PT92235B

PT92235B - Processo para a preparacao de um anticorpo monoclonal anti-fucosilceramida e de agentes de diagnostico que o contem

Info

Publication number: PT92235B
Application number: PT92235A
Authority: PT
Inventors: Hideki Ishihara; Hiroshi Hattori; Kenichi Ono
Original assignee: Hoechst Japan
Priority date: 1988-11-09
Filing date: 1989-11-08
Publication date: 1995-07-06
Also published as: AU4450389A; PT92235A; NO894444D0; FI895287A0; NZ231292A; NO894444L; US5331093A; DK557289D0; KR900007430A; EP0368222A1; JPH02128697A; CA2002530A1; DK557289A; IL92232A0; NO177311B; NO177311C; AU624440B2; ZA898499B

Description

Descrição

E.I._

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um novo anticorpo monoclonal eficaz para o diagnóstico de cancro humano, a um hibridoma que produz este anticorpo, a um processo para a preparação do anticorpo e a um agente de diagnóstico que o contêm.

A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal que reage especificamente com fucosilceramida de uma fracção de ceramida-mono-glicosido contida em glicolípidos neutros extraídos a partir de tecidos cancerosos humanos, um hibridoma que produz o referido anticorpo, um processo para a preparação do referido anticorpo usando o referido hibridoma e um agente de diagnóstico que usa o referido anticorpo.

Após ter sido estabelecida uma técnica de preparação de anticorpos monoclonais em 1975 por Kohler e Milstein [Nature 256: 495 (1975)], numerosos investigadores tentaram até agora . preparar um anticorpo monoclonal que reconheça especificamente

'^í3Taa«w=n>^_>>^ tecidos cancerosos. Estes investigadores empregaram um método para seleccionar um hibridoma que não é reactivo com células humanas normais mas reconhece células de cancro humano por imunização directa de um rato com células de cancro humano. Aconteceu que muitos dos antigenes de tumor que são reconhecidos pelo anticorpo monoclonal obtido pelo processo descrito acima eram antigenes da cadeia de açúcar [S. Hakomori, Scientific American 254, 32.41 (1986)].

Como exemplos típicos destes antigenes podem ser mencionados, CA-19-9, sialilo SSEA-1, etc.. Estes antigenes têm sido já largamente usados no campo clínico como marcadores de cancro [Reiji Kannagi, Clinicai Pathology XXXTV: 11, 1247«1264 (1986)]. Contudo, estes antigenes têm cadeias de açúcar que possuem 5 ou mais açúcares. No que diz respeito a um antigene de cadeia de açúcar curta, é considerado que a pesquisa nesse campo é ainda insuficiente apesar de a respectiva capacidade de serem antigenes de tumores importantes ter já sido discutida.

A fucosilceramida (fórmula estrutural: L-Fuaxl-lCer) composta por uma fucose que está ligada à ceramida (parte lipídica) foi isolada a partir de tecidos de cancro do cólon por Senitiroh Hakamori et al, em 1976 e havia uma possibilidade de que a fucosilceramida fosse um glicolípido que era expresso especif icamente em cancros humanos [JBC, 251, 2385-2387 (1976)]. Para além disso, imunizaram um coelho com fucosilceramida sintetizada quimicamente para preparar um anticorpo policlonal. Contudo, este anticorpo policlonal não era específico apenas para a fucosilceramida mas apresentava reactividade cruzada para ceramida e galactosilceramida, de tal modo que era impossível determinar com precisão a presença de fucosilceramida em células ou tecidos de cancro humano [Biochemistry, 21, 928-934 (1982)].

RESUMO DA INVENÇÃO

Como descrito acima, não era ainda conhecido um anticorpo monoclonal que reagisse especificamente com fucosilcera- 2 -

mida. Se existe um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente fucosilceramida, não seria somente útil para o diagnóstico de cancro humano mas também muito útil para a determinação de fucosilceremida em células ou tecidos de cancro humano.

Na nossa pesquisa intensiva de um anticorpo monoclonal que reagisse especificamente com fucosilceramida, provamos que o anticorpo monoclonal PC47H que é produzido a partir de um hibridoma estabelecido por imunização de um rato com uma fracção de glicolípido neutra extraída do tecido dum cancro do pâncreas humano que reage especificamente com fucosilceramida e verificou-se que foi possível determinar a presença de fucosilceramida em várias células de cancro usando o anticorpo de acordo com a invenção.

A presente invenção por conseguinte diz respeito a:

(1) Um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a fucosilceramida.

(2) Um anticorpo monoclonal de acordo com (1) que tem as propriedades seguintes:

a. Classe de Ig: IgM

b. Reactivo com linhas de células derivadas do cancro do pulmão cancro do estômago, cancro do cólon e cancro do pâncreas.

c. Não reactivo com linfócitos do sangue periférico normal, com eritrócitos normais e com fibroblasto normais.

d. Não reactivo com linhas de células derivadas de leucemia, hepatoma, cancro da mama e neuroblastoma.

(3) Um anticorpo monoclonal de acordo com (1) denominado PC47H.

(4) Um hibridoma que tem uma capacidade de produzir um anticorpo monoclonal de acordo com (1), (2) ou (3).

(5) Um processo para produzir um anticorpo monoclonal de acordo com (1), (2) ou (3) por imunização de um animal com fracção de glicolípido neutra extraída do cancro do pâncreas humano, fusão de células do animal com células de mieloma para gerar hibridomas, clonagem dos hibridomas, selecção dos clones

que produzem anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente a fucosilceramida e isolamento do anticorpo monoclonal.

(6) Um auxiliar de diagnóstico para a determinação de cancros que contêm um anticorpo monoclonal de acordo com (1), (2) ou (3) como um componente activo.

(7) Um auxiliar de diagnóstico de acordo com (6) eficaz para cancro do pulmão, cancro do estômago, cancro do cólon e cancro do pâncreas.

De acordo com a presente invenção, é proporcionado um anticorpo monoclonal que é útil para a determinação com precisão da presença de fucosilceramida em vários tecidos cancerosos Para além disso, é proporcionado um auxiliar de diagnóstico que é eficaz para o diagnóstico de cancros utilizando este anticorpo monoclonal.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

A fig. 1 mostra o desenho duma CCF (Cromatografia em Camada Fina) por coloração de todas as fracçoes de glicolípidos neutras e um padrão de CCF por imunocoloração da fucosilceramida (Fuc-Cer) com o anticorpo monoclonal PC47H.

A fig. 2 mostra os resultados da análise de reactividade cruzada do anticorpo monoclonal PC47H de Fuc-Cer, Gal-Cer e Glc-Cer.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Seguidamente, a presente invenção será descrita em pormenor.

Imunizou-se um rato com uma fracção glicolipidica neutra extraída de tecidos de cancro do pâncreas humano [a imunização foi realizada de acordo com o processo de Carlson et al (Eur. J. Immunol., 16 , 951 (1986))]. Fundiram-se células de baço de rato com células de mieloma de rato para preparar hibridomas. Em seguida os hibridomas são clonados por diluição limi4

tada para obter um anticorpo monoclonal [J. Biochem (Tokio),

99, 269 (1986)]. Analizou-se um antigene que reconhece o anticorpo monoclonal [J. Immunol. Methods, 38, $5 (1980)] por coloração imunológica usando cromatografia em camada fina (CCF) (daqui em diante abreviada para coloração imunológica por CCF) [Can. Res., 4_7, 1968 (1987)] e por imunoanálise enzimática (EIA) usando uma placa de microtitulação na qual o glicolípido está absorvido.

anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma descrito acima pertence à classe IgM e reconhece especificamente a fucosilceramida que ocorre numa fracção de ceramida-mono-glicosido de glicolípido neutro como um antigene. Um exemplo específico do presente anticorpo monoclonal é PC47H que é produzido por uma linha de células de hibridoma FERM BP-2557.

Seguidamente será descrito em pormenor um processo para a preparação do presente anticorpo monoclonal.

(1) Preparação de Glicolípidos Neutros

Cortam-se em pequenos pedaços tecidos de cancro de pâncreas humano usando um misturador Warring ou semelhante. Extraiem-se os pedaços de tecidos com uma mistura de clorofórmio-metanol 2:1 (daqui em diante designada abreviadamente por C-M 2:1), uma mistura de clorofórmio-metanol 1:1 (daqui em diante designada abreviadamente por C-M 1:1) e uma mistura de clorofórmio-metanol-água 1:2:0,8 (daqui em diante designada abreviadamente por C-M-A 1:2:0,8), sendo cada volume destas misturas aproximadamente 20 vezes o dos pedaços de tecidos. Evapora-se o extracto à secura sob pressão reduzida a fim de obter as fracções de lípidos totais. Em seguida, as fracções de lípidos totais são dissolvidas em C-M 1:1 contendo KOH 0,5 N. Depois de se deixar a mistura de um dia para o outro à temperatura ambiente, a solução resultante é dialisada contra água destilada para remover a fracção fosfolipídica. Esta fracção é dissolvida em C-M-A 30:60:8 e depois carregada numa coluna de DEAE-Sephadex A-25 (tipo ácido acético, fabricada por Pharmacia Fine Chemicals Inc.) para remover por absorção as fracções de lípido acídicas. Seguidamente, as fracções de lípido neutras são car5

regadas numa coluna de Sílica Gel 60 (fabricada por Merck Corp. para eluir em primeiro lugar os lípidos simples com clorofórmio e em seguida eluir uma fracção glicolipídica bruta com C-M-A 65:30:8. Depois de evaporar à secura, a fracção glicolipídica bruta é acetilada dissolvendo a mesma numa mistura de piridina-anidrido acético. A fracção acetilada é carregada numa coluna de Florisil (fabricada por Floridin Inc.). Depois de eluir os lípidos pouco polares com 1,2-dicloroetano, é eluida uma fracção de glicolípidos acetilada com uma mistura de 1,a-dicloroetano-acetona (1:1). Esta fracção é dissolvida numa mistura de amónia a 28 ^-metanol 1:4 e depois é deixada em repouso durante 12 horas à temperatura ambiente para provocar a desacetilação.

Adopta-se para a análise da fracção de glicolípido neutra a cromatografia em camada fina (CCF). Na CCF usa-se uma placa de Sílica Gel 60 (5461 ou 5547, fabricada por Merck Corp. que é desenvolvida com C-M-A 65:25:4. Para a detecção do glicolípido neutro usa-se reagente de resorcinol.

A determinação de glicolípido é realizada por cromatografia gás líquido.

(2) Preparação de Ratos Imunizados

Dissolve-se uma quantidade adequada de glicolípido preparado conforme descrito em (1), 5 mg de lípido A, 68 mg de dimiristoíl-fosfatidil-colina, 28 mg de colesterol e 6 mg de fosfato de dicetilo num solvente orgânico adequado. Depois de evaporar a mistura à secura num balão de forma de pêra de 50 ml adicionaram-se 10 ml de solução tampão de fosfato (PBS; contendo 2,8 g de fosfato de sódio dibásico, 0,3 g de fosfato de sódio monobásico, 9 g de NaCl e 1 1 de água destilada; PH 7,2) e 3 ml de esferas de vidro (2 mm de diâmetro) à mistura seca. A solução resultante é sacudida fortemente e agitada para formar liposomas. A suspensão, sem as esferas de vidro, é administrada a ratos de 8 semanas de idade aproximadamente por via hipodérmica (nas articulações dos menbros) num volume de 150 ul e por via intraperitoneal num volume de 50 ul para dar um volume total de 200 ul para os imunizar. Em seguida, repete-se a imunização com intervalos de duas semanas do mesmo modo acima menci6

onado. Recolhe-se o anti-soro do fundus venous plexus uma vez por semana e o seu título de anticorpo é determinado por imunoanálise enzimática.

Imunoanálise Enzimática

Dissolve-se em C-M 2:1 o glicolípido neutro preparado conforme descrito em (1) e em seguida mistura-se numa quantidade adequada de etanol (esta solução é ajustada de modo a conter 20 a 100 ng/ml de glicolípido). A solução resultante é distribuída a 50 ul/alvéolo numa placa de EIA de 96 alvéolos (fabricada por Junyaku Co., Ltd.) e é deixada em repouso durante uma hora a 56°C para evaporar o etanol. Em seguida, cada alvéolo é cheio com albumina de soro de bovino a 1 % (BSA)-PBS (daqui em diante designada abreviadamente por BSA/PBS) e deixa-se em repouso uma hora à temperatura ambiente para bloquear a adsorção não específica. Então, separa-se o BSA/PBS e distribui-se uma amostra diluída de BSA/PBS (anti-soro de rato ou sobrenadante de cultura dos hibridomas) a 50 ul/alvéolo e incuba-se durante uma hora à temperatura ambiente. Depois de lavar 3 vezes com BSA/PBS, distribui-se uma diluição de 2,000 vezes de IgG de coelho anti-rato ligada a peroxidase (fabricada por DAKO Inc.) a 50 ul/alvéolo como um segundo anticorpo e deixa-se em repouso durante uma hora à temperatura ambiente. Depois de lavar os alvéolos 3 vezes com BSA/PBS, distribui-se nos alvéolos uma solução de substrato de OPD (uma solução preparada por dissolução em primeirc lugar de 10 mg de o-fenilenodiamina em 10 ml de solução tampão de citrato (PH 5,0) e em seguida, imediatamente antes da utilização, adição de urra solução aquosa de peróxido de hidrogénio até uma concentração final de 0,006 %) a 50 ul/al véolo e incuba-se durante 20 a 30 minutos á temperatura ambiente. Em seguida, adiciona-se a cada alvéolo para fazer parar a reacção 50 ul/alvéolo de ácido sulfúrico 2 M. Mede-se a absorvância a 490 nm usando um fotómetro.

Selecciona-se um rato portador de anti-soro que reage fortemente com o imunogene de acordo com os processos de determinação anteriormente descritos e utiliza-se para a preparação

de um hibridoma. Em seguida, remove-se o baço de forma estéril do rato imunizado ao qual se administra para reforço o imunogene três dias antes da fusão de célula. 0 baço é desintegrado em células isoladas usando um homogeneizador. As células isoladas são lavadas cuidadosamente com um meio RPMI 1640 que não contêm soro fetal de bovino (fabricado por Nippon Suisan Kaisha, Ltd.) e em seguida são usadas na fusão como células de baço.

(3) Preparação de Células de Mieloma

Usam-se como células de mieloma, células da linha de células de mieloma resistente a 8-azaguanina derivada de rato P3-X63 Ag8-Ul(P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology 1 e European J. Immunology, 6, 511“519 (1976)]. Antes do dia da fusão, as células de mieloma são incubadas durante vários dias na presença de 8-azaguanina para remover completamente as células revertentes. As células de mieloma são preparadas de tal modo que as células em fase de crescimento logarítmico po. 7 dem ser usadas em numero de 2x10' ou mais.

(4) Fusão de Célula

As células de baço de um rato imunizado preparadas conforme descrito em (2) e as células de mieloma obtidas conforme descrito em (3) são cuidadosamente lavadas com um meio RPMI 1640 que não contenha soro de bovino fetal e em seguida são misturadas de tal modo que a proporção entre as células de baço imunizadas e as células de mieloma é de 10 para 1. Depois de centrifugação da mistura (a 1200 rom durante 5 minutos), separa-se o sobrenadante. Depois de soltar cuidadosamente o aglomerado de células precipitado adiciona-se a estas 1 ml de solução de polietileno-glicol (meio RPMI 1640 que contêm polietileno-glicol 1540 a 40 55 fabricado por Wako Junyaku Co., Ltd.) previamente aquecido a 37°C. Depois de centrifugar a solução resultante sucessivamente a 300 rpm durante 2 minutos, 700 rpm durante 2 minutos e 1 000 rpm durante 2 minutos, elimina-se o sobrenadante e adiciona-se ao bolo um meio HAT (RPMI 1640 que contêm hipoxantins, timidina, aminopterina e soro fetal de bovino a 15 %), suspendendo-se em seguida delicadamente as células com uma pipeta. Distribui-se esta suspensão a 200 ul/alvé8

olo numa placa de 96 alvéolos e incuba-se durante 7 dias num incubador de CO2. Em seguida separaram-se 100 ul do sobrenadante da cultura e adiciona-se de fresco um volume igual de meio HAT aos alvéolos. Depois de continuar as mesmas operações com 2 ou 3 dias de intervalo durante 3 semanas a partir do dia da fusão, o meio é gradualmente alterado para meio HT (um meio preparado excluindo a aminopterina do meio HAT). A partir dos alvéolos nos quais os hibridomas estão em proliferação tiram-se amostras de parte do sobrenadante da cultura e submetem-se a determinação do seu título de anticorpo contra a fracção glicolipídica neutra usada como um imunogene de acordo com a imunoanálise enzimática acima descrita.

Os hibridomas que apresentam títulos de anticorpo elevados são submetidos a clonagem de acordo com a diluição limitante usando um timócito dum rato de idade aproximada de 4 semanas para células de alimentação e um meio RPMI 1640 que contêm soro fetal de bovino a 15 í para diluição.

(5) Preparação do Anticorpo Monoclonal

Há dois modos de preparação; de acordo com um dos modos, o sobrenadante da cultura de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais é usado directamente; de acordo com o outro modo de preparação, usa-se uma grande quantidade de anticorpos monoclonais purificados. Neste último modo, aproximadamente 1x10° células de cada hibridoma que produz o anticorpo visado são administradas por via intraperitoneal a ratos previamente tratados com pristano, recolhe-se o líquido ascítico de ratos que apresentam cancro ascítico depois de aproximadamente 2 semanas, centrifugam-se as ascites (a 3 000 rpm durante 10 minutos) e em seguida conserva-se o sobrenadante criogenicamente sob -70°C.

No caso de purificação dum anticorpo a partir destas ascites, as ascites são tratadas com sulfato de amónio saturado a 45 $ 3 vezes a 4°C e em seguida filtra-se através de gel usando Sephacryl S300 (fabricado por Pharmacia Fine Chemicals, Inc.). No caso em que o isótipo de um anticorpo é IgM, o anticorpo é filtrado por gel usando uma solução de tampão de fosfa9

to que contêm cloreto de sódio 0,5 Μ. A determinação da concentração de proteína é realizada usando um conjunto de análise de proteínas fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.

A determinação do isótipo de um anticorpo é realizada de acordo com a técnica de Ouchterlony (técnica da imunodifusão dupla) usando anti-soro de coelho específico para cada isótipo (fabricado por Miles, Inc.).

(6) Processo de Imunocoloração por Cromatografia em Camada Fina (Processo de Imunocoloração-CCF)

Usa-se para placa de camada fina uma placa de Sílica Gel 60 (5547, fabricada por Merck Corp.). As fracções de glicolípido neutro extraídas de vários cancros e tecidos normais são desenvolvidas usando um solvente de desenvolvimento C-M-A 65:30:6. A placa de camada fina é seca cuidadosamente, imersa em BSA/PBS a 5 % e em seguida deixada em repouso durante uma hora à temperatura ambiente para bloquear a reacção de anticorpos não específicos.

Depois de remever o BSA/PBS a 5 % por aspiração, a placa é imersa no sobrenadante da cultura de hibridomas positivos obtido como em (4) e em seguida é deixada em repouso durante 3 horas à temperatura ambiente. Depois de lavar a placa 5 a 8 vezes com BSA/PBS a 0,5 %, adiciona-se IgG anti-rato biotinizada diluida 100 vezes (fabricado por DAKO, Inc.) e deixa-se reagir durante 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, lava-se a placa 5 a 8 vezes com BSA/PBS a 0,5 %.

Em seguida adiciona-se à placa uma solução de peroxidase acoplada a avidina (fabricada por Funakoshi Co., Ltd.) previamente preparada e deixa-se reagir durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de lavar a placa resultante 5 a 8 vezes com BSA/PBS a 0,5 % e duas vezes com PBS, adiciona-se de seguida uma solução de substrato (IMMUNOSTAIN^R fabricado por Konica Corp.) e deixa-se reagir durante 20 a 30 minutos à temperatura ambiente com agitação leve. Depois de lavar 2 a 3 vezes com BSA/PBS a 0,5 % a placa é seca ao ar. Em seguida a localização de um antigene que se pretende reconhecer pelo anticorpo mono10

clonal contido no sobrenadante da cultura é identificada na placa de camada fina.

Seguidamente, a presente invenção será descrita por meio de exemplos. Contudo, a presente invenção não deve ser considerada restringida a estes exemplos.

Exemplo 1 (1) Preparação de Glicolípido Neutro

Extraíu-se uma fracção de glicolípido neutro de 25,8 g de tecidos de cancro de pâncreas humano e purificou-se de acordo com o método geral mencionado anteriormente. A quantidade total de glicolípido neutro obtida foi de 3,74 mg. 0 padrão do desenvolvimento desta fracção de glicolípido neutro obtida usando uma placa de camada fina (5547, fabricada por Merck Corp. é apresentado na Fig. 1-A.

(2) Preparação de ratos imunizados

A fracção de glicolípido neutro obtida de tecido de cancro de pâncreas humano do modo descrito em (1) foi administrado a ratos de 8 semanas de idade a 25 ug (em termos de glicolípido) /rato para imunização de acordo com o método mencionado anteriormente. A seguir, os ratos foram ainda imunizados 5 vezes com 25 ug (em termos de glicolípido por rato) do mesmo antigene a intervalos de 2 semanas. Seleccionou-se por imunoanálise enzimática o rato que tinha o título de anticorpo do seu anti-soro mais elevado de entre estes ratos imunizados. A partir desterato, tomaram-se células de baço e submeteram-se a fusão celular.

(3) Preparação de Células de Mieloma de Rato

A linha de células de mieloma de rato resistente a 8-azaguanina P3-U1 foi cultivada num meio FCS RPMI 1640 contendo 15 % de soro fetal de bovino. Na altura da fusão das células usaram-se aprox. 2xl0 células para a fusão celular.

(4) Preparação do Hibridoma

Misturaram-se numa relacção de 10:1 células de baço e células de mieloma obtido conforme descrito em (2) e (3) res11

pectivamente a fim de serem submetidas a fusão celular de acordo com o método mencionado.

Em cada sobrenadante de cultura foram colhidas amostras a partir dos alvéolos nos quais proliferaram hibridomas e em seguida submeteram-se à mencionada imunoanálise enzimática para determinar o seu título em anticorpo. Em seguida, os alvéolos que tinham títulos elevados foram seleccionados e submetidos à clonagem para estabelecer um hibridoma PC47H.

(5) Processo de Imunocoloração-CCF

No sentido de detectar um antigene que é reconhecido por um anticorpo monoclonal produzido pela linha de células de hibridoma obtida, efectuou-se a coloração imunológica de CCF usando uma placa de Sílica Gel 60 (5547, fabricada por Merck Corp.).

Como resultado obteve-se um anticorpo monoclonal PC47H que era reactivo para a fracção de ceramida-mono-glicosido contida nos glicolípidos neutros extraídos dum tecido de pâncreas humano.

Na Fig. 1-B é apresentado um padrão de reacção de PC47H de acordo com o processo de coloração imunológica de CCF.

anticorpo monoclonal (acm) PC47H não apresenta reactividade com qualquer das fracçoes a não ser com a fracção ceramida-mono-glicosido de glicolípidos neutros.

(6) Isótipo do acm PC47H

Pelo uso de anti-soro de coelho (fabricado por Miles Inc.) específico para cada classe Ig de imunoglobulina de rato, o isótipo do acm PC47H foi determinado por imunodifusão dupla. Como resultado tornou-se claro que o anticorpo monoclonal PC47H pertencia à classe IgM. 0 hibridoma que produz o anticorpo monoclonal anti-fucosilceramida PC47H preparado de acordo com a presente invenção está depositado no Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology sob o número de acesso FERM BP-2557.

Exemplo 2

Uma fracção de ceramida-mono-glicosido nos mamíferos contêm galactosilceramida (daqui em diante designada abreviadamente por Gal-Cer), Glucosilceraraida (daqui em diante designada abreviadamente por Glc-Cer) e fucosilceramida (daqui em diante designada abreviadamente por Fuc-Cer), como referido previamente [Akira Makita, Methods of Studying Complex Glycolipid II, págs. 3=12 in Lectures on Biochemical Experiment, 2nd series, Vol. 4, Tokyokagakudojin, Tokio (1986)].

No sentido de identificar o antigene a ser reconhecido por PC47H, realizámos a seguinte experiência.

A Gal-Cer autêntica (fabricada por Seikagaku Kogyo K.K.), Glc-Cer purificada e Fuc-Cer sintetizada quimicamente foram dissolvidas separadamente num solvente de clorofórmio/metanol (CM), 2:1 em volume, e o solvente foi substituído por etanol. A solução etanólica resultante foi distribuída em alvéolos de uma placa de ELISA (fabricada por SANKO JUNYAKU Co., Ltd.) em porções de 80, 40, 20, 10 e 5 ng e em seguida foi deixada em repouso toda a noite à temperatura ambiente para evaporar o solvente.

Depois de bloquear os alvéolos com BSA/PBS, distribuiu-se o sobrenadante da cultura de PC47H em porções de 50 ul/ /alvéolo e em seguida deixou-se reagir durante duas horas à temperatura ambiente.

Depois de lavar os alvéolos 3 vezes com BSA/PBS, distribuiu-se em porções de 50 ul/alvéolo uma diluição de 2 000 vezes de anticorpo de imunoglobulina anti-rato de coelho ligada a peroxidase (fabricado por DAKO Inc.) e em seguida deixou-se em repouso 1 hora à temperatura ambiente.

Depois de lavar cada alvéolo 3 vezes com BSA/PBS, adicionou-se a cada alvéolo a solução do substrato acima mencionado OPD. Depois de deixar reagir 20 minutos à temperatura ambiente, interrompeu-se a reacção com 50 ul de ácido sulfúrico 2 Μ. A absorvância a 490 nm da solução foi medida com um fotómetro. Os resultados são apresentados na Fig. 2.

acm PC47H não apresentou qualquer reactividade cruzada para Gal-Cer ou Glc-Cer mas reagiu significativamente com Fuc-Cer isolada. Este resultado prova que o PC47H é um anticorpo monoclonal que reage especificamente com Fuc-Cer que está presente na fracção de ceramido-mono-glicosido dos glicolípidos neutrais.

Exemplo 3

A reactividade do anticorpo monoclonal de anti-fucosilceramida PC47H para várias linhas de células foi observada de acordo com o seguinte processo EIA.

Suspenderam-se células num meio cultural que contêm FCS a 15 % e distribuiram-se numa placa de filtração de 96 alvéolos (GV de milititulação, fabricada por Millipore Inc.) numa quantidade de 10^ células/alvéolo e em seguida deixaram-se em repouso durante 1 hora a 37°C (a reacção de ligação não específica é bloqueada por esta operação). Depois de remover o meio de cultura dos alvéolos por aspiração, o sobrenadante da cultura de PC47H foi distribuído em porções de 100 ul/alvéolo e em seguida deixou-se reagir durante 1 hora a 4°C.

Depois de lavar as células resultantes 3 vezes com PBS para células (fosfato de sódio dibásico 2,9 g, fosfato de potássio monobásico 0,2 g, cloreto de potássio 0,2 g, NaCl 8 g e água destilada 1 1; PH 7,2), adicionou-se uma diluição de

000 vezes de anticorpo de imunoglobulina anti-rato de coelho ligada a peroxidase numa quantidade de 100 ul/alvéolo e em seguida fez-se reagir 1 hora a 4°C. Depois de lavar cada alvéolo vezes com PBS para células, adicionou-se uma solução de substrato de OPD numa quantidade de 100 ul/alvéolo para efectuar a reacção com as células lavadas.

A reacção enzimática foi prolongada durante 20 minutos e em seguida interrompida adicionando ácido sulfúrico 2 M numa quantidade de 50 ul/alvéolo. 0 grau de coloração foi avaliado usando um fotómetro. 0s resultados são dados no Quadro 1.

anticorpo monoclonal anti-fucosilceramida PC47H apresentou reactividade com linhas de células derivadas de can14

cro de pulmão, cancro do estomago, cancro do colon e cancro do pâncreas. Contudo, o PC47H não apresentou reactividade com linfócitos de sangue periférico normal, eritrócitos normais ou fibriblastos normais. Para além disso, o acm PC47H não mostrou reactividade com linhas de células derivadas de leucemia, hepatoma, cancro da mama ou neuroblastoma.

Reactividade do Anticorpo Monoclonal PC47H para com Várias Células de acordo com a

Análise Imunitária Enzimática (EIA) usando as Células

Nome das Células PC47H

Linha	de	células	de	leucemia	0/6
Linha	de	células	de	cancro do pulmão	2/3
Linha	de	células	de	cancro do estômago	1/1
Linha	de	células	de	cancro do cólon	2* *²/2
Linha	de	células	de	cancro do pâncreas	3*3/3
Linha	de	células	de	cancro do fígado	0/1
Linha	de	células	de	neuroblastoma	0/1
Linha	de	células	de	cancro da mama	0/1
Linha	de	células	de	fibroblastos normais	0/1

Linfócitos normais de sangue periférico 0/3

Eritrócitos normais 0/3 *1 Número de casos positivos/número de linha de células ou de especimens.

*2 2 casos deram resultados fracamente positivos.

*3 Um caso em 3 era fracamente positivo e os dois casos restantes eram positivos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lã Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a fucosilceramida caracterizado por compreender as fases de imunizar um animal com uma fracção glicolípida neutra extraída de cancro do pâncreas humano, fundir células do animal com células de mieloma para dar origem a hibridomas, clonar os hibridomas, seleccionar clones que produzem anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente a fucosilceramida e isolar o anticorpo monoclonal.

- 2ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo monoclonal ter as seguintes propriedades :

a. classe de Ig: IgM

b. Reactivo com linhas de células derivadas do cancro do pulmão, do cancro do estômago, do cancro do cólon e do cancro do pâncreas.

c. Não reactivo com linfócitos do sangue periférico normais, eritrócitos normais e fibroblastos normais.

d. Não reactivo com linhas de células derivadas de leucemia, hepatoma, cancro da mama e neuroblastoma.

_ 3ã _

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser PC47H.

- 4ã Processo para a preparação de uma linha de células de hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que re17 conhece especificamente a fucosilceramida caracterizado por compreender as fases de imunizar um animal com uma fracção glicolípida neutra extraída de cancro do pâncreas humano e fundir células do animal com células de mieloma.

_ 5a _

Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a linha de células de hibridoma ser FERM BP-2557 e produzir o ame PC47H.

- 6§ Processo para a preparação de um agente de diagnóstico para a determinação de cancros caracterizado por se incorporar um anticorpo monoclonal quando obtido de acordo com a reivindicação 1.

_ 7a _

Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o agente de diagnóstico preparado se destinar à determinação de cancro do pulmão, do cancro do estômago, do cancro do cólon ou do cancro do pâncreas.