PT80233B - Process for preparing glycosidic linkage related antigen - Google Patents
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Description
Descrição breve dos desenhos
A Fig. 1 é um gráfico que mostra a influência da adi ção de um monossacárido sobre a primeira reacção do ensaio de
I ligação de*lèctina-anticorpo GGF, isto é a reacção entre o anticorpo GGF e GSA-2.
Descrição pormenorizada da invenção
0 processo da presente invenção pode efectuar-se de acordo com técnicas físico-químicas ou bioquímicas convencio nais, utilizando a afinidade para uma ligação glucosídica da fucose terminal. Mais especificadamente, pode efectuar-se o process®, tratando um componente da membrana de células can- 3 cerosas com uma substância que tenha afinidade para uma estru tura de ligação glucosídica da fucose terminal para ligar GEA e libertar àepois o GBA a partir da mesma.
Podem ser utilizadas diversas técnicas para esse fio. Os exemplos destas técnicas compreendem não só técnicas comuns como a cromatografia de afinidade e a imunoprecipitação mas também as técnicas de purificação geralmente utilizadas como filtração através de gel, electroforese, diálise e precipitação física utilizando um agente de precipitação de glucoproteí^ nas, a saber polietilenoglicol e acetona e suas misturas.
Os componentes da membrana de células cancerosas a serem utilizados como matérias primas na presente invenção não são específicamente limitados e pode utilizar-se qualquer deles, preparados pela maneira convencional a partir de células cancerosas humanas ou animais como células de cancros cultivados, células de cancros transplantados, células de cancros espontâneos, células de cancros induzidos por compostos químicos ou por vírus e células cancerosas provenientes de tecidos operados. A separação do componente da membrana da célula cancero sa pode efectuar-se por processos conhecidos, como o processo de homogeneização ou o processo de solubilização utilizando um agente de solubilização. £ preferível efectuá-la por um proces so que consiste em homogeneizar células cancerosas em soro fisiológico ou em uma solução-tampão apropriada, em separar o precipitado resultante mediante centrifugação, etc·, em disaol vê-lo em soro fisiológico ou em uma solução-tampão na presença de um agente de solubilização e em separar o líquido sobrenadante mediante centrifugação, etc. Pode utilizar-se, como agen tes de solubilização, diversos agentes tensioactivos que se
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sabe solubilizarera as íaeirbranas das células, Os exemplos des- | tes agentes tensioactivos compreendem agentes tensioactivos não-iónicos como “Triton X-100* (produzido por Wako Pure Che mical Industries, Ltd.), “NB-40" (produzido por Shell Co.), digitonina ou ureia, etc., e agentes tensioactivos aniónicos como dodecil-sulfato de sódio (SDS), etc.
Deserever-se-â a seguir o processo de acordo com a presente invenção com mais pormenor, considerando um exemplo de um modo de realização em que se utiliza uma cromatografia de afinidade.
| Pode obter-se facilmente um veiculo de coluna a ser
utilizado na cromatografia citada, fixando uma substância capaz de fixar uma fucose terminal sobre um suporte insolúvel.
Âs substâncias capazes de fixar uma fucose terminal são, por exemplo, lectinas fixadoras de fucose como lectina de "Lotus tetragonolobus" /“"Brt. J. Exp. Pathol.”, 34,94(1953 ) 7» lec tina de "Blex europeus” /“"Blood", 9,1195 (1954) 7» etc. e an ticorpos fixadores de fucose como SSEA-1 /“"Biochem., Biophys. Res. Coamun." 100, 1578-1586 (1981)7, ZWG 29, 13,14, 111J
, »«,..· »«..·, m, «» (wmj. . u.
P8 /""Arch. Biochem. Biophys.", 220, 318-320 (1983 VBP 8,9 zf"Bur. J. Immunol.", , 306-312 (1983)7» My-1 /“"Bloca", 61 , 1020-1023 (1983)7» &GF, etc. Entre essas substâncias, prefere-se as que têm afinidade para uma estrutura de ligação gluõosídica III V Fuc2 n Lcg descrita em "Biochem. Biophys. Res. Commun"., 109 (1), pág. 36-44 (1982) (estrutura de ligação glucosídica difucosílica), por ex. o anticorpo-GGP preparado de acordo com o exemplo de referência descrito mais adian te.
- 5 0 anticorpo GGF é um anticorpo monoclonal que é ca3 3 3
racterizado pela sua reactividade a III V Fuo2 nlcg e III V* VII^ Fuc^ n LOg mas nâo a III^ Fucn Lc^. 0 anticorpo que apresenta esta actividade única em relação à ligação glucosídica é novo e foi preparado pela primeira vez pelo inventor da presente invenção.
A fixação (imobilização) ia substância ie ligação da fuoose terminal mencionada antes sobre o suporte insolúvel pode efectuar-se pelos métodos conhecidos de fixação de matérias vivas. Entre eles, é preferível utilizar a fixação por um méI
todo que utiliza um polissacárido activado com brometo de cianogénio e um método que utiliza um éster de N-hidroxi-succinimida. 0 método que utiliza um polissacárido activado com brometo de cianogénio consiste em tratar um suporte insolúvel com brometo de cianogénio e em combinar os materiais activados resultantes com a substância fixadora da fuoose terminal, sob condições suaves, para fixar a substância citada ao suporte.
Ao tratar o suporte insolúvel com brometo de cianogénio, pode-se tratá-lo em água ou acetonitrilo à temperatura ambiente,
I mantendo o pH entre 7,5 e 12 com um composto alcalino como hidróxido de sódio ou carbonato de hidrogénio e sódio, etc. ou em uma solução-tampão com um pH compreendido entre 7,5 e 12, como uma solução O,1M de carbonato de hidrogénio e sódio com um pH de cerca de 8,7 ou uma solução-tampão 0,01M de ácido fosfórico com um pH de cerca de 7,7, durante cerca de 1 a 12 minutos. A quantidade de brometo de cianogénio utilizado é aproximadamente igual à do suporte insolúvel. Gomo suporte insolúvel, pode utilizar-se qualquer suporte insolúvel conhecido que apresente uma adsorção não-específica fraca para
matéria viva em geral e tenha uma grande porosidade, que te- * nha um grupo funcional capaz de fixar o material vivo sob con diçSes suaves e esteja suficientemente estabilizado sob os pontos de vista químico e físico. Os exemplos de suportes insolúveis compreendem suportes celulósicos como aminoetil-celulose, carboximetil-celulose, bromoacetil-celulose ou p-ani lino-celulose e similares, suportes de dextrano reticulado co mo Sephadex ou CM-Sephadex (produzidos por Pharmacia Co.) e similares, e suportes de agarose como Sepharose 2B, Sepharose 4B ou Sepharose 6B (produzidos por Pharmacia Co.), etc·, e si milares. No caso de se efectuar a associação do suporte activado com brometo de cianogénio resultante com a substância de ligação da fucose terminal, o suporte activado com brometo de cianogénio é utilizado em uma quantidade de 30 a 30 vezes, em peso a quantidade da substância citada, efectuando-se a reacção geralmente a uma temperatura compreendida entre 0° e 40° 0, de preferência entre 2° e 8° 0, durante cerca de 10 a 20 horas, no seio de um dissolvente apropriado, por exemplo uma solução aquosa 0,1 II de carbonato de hidrogénio e sódio (contendo 0,5M de cloreto de sódio; pH 8,4)· Pode, deste modo, produzir-se o veículo para a cromatografia de afinidade, que contím a substân cia de ligação da fucose terminal.
De acordo com a cromatografia que utiliza o veículo anteriormente descrito para a cromatografia de afinidade que contêm a substância de ligação da fucose terminal, pode captar-se o GRA desejado sobre a coluna, ligando-o à substância de ligação da fucose terminal no veículo referido antes. Obtém -se depois o GRA efectuando uma reacção de permuta em que se faz passar, através da coluna, uma substância capaz de fixar a
substancia de ligação da fucose terminal ou se faz passar, através da coluna, um separador adsorvente (eluente) tal como uma solução salina muito concentrada, uma solução aquosa de tiocianato de potássio, uma solução-tampão de ácido bórico ou uma solução-tampão de áoido clorídrico-glicina (pH 2,7) ou si milar, para separar o GRA.
As substâncias capazes de fixar a substância de ligação da fucose terminal, que podem ser utilizadas na reacção de permuta mencionada antes, são, por exemplo, a fucose e os dissacáridos e oligossacáridos que contém fucose·
0 GRA, obtido pela maneira descrita antes de acordo com a presente invenção, contém glicoproteínas com uma estrura de ligação glucosídica da fucose terminal. Se necessário, este GRA pode ainda ser purificado ou liofilizado por um pro cesso convencional. Por exemplo, pode ser tratado com uma lectina capaz de ligar uma galactose terminal e/ou uma N-acetilgalactoeémina terminal, de maneira a isolar o GRA ligado A lectina citada.
Além disso, o processo de acordo com a presente invenção pode também ser utilizado como um meio para purificar o GRA previamente obtido, utilizando o GRA como material inicial em vez dos componentes da membrana da célula cancerosa. Este modo de realização está também incluído no âmbito da pre sente invenção.
Como se mencionou antes, o GRA obtido de acordo com a presente invenção tem uma imunôgenicidade muito elevada que causa uma resposta imune específica em relação a células cancerosas e apresenta um efeito excelente no tratamento e na prevenção de cancros.
A presente invenção proporciona ainda um processo para a produção de um antigénio desnaturado termicamente obti do mediante tratamento do GRA citado pelo calor (de aqui em diante designado por " GRA desnaturado termicamente")·
0 GRA desnaturado termicamente tem uma caracteristi ca que pode impedir a ocorrência de imunidade humoral de hospedeiros portadores de cancro com uma fraca produtividade de anticorpo e pode produzir uma forte imunidade mediada por células que é específica para as células cancerosas.
De um modo geral, sabe-se que, porque a reacção imu ne a cancros ( rejeição de tumores) se baseia principalmente na imunidade mediada por células, enquanto a imunidade humoral é causada por um anticorpo relativo a um antigénio associado a um cancro mascarando o antigénio e actuando como um factor inibidor da reacção imune (anticorpo bloqueador) por si próprio ou formando um complexo imune, ou alterando a distribuição do antigénio (modulação antigénica), resulta por vezes não só a destruição do mecanismo de vigilância imunológico do organismo vivo como também a acelaração do desenvolvimento dos tumores produzindo uma acção desvantajosa no hospedeiro. For isso, o GRA desnaturado termicamente, que tem as caracteristicas mencionadas antes, é extremamente vantajoso como preventivo ou como remédio para o cancro. Além disso, pode ser utilizado na terapia e na profilaxia de cancros em um intervalo de dosagem bastante largo visto o seu efeito depender pouco da sua coneen tração·
0 tratamento térmico do GRA é efectuado sob condições de aquecimento convencionais que podem desnaturar, nele, o com ponente proteico mas não a ligação glucosídica. Pode efectuar-sa·
9
por exemplo, aquecendo o GRA em um dissolvente cano a água, o ao 1 ro fisiológico ou uma solução-tampão de ácido fosfórico, a uma temperatura compreendida entre cerca de 60° e 120° 0, de preferência entre 90° C e 110° C, durante 5 a 60 minutos, de preferência 10 a 20 minutos.
0 GRA desnaturado termicamente, preparado de acordo com o processo da presente invenção, é uma glucoproteína cons tituída por uma porção de uma estrutura de ligação glucoaídica não-desnaturada e uma porção de proteína desnaturada termicamente·
Quando os linfócitos são sensibilizados como o GRA ou o GRA desnaturado termicamente obtido pelo processo de acordo com a presente invenção, produzem-se células assassinas.
Os linfócitos aqui utilizados não são especialmente limitados, podendo utilizar-se quaisquer linfócitos normais ou portadores de cancro do homem ou de outros animais. Os exemplos destes compreendem os linfócitos provenientes do sangue periférico, da medula óssea, dos nodos linfáticos, do baço, das amígdalas e da glândula timo, etc. Estes linfócitos podem ser isolados, por exemplo, por um processo físico ou químico ou por um processo de membrana de superfície e podem ser utilizados no processo de produção de células assassinas.
Pode efectuar-se a sensibilização de linfócitos com o GRA ou o GRA desnaturado termicamente, cultivando os linfóoitos em um meio que contém o GRA ou o GRA desnaturado termicamente, durante um intervalo de tempo compreendido entre algumas horas e 10 dias, de preferência entre 1 e 5 dias.
Podem ser utilizados diversos tipos de meios convencionalmente usados para incubar esta espécie de células, fi pre
- 10
ferível utilizar, por exemplo, meio RPMI-1640 e meio MEM de | Eagle a que se adiciona soro humano, soro de feto de vitela, soro de vitela ou soro de cavalo, e similares. 0 GRA ou o GRÃ desnaturado termicamente deve ser adicionado ao meio de preferência em uma quantidade compreendida entre 0,1 e 2000 ng/ml, com vantagem entre 1 e 1000 ng/ml como proteína em função de 1x10^ linfócitos /ml·
A incubação é efectuada, por exemplo, a 37° C e a um pH de 7,2, de acordo com o processo convencional.
Deste modo, as células-assassinas resultantes podem I mutiplicar-se sem qualquer restrição no meio anteriormente des
crito que contém o factor de crescimento de células Ϊ (5CGF , IL-2). Neste caso, a incubação selectiva de clonagem de células-assassinas pode ser efectuada por um método de diluição limitada convencional. Às células-assassinas podem ser conservadas em condições de estabilidade durante um intervalo de tem po prolongado se forem conservadas, por exemplo, em azoto líquido.
Às células-assassinas resultantes são substancialmen I te linfócitos normais que são caracterizados por terem uma acti_
vidade citotóxica específica em relação a GRÀ.
0 GRÀ e o GRÀ desnaturado termicamente preparados
de acordo com o processo da presente invenção como se descreveu antes podem ser utilizados como agentes aaticancerosos.
0 GRÀ e o GRÀ desnaturado termicamente podem ser utilizados sézinhos, como ingredientes activos, ou podem ser utilizados juntamente com outros agentes antimicrobianos e/ou agentes anticancerosos. 0 agente anticanceroso que contém o GRÀ ou o GRÀ termicamente desnaturado, preparados de acordo com o pro- 11 cesso da presente invenção, como ingrediente activo, pode apre sentar-se em qualquer forma se contiver uma quantidade eficaz de GRA ou do GRA desnaturado termicamente, como agente principal. De um modo geral, é administrado mediante injecção intravenosa, injecção subcutânea ou injecção intramuscular, sob a forma de inclusão de liposoma, solução, suspensão ou emulsão ou similar. Prefere-se, em especial, a forma de uma inclusão de liposoma. Pode ser fornecido sob a forma de um pó seco que pode ser liquefeito mediante adição de um excipiente apropriado antes ti. suautilização. Esses agentes líquidos podem conter agen tes de suspensão como metil-celulose, e emulsionantes como lecitina, antissépticos como p-hidroxibenzoato de metilo e estabilizantes ou compostos-tampão que não afectem deefavoravelmen te a função imune do homem ou de um outro animal, etc. Pode utilizar-se soro fisiológico como meio aquoso e óleos vegetais como óleo de sésamo e similares, óleos minerais como parafina e similares, óleos vegetais e animais como esqualeno e similares, e propilenoglicol e similares como meio não aquoso. Ssse agente líquido pode ainda conter adjuvantes apropriados para promoverem imunidade como, por exemplo, adjuvante completo de Freuni, saponina para animais e hidróxido de alumínio para o homem, etc.
0 agente anticanceroso descrito antes pode ser administrado a pacientes cancerosos uma ou mais vezes durante um intervalo de tempo prolongado para curar e pode ser administra do a pessoas que estejam em risco de desenvolver um cancro com o fim de evitar o desenvolvimento desse cancro.
Como tanto o GRA como o GRA desnaturado termicamente têm uma toxicidade fraca, em que a DI^q (murganho; via in- 12 -
traperitoneal) é de 500 mg/Kg ou mais como sacárido, podem ser administrados em uma quantidade compreendida dentro de um intervalo largo· For conseguinte, a quantidade de GRÃ. ou de GRÃ. desnaturado termicamente no agente anticanceroso não é especial mente limitada e deve estar, de preferência, compreendida entre 0,001 e 100y^g/ml como sacárido. A quantidade a administrar depende do estado da doença, da idade e do sexo, sendo preferível administrá-lo, uma ou mais vezes, em uma quantidade compreendida entre 0,001 e 1.000 /^g/Kg/dia.
Âs células-assassinas obtidas pela maneira descrita antes podem ainda ser utilizadas como agente anticanceroso. É preferível utilizar este agente anticanceroso sob a forma de injecção juntamente com um veículo apropriado para este tipo de administração intravenosa. 0 veículo não é especificamente limitado e é preferível utilizar os que são isoténicos com o sangue, de preferência soro fisiológico. Na produção do agente é vantajoso que as células assassinas, depois de serem lavadas suficientemente com soro fisiológico para eliminar o meio referido antes, sejam suspensas em um veículo.
A concentração de células assassinas no agente mencionado antes não é especialmente crítica e está, de um modo geral, compreendida entre 10^ e 10^ células/ml. Além disso, não se observa qualquer toxicidade das células assassinas quan
g
do estas são administradas em uma quantidade de 10 células/ /murganho (por via intraperitoneal). A quantidade a administrar depende do estado de doença, da idade e do sexo, mas é preferível efectuar a administração, uma ou mais vezes, em uma quan
K TO
t idade compreendida entre 103 e 10 células/Kg/dia.
A presente invenção é ilustrada a seguir com a des- 13 - J
crição de exemplos, exemplos de referência e ensaips de referência que, de modo nenhum * limitam.
Às células cancerosas aqui utilizadas são todas conhecidas e foram obtidas no laboratório da Universidade de Niigata (Dr. Suzuki, professor-assistente) e em "Japan Immunoresearoh Laboratories Co., Ltd.
Exemplo de referência 1
(1) Utilizando GEA 2, descrito na patente de invenção
britânica Ns 2106935A, em uma quantidade de 5pS como proteína juntamente com adjuvante completo de Preund, submete-se um murganho Balb/C a imunização mediante administração por via subcutânea à razão de uma vez em duas semanas. Três dias depois da terceira imunização, retira-se o baço e lava-se as células do baço, três vezes, com meio EPMI-1640. Lava-se analogamente uma série de células SP 2 de mielorna de murganho £ referência a "Einsho Meneki", Vol. 13, NS 11, pág. 912-919 (1981)_/, pUe-se
*7
as células 3P2 (1x10 células) e as células de baço menciona| das antes (4x10? células) em um tubo de centrífuga e mistura-se as mesmas. Após centrifugação (200xg, 5 minutos), elimina-se o líquido sobrenadante com uma pipeta de Pasteur. Adiciona-se, gota a gota, 1 ml de uma solução de RPMI-1640 que contém 45% (peso/volume) de polietilenoglicol 4000 (produzido por Sigma Co.) mantida a 37° C ® mistura-se suavemente durante 2 minutos· Adiciona-se, gota a gota 1 ml de meio EPMI-1640 contendo 15% de PCS (soro de feto de vitela) e lmM de piruvato (de aqui em diante designado por "EPMI-1640 completo") e mantido a 37° C e agita-se suavemente durante 1 minuto, adiciona-ae depois, gota a gota, a mesma quantidade do BPMI-1640 com pleto citado e em seguida mais 8 ml e, de cada vez, agita-se suavemente durante 1 minuto e 2 minutos, respectivamente. Após centrifugação da mistura resultante (200xg; 5 minutos), elimina-se o líquido sobrenadante e suspende-se o restante conteúrdo do tubo em BPMI-1640 completo, mantido a 37° C, em uma quan tidade de 1x10^ cólulas/ml. Inocula-se cada 100 ^1 da suspensão obtida em uma placa de Miorotest-II (produzida por Palcon Co.) e cultiva-se em um incubador que contém 5% de anidrido
carbónico, a 37° C. Decorridas 24 horas, adiciona-se, a cada
I ,
concavidade, 100 ^2. do BPMI-1640 completo contendo 1,0x10
—7 —5
de hipoxantina, 4,0x10 M de aminopterina e 1,6x10 M de timidina (de aqui em diante designado por "meio HAT”). Depois, substitui-se metade do líquido sobrenadante por meio HAT recen te no 22,32, 5S, 8fi e 112 dias e, no 14B dia, substitui-se
igualmente metade do líquido sobrenadante por BPMI-1640 com-4 „ —5
pleto contendo 1,0x10 M de hipoxantina e 1,6x10 J M de timi dina ( de aqui em diante designado por " meio HT*). Pela mesma maneira, substitui-se metade do liquido sobrenadante por um
| meio HT recente no 182, 222, 252e 262 dias e, no 282 dia,
substitui-se metade do líquido sobrenadante por meio BPMI-1640 completo recente. Depois, mantém-se a proliferação neste BPMI-1640 completo. 0 hibridoma assim obtido é cionado por um método de cultura por diluição limitada. Mais exactamente, ajus ta-se o meio BPMI-1640 completo de maneira a conter hibridomas em uma quantidade de 3 células/ml e células do timo de murganho Balb/O em uma quantidade de 1x10' células/ml, e implanta-se aquele, numa placa com 96 concavidades cada, em uma quantidade de 0,2 ml/concavidade, e deixar-se cultivar. 0 hibridoma proli- 15
ferado é depois clonado por uma maneira análoga. Para o contro lo do clónio que pode produzir o anticorpo desejado, utiliza-se uma placa de 96 concavidades (produzida por Dynatech Laboratory Co.) revestida com/ΪΟ ng/concavidade de um III3 FucnLc^, III3 V3 Pttc2 nlc6 ou III3 V3 VII3 Fuc^ nLcg purificado, 30 ng/ /concavidade de colesterol e 50ng/ concavidade de lecitina, em um método de fase sólida, utilizando uma imunoglobulina antimurganho de coelho (produzida por Eàppel Co.) e ''I-Proteína À (produzida por Sigma Co.)· Obtém-se, deste modo, o hibridoma dsejado representado pelo clónio N®. GGF.
(2) Cultiva-se o hibridona do clónio N®. GGP obtido
antes em (1) em um meio EPMI-1640 completo, colocado em um incubador com 5% de anidrido carbónico a 37° C, durante 4θ ho ras. Submete-se a solução cultivada a separação centrífuga (3·000 rpm; 10 minutos), para se obter um liquido sobrenadan te cultivado que contém um anticorpo monoclonal (de aqui em diante designado por ”GGFn).
I (3) Suspende-se 1x10^ células de hibridoma do clónio
N®. GGF obtido antes em (1) em 0,5 ml de meio HPKE-1640 e admi nistra-se a suspensão, por via intraperitoneal, a um murganho Balb/C. Decorridas 2 a 3 semanas, colhe-se o liquido ascítico acumulado, obtendo-se, deste modo, 2 a 5 ml/murganho de um líquido ascítico que contém um anticorpo GGF. Â concentração de anticorpo é de oerca de 0,5 mg/ml.
(4) Classe de imunoglobulina
A classificação é efectuada de acordo com um método
de Yeh e colab., utilizando um anticorpo de coelho para o tipo correspondente da classe de imunoglobulina de murganho (Litton. Bionetico, Inc. Kensington, MD 20795) e Proteína A marcada com /"Ming-Yang Yeh e colab. "Proc. Natl. Acaà. Sei. U.S.A.", vol. 76, Νδ. 6, pég. 2927-2931 (1979)7. Como resultado, o GGF mostrou pertencer a uma sub-classe IgG 3.
(5) Reactividade do anticorpo GGF a diversos tipos
àe antigénios Glucolipídicos
(a) Como antigénio purificado, utiliza-se III3 lhcnU4 , III3 V3 Puc2 nLcg ou III3 V3 VII3 Fue3 nLcg 7 "Bio
chem, Biophys, Res. Commun". 109, (1), pág. 36-44 (1982)7· Faz-se reagir o anticorpo obtido antes em (2) (e suas amostras diluídas gradualmente) com o antigénio citado em uma quantida de de lOng/ooncavidade de uma tira vinílica (produzida por Cos ter Co.) revestida com colesterol (30ng/concavidade) e lecitina (5Qng/eoncavidade) (produzida por Coster Co.).
Depois de bem lavado com PBS, o anticorpo ligado ao antigénio purificado é medido (avaliado), utilizando uma imunoglobulina anti-murganho de coelho como segundo anticorpo e depois ^^i-proteína A. Calcula-se a relação âe ligação em função da contagem da radiação. Como resultado, o anticorpo GGF mostra ter reactividade com III3 V3 Fucg nLcg e III3 V3 VII3 Puc3 nLcg, mas não reage com III3 Puc nLc^.
(b) Influência da adição de um monossacárido so bre a primeira reacção do ensaio da ligação lectina-GGP
De acordo com um método descrito adiante, investiga-se a influência sobre a primeira reacção (reacção âe an- 17
ticorpo aonoclonal e GEA 2 ) do ensaio de ligação lectina-GGF, no caso de se lhe adicionar um monossacárido. 0 resultado está indicado na Figura 1. A este respeito, verifica-se que a ligaçSo é inibida em todos os casos em que se utiliza III^
FuCg nLeg ou III V VII Fuc^ nlcg em vez do mono ssacár ido. Método de avaliação
(1) PCe-se cada uma das pérolas de poliestireno reves tidas com anticorpo monoclonal GGF em tubos de ensaio.
(2) Põe-se, em cada tubo de ensaio, 0,1 ml de solução de GEA 2 e o sacárido* (varadiante).
Concentração do sacárido: 600 ^ôeg de fhcose e 6 mg de galactose
(3) Adiciona-se, ainda, 0,6 ml de solução-tampão de 10 nX d. ácido forfárioo (pH 7,0) ,ue contá» laMde KgCl2, 0,1% de HSA e O,1M de Na&l.
(4) Mi st ura-se e incuba-se depois à temperatura ambien te durante 3 horas e depois a 4° C durante 24 horas.
(5) Lava-se cada pérola, cinco vezes, com uma solução-tampão de lavagem que contém:
solução-tampão 0,05 M tris-UJl (pH 7,2)
2 mM de Ca&2 2 mM de MgClg 0,85% de NaCl
(6) Adiciona-se depois 0,5 ml da solução-tampão de lavagem e 0,1 ml de solução PNA-POX a cada tubo de ensaio e mistura-se bem.
(7) Incuba-se os tubos à temperatura ambiente durante 2 horas e, depois, a 4° C durante 18 horas.
(8) Lava-se estes tubos, cinco vezes, com uma solução de sal comum (cloreto de sódio) a 0,85%.
(9) Paasa-se cada pérola para um tubo de ensaio limpo e adiciona-se-lhe 2 ml de uma solução de cloreto de sódio a 0,85% e 0,5 ml de uma solução de 3 ag de o-fenilenodiamina/ /ml (dissolvida em solução-tampão de ácido cítrico de pH 5,8) contendo 0,03% (concentração final) de peróxido de hidrogénio.
(10) Mistura-se bem e incuba-se à temperatura ambiente durante 30 minutos.
(11) Adiciona-se 1 ml de MCI 3 N· termina-se a reacção.
I (12) Utilizando um espectrofotómetro, mede-se a obsorvência de um comprimento de onda de 492 nm em cada amostra.
(c) Reactividade de diversos tipos de células humanas:
Trata-se células fixadas sobre uma placa com uma solução-tampão salina a 5% de ácido fosfórico contendo albumina de soro bovino (pH 7,4) durante uma hora, adiciona-se depois anticorpo GGF anticorpo diluído 100 vezes obtido em (3) referido antes J7 e incuba-se durante 18 horas. Depois, trata-se as células sobre a placa com um anticorpo de coelho marcado com FITO (produzido por JIMRO Co.) capaz de reagir com uma IgG 3 ds murganho, como segundo anticorpo, tendo o citado anticorpo sido diluído 1000 vezes.
Os resultados estão indicados no Quadro 1 a seguir em que "positividade" significa a percentagem de células mortas.
- 19 Quadro 1
| Cancro | Série de células | Positividade |
| Linfoma | MOLT-4 K-562 | 50,0 97,1 |
| Cancro do | KATO-III | 37,3 |
| estômago | MKN-74 | 8o, 6 |
| Cancro do | PC-3 | 82,1 |
| pulmão | QG-90 | 4,2 |
| Cancro renal | NRC-125 Exemplo de referência | 3,3 2 |
(1) Suapenâe-se 3g de Sepharose 4B-activada com bro meto de cianogénio (produzida por Pharmacia Co. ), depois de suficientemente lavada com 1 mM de ácido clorídrico, em 200 ml de uma solução 0,llí de carbonato de hidrogénio e sédio (pH 8,5). Adiciona-se 5 ml de uma solução-tampão 0,01M de fosfato (pH 7,7) contendo 20 mg de lectina de "Lotus tetragonolobus" e efeç tua-se a reacção a 25° C durante 2 horas, com agitação de vez em quando, para se obter lectina (lectina de "Lotus tetragonolobus* )-Sspharose insolúvel.
(2) A 2 ml de Anticorpo GGF, obtido no exemplo de re—
- 20 -
ferência 1-(2), adiciona-se uma solução aquosa 0,11 de carbonato de hidrogénio e sódio contendo 5g/l5 ml de Bromocyan Sephrose (Pharmacia Co.) e 0,5M de cloreto de sódio (pH 8,3) e agita-se a mistura resultante durante 2 horas para se obter um amMoorpd ins^nvel (GGf-Sepharose).
Exemplo 1
(1)
Homogeneíza-se cerca de 5g (peso húmido) de células EATO-III em 50 ml de PBS, utilizando um moinho (Waring Blen der). Adiciona-se o precipitado obtido mediante centrifugação ( lOO.OOOxg; 1 hora) a 50 ml de uma solução—tampão de 0,01X de tris-ácido clorídrico (pH 7,6) contendo 2% de Triton X-100, 2»M de oloreto de magnésio, 2mX de cloreto de cálcio e 0,85% de oloreto de sódio, enquanto se agita. Deita-se o líquido sobrenaâante obtido mediante centrifugação (lOO.OOOxg ; 1 hora) em uma coluna (00,8x15 cm) de uma lectina insolúvel [veículo obtido no exemplo de referência 2-(l)J equilibrada com uma solução-tampão 0,01H de tris-ácido clorídrico (pH 7,6) contendo 0,015% de Triton X-100, 2 mM de cloreto de magnésio, 2 mM de cloreto de cálcio e 0,85% de cloreto de sódio. Apés lavagem com a mesma solução-tampão, elui-se ainda com a mesma solução-tampão mas contendo O,lXde fucose e dialisa-se o líquido com uma solução aquosa de cloreto de sódio a 0,85% (5 litros x3j dois dias). Apés concentração (ultrafiltro ÇX-10: Xillipore Co.) , filtra-se (filtro de 0,2^,m : Arnicon Co.) para se obter uma solução de GRA. Quantidade de proteína: 1,5 mg. Quantidade de sa cárido 1,6 mg. Aquela é denominada *TCA-1".
(2) De acordo com a técnica mencionada antes em (1),
- 21 fWT
utiliza-se cerca de 10 g de células QG—90 em vez de células KATO-III e, como veículo, uma coluna de um anticorpo insolúvel obtido no exemplo de referência 2-(2) mencionado antes (eluente: solução-tampão 0,2M de ácido clorídrico-glicina, de pH2,7) e trata-se por uma maneira análoga para se obter uma solução de GRA. Quantidade de proteína: 570 ytg. Quantidade de sacárido: 500 yítg. Ê denominada "TCA-2".
(3) lava-se uma coluna de um anticorpo insolúvel, obti^ do no exemplo de referência 2-(2) mencionado antes, com uma solução-tampão 0,01M de tris-ácido clorídrico (pH 7,6) contendo 0,015% de Triton X-100, 2 mM de cloreto de magnésio, 2 mM
de cloreto de cálcio e 0,85% de cloreto de sódio e aplica-se de, pois o GRA-1 descrito na patente de invenção britânica NQ. 2106935A em uma quantidade de 300 y&g, como proteína. Após lavagem com a mesma solução-tampão, elui-se com uma solução-tampão 0,2M de ácido clorídrico-glicina (pH 2,7) para se obter uma solução de GRA. Quantidade de proteína: 200 y«zg. Quantida de de sacárido: 220 yg. £ denominada WTCA-3H.
(4) De acordo com a técnica (3) descrita antes, utiliza-se GRA-8 descrito na patente de invenção britânica N8.210693 5A em vez do GRA-1, sendo a quantidade de GRA-8 utilizada 20yòg, como proteína , e trata-se por uma maneira análoga para se obter uma solução de GRA. Quantidade de proteína: 15 ytg. Quantidade de sacárido: 13 ytg. Ê denominada "TCA-4".
Exemplo 2
(1) Aquece-se uma solução em soro fisiológico que con
tém TCA-1 em uma quantidade de 100 ^ítg como proteína, obtido no
-22
exemplo l-(l) mencionado antes, em um banho de água quente a 100°C, durante 10 minutos, para se obter um GSÁ desnaturado termicamente e que á denominado "TCA-IH".
(2) De acordo com a técnica (1) descrita antes, mas
utilizando cada um de TCA-2 a 4 em vez do TCA-1 e tratando de maneira análoga, obtém-se cada um dos GRA desnaturados térmica mente indicados no Quadro 2 a seguir.
Quadro 2
Matéria-prima Condições de aquecimento GRA desnaturado termicamente
| TCA-2 | 100°C, | 10 min. | TCA-2H |
| TCA-3 | 120°C, | 5 min. | TCA-3H |
| TCA-4 | 100°C, | 10 min. | TCA-4H |
Bnsaio de referência 1
(1) Regula-se os linfécitos de sangue periférico, obti,
dos a partir de um ser humano adulto saudável mediante centrifugação em uma centrífuga Picollpack (Pharmacia Co.), com um meio RPMI-1640 que contém 10% do PGS (soro de feto de vitela) de maneira a ter 1,5x10^ células/ml. A 10 ml desta diluição, adiciona-se TCA-2 de modo a ter uma quantidade de proteína do 25 ng/ml e incuba-se a 37° C em um incubador com anidrido carbónico gasoso a 37° C, durante 43 horas, para se obter células
- 23
assassinas .
λ parte, prepara-se células-assassinas ia mesma maneira, mas sem adição de TCA (testemunha).
(2) Lava-se, duas vezes, as células-assassinas obtidas
antes em (1) com o meio RPMI-164O (1000 rpm; 10 minutos) e regula-se depois com o mesmo meio contendo 10% de soro de feto de vitela (PCS) de maneira a obter-se 1,5x10 células/ml, o que é designado célula "Sffector" (E). Como células-alvo (T), utiliza-se as que são obtidas mediante regulação de células Daudi, lavadas duas vezes com o meio descrito antes, com o mesmo meio contendo 10% de 70S (soro de feto de vitela) de maneira a ter-se 1,5x10^ células/ml.
Mistura-se 100 ρΛ, das células (E) descritas antes com 100 yttl das células T. Após incubação da mistura a 37° C durante 1 hora, coloca-se o tubo de ensaio que contém a mistura em água e gelo para interromper a reacção e conta-se o número de células sobreviventes corando com Azul de Srypan a 0,2%. A actividade destruidora de E é calculada a partir da fórmula seguinte:
Actividade destruidora (%) = (número de células no caso de se utilizar B da testemunha)- (número de células ensaiadas) Jí / (Β»+ϊ ·)
em que E' representa o número de células sobreviventes após incubação de 100 jjCL de E a 37° C durante 1 hora; e T* representa o número de células sobreviventes após incubação de 100 ytz.1 de T a 37° C durante 1 hora.
No resultado, admite-se, em média, 20,5% da activida- 24
de destruidora de E. “
(3) De maneira análoga à mencionada antes em (1) e
(2), calcula-se a actividade destruidora de células-assassinas provenientes de TCA-1, TCA-3, TCA-4, TCA-1H, TCA-2H, TCA-3H e TCA-4H e, como resultado, observa-se, em todos os casos praticamente a mesma actividade que a referida anteriormente.
Ensaio de referência 2
(1) Kegula-se o TCA-3H, obtido de acordo com a técnica descrita no exemplo 2, oom soro fisiológico de maneira a ter uma quantidade de proteína de 100 ng/ml.Ê designado por Agente antioanceroso N2. 1.
(2) Injecta-se lxlO^ células de LLC, provenientes de murganhos C57BI/6 (Charles River, machos, 5W), no citado murganho C57BI/6, em uma veia da cauda. Seis dias depois da injecçffo, administra-se o Agente antioanceroso N2. 1 descrito antes no murganho citado em uma quantidade de 1 ml/murganho/dia, na veia da cauda, durante 3 dias consecutivos. Decorridos 22 dias depois da injecção de células LLC, retira-se os pulmões
e observa-se visualmente a presença ou a ausência de células LLC implantadas sobre os pulmões e determina-se o peso destes· Como testemunhas, utiliza-se murganhos normais a que não se administrou o agente antioanceroso. Os resultados estão indicados no Quadro 3·
- »1 w ·ιΚ'·. 'Í'
Quadro 3
| Grupo | Número de murganhos ensaiados (n) | Peso médio do pulmão («) | Presença ou ausência de implantação |
| Controlo | 5 | 0,351 | + |
| TCA | 5 | 0,195 | - |
| Normal | 5 | 0,177 |
Confirma-se, pelos resultados indicados no quadro 3» que a administração do antigénio desnaturado termicamente de acordo com a presente invenção provoca nitidamente a rejeição do tumor ou a supressão do desenvolvimento do tumor.
Hmbora a invenção tenha sido descrita em pormenor e com referência aos seus modos de realização específicos, tornar-se-ά evidente para os entendidos na matéria que podem ser introduzidas diversas alterações e modificações sem que por isso se verifique um afastamento do espírito e do ãâbito da mesma.
Claims (10)
- Reivindicações1. - Processo para a preparação de um antigênio relativo à ligação glucosídica, proveniente de células cancerosas,caracterizado pelo facto de se tratar um componente da membrana de uma célula cancerosa com uma substância capaz de ligar uma estrutura de ligação glucosídica de fucose terminal.
- 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo facto de o citado componente da membrana celular ser um componente da membrana da célula cancerosa humana.
- 3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo facto de a citada substância capaz de ligar uma estrutura de ligação glucosídica da fucose terminal ser uma lectina
- 4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza do pelo facto de a lectina citada ser a lectina de "Lotus tetragonolobus".
- 5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo facto de a citada substância, capaz de ligar uma estrutu ra de ligação glucosídica da fucose terminal ser um anticorpo.
- 6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o anticorpo citado ser um anticorpo monocZLonal 3 3 3 3 3que reage com III V Fu^nLCg e III V VII FuCgnLCg mas nao reage3com III FucnLc^.
- 7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo facto de o citado componente da membrana celular ser um componente da membrana celular capaz de ligar uma lectina capaz27 de ligar uma galactose teminal e/ou uma estrutura de ligação glu cosídica de N-acetilgalactosamina terminal.
- 8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo facto de compreender as fases de:a) homogeneização de células cancerosas humanas e separaração do precipitado;b) solubilização do precipitado e separação do líquido sobrenadante resultante;c) reacção do líquido sobrenadante com lectina de "Lotus tetragônolobus" para ligar uma glucoproteína;ed) separação da glucoproteína ligada, libertação da glucoproteína da lectina e isolamento da glucoproteína libertada.
- 9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do pelo facto de compreender as fases de:a) homogeneização de células cancerosas humanas e separação do pricipitado;b) solubilização do precipitado e separação do líquido sobrenadante resultante;c) reacção do líquido sobrenadante com um anticorpo mono3 3 3 3 3clonal que reage com III V Fuc2nLCg e III V VII Fuc^nLCg mas nao3 *reage com III FucnLc^ para ligar uma glucoproteína; ed) separação da glucoproteína ligada, libertação da glucoproteína a partir da lectina e isolamento da glucoproteína liberta da.
- 10. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de o processo citado compreender oaquecimento do antigênio relativo à ligação glucosídica tante a uma temperatura compreendida entre 60° e 120°C te 5 a 60 minutos, para desnaturar a porção proteica do antigênio relativo â ligação glucosídica.resuldurancitado
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