NO177311B - Anti-fucosylceramid monoklonalt antistoff - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et nytt monoklonalt antistoff som "binder seg til fucosylceramid og har spesielle egenskaper.

Oppfinnelsen vedrører en hybridomacellelinje som fremstiller det monoklonale antistoffet, og en in vitro anvendelse av det monoklonale antistoffet som et dignostisk hjelpemiddel til bestemmelse av cancer.

Siden en monoklonal antistoff-fremstillingsteknikk hie etablert i 1975 av Kohler og Milstein [Nature 256:495

(1975) ], har en lang rekke forskere prøvd å fremstille et monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner cancervev. De benyttet en fremgangsmåte med selektering av et hybridom som er ureaktivt med humane normale celler, men gjenkjenner humane cancerceller ved direkte immunisering av en mus med de humane cancercellene. Det viste seg at mange av tumoranti-genene som ble gjenkjent av det monoklonale antistoffet oppnådd i den ovenfor beskrevne metoden, var sukkerkjedeanti-gener [S. Hakomori, Scientific American 254. 32.41 (1986)].

Som typiske eksempler på dette kan nevnes CA-19-9, sialyl SSEA-1, etc. Disse har allerede fått bred anvendelse innenfor det kliniske felt som markører for cancer [Reiji Kannagi, Clinical Pathology XXXTV: 11, 1247-1264 (1986)]. Disse antigenene har derimot sukkerkjeder som bærer 5 eller flere sukkere. Med hensyn til et kort-sukkerkjedet antigen, er det vurdert at undersøkelser senere fremdeles er utilstrekkelig selv om deres evne til å være viktige tumor-antigener allerede er diskutert.

Fucosylceramid (strukturformel: L-Fucal-lCer) bestående av en fucose som er bundet til ceramid (lipid-del) ble isolert fra tarmcancervev av Senitiroh Hakomori et al i 1976 og det var en mulighet at fucosylceramidet var glykolipid som er uttrykt spesifikt i humane cancere [JBC, 251. 2385-2387

(1976) ]. I tillegg immuniserte de en kanin med kjemisk syntetisert fucosylceramid for å fremstille et polyklonalt antistoff. Dette polyklonale antistoff var derimot ikke spesifikt til fucosylceramid alene, men tverr-reaktivt til ceramid og galaktosylceramid, slik at det var umulig å nøyaktig bestemme nærvær av fucosylceramid i humane cancerceller eller vev [Biochemistry, 21, 928-934 (1982)].

Som beskrevet over er et monoklonalt antistoff som reagerer spesifikt med fucosylceramid ennå ikke kjent. Hvis det er et monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner fucosylceramid, vil det ikke bare være nyttig for diagnose av humane cancere, men også meget nyttig for bestemmelse av fucosylceramid i humane cancerceller eller vev.

I den intensive forskning på et monoklonalt antistoff som reagerer spesifikt med fucosylceramid, er det vist at det monoklonale antistoffet PC47H som blir fremstilt fra et hybridom etablert ved immunisering av en mus med en nøytral glykolipidfraksjon ekstrahert fra et humant pancreascancervev, reagerer spesifikt med fucosylceramid og det er funnet det var mulig å bedømme nærvær av fucosylceramid i forskjellige cancerceller ved anvendelse av antistoffet i henhold til oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører derfor et monoklonalt antistoff som binder til fukocylceramid, men hverken til galaktocylceramid eller til glukocylceramid, kjennetegnet ved at det monoklonale antistoffet har følgende egenskaper: a. Ig-klasse: IgM; b. Reaktivt til cellelinjer avledet fra lungecancer, magecancer, tarmcancer og pancreascancer; c. Ureaktivt til normal perifer blodlymfocytt, normal erytrocytt og normal fibroblast; d. Ureaktivt til cellelinjer avledet fra leukemi, hepatoma,

brystcancer og neuroblastoma;

og at antistoffer er fremstilt ved anvendelse av naturlig

forekommende fukocylceramid ekstrahert fra humant cancervev som immunogen.

Oppfinnelsen angår videre en hybridomacellelinje som fremstiller et monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner fucosylceramid, kjennetegnet ved at den omfatter immuni-ser ing av et dyr med en nøytral glykolipidfraksjon ekstrahert fra human pancreascancer og sammensmelting av dyreceller med myelomaceller.

Oppfinnelsen angår også anvendelse in vitro av et monoklonalt antistoff som et diganostisk hjelpemiddel til bestemmelse av cancer, særlig lungecancer, magecancer, tarmcancer og pancreascancer.

Oppfinnelsen vil bli belyst ved hjelp av tegninger, der:

Fig. 1 viser et TLC (tynnsjiktskromatografi) mønster ved farging av alle nøytrale glykolipidfraksjoner og et TLC-mønster ved immunofarging av fucosylceramid (Fuc-Cer) med monoklonalt antistoff PC47H. Fig. 2 viser resultatene fra analyse av kryssreaktivitet av monoklonalt antistoff PC47H av Fuc-Cer, Gal-Cer og Glc-Cer.

Foreliggende oppfinnelse vil heretter bli beskrevet i detalj.

En mus blir immunisert med en nøytral glykolipidfraksjon ekstrahert fra human pancreas cancervev [immunisering ble utført i henhold til metoden til Carlson et al. (Eur. J. Immunol., 16, 951 (1986))]. Miltceller fra mus blir smeltet sammen med mus-myelomaceller for å fremstille hybridomer. Deretter blir hybridomene klonet ved begrenset fortynning for å oppnå et monoklonalt antistoff [J. Biochem (Tokyo), 99, 269

(1986)]. Et antigengjenkjennende monoklonalt antistoff blir analysert [J. Immunol. Methods, 38, 85 (1980)] ved immunologisk farging ved å anvende tynnsjiktkromatografi (TLC)

(heretter forkortet til TLC-immunofarging) [Can. Res., 47, 1968 (1987)] og ved enzymimmunoanalyse (EIA) ved å anvende en mikrotitrerings-plate til hvilken glykolipidet blir adsor-bert.

Det monoklonale antistoffet fremstilt ved den ovenfor beskrevne hybridoma tilhører IgM-klassen, og gjenkjenner spesifikt fucosylceramid som forekommer i en ceramid-mono-glykosidfraksjon fra nøytrale glykolipider som et antigen. Et spesifikt eksempel på foreliggende monoklonale antistoff er PC47E som blir produsert av en hybridomcellelinje FERM BP-2557.

En fremgangsmåte for fremstilling av det foreliggende monoklonale antistoff vil heretter bli beskrevet i detalj.

(1) Fremstilling av nøytralt glvkollpid

Et humant pancreas cancervev blir kuttet i små biter ved å anvende en Warring-blender eller lignende. Vevsbitene blir ekstrahert med 2:l-blanding av kloroform-metanol (heretter forkortet til C-M 2:1), en l:l-blanding av kloroform-metanol (heretter forkortet til C-M 1:1) og en 1:2:0,8-blanding av kloroform-metanol-vann (heretter forkortet til C-M-W 1:2:0,8), hvert volum er tilnærmet 20 ganger det til vevsstykkene. Ekstraktet blir inndampet til tørrhet under redusert trykk for å oppnå samlede lipidfraksjoner. Deretter blir de samlede 1 ipidf raks j onene oppløst i C-M 1:1 som inneholder 0,5N KOE. Etter at blandingen får anledning til å stå over natten ved romtemperatur, blir den resulterende oppløsningen dialysert mot destillert vann for å fjerne en fosfolipidfraksjon. Denne fraksjonen blir oppløst i C-M-W 30:60:8 og deretter anbrakt på en DEAE-Sephadex A-25

(eddiksyretype, fremstilt ved Pharmacia Fine Chemicals Inc.)

for ved adsorpsjon å fjerne sure lipidfraksjoner. Nøytrale lipidfraksjoner blir anbrakt på en silikagel 60 (forhandlet av Merck Corp. ) kolonne for først å eluere enkle lipider med

kloroform og deretter eluere en rå glykolipidfraksjon med C-M-W 65:30:8. Etter inndamping til tørrhet blir den rå glykolipidfraksjonen acetylert ved oppløsning av den samme i en 3:2-blanding av pyridin-eddikanhydrid. Den acetylerte fraksjonen blir anbrakt på en Florisilkolonne (forhandlet av Floridin Inc.). Etter eluering av lave polare lipider med 1,2-dikloretan, blir en acetylert glykolipidfraksjon eluert med en blanding av 1,2-dikloretan-aceton (1:1). Denne fraksjonen blir oppløst i en 1:4 blanding av 28$ ammoniakk-vann-metanol og får deretter anledning til å stå i 12 timer ved romtemperatur for å deacetylere den samme.

Til analyse av en nøytral glykolipidfraksjon, blir tynnsjiktkromatografi (TLC) valgt. I TLC blir en silikagel 60 plate (5461 eller 5547, fremstilt av Merck Corp.) anvendt, som blir utviklet med C-M-W 65:25:4. Til påvisning av nøytrale glykolipider blir resorcinolreagens anvendt.

Bestemmelse av glykolipid blir utført ved gassvæskekromato-grafi.

(2) Preparering av immuniserte mus

En tilstrekkelig mengde glykolipider fremstilt som i (1), 5 mg lipid A, 68 mg dimyristylfosfatidylkolin, 28 mg kolesterol og 6 mg dicetylfosfat blir oppløst i et hensiktsmessig løsningsmiddel. Etter inndamping av blandingen til tørrhet i en 50 ml egg formet flaske, blir 10 ml fosfatbufferoppløsning (PBS; som inneholder 2,8 g toverdig natriumfosfat, 0,3 g enverdig natriumfosfat, 9 g NaCl og 1 1 destillert vann; pH 7,2) og 3 ml av glassperler (2 mm diameter) tilsatt den tørkede blandingen. Den resulterende oppløsningen blir kraftig ristet og omrørt for å danne liposomer. Suspensjonen, uten glassperlene blir administrert til omtrent 8 uker gamle mus hypodermisk (i de sammenføyde delene av bena) i et volum på 150 pl og intraperitonealt i volum på 50 pl som gir et samlet volum på 200 pl. Deretter blir immuniserIngen gjentatt i 2-ukers intervaller på samme måte som nevnt foran. Antiserum blir oppsamlet fra fundus venous plexus hver uke og dens antistofftiter blir bestemt ved en enzymimmunoanalyse.

Enzvmimmunoanalvse

Nøytrale glykolipider fremstilt som i (1) blir oppløst i C-M 2:1 og deretter blandet i en passende mengde med etanol (denne oppløsningen blir deretter justert til å inneholde 20 til 100 ng/ml glykolipid). Den resulterende oppløsningen blir dispensert i 50 pl/brønn på en 96-brønners EIA-plate (produsert av Sanko Junyaku Co., Ltd.) og fikk anledning til å stå i 1 time ved 56°C for å inndampe etanol. Deretter blir hver brønn fylt med 1% bovint serumalbumin (BSA)-PBS (heretter forkortet til BSA/PBS) og fikk anledning til å stå i 1 time ved romtemperatur for å blokkere uspesifikk adsorpsjon. Deretter ble BSA/PBS helt vekk og en BSA/PBS-fortynnet prøve (museantiserum eller hybridoma dyrkingssupernatant) blir dispensert 50 pl/brønn og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking av hver brønn 3 ganger med BSA/PBS, blir en 2000-gangers fortynning av peroksidase-bundet kaninanti-mus IgG (forhandlet av DAKO Inc.) dispensert i 50pl/brønn som et annet antistoff og fikk anledning til å stå i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking av brønnene 3 ganger med BSA/PBS, blir en OPD-substratoppløsning (en oppløsning fremstilt ved først å oppløse 10 mg o-fenylen-diamin i 10 ml citratbufferoppløsning (pH 5,0) og deretter umiddelbart før anvendelse tilsetning av vandig oppløsning av hydrogenperoksid for å gi sluttkonsentrasjon på 0,006$) dispensert i brønnene ved 50 pl/brønn og inkubert i 20 til 30 minutter ved romtemperatur. Deretter blir 50 pl/brønn 2M svovelsyre tilsatt til hver brønn for å stoppe reaksjonen. Absorbans ved 490 nm blir målt ved å anvende et fotometer.

En mus som bærer antiserum som reagerer kraftig med immunogene, blir utvalgt i henhold til bestemmelsesmetodene over og anvendt for fremstilling av et hybridom. Deretter blir en milt sterilt fjernet fra den immuniserte musen til hvilken immunogene forsterket 3 dager før cellefusjon. Milten blir brutt opp i enkle celler ved å anvende en homogenisator. De enkelte cellene blir vasket grundig med et RPMI 1640 medium som ikke inneholder føtalt bovint serum (fremstilt av Nippon Suisan Kaisha, Ltd.) og deretter anvendt som fusjonsmilt-celler.

(3) Fremstilling av Myeloma- celler

Som en myelomacelle blir muse-avledet 8-azaguaninresistent myelomacellelinje Ps-X63 Ag8-Ul(P3-Ul) [Current Topics in Microbiology and Immunology 1 and European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)] anvendt. Før infusjonsdagen blir myelomaceller inkubert i flere dager i nærvær av 8-azaguanin for fullstendig å fjerne revertanter. Myeolomaceliene blir således fremstilt ved at cellene i logaritmisk vekstfase kan bli anvendt i et antall på 2X10<7> eller mer.

(4) Cellefus. lon

Miltceller fra en immunisert mus fremstilt som i (2) og myelomaceller oppnådd som beskrevet i (3), blir grundig vasket med et RPMI 1640 medium som ikke inneholder føtalt bovint serum og deretter blandet slik at celletallforholdene mellom immunisert miltcelle til myelomacelle er 10 til 1. Etter sentr i fuger ing av blandingen (ved 1200 rpm i 5 min.) blir supernatanten helt vekk. Etter å ha løsnet den bunnfelte celleklumpen grundig, blir 1 ml polyetylenglykoloppløsning (RPMI 1640 medium som inneholder 40$ polyetylenglykol 1540 produsert av Wako Junyaku Co., Ltd.) som nylig var oppvarmet til 37°C tilsatt. Etter sentrifugering av den resulterende oppløsningen suksessivt ved 300 rpm i 2 min., 700 rpm i 2 min. og 1000 rpm i 2 min., blir supernatanten fjernet og et HAT-medium (RPMI 1640 medium som inneholder hypoxantin, tymidln, aminopterin og 15$ føtalt bovint serum), blir tilsatt pelleten. etterfulgt av forsiktig suspendering av cellene med en pipette. Denne suspensjonen blir dispensert i 200 pl/brønn på en 96-brønnplate og inkubert i 7 dager i en C02~inkubator. Deretter blir 100 pl av dyrkingssupernatanten helt vekk og et likt volum med HAT-medium blir friskt tilsatt til brønnene. Etter fortsettelse av samme operasjon med 2 til 3 dagers intervaller i 3 uker fra infusjonsdagen, blir mediet gradvis endret til HT-medium (et medium fremstilt ved å ekskludere aminopterin fra HAT-mediet). Fra brønnene der hybridomene prolifererer, blir dyrkingssupernatanten delvis oppsamlet og er gjenstand for bestemmelse av antistofftiter mot den nøytrale glykolipidfraksjonen som blir anvendt som et immunogen i henhold til den ovenfor beskrevne immunoanalyse.

Hybridomet som viser høy antistofftiter er gjenstand for kloning i henhold til begrenset fortynning ved å anvende en tymocytt fra en mus med alder tilnærmet 4 uker som en tilføringscelle og et RPMI 1640 medium som inneholder 15$ føtalt bovint serum som en fortynning.

(5) Fremstilling av monoklonalt antistoff

Det er to fremstillingsveier, den ene veien der dyrkingssupernatanten med hybridomer, som produserer monoklonale antistoffer blir anvendt direkte, og den andre veien der en stor mengde av rensede monoklonale antistoffer blir anvendt. I den sistnevnte blir tilnærmet 1x10^ celler av hvert hybridom som fremstiller det ønskede antistoff Intraperitonealt administrert til mus som nylig var forbehandlet med pristan, ascites blir oppsamlet fra mus som viser ascitisk cancer etter tilnærmet 2 uker, ascites blir sentrifugert (ved 3000 rpm i 10 min.) og deretter blir supernatanten kryopre-servert under -70°C. I det tilfellet med rensing av et antistoff fra disse ascitene, blir ascitene utsaltet med 45$ mettet ammoniumsulfat 3 ganger ved 4°C og deretter gelfil-trert ved å anvende Sephacryl S300 (produsert av Pharmacia Fine Chemicals, Inc.). I det tilfellet isotypen til et antistoff er IgM, blir antistoffet gelfUtrert ved å anvende en fosfatbufferløsning som inneholder 0,5M natriumklorid. Bestemmelse av proteinkonsentrasjon blir gjennomført ved å anvende et proteinanalysesett produsert av Bio-Rad Labora-tories, Inc.

Bestemmelsen av isotypen til et antistoff blir gjennomført i henhold til Ouchterlony-teknikken (dobbel immunodiffusjon-teknikk) ved å anvende kaninantisera som er spesifikk til hver isotop (produsert av Miles, Inc.).

(6) Immunofargingsmetode ved å anvende tynns. 1 iktkromatograf i

( TLC- immunofargingsmetode)

Som en tynnsjiktplate blir det anvendt en silikagel 60 plate (5547, produsert av Merck Corp.). Nøytrale glykolipidfraksjoner ekstrahert fra forskjellige cancere og normalt vev blir fremkalt ved å anvende et fremkallingsløsningsmiddel C-M-W 65:30:6. Tynnsjiktplaten blir tørket grundig, senket i 5$ BSA/PBS og deretter fikk anledning til å stå i 1 time ved romtemperatur for å blokkere reaksjonen til uspesifikke antistoffer.

Etter fjerning av 5$ BSA/PBS ved oppsuging, blir platen senket i dyrkingssupernatanten med de positive hybridomene oppnådd som i (4) og fikk deretter anledning til å stå i 3 timer ved romtemperatur. Etter vasking av platen 5 til 8 ganger med 0,5$ BSA/PBS, blir en 100-gangers fortynning med biotinisert antimus IgG (produsert av DAKO, Inc.) tilsatt og reagert i 1 time ved romtemperatur. Deretter blir platen vasket 5 til 8 ganger med 0,5$ BSA/PBS.

Deretter blir en avidinkoblet peroksidaseoppløsning (produsert av Funakoshi Co., Ltd.) som nylig var fremstilt tilsatt til platen og reagert i 1 time ved romtemperatur. Etter vasking av den resulterende platen 5 til 8 ganger med 0,5$ BSA/PBS og deretter to ganger med PBS, blir en substrat-oppløsning (IMMUNOSTAIN produsert av Konica Corp.) tilsatt og reagert i 20 til 30 minutter ved romtemperatur med forsiktig risting. Etter vasking 2 til 3 ganger med 0,5$ BSA/PBS, blir platen lufttørket. Deretter blir lokaliseringen av et antigen som blir gjenkjent av det monoklonale antistoff som er inneholdt i dyrkingssupernatanten identifisert på tynnsjiktplaten.

Eksempel 1

(1) Fremstilling av nøytralt glvkolipid

Fra 25,8 g human pancreascancervev, ble en nøytral glykolipidfraksjon ekstrahert og renset i henhold til den forannevnte generelle metoden. Den samlede mengden av nøytralt glykolipid som ble oppnådd var 3,74 mg. Utviklingsmønstre av denne nøytrale glykolipidfraksjonen som ble oppnådd ved å anvende en tynnsjiktplate (5547, produsert av Merck Corp.), er vist i fig. 1-A.

(2) Preparering av immuniserte mus

Den nøytrale glykolipidfraksjonen oppnådd fra humant pancreascancervev på den måten som beskrevet i (1) ble administrert til 8 uker gamle mus ved 25 pg (uttrykt ved glykolipid)/mus for å immunisere i henhold til den forannevnte metoden. Deretter ble musene videre immunisert 5 ganger med 25 jjg (uttrykt ved glykolipid/mus) med samme antigen ved intervaller på 2 uker. Den ene som hadde den høyeste antistofftiter i sitt antiserum blant disse immuniserte mus ble selektert ved enzymimmunoanalyse. Fra denne mus ble miltceller tatt og var deretter gjenstand for cellefusjon.

(3) Fremstilling av muse- myelomacelle

8-azaguanin-resistent musemyelomcellelinje P3-U1 ble dyrket i et FCS RPMI 1640 medium som inneholder 15$ føtalt bovint

serum. Ved tidspunktet for cellefusjon ble tilnærmet 2X10<7 >celler anvendt til cellefusjon.

(4) Fremstilling av hybridoma

Miltceller og myelomaceller oppnådd som i henholdsvis (2) og (3) ble blandet i et 10:1 forhold for å gjennomgå cellefusjon i henhold til foregående metode.

Hver dyrkingssupernatant ble samlet fra brønner der hybridoma prolifererte og var deretter gjenstand for den forannevnte enzymimmunoanalysen for å måle dens antistofftiter. Deretter ble brønnene som hadde høye titere selektert og gjenstand for kloning for å etablere en hybridoma PC47H.

(5) TLC- immunofargemetode

For å påvise et antigen som er gjenkjent ved et monoklonalt antistoff fremstilt ved den oppnådde hybridomacellelinjen, ble TLC-immunologisk farging gjennomført ved å anvende en silikagel 60 plate (5547, produsert av Merck Corp.).

Som et resultat ble et monoklonalt antistoff PC47H som var reaktivt til ceramid-mono-glykosidfraksjonen som var inneholdt i de nøytrale glykolipidene ekstrahert fra et humant pancreascancervev oppnådd.

Et reaksjonsmønster for PC47H i henhold til TLC-immunologisk fargingsmetode er vist i fig. 1-B.

PC47H monoklonalt antistoff (mab) viste ikke reaktivitet med noen fraksjoner andre enn ceramid-mono-glykosidfraksjonen fra nøytrale glykolipider.

(6) Isotvpe av PC47H mab

Ved anvendelse av kaninantiserum (produsert av Miles Inc.) spesifikt til hver museimmunoglobulin lg klasser, ble isotypen til PC47H bestemt ved dobbel immunodiffusjon. Som et resultat ble det klart at monoklonalt antistoff PC47H tilhørte IgM klassen. Hybridomene som produserer anti-fucosylceramid monoklonalt antistoff PC47H i henhold til foreliggende oppfinnelse er deponert i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology med aksesjon FERM BP-2557.

Eksempel 2

En fraksjon med ceramid-mono-glykosid i pattedyr inneholder galaktosylceramid (heretter forkortet til "Gal-Cer"), glykosylceramid (heretter forkortet til "Glc-Cer") og fucosylceramid (heretter forkortet til "Fuc-Cer"), som nylig rapportert [Akira Makita, "Methods of Studying Complex Glycolipid II", s. 3~12 i "Lectures on Biochemical Experi-ment, 2nd series", vol. 4, Tokyokagakudojin, Tokyo (1986)].

For å identifisere antigenet som skal bli gjenkjent av PC47H, ble følgende eksperiment gjennomført.

Autentisk Gal-Cer (produsert av Seikagaku Kogyo K.K.) og renset Glc-Cer og kjemisk syntetisert Fuc-Cer ble separat oppløst i et løsningsmiddel med kloroform/metanol (CM), 2:1 ved volum, og løsningsmidlet ble erstattet med etanol. Den resulterende etanoloppløsningen ble dispensert i brønner på en ELISA-plate (produsert av SANKO JUNYAKU Co., Ltd.) i 80, 40, 20, 10 og 5 ng porsjoner og fikk deretter anledning til å stå over natten ved romtemperatur for å inndampe løsnings-midlet .

Etter blokkering av brønnene med BSA/PBS, ble supernatanten fra PC47H-kulturen dispensert i 50 pl/brønn porsjoner og deretter reagert i 2 timer ved romtemperatur.

Etter vasking av brønnene 3 ganger med BSA/PBS, ble en 2000-gangers fortynning av peroksidase-bundet kanin-anti-mus-immunoglobulin-antistoff (produsert av DAKO Inc.) dispensert i 50 Ml/brønn porsjoner og fikk deretter anledning til å stå 1 time ved romtemperatur.

Etter vasking av hver brønn 3 ganger med BSA/PBS ble den forannevnte OPD substratoppløsningen tilsatt til hver brønn. Etter en 20 minutters reaksjon ved romtemperatur ble reaksjonen stopper med 50jj1 2M svovelsyre. Absorbans ved 490 nm av oppløsningen ble målt med et fotometer. Resultatene er vist i fig. 2.

PC47H mab viste ingen kryssreaktivitet i det hele tatt til Gal-Cer eller Glc-Cer, men reagerte betydelig på Fuc-Cer alene. Dette resultatet beviser at PC47H er et monoklonalt antistoff som spesifikt reagerer med Fuc-Cer som er tilstede i ceramid-mono-glykosidfraksjonen i nøytrale glykolipider.

Eksempel 3

Reaktiviteten til anti-fucosylceramid monoklonalt antistoff PC47H til forskjellige cellelinjer ble undersøkt i henhold til følgende EIA-metode.

Cellene ble suspendert i et RPMI 1640 dyrkingsmedium som inneholder 15$ FCS og ble tilført en 96-brønn filtrer-ingsplate (millititer GV, produsert av Millipore Inc.) ved en hastighet på IO<4> celler/brønn og fikk deretter anledning til å stå i 1 time ved 37°C (reaksjon av uspesifikk binding blir blokkert i denne operasjon). Etter fjerning av dyrkingsmediet fra brønnene ved oppsuging, ble supernatanten til PC47H-kulturen dispensert i 100 pl/brønn porsjoner og deretter reagert i 1 time ved 4°C.

Etter vasking av de resulterende cellene 3 ganger med "PBS til celler" (toverdig natriumfosfat 2,9 g, enverdig kalium-fosfat 0,2 g, kaliumklorid 0,2 g, NaCl 8 g og destillert vann 1 1; pH 7,2), ble en 2000-gangers fortynning av peroksidase-linket kanin-anti-mus-immunoglobulin-antistoff tilsatt ved en hastighet på 100 pl/brønn og deretter reagert 1 time ved 4°C. Etter vasking av hver celle 3 ganger med "PBS til celler", ble en OPD-substratoppløsning tilsatt ved en hastighet på 100 pl/brønn for å utføre reaksjon med de vaskede cellene.

Den enzymatiske reaksjonen ble fortsatt i 20 minutter og deretter stoppet ved tilsetning av 2M svovelsyre ved en hastighet på 50 pl/brønn. Graden av farging ble bedømt ved å anvende et fotometer. Resultatene er gitt i tabell 1.

Det anti-fucosylceramidmonoklonale antistoff PC47H viste reaktivitet med cellelinjene avledet fra lungecancer, magecancer, tarmcancer og pancreascancer. Derimot viste PC47H ingen reaktivitet med normal perifer blodlymfocytt, normal erytrocytt eller normal fibroblast. I tillegg viste PC47H mab ingen reaktivitet med cellelinjer avledet fra leukemi, hepatoma, brystcancer eller neuroblastoma.

Claims (6)

1. Monoklonalt antistoff som "binder til fukocylceramid, men hverken til galaktocylceramid eller til glukocylceramid, karakterisert ved at det monoklonale antistoffet har følgende egenskaper: a. Ig-klasse: IgM; h. Reaktivt til cellelinjer avledet fra lungecancer, magecancer, tarmcancer og pancreascancer; c. Ureaktivt til normal perifer blodlymfocytt, normal erytrocytt og normal fibroblast; d. Ureaktivt til cellelinjer avledet fra leukemi, hepatoma, brystcancer og neuroblastoma; og at antistoffer er fremstilt ved anvendelse av naturlig forekommende fukocylceramid ekstrahert fra humant cancervev som immunogen.

2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det monoklonale antistoffet er PC47H.

3. Hybridomacellelinje som fremstiller et monoklonalt antistoff ifølge krav 1 som spesifikt gjenkjenner fucosylceramid, karakterisert ved at den omfatter immuni-ser ing av et dyr med en nøytral glykolipidfraksjon ekstrahert fra human pancreascancer og sammensmelting av dyreceller med myelomaceller.

4. Hybridomcellelinje ifølge krav 3, karakterisert ved at hybridomacellelinjen er FERM BP-2557 som fremstiller mab PC47E.

5. Anvendelse in vitro av monoklonalt antistoff ifølge krav 1 som et diagnostisk hjelpemiddel til bestemmelse av cancer.

6. Anvendelse Ifølge krav 5 der cancerne er lungecancer, magecancer, tarmcancer og pancreascancer.