KR870001375B1 - 글리코사이드결합 관련항원의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
제1도는 렉틴-GGF항체결합분석의 제1반응(GGF항체와GRA-2간의 반응)에 있어서 단당류의 첨가에 따른 효과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 암세포에서 유도된 글리코사이드결합 관련항원(이하에서는 GRA라 칭한다)의 신규 제조방법에 관한 것이다.
영국특허원 제 2106935A호(상응특허 : 일본국특허원 제 1420/84호에 기술된 바와같이, GRA는 말단갈락토즈 및 또는 말단 N-아세틸 갈락토사민에 결합가능한 렉틴에 결합할 수 있는 암세포 막성분이며, 숙주에 대해 면역원으로 작용하고, 암세포에 대해 선택적인 면역반응을 유발하여 암의 치료 및 예방에 탁월한 효과를 나타낼 정도로 아주 높은 면역생성능을 갖는 것으로 알려져 있다.
상기와 같은 기술조건하에 집중적으로 연구한 결과, 이하에 기술되는 모노클로날 항체 GGF에 의해 인식될 수 있는 에피톱(epitope)이 상기 언급된 GRA의 특정글리코사이드 결합구조중에 존재하며 말단퓨코즈 글리코사이드 결합구조에 대한 친화성을 이용한 분리법을 사용하여 GRA를 효과적으로 수득할 수 있음을 알게 되었다.
그러므로, 본 발명은 말단퓨코즈 글리고사이드 결합에 대한 친화성을 이용하여 암세포막 성분에서부터 GRA를 제조하는 신규방법에 관한 것이다.
본 발명은 말단퓨코즈 글리코사이드결합에 대한 친화성을 이용하는 통상의 물리화학적 또는 생화학적 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 더욱 특히, 본 발명은 암세포막 성분을 말단퓨코즈 글리코사이드결합구조에 대한 친화성을 갖는 물질로 처리하여, 이 물질에 GRA를 결합시킨후 이로부터 GRA를 유리시켜 수행할 수 있다.
상기와 같은 방법으로서 여러가지 기술이 사용될 수 있다. 이와같은 기술의 예에는 친화성 크로마토그라피 및 면역침전법과 같은 통상의 기술뿐만 아니라. 겔여과, 전기영동, 투석 및 당단백 침전제(예 : 폴리에틸렌글리콜, 아세톤)를 사용하는 물리적 침전법과 같은 일반적으로 사용되는 정제기술 및 이들 방법의 조합이 포함된다.
본 발명의 원료물질로 사용되는 암세포막 성분은 특정한 것으로 한정되어 있지는 않지만, 배양암세포, 이식된 암세포, 본태성 암세포, 화학적 또는 바이러스유동성 암세포 및 수술조직에서 유도된 암세포와 같은 인체 또는 동물암세포에서 통상의 기술에 따라 제조하여 사용할 수 있다. 암세포막 성분의 분리는 균질화법 또는 가용화제를 사용하는 가용화법과 같은 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 이 공정은 바람직하게는 암세포를 생리적 식염수 또는 적절한 완충액중에 균질화시킨후 생성된 침전물을 원심분리 등에 의해 분리하여, 수득된 침전물을 가용화제의 존재하에 생리적 식염수 또는 완충액에 용해시킨 다음 원심분리 등의 방법에 의해 상등액을 분리하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 공정에서 세포막을 용해시키는 것으로 알려진 여러가지 계면활성제를 가용화제로 사용할 수 있다. 이와같은 계면활성제의 예에는 트리톤 X-100(wakopure Chemical Industries Ltd. 제품), NP-40(Shell Co. 제품), 디기토닌 또는 요소등과 같은 비이온성 계면활성제 : 나트륨도데실 설페이트(SDS)와 같은 음이온성 계면활성제가 포함된다.
본 발명의 공정은 친화성 크로마토그라피를 이용하는 양태를 한 예로들어, 이하에서 보다 상세히 설명된다.
친화성 크로마토그라피에 사용되는 컬럼담체는 말단퓨코즈를 결합시킬 수 있는 물질을 불용성 지지체상에 고정시켜 용이하게 수득할 수 있다. 이와같은 물질은 말단퓨코즈를 결합시킬 수 있는 물질로, 예를들면 로투스 테트라고노로부스-렉틴(Lotus tetragonolobus-lectin (Brt. J. Exp. Pathol. 34,94(1953), 울렉스유로피우스-렉틴[Ulexn europeus-lectin (Blood, 9, 1195(1954)]등과 같은 퓨코즈-결합성 렉틴 : SSEA-1(Biochem, Biophys, Res. Commun 100, 1578-1586(1981) ZWG29, 13.14.111(Arch. Biochem Biophys 217, 647-651(1982)) 538F 12, F8(Arch. Biochem. Biophys. 220, 318(1983)), VEP 8,9(Eur. J. Immunol. 13, 306-312(1983)), MY-1(Blood, 61, 1020-1023(1983)) , GGF등과 같은 퓨코즈-결합성항체이다. 이들 중에서 바람직한 것은 글리코사이드 결합구조 III3VFuc2nLc6에 대한 친화성을 갖는 물칠이며[참조 Biochem. Biophys. Res. Commun., 109(1)p.36-44(1982)](디퓨코실 글리코사이드 결합구조), 예로는 하기 기술되는 참조실시예에 따라 제조되는 GGF-항체를 들 수 있다.
GGF항체는 III3V3Fuc2nLc6및 III3V3Fuc2nLc8에 대해 반응성을 가지나 III3FucnLc4에 대해서는 반응성을 갖지 않는 것으로 특징지워지는 모노클로날 항체이다. 글리코사이드결합에 대해 상기와 같은 특이한 활성을 갖는 항체는 신규하며 본 발명자들에 의해 최초로 제조되었다.
불용성 지지체상에 상기 언결된 말단퓨코즈-결합성 물질을 고정시키는 조작(고정화)은 공지된 생물체 고정법에 의해 수행할 수 있다. 이들 방법중에서, 시아노겐 브로마이드로 활성화된 다당류를 사용하는 방법 및 N-하이드록시석신이미드 에스테르를 사용하는 방법에 의해 고정시키는 것이 바람직하다. 시아노겐 브로마이드로 활성화된 다당류를 사용하는 방법은 불용성 지지체를 시아노겐 브로마이드로 처리한 후 생성된 활성화물질을 완화한 조건하에 말단퓨코즈-결합성물질과 커플링시켜 언급한 말단퓨코즈-결합성물질을 지지체에 고정시키는 단계로 이루어진다. 불용성 지지체를 시아노겐 브로마이드로 처리함에 있어서, 지지체를 물 또는 아세토니트릴중, 실온에서 수산화나트륨 또는 중탄나트륨과 같은 염기성화합물로 pH7.5내지 12로 유지시키거나, pH약 8.7의 0.1M중탄산나트륨용액 또는 pH약 7.7의 0.01M인산환충액과 같은 pH7,5내지 12의 완충액 중에서 약 1내지 12분간 처리할 수 있다. 시아노겐 브로마이드의 사용량은 일반적으로 불용성 지지체의 중량과 거의 같다. 불용성 지지체로는, 일반적으로 생물체에 대해 비선택적 흡착성이 낮고 다공성이 크며 완화한 조건하에 생물체를 고정시킬 수 있는 작용성그룹을 함유하고 물리화학적으로 충분히 안정화된 불용성 지지체이면 어떤 것이나 사용할 수 있다. 불용성 지지체의 예에는 아미노에틸 셀룰로즈, 카복시메틸 셀룰로즈, 브로모아세틸 셀룰로즈 또는 p-아닐리노 셀룰로즈와 같은 셀룰로즈 지지체 : 세파덱스 또는 CM-세파덱스(pharmacia 사제품)등과 같은 가교결합된 덱스트란 지지체 및 세파로즈 2B, 세파로조 4B 또는 세파로즈 6B(pharmacia 사제품)와 같은 아가로즈 지지체가 포함된다. 시아노겐 브로마이드로 활성화된 지지체를 말단퓨코즈-결합성물질과 커플링시킬 경우에, 시아노겐 브로마이드로 활성화된 지지체는 말단퓨코즈-결합성물질중량의 30내지 80배의 양으로 사용하고 반응은 0.1M중탄산나트륨 수용액(0.5M 염화나트륨을 함유, pH8.4)과 같은 적절한 용매중, 일반적으로 0내지 40℃, 바람직하게는 2내지 8℃에서 약 10내지 20시간동안 수행한다. 이와같은 방법으로 말단퓨코즈-결합성 물질을 함유하는 친화성 크로마토그라피용 담체를 수득할 수 있다.
상기 설명된 말단퓨코즈-결합성 물질을 함유하는 친화성 크로마토그라피용 담체를 이용하는 크로마토그라피법에 따라, 목적하는 GRA를 전술된 담체중의 말단퓨코즈-결합성 물질에 결합시킴으로써 컬럼상에 포착시킬 수 있다. 다음에 말단퓨코즈-결합성 물질을 결합시킬 수 있는 물질을 컬럼에 통과시키거나 고농도의 염용액, 칼륨티오시아네이트, 수용액, 붕산완충액 또는 염산-글리신 완충액(pH2.7)과 같은 흡착성 분리제(용출제)를 컬럼에 통과시켜 GRA를 분리시키는 교환반응을 수행함으로써 GRA를 수득한다.
상기 교환-반응에 사용되는 말단퓨코즈-결합성 물질을 결합시킬 수 있는 물질에 예로는 퓨코즈, 말단퓨코즈-함유 이당류 및 올리고사카라이드를 들 수 있다.
본 발명에 따라 상기 기술된 바와 같이 수득된 GRA는 말단퓨코즈 글리코사이드결합 구조를 갖는 당단백질의 함유한다. 이 GRA는 필요하면 통상의 방법에 의해 더 정제하거나 동결건조시킬 수 있다. 예를들면, 수득된 GRA를 말단 갈락토즈 및/또는 말단 N-아세틸갈락토사민을 결합시킬 수 있는 렉틴으로 처리하여 렉틴에 결합된 형태로 GRA를 분리할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 암세포막 성분대신 GRA는 출발물질로 사용하여 이전에 수득된 GRA를 정제하기 위한 수단으로 사용할 수도 있다. 이 공정 또한 본 발명의 범위내에 포함한다.
전술된 바와같이, 본 발명의 방법에 따라 수득된 GRA는 암세포에 대해 선택적인 면역반응을 유발하는 면역생성력이 매우 높으며 암치료 및 예방에 우수한 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명은 상기GRA를 열처리하여 수득된 열변성된 항원(이하에서는 "변성된 GRA"라 칭한다)을 제조하는 방법도 제공한다.
열변성된 GRA는 암이 유발된 숙주의 체액면역성의 유발을 억제하여 항체생성능이 낮아지도록 하며 암세포에 대해 선택적인 강한 세포조절 면역성을 나타낼 수 있게 하는 특성을 갖는다.
일반적으로, 암에 대한 면역반응(육종억제)은 주로 세포조절성 면역에 근거하기 때문에, 항원을 차폐하거나, 단독으로나 또는 면역복합체를 형성하여 면역반응의 억제인자(차단항체)로 작용시키거나, 항원분포를 변화(항원성 조절)시킴으로써 암관련 항원에 대한 항체에 의해 유발되는 체액면역성은 생체의 면역감독기전을 파괴할 뿐만 아니라 육종의 성장을 가속화시켜 숙주에 대해 불리하게 작용하는 경우가 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 전술된 득성을 갖는 열변성된 GRA는 암예방 또는 치료제로 매우 바람직하다. 또한 열변성된 GRA의 효과는 농도에 대한 의존도가 낮기 때문에 광범위한 용량범우로 암치료 및 예방에 사용될 수 있다.
GRA의 가열처리는 GRA의 단백질성분을 변성시킬 수 있으나, 글리코사이드결합은 변성시키지 않는 통상의 가열조건하에서 수행한다. 예를들면, 이 처리는 GRA를 물, 생리적 식염수 또는 인산완충액과 같은 용매중, 약 60내지 120℃, 바람직하게 90내 110℃에서 5내지 60분, 바람직하게는 10내지 20분간 가열하여 수행한다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 열변성된 GRA는 변성되지 않고 글리코사이드 결합구조 부분과 열변성된 단백질부분으로 이루어진 당단백질이다.
림프구를 본 발명의 방법에 따라 수득된 GRA또는 열변성된 GRA로 감작시킬 경우, 킬러(killer)세포가 생성된다.
상기에서 사용되는 림프구는 특별히 한정되는 것은 아니며 인체 또는 동물의 정상 림프구 또는 암이 유발된 림프구이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 이의 예로는, 말초혈, 골수, 림프절, 비장, 편도선 및 흉선 등에서 유도된 림프구를 들 수 있다. 이들 림프구는 물리적 또는 화학적 방법 또는 표면막 방법에 의해 분리할 수 있으며, 킬러세포 유도방법에 사용할 수 있다.
GRA또는 열변성된 GRA에 의한 림프구의 감작은 GRA또는 열변성된 GRA를 함유하는 배지 중에서 림프구를 수시간 내지 10일, 바람직하게는 1내지 5일단 배양시켜 수행할 수 있다.
이와같은 종류의 세포배양에 통상 사용되는 각종 배지를 사용할 수 있다. 사용하기에 바람직한 배지의 예로는 인체혈청, 태생송아지혈청(FCS), 송아지혈청 또는 말혈청을 가한 RPMI-1640배지 및 이글 MEN배지를 들 수 있다. 배지에 가해지는 GRA또는 열변성된 GRA의 양은 1×106림프구/㎖을 기준으로 하여 단백질로서 0.1내지 2000mg/㎖, 바람직하게는 1내지 1000mg/㎖의 양이 바람직하다.
배양은 예를들면 37℃ 및 pH7.2정도에서 통상의 방법으로 수행한다.
생성된 킬러세포는 T-세포 성장인자(TCGF, IL-2)를 함유하는 상기 언급된 배지중에서 무한정 증식시킬 수 있다. 이때 통상의 제한희석법에 의해 킬러세포의 클로닝을 선별 배양할 수 있다. 킬러세포는 예를들어 액체질소 중에서 보존하면 장시간동안 안정하게 보존할 수 있다.
생성된 킬러세포는 거의 정상 림프구이며, GRA에 대한 선택적 세포독성을 갖는 사시로 특징지워진다.
본 발명방법에 따라 전술된 바와같이 제조된 GRA 및 열변성된 GRA는 항암제로 유용하다. GRA 및 열변성된 GRA는 단독으로활성성분으로서 사용하거나, 다른 항균제 및/또는 항암제와 같이 사용할 수 있다. 본 발명방법에 따라 제조된 GRA또는 열변성된 GRA를 활성성분으로 함유하는 항암제는 주성분으로 유효량의 GRA또는 열변성된 GRA를 함유하기만 한다면, 어떤 형태로도 가능하다. 일반적으로 이들 항암제는 리포솜-함유상태, 용액, 현탁액 또는 유탁액의 상태로써 정맥주사, 피하주사 또는 근육주사로 투여할 수 있다. 특히 리포솜-함유형태가 바람직하다. 또한 이들 항암제는 사용하기 전에 적절한 담체를 가하여 액화시킬 수 있는 건조상태로 제공될 수도 있다. 이와같은 액제는 메틸 셀룰로즈와 같은 현탁화제, 레시틴과 같은 유화제, 메틸p-하이드록시 벤조에이트와 같은 방부제 및 인체 및 동물의 면역작용에 부작용을 나타내지 않는 안정제 또는 완충액을 함유할 수 있다. 수성매질로 생리적 식염수를 사용하고, 비수성매질로는 호마유와 같은 식물성유, 파라핀과 같은 광유, 스퀄렌과 같은 동식물성유 및 프로필렌글리콜 등을 사용할 수 있다. 또한 이와같은 액제에는 프로인트 완전보조제, 동물용 사포닌 및 인체용 수산화알루미늄과 같은 면역성증가를 위한 보조제가 함유될 수 있다.
상기 기술된 항암제는 암환자에게 치료용으로 장기간에 걸쳐 1회 또는 수회에 투여하거나 암이 심해질 우려가 있는 사람에게 암의 진행을 방지하기 위해 투여할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 GRA 및 열변성된 GRA는 독성이 낮기(마우스에 복강내투여시 LD50은 당으로 500mg/kg 이상)때문에 광범위한 용량범위로 투여할 수 있다. 따라서, 항암제중 GRA또는 열변성된 GRA의 양은 특별히 한정되는 것은 아니나, 일반적으로 당으로 0.001내지 100㎍/㎖의 범위내에서 사용하는 것이 바람직하다. 투여량은 병의 상태, 나이 및 성별에 따라 결정되며 1일에 0.001내지 1000㎍/kg을 1회 내지 수회 투여하는 것이 바람직하다.
또한 상술된 바와같이 수득된 킬러세포를 항암제로 사용할 수도 있다. 이와같은 항암제는 이와같은 종류의 혈액시약에 사용되는 담체와 함께 주사제로 사용하는 것이 바람직하다. 이와같은 담체는 특별히 한정되는 것은 아니나, 혈액과 등장성인 담체(바람직하게는 생리적 식염수)을 사용하는 것이 바람직하다. 킬러세포를 사용하여 항암제를 제조할 경우, 킬러세포를 생리적 식염수로 충분히 세척하여 상기 기술된 배지를 제거한후 담체에 현탁시키는 것이 바람직하다.
상기 기술된 항암제중 킬러세포의 농도는 특별히 한정되는 것은 아니나, 105내지 109세포/㎖의 범위로 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 또한, 108세포/마우스의 양으로 투여(복강내로)했을 때 킬러세포의 독성은 관찰되지 않았다. 투여량은 병의 정도, 나이 및 성별에 따라 결정되지만 1일 105내지 1012세포/kg의 양으로 1회 내지 수회 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명은 하기 실시예, 참고실시예 및 시험에서 상세히 설명되나 본 발명이 이들에만 제한되는 것은 아니다.
하기에서 사용된 암세포는 모두 공지된 것으로 니이가타 대학실험실[Niigata University(Dr. Suzuki. assistant professor) 및 일본면역조사 래보러토리즈 캄파니 리미티드[Japan Immunoresearch Laboratories CO., Ltd.]에서 입수하였다.
[참고실시예 1]
(1) 영국특허 제 2106935A호에 기술된 GRA를 5㎍(단백질로서)의 야으로 프로인트 완전보조제와 함께 사용하여, 2주일에 1번 정도로 피하투여함으로써 Balb/c마우스를 면역시킨다. 3번째 면역시키고 3일후 비장을 적출한 다음 비장세포를 RPMI1640배지로 3회 세척한다. 마우수골수종 셀라인 SP2("Rinsho Meneki"vol. 13, No. 11, pp.912-919,1981)를 전술한 바와 유사한 방법으로 세척하고 SP2세포(1×107개) 및 전술된 비장세포(4×107개)를 원심분리관에 넣고 혼합한다. 원심분리(200×g.5분)한 후 파스퇴르 피펫을 사용하여 상등액을 제거한다. 다음에는 45% w/v%의 폴리에틸렌글리콜 4000(Sigma Co.제품)을 함유하며 37℃로 보유된 RPMI-1640배지 1㎖를 적가하고 2분간 완화하게 혼합한다. 15% FCS 및 1mM피루베이트를 함유하며, 37℃로 유지된 RPMI1640(이하에서는 "완전 RPMI-1640"이라함) 1㎖를 적가하고 1분간 완화하게 교반한후 동량의 완전 RPMI-1640을 적가하고 1분간 완화하게 교반한후 다시 8㎖의 완전 RPMI-1640을 적가하여 2분간 완화하게 교반시킨다. 생성된 혼합물을 원심분리(200×g,5분)시키고, 상등액을 제거한후 잔존하는 내용물을 1×107세포/㎖의 양으로 37℃로 유지된 완전 RPMI-1640에 현탁시킨다. 수득된 현탁액 100㎕를 각각 마이크로테스트-Ⅱ 플레이트(Falcon Co. 제품)중에 접종하고 5%CO2를 함유하는 배양기종, 37℃에서 배양시킨다. 24시간후, 1.0×10-4M 하이포크산틴, 4.0×10-7M 아미노프테린 및 1.6×10-5M 티미딘을 함유하는 상기 언급된 완전 RPMI-1640(이하에서는 "HAT"배지라 함) 100㎕를 각각의 웰에 가한다. 다음에, 각 웰에 들어있는 상등액의 반을 제2일, 3일, 5일 및 11일째에 새로 만든 HAT배지로 바꾸고, 제14일째에는 상등액의 반을 동일한 방법으로 1.0×10-4M 하이포크산틴 및 1.6×10-5M 티미딘을 함유하는 완전 RPMI-1640(이하에서는 "HT배지"라 함)으로 바꾼다. 같은 방벙으로, 18일, 22일, 25일 및 26일째에 상등액의 반을 새로 만든 HT배지로 교환하고 제28일째에는 상등액의 반을 새로 만든 완전 RPMI-1640으로 교환한다. 다음에, 완전 RPMI-1640중에서 증식시킨다. 이와같은 방법으로 수득된 하이브리도마를 제한 희석-배양법에 의해 클론화한다. 상술하면, 완전 RPMI-1640배지를 1㎖당 3개의 하이브리도마세포 및 1× 107개의 Balb/c마우스 흉선세포를 함유하도록 조정하고 각 웰당 용적이 0.2㎖인 96개의 웰을 함유하는 플레이트[Dynatech Laboratory Co. 제품] 중에 이식시켜 배양시킨다. 증식된 하이브리도마를 유사한 방법으로 다시 클론화한다. 목적하는 항체를 생성할 수 있는 클론을 확인하기 위해, 토끼항-마우스 면역글로블린[kappel Co. 제품]및125I-프로테인 A[Sigma Co. 제품]를 사용하는 고체상 방법에 따라 10ng/웰의 정제된 III3FucnLc4III3V3Fuc2nLc6또는 III3V3VII3Fuc3nLc8.30ng/웰의 콜레스테롤 및 50ng/웰의 레시틴으로 코팅한 96-웰 플레이트를 사용한다. 이와같은 방법으로 클론 No. GGF로 표시된 목적 하이브리도마가 수득된다.
(2) 상기 (1)항에서 수득된 클론 No. GGF의 하이브리도마를 완전 RPMI-1640배지 중에서 5% CO2를 함유하는 배양기에 넣어 37℃에서 48시간동안 배양시킨다. 배양용액을 원심분리(3000rpm. 10분)시켜 모노클로날항체(이하에서는 "GGF"라 칭함)를 함유하는 배양상등액을 수득한다.
(3) 상기 (1)항에서 수득된 클론 No. GGF하이브리도마 세포 1×106개를 0.5㎖의 RPMI-1640배지에 현탁시켜 Balb/c마우스에 복강내 투여한다. 2내지 3주후, 축적된 복수를 채취하고 항체 GGF를 함유하는 복수 2내지 5㎖/마우스를 수득한다. 이 항체의 농도는 약 0.5mg/㎖이다.
(4) 면역글로블린등급(class)
각종 마우스 면역글로블린등급에 대한 토끼항체[Litton. Bionetico. Inc. Kensington. MD20795]및125I-표지프로테인 A를 사용하여 이에 등(Yeh et al.)의 방법에 따라 분류한다[Ming-Yang Yeh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 76, No. 6, pp.2627-2931,1979]. 결과적으로 GGF가 IgG3서브-클래스에 속하는 것으로 입증되었다.
(5) 여러 종류의 당지질 항원에 대한 항체 GGF의 반응성
(a) 정제된 항원으로 III3FucnLC4III3V3Fuc2nLc6또는 III3V3VII3Fuc3nLc8[Biochem. Biophys. Res. Commun., 109, (1), pp.36-44, 1982]를 사용한다. 상기(2)항에서 수득된 항체(및 이를 단계적으로 희석한 시료)를 콜레스테롤(30ng/웰) 및 레시틴(50ng/웰)[Coster Co. 제품]으로 코팅한 비닐스트립[Coster Co. 제품] 10ng/웰에서 상기 항원과 반응시킨다. 웰을 PBS로 세척한 후, 제2항체로 토기항-마우스 면역글로블린을 사용하고 이어서125I-프로테인 A를 사용하여 정제된 항원에 결합된 항원에 결합된 항체를 측정한다. 방사계수법에 준하여 결합율을 계산한다. 결과적으로, 항체 GGF는 III3V3VII3Fuc2nLc6및 III3V3VII3Fuc3nLc8에는 반응성을 가지나 III3FucnLc4와는 반응하지 않음이 입증되었다.
(b) 렉틴-GGF결합분석의 제1반응에 대한 단당류 첨가효과
하기 설명되는 바와 같은 방법으로, 단당류를 가했을 때 렉틴-GGF결합분석의 제1반응(모노클로날 항체와 GRA-2간의 반응)에 대한 효과를 조사한다. 결과는 제1도에 나타낸 바와 같다. 이와 관련하여, 단당류 대신 III3V3Fuc2nLc6또는 III3V3VII3Fuc3nLc8을 사용할 경우 렉틴-GGF결합이 억제되었음을 알 수 있다.
측정방법 :
(1) 모노클로날 항체 GGF로 코팅한 폴리스티렌비드(bead)각각을 각 분석관에 넣는다.
(2) 0.1㎖의 GRA 2용액과 당*(하기 참조)을 각 분석관에 가한다.
*당농도 : 퓨코즈(600㎍) 및 갈락토즈(6mg)
(3) 또한 1mM-Mgcl2, 0.1% HSA 및 0.1M NaCl을 함유하는 10mM인산완충액(pH7.0)0.6㎖를 가한다.
(4) 상기 물질들을 혼합한 후 실온에서 3시간동안 배양시키고 4℃에서 24시간동안 배양시킨다.
(5) 각 비드를 하기 성분으로 함유하는 세척완충액으로 5회 세척한다.
(6) 다음에 0.5㎖의 세척완충액 및 0.1㎖의 PNA-POX용액을 각 분석관에 가하고 혼합한다.
(7) 실온에서 2시간동안, 이어서 4℃에서 18시간동안 배양시킨다.
(8) 0.85%염수로 5회 세척한다.
(9) 각 비드를 새로운 분석관을 옮기고 여기에 2㎖의 0.85%염수와 과산화수소를 최종농도 0.03%가 되도록 가한 3mg/㎖의 오르토-페닐디렌아민용액(pH5.8의 시트르산 완충액중에 용해) 0.5㎖를 가한다.
(10) 혼합한 후 실온에서 30분간 배양시킨다.
(11) 1㎖의 3N-HCI을 가하고 반응을 종결시킨다.
(12) 분광광도계를 사용하여 각 샘플의 흡광도를 492nm에서 측정한다.
(c) 각종 인체세포에 대한 반응성 :
플레이트상에 고정된 세포를 5%소혈청 알부민-함유인사 완충염수액(pH7.4)으로 1시간동안 처리한 후 항체 GGF(상기 (3)항에서 수득된 100백-희석항체(를 가하고 18시간동안 배양시킨다. 다음에 플레이트상의 세포를 제2항체로서 마우스 IgG3과 반응할 수 있는 FITC-표지 토끼항체(JIMRO Co. 제품)를 1000배 희석한 것으로 처리한다.
결과는 표1에 기재하였으며 "양성율"은 염색세포의 백분율이다.
[표 1]
[참고실시예 2]
(1) 3g의 CNBr-활성화 세파로즈 4B(Pharmacia Co. 제품)를 1mM-HCI로 충분히 세척한 후 200㎖의 0.1M 중탄산나트륨(pH8.5)중에 현탁시킨다. 여기에 20mg의 로투스 테트라고노부스렉틴을 함유하는 0.01M 인산염완충액(pH=7.7) 5㎖를 가한 다음 25℃에서 2시간 동안 때때로 교반시키면서 반응을 수행하여 불용해 렉티(로투스테드라고노로부스렉틴)-세파로즈를 수득한다.
(2) 참고실시예 1-(2)에서 수득된 2㎖의 항체 GGF에 5g/15㎖의 브로모시안 세파로즈(Pharmacia Co. 제품) 및 0.5M의 NaCl을 함유하는 0.1M 중탄산나트륨 수용액(pH=8.3)을 가한 후, 생성된 혼합물을 2시간동안 교반시켜 불용해 항체(GGF-세파로즈)를 수득한다.
[실시예 1]
(1) 약 5g(습윤중량)의 KATO-III세포를 분쇄기(Waring Blender)에 의해 50㎖의 PBS중에 균질화한다. 원심분리(100,000×g, 1시간)에 의해 수득된 침전물을 2%의 트리톤 X-100, 2mM의 MgCl2. 2mM의 CaCl2및 0.85%의 NaCl을 함유하는 0.01M 트리스-염산완충액(pH7.6)50㎖에 교반시키면서 가한다. 원심분리(100,000×g, 1시간)에 의해 수득된 상등액을 0.015%의 트리톤 X-100,2mM MgCl2,2mM CaCl2및 0.85%의 NaCl을 함유하는 0.01M트리스-염산완충액(pH7.6)으로 평형화시킨 불용해 렉틴컬럼(Φ0.8×15cm)[참고실시예2-(1)에서 수득된 담체]에 충진한다. 동일한 완충액으로 세척한 후, 0.1M의 퓨코즈를 함유하는 동일한 완충액으로 용출시키고 용출물을 0.85% NaCl수용액(5ℓ×3,2)으로 투석시킨다. 농축(CX-10초여과기 : Millipore Co)시킨 후, 여과(0.2㎛여과기 : Amicon Co.)시켜 GRA용액을 수득한다. 단백질의 양은 1.5mg이고, 당의 양은 1.6mg이며 생성물을 "TCA-1"이라 명명한다.
(2) 상기 언급된 과정(1)에서 KATO-III세포대신 약 10g의 QG-90세포를 사용하고, 상기 언급된 참고실시예 2-(2)에서 수득된 불용해 항체컬럼(용출제 : 0.2M염산-글리신 완충액, pH2.7)을 담체로 사용하여 유사한 방법으로 처리함으로써 GRA용액을 수득한다. 단백질의 양은 570㎍이며, 당의 양은 500㎍이고, 이를, "TCA-2"라 명명한다.
(3) 상기 언급된 참고실시예 2-(2)에서 수득된 불용해 항체칼럼을 0.015%의 트리톤 X-100, 2mM의 MgCl2, 2mM의 CaCl2및 0.85%의 NaCl을 함유하는 0.01M트리스-염산완충액(pH=7.6)으로 세척하고 영국특허원 제 2106935A호에 기술된 GRA-1을 300㎍(단백질로서)의 양으로 적용시킨다. 동일한 완충액으로 세척한 후, 0.2M염산-글리신 완충액(pH=2.7)으로 용출시켜 GRA용액을 수득한다. 단백질의 양은 200㎍이고 당의 양은 22㎍이며 생성물은 " TCA-3"으로 명명한다.
(4) 상기 과정(3)에서 GRA-1대신 영국특허원 제 2106935A호에 기술된 GRA-8을 20㎍(단백질 량으로)의 양로 사용하고 유사한 방법으로 처리하여 GRA용액을 수득한다. 단백질의 양은 15㎍이고 당의 양은 13㎍이며, 생성물을 "TCA-4"라 명명한다.
[실시예 2]
(1) 상기 언급된 실시예1-(1)에서 수득된, 단백질량으로서 100㎍의 TCA-1을 함유하는 생리적 식염수를 열수욕 중에서 100℃로 10분간 가열하여 열변성된 GRA를 수득한다. 생성물을 "TCA-1"라 명명한다.
(2) 상기 과정(1)에서, TCA-1대신 TCA-2 내지 4를 사용하고 유사한 방법으로 처리하여 하기 표 2에 나타낸 바와같은 열변성된 GRA를 수득한다.
[표 2]
[참고시험 1]
(1)건강한 성인으로부터 피콜팩(Ficollpack, Pharmacia Co.)을 사용하여 원심분리시켜 수득한 말초혈림프구를 10%의 FCS를 함유하는 RPMI-1640배지로 조정하여 1.5×106세포/㎖가 되도록 한다. 이중 10㎖에 TCA-2를 가하여 단백질의 양이 25ng/㎖가 되도록 하고, 탄산가스 배양기 중에서 48시간동안 37℃로 배양시켜 킬러세포를 수득한다.
이와 별도로 TCA를 가하지 않고(대조) 동일하게 조작하여 킬러세포를 수득한게.
(2) 상기 (1)항에서 수득된 킬러세포를 RPMI-1640배지로 2회 세척한 후 (1000rpm. 10분), 10% FCS를 함유하는 동일한 배지로 1.5×106세포/㎖가 되도록 조정하고, 이를 "주효세포(E)"라 명명한다. 표적세포(T)로는, 상기 언급한 배지로 2회 세척한 다우디(Daudi)를 10%의 FCS를 함유하는 동일한 배지로 1.5×106세포/㎖가 되도록 조정한 것을 사용한다.
100㎕의 상기 언급된 E와 100㎕의 T를 혼합한다. 혼합물을 37℃에서 1시간동안 배양시킨 후, 혼합물을 함유하는 시험관을 빙수에 넣어 반응을 중지시키고 0.2%트리판 블루로 염색하여 생존 세포 수를 측정한다. E의 킬러활성은 하기 식으로 계산한다.
킬러활성(%)=[(대조 E사용시의 세포수)-(시험군의 세포수)]/(E'+T')
상기식에서, E'는 100㎕의 E를 37℃에서 1시간동안 배양시킨 후의 생존세포수를 나타내고, T'는 100㎕의 T를 37℃에서 1시간동안 배양시킨 후의 생존세포수를 나타낸다.
상기 시험결과, E의 킬러활성은 평균 20.5%였다.
(3) 상기(1) 및 (2)항과 유사한 방법으로, TCA-1, TCA-3, TCA-4, TCA-1H, TCA-2H, TCA-3H 및 TCA-4H에서 유도된 킬러세포의 킬러활성을 계산하면 매경우마다 상기와 거의 같은 활성이 나타난다.
[참고시험 2]
(1) 실시예 2에서 수득된 TCA-3H를 생리적 식염수로 조정하여 단백질이 양이 100ng/㎖되도록 한다. 생성물을 항암제 1호로 명명한다.
(2) C57BL/6마우스(Charles liver. 숫컷 5W)에서 유도된 LLC세포 1×104개를 C57BL/6마우스의 꼬리정맥에 주사한다. 주사하고 6일 경과후에, 항암제 1호를 상기 마우스에 1일에 1㎖/마우스의 양으로 꼬리정맥에 3일간 계속 투여한다. LLC세포를 주사하고 22일 후, 폐를 적출하고 LLC의 폐착상 여부를 육안으로 관찰하며 폐의 중량을 측정한다. 대조군으로 항암제를 투여하지 않은 그룹 및 정상마우스를 사용한다. 결과는 표 3에 나타내었다.
[표 3]
상기 표 3으로부터 본 발명의 열변성된 항원을 투여할 경우 육종억제 또는 육종의 성장이 억제됨이 확인되었다.
본 발명을 특정한 태양에 관하여 기술하였으나, 본 발명의 취지와 범위를 벗어남이 없이 여러가지로 변경 및 변형시킬 수 있음은 본 분야의 숙련가에게는 인지될 것이다.
Claims (4)
- a) 인체 암세포를 균질화한 다음 침전물을 수거하고 ; b) 수거한 침전물을 용해시킨 다음 생성된 상등액을 수거하고 ; c) 수거한 상등액을 로투스 테트라고노로부스(Lotus tetragonolobus)렉틴과 반응시켜 렉틴에 당단백질을 결합시킨 후 ; d) 결합된 당단백질을 수집하고 렉틴에서부터 당단백질을 유리시킨 후 유리된 당단백질을 단리시킴을 특징으로 하여, 암세포-유도된 글리코사이드 결합관련 항원을 제조하는 방법.
- a) 인체 암세포를 균질화하고 침전물을 수거한 다음 ; b) 수거한 침전물을 용해시키고 생성된 상등액을 수거한 후 ; c) 수거한 상등액을 III3V3Fuc2nLc6및 III3V3VII3Fuc3nLc8과 반응하나 III3FucnLc4와는 반응하지 않는 모노클로날 항체와 반응시켜 항체에 당단백질을 결합시키고 ; d) 결합된 당단백질을 수거하여 항체에서 당단백질을 유리시킨 후 유리된 당단백질을 단리시킴을 특징으로 하여, 암세포-유도된 글리코사이드 결합관련 항원을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 생성된 글리코사이드 결합관련 항원을 60내지 120℃에서 5내지 60분간 가열하여 글리코사이드 결합관련 항원의 단백질부위를 변성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제2항에 있어서, 생성된 글리코사이드 결합관련 항원을 60내지 120℃에서 5내지 60분간 가열하여 글리코사이드 결합관련 항원의 단백질 부위를 변성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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