JPS6054322A - 赤血球よりなる組成物及びその転換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は輸血療法に使用させるために成る亜型の血液型
Ａ赤血球を型Ｏ細胞に転換する方法に関する。さらに詳
細には本発明は細胞がそｆｌらの細胞的機能を失わない
条件下で成る１１（型Ａ赤血球を型０細胞に転換する方
法に関１〜それら【′、１酸素の吸着及び放出に好適で
ありそれにより細胞は型０血液の方法で輸血されうる。

本発明は又このような赤血球亜型を型０細胞に転換する
ことにより得られる生成物に関する。

〔従来の技術〕

輸血療法において良く知られているように、受血者の血
液型と血液銀行で利用しうろ血液の型とを合わせる必要
がある。従って例えば型人血液の受血者は型Ａの血液を
安全に輸血されるに過ぎない。この例外は型０の血液で
ある。その赤血球は０受面者と同じく型Ａ１型Ｂ及び型
ＡＢの受面者に安全に輸血されうる。

全血液又はその少くとも赤血球成分を蓄える血液゛銀行
又は他の設備の操業において各型の血液の供給を維持す
る必要がある。０型の供血者が少数なのでＯ型の血液の
みを維持することは従来不可能であった。それ故０型の
供血者の血液は主としてＯ型の受血者に用いられてきた
。一方多数の供血者はＡＩ　Ｂ又はＡＢの血液を有しそ
して時々過剰のこれらの型の血液か存在することかある
。そのため需要圧供給をｉｌｌ　ｆｔｇすることが望ま
しくなってきた。特にＡ、Ｂ又はＡ　Ｉ’（型の血液を
０型の血液型−昔偏的な供血者に転換することが望まね
ていた。

ＡＢＯ血液血液群発見された初めてのもので）１りそし
て血液の輸血という点から極めて重要ｔ、ｒものの一つ
である。血液型Ａ、Ｂ及びＯの個人はそれぞれＡｌＢ及
びＨ抗原を表わ１゜これらの抗原は赤血球のみならずす
べての内皮細ＩＩζそして殆んどの上皮細胞の表面にも
児い出さ才する。さらにＡｌＢ及び）Ｉ抗原性を壱゛す
る糖蛋白質は又メンデル優性として遺伝されたそれらが
名付けら第１た血液群の物質又は要素を分泌１ろ能力を
有すイ）こわら個人の組織液及び分泌物に見い出される
。

血液群物質は糖蛋白質であるが細胞朦より得られたＡＢ
Ｈ活性物質は糖脂質及び糖蛋白質であると思われる。

ＡＢＨ決定子の構造を決定するために多くの作業が行わ
れてきた。ペプチド骨格に結合された１種以上の炭水化
物鎖を含んでいるだろう全分子の血液群特異性はこねら
鎖の非還元末端に位置するこれら単Ｎ類の性質及び連鎖
により定められることが分った。しばしば免疫優性又は
免疫決定糖と呼ばれる各特異性のための最も重要な糖は
次のものであることが分った。■（抗原についてはフコ
ース；Ａ抗原についてはＮ−アセチルガラクト−スアミ
ン部 スである。芒らに最近では赤血球細胞膜から得られるＡ
　Ｄ　Ｈ活性糖脂質に関する研究は又聞−の連鎖により
隣接した糖に結合された炭水化物前の還元末端における
同一の免疫優性の糖の存在を示す。

炭水化物鎖は次に蛋白質又はセルアミド（膜の脂質二重
層に埋め込まれている）の何れかに結合する。炭水化物
部分の長さは変化してよくそしてそれは直鎖又は枝分れ
鎮の構造を有してもよい。従って今迄血液群活性Ａ糖脂
質の４変棺、Ｂの２種及びＨの３栢が赤血球細胞膜から
単離さねた。

これらの研究により細胞にぶら下っている唱糖類群の一
つの除去により型Ｏ細胞に対応する型Ｈ抗原へ型Ａ又は
型Ｂ抗原を転換しうるであろうことが理論付日られた８ Ｂ抗原性に関係のあイ１ガラクトース分子が細１ｉ１の
生長性及び膜の完全性を保つ条件下で酵素的に型Ｂ細胞
から除去され従ってそ才′１らを型０赤血球に転換しう
ろことが最近示された。その上Ｊｍｌ＄のこの酵素的に
転換された細ｎｒ＋、か元の型Ｂ供ｍ（者に返さねたと
きのみならずこの室かＡ及びＢ受血者（それらの免疫系
が未転抄！の型Ｂ細胞には耐六られないと思われる）に
輸血さ才するときＷも循環中に通常の如く生存している
。ことが示された（　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｊ　１Ｓｉ
ｖｊｇｌ　ｉａ、Ｇ、、Ｆｌｕｒｓｔ、１％、Ｊ、ｅｎ
ｎｙ　Ｉ、。

及び１（ｅｔｃｈ　Ｌ−＋５ｃｉｅｎｃｅ　２］５１６
８．ＨＪ８２　）又米国ｆＦ、’ｊＦＦ第４，３３０，
６１９　％；）づ−α−カラクトシトルゼを用いてＢ赤
血球なＯ赤血球に転換する方法が開示されている。

特にＡ抗原の場合型Ａ抗原のＮ−アセチルガラクトース
アミン部分が酵素的に除去さねそ１１．　Ｋより型Ａ抗
原が型■抗原に転換さねるのでは７（いかと予想されて
いた。この酵素的転換を達１１児させそして輸出しうる
品質の細胞を生成する試みか従来なされている。Ｌｅｖ
ｙ及びＡｎｉｍｏｆｆ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ１３ｉｏ
１ｏｇｉｃａｌ　（：ｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｖｏｌ、２５
５．Ｎｏ、２４．１９８０年１２月２５日、１１７３７
〜４０ページ参照。しかしこれは不成功であった。それ
はこわらの被処理細胞、が未だ人間の抗Ａ抗血清により
凝集された（１６倍迄の希釈）のでＡ抗原性の部分的な
除去が用いられた細菌性酵素により達成されただけだか
らである。この細胞は型Ｏ友びＢの受血者への輸血には
生育しえない。それはそれらが輸血反応及び受血者の免
疫系（Ｃよる破壊を含めて未処理型Ａ赤血球と同じ効果
を生じさせろと思われるからである。

その上この細菌性酵素は顕著な量（０，１％）のシアリ
ダーゼとして知られている他の酵素により汚染されてい
る。シアリダーゼによる赤血球の処理はそれらの早熟な
老化をもたらす。即ちすべての人間の血清によるこれら
の細胞の凝集をもたらす潜在性抗原の顕在化は輸血の次
の循環からのそねらの早い除去を生じさせる。従ってた
とえすべてのＡ抗原性が除去されたとしても細菌性酵素
に存在するシリアリダーゼはこの被処理細胞を輸血に適
さないようにする。ＡＩ’＃Ａ中間体即ちＡｉｎｔ及び
Ａ２として知られている血液型Ａの３種の認められた主
な亜型かある。亜型を区別する定針的及び定性的な相違
がある。ＡＩ細胞けＡｉｎｔ　細胞よりもより抗原的な
Ａ部位即ち末端Ｎ−アセチルガラクトースアミン残基な
有しそしてＡ　ｉ　ｎ　ｔ　１１！Ｉ胞は次にＡ２赤血
球よりもそうである。定性的にＡ抗原の形成に関係のあ
るトランスフェラーゼ酵素はＡ１、Ａｉ　ｎｔ及びＡ２
の個人において互に生化学的に相違すする。これ□は３
種の亜型について遺伝的基礎を暗示しており即ちＡ遺伝
座が３種の共通な遺伝子座に分割されそれぞれ異った亜
型を表わしそしてそれぞれの座はそれ自体の特異的なト
ランスフェラーゼ酵素にコードする。

Ａｉｎｔ　及びＡ２個人の数は異った人種において広く
変化する。例えばＡ２の頻度は白人（英国大）において
Ａ、の約３０％で雨、りぞして東洋人（日本人）では１
％より少ない。Ａｉｎｔの頻度は白人でへの約１〜２．
５％東洋人で０．５％に過ぎないが黒人では１〜３２％
に及ぶ。

〔発明が解決しようとする問題点〕

それ故人及びＡＢ型細胞の成る亜型からの基質のＡ抗原
決定子の末端部分を除去する一方赤面球をそのまま残し
て得られた組成物が輸血療法に用いられうる方法を提供
するのが本発明の目的で力）る。特に成る亜型Ａ及びＡ
Ｂ細胞を０型細胞としそれにより細胞がそのまま残りそ
してもしあるとしても殆んど溶血素を行わすそして得ら
れた組成物か輸血療法に用いられうるのが本発明の目的
である。又特にＡ及びＡＢ細胞の成る亜型を０型細胞に
転換しそわにより細胞がそのままで残りそしてもしある
としても殆んど溶血素を行わずそして得られた組成物か
輸血療法に用いられうるのが本発明の目的である。本発
明はＡ（中間体）及びＡ２細胞及び対応するＡＢ細胞の
０細胞への転換に関する。０細胞へ転換されるこれらの
細胞は以下ｒＡｉｎｔ　Ａ２細胞」と名付けられそして
この用語は対応するＢ細胞例えばＡ２Ｂ細胞も含むもの
である。

〔問題点を解決１−ろための手段〕 本発明によりば Ａ、該Ａｉｎｔ　−Ａ　２赤面球をｐＨ５，６〜５．８
に平衡させ、 ８０次に該細胞がＴ（抗原性を有１゛イ）細胞に転換す
るのに充分な時間そのように平衡された赤血球と酵素と
を接触させ、 Ｃ０該赤血球から該酵素を険央し、そしてり、該赤血球
をｐＨ７，２〜７．４に再び平衡させろことよりなる方
法によりト述の［１的は達成さ、ｈる。

本方法は鳥類の肝臓からｖ＋＋らねたα−Ｎ−アセチル
ガラクトースアミニダーゼを用いて好ましくは行わわる
。種々の鳥類の肝臓が用いられニワトリ、七面鳥、鳩な
どのそれらを告む。これらの源から得られるα−Ｎ−７
セチルガラクトースアミニダーゼは酵素的転換の点で優
れた活性を有することが分った。活性成分が他の肝臓蛋
白質から分離出来てそれにより反応物が他の源側★ば細
菌及びは乳動物の肝臓から得られろＮ−アセチルガラク
トースアミニダーゼＪ゛すｉ純粋７ｆのでこの酵素源が
さらに好ましい。その結果Ｎ−アセチルガラクトースア
ミン部分の開裂が一層良好に達成されそｔｌ、により純
粋でしかも一層生物学的に両立しうる生成物が得られる
。本発明の転換された細胞は天然に生じたＯ型赤向球の
形で働きそして輸血療法に用いられうる。

原料の赤血球の抗原性に応じて異った生成物が得られる
。従ってＡ２Ｂ赤血球から出発するとき型Ｂ赤血球は Ａ、Ａ抗原性の不存在、 Ｂ、天然に生ずるＡ２Ｂ細胞より大きいＨ抗原性、Ｃ，
Ｂ抗原性の存在、 Ｄ、天然に生ずる１２Ｂ赤血球の６０〜９０％のアデノ
シン−５′−三燐酸（ＡＴＰ）含量による特徴をもって
生成される。

この転換されたＡ２Ｂ赤血球はさらに天然に生ずるＡｓ
Ｂ赤血球の６０〜９０％の２，３−ジホス木グリセリン
酸（２，３ＤＰＧ）含ｆにより特徴付けられうる。一般
にこの転換されたＡ２Ｂ赤血球（今ではＢ赤血球）は全
細胞ヘモグロビンの重量に基づいて０．１〜１％の範囲
の天然に生ずるＡ２Ｂ細胞のメトーヘモグロビン含量に
比べて赤血球中の全ヘモグロビンの２〜６％のメト−ヘ
モグロビン含量を有する。好ましくはそれぞわのＡＴＰ
及び２，３−ＤＰＧ含ｌは７０〜９０％の範囲そして特
に８０〜９０％である。

酵素的転換が又Ｂ型ではないＡｉｎｔ−Ａ２　ａｊ胞に
ついて行われるとき生成物はさらＫ Ａ、末端α−フコース部分 Ｂ、Ｏ抗原性 ’　Ｃ，Ａ抗原性の不存在 り、天然に生ずる０赤面球の６０〜９０％の７デノシン
ー５′−三燐酸（ＡＴＰ）含量により特徴付けられる型
Ｏ赤血球で））る。Ａ　２　Ｂ赤血球から誘導される型
Ｂ赤血球の場合のように２゜３−ＤＰＧ含量は普通天然
に生ずるＢ赤血球のそれの６０〜９０％である。同様に
ＡＴＰ及び２，３−ＤＰ′Ｇ含墓が天然に生ずる赤血球
のそれの７０〜９０％そして特に８０〜９０％の範囲に
あることが好ましい。これらの含量は重量又は容量基準
の何れかで示されることが出来そして含量は一般に生化
学的方法によりめられる。こわらけＡＴＰについてはＳ
ｉｇｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎ
ｏ　、　３６６−ＵＶそして２．３−　Ｄ　Ｐ　Ｇにつ
いてけＳｉｇｍａ　Ｔｅ−ｃｈｎｆｃａＪ　Ｂｕｌｌｅ
ｔｉｎ　Ｎｏ。３５−ＵＶに示されていもＡ２Ｂ赤血球
から誘導されたＢ赤血球は好ましくは天然に生ずるＡ２
Ｂｍ胞よりも少くとも２０％大きいＨ抗原性を有する。

■抗原性は植物ＴＪｌｅｘｅｕｒｏｐａｅｕｓの種子か
ら得られるレクチンにより測定されうる。

転換されたＡ２Ｂ赤血球はＢ抗原性により特徴付けらね
る。このＢ抗原性は人間の抗Ｂ抗血清との反応によりめ
られろ。同様にＡｉｎｔ−Ａ２赤血球から誘導されたＯ
赤血球は少くとも２，０００，０００個の末端α−フコ
ース部分により特徴付けられる。Ａ抗原性の不存在は人
間の抗Ａ抗血清との反応の不存在（（より明らかとなる
。

この方法の結果として回収される０、ｌ′ｌＩ胞には元
のＡｔｎｔ−Ａ２細胞に存在した末端的にα一連鎖した
Ｎ−アセチルガラクトースアミン部分が実質的に存在し
ない。

もしＡ２Ｂ　、ｍ胞がＢ細胞に転換されるならばこれら
は次に米国特許第４，３３０，６１９号の方法により０
細胞に転換されうる。

本発明の方法においてα−Ｎ−アセチルガラクトースア
６−ゼが酵素として用いられる。それは遊離の酵素の形
でも又は支持体上に支持されていてもよい。支持体は可
溶性の支持体例えばデキストラン又はポリエチレングリ
コールであっても又は不溶性の支持体例えばセルローズ
及びアクリルア弓ド、デキストラン、アガロースの交叉
結合重合体であってもよい。

■抗原型における非情面素赤血球の実現は厳密なｐＨ５
，６〜５．８へ酵素の不存在下Ａｉｎｔ−Ａ！赤血球の
最初に平衡化することＫより行われる。平衡は望ましく
は０．０５〜０．１０　Ｍの濃度の二塩基性燐酸ナトリ
ウム及び０．１５Ｍの濃度の塩化ナトリウムに加えて０
．０２〜０．０５Ｍの濃度の（えん階を含むｐＨ５，６
〜５．８のくえん酸塩・燐酸塩緩衝液を用いて行われる
。

平衡は通常少くとも５分間好ましくは１５分以下の時間
緩衝液溶液中に赤血球を懸濁することにより行われる。

本発明の好ましい態様によれば緩ｉ液は赤血球から除失
されそして新しい緩衝液が再び加えられて少くとも５分
間そして好ましくはは又少くとも５分間そして好ましく
は１５分間以内である。

緩衝液と赤血球との全接触時間は２時間以内でネ）るこ
とを生体外のテストは示しているが生体内を考慮すると
接触時間は２時間を超えず好ましくは％時間より短くな
くそして好ましくは１時間より長くないことが好ましい
。目的が細胞体をそのままにしてＡ抗原をＨ抗原に転換
しそれＫより輸血療法に用いられるとき細胞がその通常
の機能特に酵素のｇ＆着及び放出を行うことが出来るこ
とを記憶しておくべきでカ）る。

酵素による赤血球の接触が細胞が５．６〜５．８に平衡
された後にのみ生ずることは本発明の極めて重要な他の
特徴である。換言すれば赤血球は一低下物質（緩衝液）
と混合している間酵素とけ最初に接触しない。

５．６〜５．８への平衡は２０°〜２６℃好ましくけ室
温で行われる。大気圧以下及び大気圧以−ヒのｍ力は必
要とせず大気圧が用いられろ。

赤血球、が５．６〜５，８に一平衡さセろとＨ型抗原へ
のＡ型抗原の酵素的転換は簡単になる。酵素的反応は細
胞１００〜１，０００μｌ当り１２〜２５０酵素単位を
用い遊離又は支持された型のα−Ｎ−ナセチルガラクト
ースアミニダーゼを用いろことにより行われる。好まし
くは酵素は細胞８００〜１、　ＯＯＯ７１１当り１６０
〜２０（）単位の量で存在する。酵素的転換は３０〜１
５０分好ましくは４５〜６０分２６〜３７℃好ましくは
３２〜３７℃で行わわる。

上述したように酵素は遊離の酵素の形又は支持された酵
素の形でル）す、支持体は可溶性又は不溶性の支持体で
ある。デキストランは好ましい可溶性の支持体であり特
に分子量の平均が２０．　ＯＯＯ〜ｓｏ、ｏｏｏのデキ
ストランがそうである。他の好ましい可溶性の支持体は
平均分子量が１０，０００〜ｓｏ、ｏｏｏのポリエチレ
ングリコールである。固体（不溶性）の支持体は交叉結
合したテキストラン、アガロース及びセルロースを含む
。

酵素処理の次に酵素は赤血球から除去されそして赤血球
は緩街液により洗滌されそして１５〜３０分間緩衝液と
接触させたままにしておき次に最後の洗滌を行うことに
より−１７，２〜７．４に再平衡される。洗滌はｐｌ（
を７．２〜７．４に調節しそして酵素及び遊離のＮ−ア
セチルガラクトースアミニダーゼを除去するという二つ
の目的のためである。

用いられうる洗滌溶液は下記の緩割液を含むものを含む
。濃度０．９％の塩化ナトリウム及び３部の一塩基性塩
に対する７部の二均基性塩の比の濃度０、　Ｏ］、　Ｍ
の燐酸カリウムを含む燐酸塩緩衝の食塩水。洗滌は２０
°〜２６℃好ましくは室温で少（とも３回好ましくは３
〜５回行われる。洗滌が洗滌溶液中に酵素の存在をもは
や認めなくなる迄行うべきであることを除いて洗滌の回
数については何も要求されない。

次に細胞はＩ■拌原の形でありイして輸血給法に用いら
れうる。輸血に用いろ］ゴ的のため絆ＩＫσけ生理学上
許各さ第１うろＭ１体により希釈されろ。生β１！学上
許容Ｌ５石奴体に０．９％）Ｆ、１化ナトリウムよりな
る滅菌等張性食ｎシ溶液及び０２％デキストロースを含
む滅菌等張性溶液をｆｉむ一般的に媒体中の細胞の濃度
は４０〜７０％好ましくけ４０〜４５％である。こねら
の条件は新しいしかも高火解し、たバックされた赤血球
の輸血に用いられろのに等Ｌ〜・０本発明の細胞は公知
のバックされた細ポリが輸血されるのと同じやり方で輸
血されうる。

−処ｆｌＪ４　後７　ｙ’　／　シ：／　−５’　−Ｅ
　ｔＡ酸（ＡＴＰ）含１１（が６０％以上残り２．３−
ジホスボグリセリン酸（２，３ＤＰＧ）含量か又６０％
以」二残ることが細胞代謝の研究で示される。これは細
胞の形のＩＢ持及び通常の酸素結合及び交換を行わせる
。

本方法により用いらＪする緩衝液及び培養条件は３時間
以内の培養で８０〜９０％又はそれ以上の保持のＡＴＰ
含引及び７０〜９０グの２，３　Ｄ　Ｐ　Ｇがある生成
物をもたらす。

酵素としてα−Ｎ−７セチルガラクトースアミニダーゼ
を用いることによりＨ活性へのＡｉｎｔ　−Ａ　２細胞
の完全な転換が得られた。この転換に必要な時間は酵素
に依存しそして酵素の量の増大により減少する。これら
の細胞、の顕微鏡的検査はそれらに大きな形態学上の異
常性がなくそしてそれらが球状赤血球円板赤血球交換を
しうろことを示す。

３膜成分、Ｒｈ　及びＭ及びＮ抗原及びシアル酸は元の
Ａ細胞と転換されたＨ細胞との間（（大きな変化を示さ
ない。又型Ａ２Ｂ細胞がこの酵素によりＢＨに転換され
るとき細胞のＢ活性の水準に変化がなくそしてＢ及び０
（Ｈ）細胞が酵素により影響を受けないそれらの活性を
有することが分っている。

転換された細胞は自己由来の血漿によりチェックされそ
して汎凝集化を示さない。

酵素が支持された酵素の形で用いられるとき転換が行わ
れるのが望まれる。好ましくは支持体は可溶性支持体で
ありそして最も好ましくは分子量２０、　ＯＯＯ〜ｓｏ
、ｏｏｏのデキストランである。

酵素は共有結合剤として臭化シアノゲンを用いて溶性支
持体に付着する。しかし未結合の材料から酵素デキスト
ランの共役を離すために粗製酵素標品なデキストランに
結合すイ）前にセファデックスＧ−Ｚｏｏゲル濾過を用
いる簡単な１′＃製法にがける必要があろう。精製条件
は完全に未結合材料のないデキストラン又は他の可溶性
支持体に共有的に結合した酵素の生成物の使用を可能に
する。酵素・可溶性支持体の共役例えば酵素デキストラ
ン共役は遊離の酵素標品と同じ特異性及び能力（赤血球
の表面からのＡ決定子の除去のための）を有しそして活
性の損失な１−に再使用されそして貯え、られうる。こ
の共役の使用は望ましい。そわはそれらが繰返して用い
られそ１．てそわらの使用が遊離の酵素が用いられると
きのような原料酵未材料中の不純物による副反応により
特徴付けられｔ［いからである。こわらの不純物は一層
容易にコントロールされてカップリングのために僅がｆ
部分的に精製された標品のみの使ｎｌを可能にする。

不動化された酵素は一層容易にそわらの基質から分離さ
れて遊離の酵素標品のグリコシダーゼ分子又は汚染蛋白
質の若干が非可逆的傾細胞構造に結合しそれにより潜在
的に抗体生成物質を導入するか又は細胞の膜を損するよ
うな厳しい洗滌面性の下においてのみ除去されうるよう
な可能性を最少にする。

新しいニワトリの肝臓から無関係の脂肪を取り去りそし
てアセトンによる抽出により又番丁凍結乾燥により脱水
する。乾燥且粉末になったニワトリの肝臓（１４０り）
を４℃ｐＨ４，Ｏの０．０１Ｍ酢酸ナトリウムと混合し
そして沈降（２〜１６時間）させられろ細い懸濁液を得
るためにブレンダー（１０〜３０分間）にかけられろ。

上澄み液の回収は遠心分離により行わ才する。次に固体
の硫酸アンモニウムを徐々に上澄み液に加えて濃度３０
％とする。得られた沈でん物を遠沈により除去し硫酸ア
ンモニウムを再び加えて最後の濃度を５０％として他の
酵素及び蛋白質の混合物の一部として用いられる酵素α
−Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼを含む沈でん
物を生ずる。沈でん物を遠心分離によりペレットとしｐ
）ｌ　５．　Ｏの０．０１Ｍ酢酸ナトリウムについて透
析して付着した硫酸アンモニウムを除去しそ１−でペレ
ットを溶解させる。溶解した混合物を先ずイオン交換ク
ラマドグラフィにかけ次にゲル濾過により汚染した物僧
を次にα−Ｎ−アヤチルガラクトースアミンダーゼから
分ける。特に１５００〜１８０　ｎ学位のα−Ｎ−アセ
チルガラクトースアミニダーゼを含む混合物がｐｉ（５
，０の０．　ＯＩ　Ｍ酢酸ナトリウムで平衡した陽イオ
ン交換剤カルボキシメチルセルローズ（ＣＭ−，５２Ｗ
）Ｉａｔｍａｎ　）のカラム（５Ｘ　Ｉ　Ｊｉｍ、３０
０．＋／）に適用される。０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（
ｐｌ＋　５．０　）゛によるカラムの洗滌ｔ−ｏ、　０
７　ｘｒ＋酎酸耐トリウムから０．２０　Ｍ酢酸ナトリ
ウム（＋１１１５．（＋）に及ふ線状の勾配が１Ｍ用さ
れ（そｔｌぞれ７５（ｉｎ／）α−Ｎ　−アセチルガラ
クトースアミニダーゼを含む蛋白質フラクションの溶離
をもたらす。このフラクションは次に０．０１Ｍ燐酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ６，０）について透析さ十１同一の
緩衝前に」：り平衡にさせられた陰イオン交換剤ジエチ
ルアミノエチルセファデックス（Ａ　−５０ｐｈａｒｍ
ａｃｊａ　）を含むカラム（２，５ＸＩ３ｆｆｉ、６０
ｇｎ１）に適用される。カラムを同一の緩？＆液により
洗滌するとα−アセチルガラクトースアミニダーゼ含有
フラクションが溶離しそれを濃縮し、そして多孔性アガ
ロース（セファデックスＧ　−１００Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ　）を含むカラ、ム（２，５Ｘ１０ぼ）を通すゲル濾
過にかける。酵素を含む溶離帯は濃縮さねそして今一度
ゲル濾過を行いこの時はカラム（バイオゲルＰ−１５０
゜ＢｉｏＲａｄ　；　２．５Ｘ１５０　）　（多孔質の
ポリアクリルアミド・アガロース混合物含有）を用いる
。得られた酵素フラクションは記述したようにＨ抗原性
へのＡｔｈｔ−Ａ２細胞の転換に用いられうろ。

ｐ）＋　５．７及び３２℃で７６％のα−Ｎ−アセチル
ガラクトースアミニダーゼの活性で存在するα−ガラク
トーシダーゼを除いて検出しうるエキソゲ劫 る。４°Ｃにおけるその等電点はエレクトロフォーカシ
ングによりめて７５〜７．８の間である。鳥類の肝臓か
らの酵素の標品は公知である（　ＷＯｎｇ及びＷｅｉｓ
ｓｍａｎ　＊　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｖｏｌ、
　１６．Ｎｏ、６＋１９７１　、１０６７〜１０７２　
ページ）が、この公知の方法はこの活性水準又はこのエ
キングリコシダーゼの不存在で所望の酵素をもたらさな
い。

中間体−Ａｚ７＆びＡ２Ｂ細胞は１９８１年８月に発行
されたそのリーフレット１−ＤＴ、−Ｃ−０１にＡＣ１
１ｇｅ〆ｎｉｃ＋ｓ　（Ｆより述べられたスライド方法
に、おいて抗Ａルクチンを用いることによりＡ１細胞か
ら区別される。本方法によねげ型Ａｔ及びＡ＋Ｂ５は１
分以内で激しく凝集する。中間体細胞は弱（凝集しそし
てＡ２及びＡ　２　Ｂ　Ｊｌｌｌ胞はこの間凝集性さ−
ない。

本発明の本質及びそｔ：を行う方法を一層良く説明する
ために下記の実施例が示されろ。添付図面は時間の関数
としての凝集単位の名でＪＩＩＢＭ胞のＨＢ細胞への転
換４・示しそ１〜てＡ抗原性が完全にＨ抗原性（「０細
胞」　）に転換されたこと及びＢ抗原性が一定に保たれ
そしてＨ抗原が０細胞の水準に増大することを示す。

実施例 前述の如く作られた酵素を用いＨ活性へのＡｉｎｔ−Ａ
２細胞の完全な転換及びＡ２Ｂ細胞のそれぞれのＨＢ対
応物への完全な転換が赤血球凝集定量により測定される
。この転換に必要な時間は再び酵素的に依存しそして酵
素の量の増加により減少し例えばＡｉｎｔＭ胞（０，１
ｍｌ　）のとき９０分（７単位）から６０分（１２単位
）３０分（１８単位）となる。この代表的な細胞の酵素
処理の結果は第１表に示される。処理条件は３２℃にお
ける等優性食塩水インキュベーションにおけるくえん酸
塩・憐＃塩緩衝液ｐ！（５，７（０，０２Ｍ＜えん酸及
び０．０６Ｍ二二塩性性燐酸ナトリウム及び低速のロー
タリーミキサーの使用を含む。

第　１　表 末 酵素処理人間赤血球からの抗原性活性の損失の

【図面の簡単な説明】

ル１困はＡ２Ｂ糸川胞のＨＲへの酵素嘔で換を示すグラ
フである。 代理人　弁理士　秋　沢　政　光 他１名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）（ａ）　Ａ抗原性の不存在 （ｂ）　天然に生ずるＡｔＢ細胞より大きいＨ抗原性（
   ｅ）　Ｂ抗原性の存在 （ｄ）　天然に生ずるＡｔ　Ｂ赤血球の６０〜９０％の
   アデノシン−５′−三燐酸（ＡＴＰ）含量を特徴とする
   型Ｂ赤血球よりｔ（る組成物。 （２）該赤血球が天然に生ずるＡ、　Ｂ赤血球の６０〜
   ９０％の２，３−ジホスホグリセリン酸（２，３ＤＰＧ
   ）含量を有する特許請求の範囲第（１）項記載の組成物
   。 （３）該赤血球が赤血球中の全ヘモグロビンの２〜６％
   のメト−ヘモグロビン含量を有する特許請求の範囲第（
   ２）項記載の組成物。 （４）該赤血球が天然に生ず７１　Ａ、　Ｂ赤血球の７
   ０〜９０％のＡＴＰ含量を看する特許請求の範囲第（３
   ）項記載の組成物。 （５）該赤血球が天然に生ずるＡＲＢ赤血球の８０〜９
   ０％のＡＴＰ含量を有する特許請求の範囲第（３）項記
   載の組成物。 （６）　（ａ）末端α−フコース部分、（ｂ）０抗原性
   、 （ｅ）　Ａ抗原性の不存在、 （ｄ）天然に生ずるＯ赤ｐｉｔ球の６０〜９０％のアデ
   ノシン−５′−三燐酸（ＡＴＰ）含量を特徴とする型０
   赤血球Ｊ：りなる組成物。 （７）、該赤血球が天然に生ずる０赤面球の７０〜９０
   ％のＡＴＰ＠量を有する特許請求の範囲第（６）項記載
   の組成物。 （８）該赤血球が天然に生ず７）　Ｏ赤血球の６０〜９
   ０％の２．３−ジホスホグリセリン酸（２，３ＤＰＧ）
   含量を有する特許請求の範Ｕ■第（６）項記載の組成物
   。 （９）該赤血球が天然に牛ずイ】０赤面球の７０〜９０
   ％の２．３　Ｄ　Ｐ　Ｇ含量を有する特許請求の範囲第
   （８）項記載の組成物。 ００）該細胞がＯ抗原性の存在を特徴とする特許請求の
   範囲第（６）項記載の組成物。 ｆｌｌ）　（ａ）　Ａｔ　ｎ　ｔ　４含有Ａ、　Ｂ赤血
   球をｐｉ４５．６〜５．８に平衡させ。 （ｂ）次に該赤血球中のＡ抗原をＨ−抗原に転換ゼ酵素
   とを接触させ。 （ｃ）該赤血球から該酵素を除去し、そして（ｄ）該赤
   血球をｐ）］　７．２〜７．４に再平衡させることより
   なるＡｉｎｔ−ＡＨ含有Ａ、Ｂ赤血球をＨ抗原型の赤血
   球に転換させる方法。 ０力　該Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼが鳥類
   の肝臓より得られたものである特許請求の範囲第０１項
   記載の方法。 （１３）　該α−Ｎ−７セチルガラクトースアミニダー
   ゼがｐＨ４及び３７℃で１ｆｎｌ当り２４〜３０単位の
   酵素活性を有する特許請求の範囲第（１２１項記載の方
   法。 αａ　該Ｎ−アセチルガラクトースアミニダーゼがｐＨ
   ５，７及び３２°Ｃで蛋白１　ｔｎｌ当り３〜４酵素単
   位を有する特許請求の範囲８１￥（１２１項記載の方法
   。 ０勺　該酵素が４℃で７５〜７８の間の等？１ｆ、点を
   有する特許請求の範囲第（１濁項記載の方法。 ００　該酵素が遊離の酵素の形で））る特ｆｌ−請求の
   範囲第０力項記載の方法。 ０η　該酵素が支持された形で本する特許請求の範囲第
   ０力項記載の方法。 ０印　該支持体が可溶性支持体である特許請求の範囲第
   ０９項記載の方法。 ０１　該支持体が不溶性支持体で滲・る特許請求の範囲
   第Ｏｎ項記載の方が；。 （イ）　Ｂ型でないＡｉｎｔ−Ａ、細胞がＴＩ抗原型に
   転換される特許請求の範囲第（１２項記１敗の方法。