NO149611B - Fremgangsmaate for isolering og rensning av immunologisk aktivt polyribosyl-ribitolfosfat (prp), det kapsulaere polysakkarid av haemophilus influenzae - Google Patents
Fremgangsmaate for isolering og rensning av immunologisk aktivt polyribosyl-ribitolfosfat (prp), det kapsulaere polysakkarid av haemophilus influenzae Download PDFInfo
- Publication number
- NO149611B NO149611B NO783635A NO783635A NO149611B NO 149611 B NO149611 B NO 149611B NO 783635 A NO783635 A NO 783635A NO 783635 A NO783635 A NO 783635A NO 149611 B NO149611 B NO 149611B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- prp
- isolation
- haemophilus influenzae
- hydroxylapatite
- phosphate buffer
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims description 12
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 title claims description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims description 8
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 title claims 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 11
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 11
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 11
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 8
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 7
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 7
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 2
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N tetraphosphorus decaoxide Chemical compound O1P(O2)(=O)OP3(=O)OP1(=O)OP2(=O)O3 DLYUQMMRRRQYAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- -1 Bio. gel HTP Chemical compound 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 239000007621 bhi medium Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229940075894 denatured ethanol Drugs 0.000 description 1
- CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J dicalcium hydroxide phosphate Chemical compound [OH-].[Ca++].[Ca++].[O-]P([O-])([O-])=O CGMRCMMOCQYHAD-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- MKWYFZFMAMBPQK-UHFFFAOYSA-J sodium feredetate Chemical compound [Na+].[Fe+3].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O MKWYFZFMAMBPQK-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/099—Bordetella
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Denne oppfinnelse angår en metode for isolering og rensning av det antigene polysakkarid polyribosylribitol-fosfat (PRP) fra Haemophilus influenzae type b-kulturer.
Det rensede polyribitolfosfat (PRP) fra Haemophilus influenzae type b undersøkes for tiden som et beskyttelses-immunogen. Et aktivt antigent svar hos unge dyr og barn er imidlertid ikke oppnådd. Ifølge den tidligere kjente metode for rensning anvendes etanol og "Cetavolon" (heksadecyltrimetyl-ammoniumbromid). Forurensningene, endotoksiner, og pyrogene stoffer ble fjernet ved anvendelse av kald fenol eller kloroform og t-butanol, som kan resultere i tap av den antigene karakter hos dette polysakkarid.
En ny fremgangsmåte for isolering og rensning av immunologisk aktivt PRP fra Haemophilus influenzae type b er ut-viklet .
Foreliggende fremgangsmåte oppviser klare fordeler i forhold til tidligere kjente metoder, ved at alle forurensninger (nukleinsyrer, proteiner og endotoksiner) fjernes til minst mulige nivå ved behandling med hydroksylapatitt. PRP fremstilt ved den her beskrevne fremgangsmåte, gir et mer høymolekylært polysakkarid enn hva som tidligere er rapportert.
Det er videre av betydning at PRP fremstilt i henhold til denne nye metode i høy grad er immunogent hos varmblodige dyr i motsetning til det PRP som fremstilles i henhold til tidligere kjente metoder.
En fremgangsmåte for fjernelse av forurensninger (proteiner, nukleinsyrer og endotoksiner) i polysakkaridet PRP oppnås ved behandling av det delvis rensede polysakkarid med et fosfatholdig adsorpsjonsmiddel som ikke absorberer polysakkaridet under de angitte betingelser.
(I) Isolering og rensning av polyribosylribitol- fosfat,
det kapsulære polysakkarid av Haemophilus influenzae type b.
Organismer, dyrkningsmedium og kultur
To stammer av Haemophilus influenzae type b anvendes.
Rab-stammen erholdes fra Grace Leidy, Babies Hospital, Columbia University, New York City, New York. CK-stammen ble isolert fra en pasient ved Waterbury Hospital Waterbury, Conn. Organismene får passere gjennom mus flere ganger for å sikre deres virulens.
Organismene isoleres ved autopsi fra hjernevev hos mus, sub-kultivert på enten 3,7%ig hjerne-hjerte-infusjonsmedium (BHI)
(Difco Lab., Detroit, Mich.) eller på 5%ig BHI-agar komplettert med 0,01%ig nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) (P-L Biochemicals, Milwaukee, Wis.) og l%ig (volum/volum) defibrinert hesteblod (Animal Blood Center, Syracuse, N.Y.), og fordeles derefter i porsjoner på 1 ml på ampuller, lyofiliseres og oppbevares ved -70°C.
Grunnmedium anvendt for dyrkning av organismene er
3,7%ig BHI. Grunnmediet suppleres med 10 mg NAD og 20 mg hemin (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) pr. liter. 1% (volum/volum) defibrinert hesteblod tilsettes pr. 50 ml podekultur. Supple-mentene nyfremstilles og filtreres gjennom en 0,4 5 p Nalgene filterenhet (Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y.) før anvendelse. For dyrkning av organismen i en 14 liters fermentor suppleres mediet ytterligere med 0,5% glukose.'
For å tilberede en kolbe med podeorganismer opptines
1 ml frosset forrådskultur og overføres til 50 ml av det anrikede BHI-mediet supplert med defibrinert hesteblod og NAD. Kulturen dyrkes i 8 timer ved 37°C på en gyroskakeanordning med en hastighet av 150 omdr./minutt. Organismene settes i form av et l%ig podestoff til 500 ml porsjoner av anriket BHI-dyrkningsvæske i 2 liters kolber, som derefter inkuberes ved 37°C med moderat skakning på en gyroskakeanordning i 8 timer (for isolering av PRP) eller 14 timer (som podekulturer).
Fermenteringen av hver sats i en 14 liters fermentor initieres ved aseptisk overføring av 700 ml av podekulturen til 7 liter av den anrikede BHI-dyrkningsvæsken supplert med hemin istedenfor defibrinert hesteblod. Kulturen opprettholdes kontinu-erlig ved 37 - 1°C. Tanken omrøres med en hastighet på 150 omdr./ minutt, og en luftstrøm på 0,25 liter luft pr. liter dyrkningsvæske pr. minutt opprettholdes. Under dyrkningen tilsettes 0,001% av et silikon-antiskummiddel (FD-82, Hodag Chemical Corp.) efter behov. Kulturer dyrkes til bare eksponentiell tilvekst (8-10 x 10 9 levedyktige celler pr. ml), vanligvis ca. 8 timer, hvorefter dyrkningen avsluttes ved at man tilsetter 0,4%ig formaldehyd og oppbevarer kulturene natten over ved 4°C.
Isolering av polyribosylribitol- fosfat ( PRP)
Dyrkningsvæske fremstilt i henhold til det ovenstående sentrifugeres ved 27.000 x g i 30 minutter ved 4°C. Den celle-frie væsken på toppen oppbevares og behandles på følgende måte:
Trinn 1, etanolutfeining
Væsken på toppen i kulturen tilsettes natriumacetat (sluttkonsentrasjon 4%). Oppløsningen innstilles på pH 6,0-6,2, og 44 liter med metanol denaturert etanol tilsettes langsomt under kraftig omrøring ved 4°C. Blandingen innstilles på pH 6,8 med iseddik og oppbevares derefter i 12 timer ved 3°C. Den dannede felningen oppsamles ved dekantering og sentrifugeres derefter for dannelse av urent PRP.
Trinn 2, " Cetavlon" ( heksadecyltrimetylammoniumbromid)- behandling
Felningen fra trinn 1 løses i pyrogenfritt destillert vann og sentrifugeres for å fjerne residuet. Den klare, brune opp-løsning settes derefter langsomt til 100 ml 10%ig vann-oppløsning av "Cetavlon" under blanding (sluttkonsentrasjon 0,5%). Blandingen omrøres i 1 time og sentrifugeres derefter. Felningen av nukleinsyrer og PRP-"Cetavlon"-kompleks blandes med 2 liter 0,3M natriumklorid. Den uklare oppløsningen sentrifugeres for å fjerne uoppløselig materiale så som imklein-"Cetavlon"-salt.
Væsken på toppen fortynnes med en lik volummengde vann, hvorved PRP-"Cetavlon"-saltet utfelles. Blandingen omrøres i 1 time, felningen oppsamles ved sentrifugering og oppløses derefter i 2 liter 0,3M natriumkloridoppløsning.
Trinn 3, etanolutfeining
"Cetavlon" og forurensningene av nukleinsyrer og proteiner fjernes ytterligere ved etanolutfeining (minst to ganger). PRP utfelles i henhold til trinn 1, mens "Cetavlon" oppløses i alkoholoppløsningen. PRP oppsamles ved sentrifugering, løses i 2 liter pyrogenfritt, destillert vann og utfelles derefter igjen som beskrevet ovenfor. Den endelige PRP-feiningen solubiliseres i 20 mM natriumfosfat, pH 6,8.
Trinn 4, hydroksylapatittbehandling
Forurensninger (så som nukleinsyrer, proteiner og endotoksiner) i de delvis rensede PRP-preparater fjernes selektivt ved adsorpsjon på hydroksylapatitt [3-Ca^(P04) 2Ca(OH) ^\ .
Oppfinnelsen bygger på den oppdagelse at polysakkaridet PRP ikke adsorberes av den hydroksylapatittholdige fosfatbuffer (0,02M) med en pH på 6,7-6,9; eller en fosfatbuffer- (0,02M) med
en pH på ca. 5,8; mens derimot forurensningene (så som nukleinsyrer, proteiner og endotoksiner) adsorberes under disse betingelser. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres satsvis eller i kolonnedrift. Ved satsvis utførelse settes hydroksyl-apatitten til det delvis rensede PRP-preparatet (i 0,02M natriumfosfatbuffer; pH 6,7-6,9). Blandingen blandes omhyggelig ved 2-10°C, og sentrifugeres for å fjerne uønskede faste substanser (adsorpsjonsmiddel og de forurensninger som er adsorbert av adsorpsjonsmidlet). Væsken på toppen underkastes nevnte prosedyre minst ytterligere to ganger. Den dannede oppløsningen filtreres gjennom "Millipore"-filter, dialyseres mot pyrogenfritt destillert vann og lyofiliseres.
Ved kolonnedrift påføres delvis renset PRP i 0,02M natriumfosfatbuffer (pH ca. 5,8) i en kolonne inneholdende adsorpsjonsmidlet hydroksylapatitt, som er bragt til likevekt med 0,02M natriumfosfatbuffer, pH ca. 5,8, og elueres med en trinnvis gradient av natriumfosfatbuffer, pH ca. 5,8 fra 0,02M til 0,05M. Fraksjoner oppsamles og analyseres med hensyn til pentose (og dermed med hensyn til polyribosylribitolfosfat). De fraksjoner som er positive med hensyn til pentose, dialyseres mot pyrogenfritt, destillert vann og lyofiliseres.
Oppfinnelsen skal illustreres nærmere ved hjelp av de følgende eksempler hvor de angitte temperaturer er i °C.
Eksempel 1
2,5 g hydroksylapatitt (f.eks. Bio. gel HTP, Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) settes til 250 ml delvis rensede PRP-preparater (efter "Cetavlon"- og etanolbehandlinger)
(inneholdende ca. 1,0 mg PRP/ml) i 20 mM natriumfosfatbuffer,
pH 6,9, og blandes i et iskaldt vannbad (1-4°C) i 1 time. Blandingen sentrifugeres i en Sorvall RC2-B i 30 minutter ved 16.000 x g. Væsken på toppen føres derefter gjennom et 0,65 m milliporefilter og underkastes nevnte prosedyre (hver gang behandlet med 2,5 g hydroksylapatitt) ytterligere to ganger. Den erholdte oppløsning filtreres gjennom 0,65 u og 0,45 m milliporefilter,
dialyseres mot pyrogenfritt, destillert vann og lyofiliseres.
Det lyofiliserte produkt oppviser kraftig immunogen aktivitet
(se nedenfor med hensyn til dyreforsøk med kombinert vaksine)
og inneholder en meget liten mengde forurensninger (så som nukleinsyrer, proteiner og endotoksiner) (se tabell I nedenfor). Ca. 170 mg lyofilisert PRP erholdes. Gjenvinningen av PRP ved denne fremgangsmåte er ca. 70%, beregnet på utgangspolysakkaridet. PRP bør oppbevares under egnede betingelser, f.eks. ved 4° i en eksikator over fosforpentoksyd og silikagel.
E ksempel 2
Delvis renset PRP (300 mg PRP) oppløses i 100 ml 20 mM natriumfosfatbuffer, pH 5,8 (dvs. 3 mg PRP/ml). Denne oppløsning påføres en kolonne ved romtemperatur (5,0 x 45 cm) av hydroksylapatitt (ca. 250 ml lagvolum), som er bragt til likevekt med 20 mM natriumfos fatbuffer, pH 5,8, og elueres med en trinnvis gradient av 20 mM, 50 mM og 100 mM natriumf osf atbuf fer, pH 5,8.
De individuelle fraksjoner (200 ml), eluert med 20 mM og 50 mM natriumfosfatbuffer (pH 5,8), som er positive med hensyn til pentose (pentosebestemmelse i henhold til originalmetoden), oppbevares, dialyseres mot pyrogenfritt, destillert vann og lyofiliseres. Man får ca. 206 mg av det lyofiliserte produkt,
PRP.
Renheten av polysakkaridet, PRP, analyseres ved at man bedømmer i hvilken utstrekning de er forurenset med nukleinsyrer, proteiner og endotoksiner. Proteinkonsentrasjonen bestemmes ifølge Lowry et al. i J. Biol. Chem. 193:265 (1951) med bovinserum-albumin som standard. Nukleinsyren bestemmes ved absorpsjon av PRP-oppløsningen ved 2 60 nm. Absorbansen av 50 yg nukleinsyre
i 1 ml vann i en celle med lysvei 1 cm ansees å være lik 1,0. Molekylstørrelsen bedømmes ved hjelp av "Sepharose" 4B- eller 2B-gelfiltrering på kolonner 1,5 x 90 cm (Pharmacia-Fine Chemicals, Pissataway, N.J.). Fordelingskoeffisienten (Kd) bestemmes fra elueringsmønsteret fremkalt ved originalreaksjonen (Herbert et al, Methods in Microbiology, vol. 5B, 285-291).
For undersøkelse av virkningen av en vaksine som inneholder PRP fra H. influenzae ble fremstilt en kombinasjonsvaksine med B.pertussis-antigener: A. En kombinasjonsvaksine inneholdende PRP fra H. influenzae type b og B. pertussis-antigener fremstilles i henhold til følgende: 140 mg PRP (fremstilt ifølge eksempel 2) oppløses i 350 ml steril,, fosfatbufret natriumkloridoppløsning (PBS) (0,113 g kaliumfosfat, 0,83 g dinatriumfosfat og 8,5 g natriumklorid pr. liter, pH 7,0, inneholdende 0,01% timerosal) og filtreres gjennom et 0,45 y millipore-filter. Denne konsentrerte PRP-oppløsning (400 yg/ml) anvendes for fremstilling av en kombinasjonsvaksine, som består av PRP og B. pertussis-antigener.
150 ml av den konsentrerte PRP-oppløsningen (400 yg/ml) tilsettes 150 ml frisk B. pertussis (stamme 138)-cellesuspensjon i PBS, pH 7,0 (med opacitet 149; op, enhetsceller/ml) for fremstilling av forrådsoppløsningen av den kombinerte vaksine. Denne forrådsoppløsning (300 ml) holdes ved 4° inntil endotoksinnivået av pertussis har sunket (minst 90 dager). Steriliteten av forråds-oppløsningen undersøkes med tioglykolatmedier (ved 32-33°). pH i forrådsoppløsningen efter 90 dagers inkubering kontrolleres og innstilles på pH 7,0 i 1. Sluttproduktet (vaksine) anvendt for dyreforsøk, fremstilles ved fortynning av den kombinerte forråds-oppløsning med PBS, og den inneholder 10 yg PRP og 3,5-op-enheter av pertussisceller/O,5 ml (dose).
B. Forrådsoppløsningen av PRP (400 yg/ml) fremstilt ved at man oppløser 30 mg PRP (fremstilt ifølge eksempel 1) i 75 ml steril, fosfatbufret natriumkloridoppløsning (PBS) og filtreres gjennom et 0,45 y milliporefilter. Til 25 ml av dette konsentrerte PRP settes en like stor volummengde (dvs. 25 ml) frisk B. pertussis (stamme 138)-cellesuspensjon i PBS, pH 7,0 (inneholdende 149 op-enheter celler/ml) for fremstilling av forrådsoppløsningen av den kombinerte vaksine. Denne forrådsoppløsning (50 ml) holdes i minst 90 dager ved 4°. Steriliteten av forrådsoppløsningen undersøkes som angitt ovenfor med tioglykolatmedier. pH i forråds-oppløsningen er 7,0 ± 1. Sluttproduktet (vaksine) anvendt for dyreforsøk fremstilles ved fortynning av den kombinerte forråds-oppløsningen med PBS, og den inneholder 10 yg PRP og 3,7 op-enheter
av pertussisceller/O,5 ml (dose).
C. PRP-forrådsoppløsningen (200 ug/ml) i PBS (pH 7,0) fremstilles som i B. Pertussis-forrådsoppløsningen (inneholdende 75 op-enheter/ml) fremstilles ved fortynning av 25 ml frisk B. pertussis-cellesuspensjon (149 op-enheter/ml) med en like stor volummengde PBS. Begge /forrådsoppløsninger inkuberes separat i 90 dager eller noe lenger ved 4°. Den kombinerte vaksine fremstilles ved at man tar 14 ml PRP-forråds-oppløsning (200 yq/ ml) og 14 ml (avgiftet) forrådsoppløsning av pertussis-antigener (75 op-enheter/ml) og fortynner den med 112 ml PBS (sluttvolum 140 ml). Den ferdige vaksine for dyre-forsøk inneholder 10 Mg PRP og 3,7 op-enneter pertussis/0,5 ml (dose).
Resultatene med hensyn til antistoffsvaret på denne kombinerte vaksine hos unge rotter angis i tabell II.
Sammenligningsforsøk
. I den følgende tabell er det vist at PRP fremstilt
i henhold til oppfinnelsen. Jean kombineres med B. pertussis celler og at den resulterende kombinerte vaksine fremkaller en betydelig større antistoff-reaksjon hos unge individer enn hva tilfellet er med vaksiner inneholdende PRP fremstilt ved en fenol-ekstraksjonsmetode.
Sammenligning av antistoff-reaksjon fremkalt med vaksiner inneholdende PRP fremstilt ved forskjellige fremgangsmåter
Antistoff-speil - 0,15 ug/ml ansees å være beskyttende
Claims (1)
- Fremgangsmåte for isolering og rensning av immunologisk aktivt polyribosyl-ribitolfosfat (PRP), det kapsulære polysakkarid av Haemophilus influenzae, efter fermentering av stammer av organismen Haemophilus influenzae type b, isolering av PRP ved etanolutfelling og ytterligere isolering av PRP som heksadecyltrimetyl-ammoniumbromid-kompleks, karakterisert ved at det efter etanolfelling og behandling med heksadecyltrimetyl-ammoniumbromid isolerte PRP renses ved hjelp av hydroksylapatitt enten (a) ved tilsetning av hydroksylapatitt [3 Ca^(P04)2Ca(OH)21 i en 0,02M natriumfosfatbuffer ved en pH fra 6,7 til 6,9,blanding ved en temperatur på 2 til 10°C, sentrifugering, fjernelse av væsken på toppen og gjentagelse av den foregående prosess minst ytterligere to ganger, filtrering av væsken på toppen gjennom passende filtere, dialysering mot pyrogenfritt destillert vann og derefter lyofilisering, eller (b) ved kolonnekromatografi i 0,02M natriumfosfatbuffer ved en pH på ca. 5,8 gjennom hydroksylapatitt [3Ca.j (PO^) 2 • Ca (OH) , eluering med en trinnvis gradient av 0,02M og 0,05M natriumfosfat-buf fer ved en pH på ca. 5,8, isolering av fraksjoner ved analyse efter PRP, dialysering av nevnte fraksjoner mot pyrogenfritt, destillert vann og derefter lyofilisering.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US05/846,466 US4196192A (en) | 1977-10-28 | 1977-10-28 | Combined Haemophilus influenzae type b and pertussis vaccine |
| US05/846,488 US4220717A (en) | 1977-12-22 | 1977-12-22 | Isolation and purification of polyribosyl ribitol phosphate from Haemophilus influenzae type b. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO783635L NO783635L (no) | 1979-05-02 |
| NO149611B true NO149611B (no) | 1984-02-13 |
| NO149611C NO149611C (no) | 1984-05-23 |
Family
ID=27126641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO783635A NO149611C (no) | 1977-10-28 | 1978-10-27 | Fremgangsmaate for isolering og rensning av immunologisk aktivt polyribosyl-ribitolfosfat (prp), det kapsulaere polysakkarid av haemophilus influenzae |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5480408A (no) |
| AR (1) | AR218932A1 (no) |
| AU (1) | AU520902B2 (no) |
| BE (1) | BE871586A (no) |
| CA (1) | CA1117866A (no) |
| CH (1) | CH649781A5 (no) |
| DD (1) | DD140701A5 (no) |
| DE (1) | DE2845745A1 (no) |
| DK (1) | DK154327C (no) |
| ES (1) | ES474611A1 (no) |
| FI (1) | FI63674C (no) |
| FR (1) | FR2407000B1 (no) |
| GB (1) | GB2007244B (no) |
| GR (1) | GR73991B (no) |
| HU (1) | HU178166B (no) |
| IE (1) | IE47474B1 (no) |
| IL (1) | IL55433A (no) |
| IT (1) | IT1107570B (no) |
| NL (1) | NL7810753A (no) |
| NO (1) | NO149611C (no) |
| NZ (1) | NZ188211A (no) |
| PH (1) | PH15882A (no) |
| PL (1) | PL210545A1 (no) |
| SE (1) | SE430753B (no) |
| YU (1) | YU250878A (no) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE889979A (fr) * | 1981-08-14 | 1982-02-15 | Smith Kline Rit | Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation |
| CA1209036A (en) * | 1982-08-20 | 1986-08-05 | Joseph S.C. Kuo | Combined haemophilus influenzae and diphtheria, pertussis, tetanus vaccine |
| US4744982A (en) * | 1982-08-24 | 1988-05-17 | Hunter Kenneth W | Human monoclonal antibody reactive with polyribosylribitol phosphate |
| DE69113564T2 (de) * | 1990-08-13 | 1996-05-30 | American Cyanamid Co | Faser-Hemagglutinin von Bordetella pertussis als Träger für konjugierten Impfstoff. |
| WO1993004183A1 (en) * | 1991-08-16 | 1993-03-04 | Merck & Co., Inc. | Process for converting lipid-containing bacterial capsular polysaccharide into lipid-free polysaccharide |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3395219A (en) * | 1964-12-11 | 1968-07-30 | Merck & Co Inc | Process for production of pertussis antigen |
| NO116869B (no) * | 1965-01-19 | 1969-06-02 | Merck & Co Inc | |
| US3465078A (en) * | 1965-10-21 | 1969-09-02 | Sydney Z Spiesel | Method of recovering antigens from bordetella pertussis cells |
| NL174267B (nl) * | 1969-05-20 | Roussel Uclaf | Verbetering van de werkwijze voor de bereiding van een somatisch antigeen volgens het nederlandse octrooischrift 169754 en werkwijze ter bereiding van een farmaceutisch preparaat. | |
| US3636192A (en) * | 1970-01-13 | 1972-01-18 | Us Army | Meningococcal polysaccharide vaccines |
| FR2253499B1 (no) * | 1973-12-10 | 1977-11-04 | Fabre Sa Pierre | |
| DE2461439C3 (de) * | 1974-12-24 | 1980-03-20 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella Pertussis sowie jenes enthaltendes Mittel |
| US3978209A (en) * | 1975-03-24 | 1976-08-31 | Merck & Co., Inc. | Endotoxin free meningococcus polysaccharides |
-
1978
- 1978-08-22 NZ NZ188211A patent/NZ188211A/en unknown
- 1978-08-25 IL IL55433A patent/IL55433A/xx unknown
- 1978-08-29 CA CA000310218A patent/CA1117866A/en not_active Expired
- 1978-08-30 AR AR273492A patent/AR218932A1/es active
- 1978-08-30 GR GR57127A patent/GR73991B/el unknown
- 1978-10-20 DE DE19782845745 patent/DE2845745A1/de active Granted
- 1978-10-24 IT IT51621/78A patent/IT1107570B/it active
- 1978-10-25 PH PH21738A patent/PH15882A/en unknown
- 1978-10-26 AU AU41081/78A patent/AU520902B2/en not_active Expired
- 1978-10-26 FR FR7830517A patent/FR2407000B1/fr not_active Expired
- 1978-10-26 FI FI783269A patent/FI63674C/fi not_active IP Right Cessation
- 1978-10-27 CH CH11125/78A patent/CH649781A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-10-27 IE IE2146/78A patent/IE47474B1/en unknown
- 1978-10-27 GB GB7842230A patent/GB2007244B/en not_active Expired
- 1978-10-27 ES ES474611A patent/ES474611A1/es not_active Expired
- 1978-10-27 YU YU02508/78A patent/YU250878A/xx unknown
- 1978-10-27 DK DK479578A patent/DK154327C/da not_active IP Right Cessation
- 1978-10-27 PL PL21054578A patent/PL210545A1/xx unknown
- 1978-10-27 BE BE191385A patent/BE871586A/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-10-27 SE SE7811192A patent/SE430753B/sv not_active IP Right Cessation
- 1978-10-27 NO NO783635A patent/NO149611C/no unknown
- 1978-10-27 DD DD78208715A patent/DD140701A5/de unknown
- 1978-10-27 HU HU78AE546A patent/HU178166B/hu not_active IP Right Cessation
- 1978-10-27 NL NL7810753A patent/NL7810753A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-10-28 JP JP13310978A patent/JPS5480408A/ja active Granted
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4220717A (en) | Isolation and purification of polyribosyl ribitol phosphate from Haemophilus influenzae type b. | |
| US4196192A (en) | Combined Haemophilus influenzae type b and pertussis vaccine | |
| ES2198405T3 (es) | Antigenos de superficie de tipo i asociados a staphylococcus epidermis. | |
| Schaffer et al. | Purification and properties of poliovirus | |
| JPH0231689A (ja) | 百日咳トキシンの精製法 | |
| DK155915B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af pertussis-toksoid til anvendelse i vacciner | |
| NO165478B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av antigeniske preparater. | |
| JPS61186328A (ja) | 新規錯体 | |
| EP0527753A1 (en) | CLEANING A PERTUSSIS EXTERIOR MEMBRANE PROTEIN. | |
| EP0407037B1 (en) | Process for removing bacterial endotoxin from gram-negative polysaccharides | |
| US4239749A (en) | Neisseria gonorrhoeae vaccine | |
| JPS638340A (ja) | レトロウイルスを含まぬ免疫グロブリンの製法 | |
| EP0175841B1 (en) | Method for the production of pertussis component vaccine and combined vaccine of pertussis antigen; diphtheria toxoid and tetanus toxoid | |
| NO149611B (no) | Fremgangsmaate for isolering og rensning av immunologisk aktivt polyribosyl-ribitolfosfat (prp), det kapsulaere polysakkarid av haemophilus influenzae | |
| EP0080021B1 (en) | Haemophilus influenzae type b and pertussis outer membrane component combined vaccine | |
| KR100266556B1 (ko) | 백일해균의 방어성분의 분리방법 | |
| NO172188B (no) | Fremstilling av pertussis-toksin ved dyrkning av bordetella pertussi | |
| Mason Smith et al. | A BALB/c mouse IgA myeloma protein that binds Salmonella flagellar protein | |
| CA1137901A (en) | Isolation of capsular polysaccharide of haemophilus influenzae | |
| US3208909A (en) | Anaerobic process for production of a gel-adsorbed anthrax immunizing antigen | |
| KR810001317B1 (ko) | 혼합백신의 제조방법 | |
| AT410636B (de) | Verfahren zur herstellung eines impfstoffes | |
| JP4777599B2 (ja) | ヒト抗胸腺細胞免疫グロブリンの製造方法 | |
| Whitney, E. & Gear | Laboratory studies of eye infections in South Africa with special reference to the virus of trachoma | |
| SU1692580A1 (ru) | Способ получени тул ремийного антигена |