solution (400 µg / ml) is used to make a combination vaccine consisting of PRP and B. pertussis antigens.
150 ml der konzentrierten PRP-Lösung (400 |ig/ml) werden mit 150 ml einer frischen Zellsuspension von B. pertussis (Stamm 138) in PBS, pH 7,0 (enthaltend 149 Opacitäts(op)-Einheitszellen/ml) versetzt, wodurch die Stammlösung der Kombinationsvakzine erhalten wird. Diese Stammlösung, 300 ml, wird bei 4 ° C gehalten, bis der Endotoxingrad von Pertussis vermindert ist (wenigstens 90 Tage). Die Sterilität der Stammlösung wird mit Thioglycollatmedien bei 32 bis 33 °C geprüft. Der pH-Wert der Stammlösung nach einer Inkubation von 90 Tagen wird geprüft und auf 7,0+ 1 eingestellt. Das für Tierversuche verwendete Fertigprodukt (Vakzine) 150 ml of the concentrated PRP solution (400 μg / ml) are mixed with 150 ml of a fresh cell suspension of B. pertussis (strain 138) in PBS, pH 7.0 (containing 149 opacity (op) unit cells / ml), whereby the stock solution of the combination vaccine is obtained. This stock solution, 300 ml, is kept at 4 ° C until the degree of endotoxin of pertussis is reduced (at least 90 days). The sterility of the stock solution is checked with thioglycollate media at 32 to 33 ° C. The pH of the stock solution after an incubation of 90 days is checked and adjusted to 7.0 + 1. The finished product used for animal testing (vaccine)
wird durch Verdünnen der vereinigten Stammlösung mit PBS hergestellt und enthält 10 ug PRP und 3,5 op-Einheiten Per-tussiszellen/0,5 ml (dosis). is prepared by diluting the combined stock solution with PBS and contains 10 µg PRP and 3.5 op units per-tussis cells / 0.5 ml (dose).
Die Ergebnisse der Antikörperreaktion auf diese Kombinationsvakzine bei jungen Ratten sind in den Fig. 1 und 2 wiedergegeben. The results of the antibody response to this combination vaccine in young rats are shown in FIGS. 1 and 2.
Beispiel 4 Example 4
Die Stammlösung von PRP (400 jig/ml) wird durch Auflösen von 30 mg des wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten PRP in 75 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Filtrieren durch 0,45-ji-Milliporfïlter hergestellt. Zu 25 ml dieser konzentrierten PRP-Lösung wird ein gleiches Volumen, d.h. 25 ml Frischzellensuspension von B. pertussis 5 (Stamm 138) in PBS, pH 7,0 (enthaltend 149 op-Einheiten Zellen/ml) gegeben, wodurch die Stammlösung der Kombinationsvakzine erhalten wird. Diese Stammlösung (50 ml) wird wenigstens 90 Tage bei 4 °C stehengelassen. Die Sterilität der Stammlösung wird wie oben erwähnt, mit Thioglykol-io latmedien geprüft. Der pH-Wert der Stammlösung beträgt 7,0+1. Das für Tierversuche verwendete Fertigprodukt (Vakzine) wird durch Verdünnen der Kombinationsstammlösung mit PBS hergestellt und enthält 10 jxg PRP und 3,7 op-Einhei-ten Pertussiszellen/0,5 ml (Dosis). The stock solution of PRP (400 jig / ml) is prepared by dissolving 30 mg of the PRP prepared as described in Example 1 in 75 ml of sterile phosphate-buffered saline (PBS) and filtering through 0.45-ji millipore filters. To 25 ml of this concentrated PRP solution, an equal volume, i.e. 25 ml fresh cell suspension of B. pertussis 5 (strain 138) in PBS, pH 7.0 (containing 149 op-units cells / ml), whereby the stock solution of the combination vaccine is obtained. This stock solution (50 ml) is left to stand at 4 ° C for at least 90 days. The sterility of the stock solution is checked with thioglycol-io latmedien as mentioned above. The pH of the stock solution is 7.0 + 1. The finished product (vaccine) used for animal experiments is prepared by diluting the combination stock solution with PBS and contains 10 jxg PRP and 3.7 op units of pertussis cells / 0.5 ml (dose).
15 15
Beispiel 5 Example 5
Die PRP-Stammlösung (200 ug/ml in PBS, pH 7,0) wird wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Die Pertussisstamm-lösung (enthaltend 75 op-Einheiten/ml) wird durch Verdün-20 nen von 25 ml Frischzellensuspension von B. pertussis (149 op-Einheiten/ml) mit einem gleichen Volumen PBS hergestellt. Beide Stammlösungen werden voneinander getrennt 90 Tage oder etwas länger bei 4 °C inkubiert. Die Kombinationsvakzine wird unter Verwendung von 14 ml PRP-Stamm-25 lösung (200 (ig/ml), 14 ml (enttoxifizierter) Stammlösung von Pertussis-Antigenen (75 op-Einheiten/ml) und 112 ml PBS hergestellt (Endvolumen 140 ml). Diese für Tierversuche verwendete Vakzine enthält 10 [ig PRP und 3,7 op-Einheiten B. pertussis/0,5 ml (Dosis). The PRP stock solution (200 µg / ml in PBS, pH 7.0) is prepared as described in Example 4. The pertussis stock solution (containing 75 op units / ml) is prepared by diluting 20 ml fresh cell suspension of B. pertussis (149 op units / ml) with an equal volume of PBS. Both stock solutions are incubated separately at 90 ° C for 90 days or a little longer. The combination vaccine is prepared using 14 ml PRP stock solution (200 (ig / ml), 14 ml (detoxified) stock solution of pertussis antigens (75 op units / ml) and 112 ml PBS (final volume 140 ml) This vaccine used for animal experiments contains 10% PRP and 3.7 op units B. pertussis / 0.5 ml (dose).
3o Die Ergebnisse der Antikörperreaktion auf diese Kombinationsvakzine bei jungen Ratten erscheinen in Fig. 3 und in Tabelle II. 3o The results of the antibody response to this combination vaccine in young rats appear in Fig. 3 and in Table II.
Tabelle II Table II
Immunogenizität von PRP-Pertussis-Komplex bei jungen Ratten3 Immunogenicity of PRP-pertussis complex in young rats3
Anti-PRP-Antikörper-Aktivität (cpm 3H-PRP gebunden/50 |il Serum) Anti-PRP antibody activity (cpm 3H-PRP bound / 50 | il serum)
Dosis ein- oder Woche nach Injektion 3. Woche nach Injektion Dose one or week after injection 3rd week after injection
Vakzine mehrfach 0 1 2 3 .. .-fache Erhöhung durch Vaccine multiple 0 1 2 3 ... Times increase by
Vorimmunisierung Pre-immunization
Phosphatgepufferte Phosphate buffered
(M)b (M) b
99c 99c
116 116
107 107
158 158
1,6 1.6
Salzlösung Saline solution
Pertussis Pertussis
(M) (M)
113 113
108 108
117 117
149 149
1,3 1.3
PRP(K) (Beispiel 1) PRP (K) (example 1)
(M) (M)
110 110
136 136
148 148
142 142
1,3 1.3
PRP (K) (3 mo) + Pertussis PRP (K) (3 mo) + pertussis
(S)d (S) d
108 108
136 136
132 132
147 147
1,4 1.4
(3 mo) (Beispiel 5) (3 mo) (example 5)
(M) (M)
101 101
135 135
1002 1002
1771 1771
17,5 17.5
PRP (K) + Pertussis (3 mo) PRP (K) + pertussis (3 mo)
(S) (S)
93 93
146 146
135 135
140 140
1,5 1.5
(Beispiel 4) (Example 4)
(M) (M)
119 119
154 154
751 751
1410 1410
11,8 11.8
a 10 (ig PRP oder 3,5 op Einheiten Pertussis/Dosis (0,5 ml) b bester Wert 2. und 3. Woche (Mehrfachinjektion) c Mittelwert von 10 Ratten d Einfachinjektion a 10 (ig PRP or 3.5 op units pertussis / dose (0.5 ml) b best value 2nd and 3rd week (multiple injection) c mean value of 10 rats d single injection
G G
3 Blatt Zeichnungen 3 sheets of drawings
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