JPS63304995A

JPS63304995A - モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPS63304995A
Application number: JP62138871A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Yamazaki; 山崎　誠彦; Kiyomi Sunaga; 須永　清美; Katsutaka Nagai; 永井　克孝
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1987-06-04
Filing date: 1987-06-04
Publication date: 1988-12-13
Anticipated expiration: 2010-03-15
Also published as: US4942131A; JPH0722518B2; EP0293940B1; DE3881101D1; EP0293940A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の目的］（産業上の利用分野）本発明は、０−アシルシアル酸含有糖鎖、特に４−Ｏ−
アセチル−Ｎ　−クリコリルノイラミニルラクトシルセ
ラミド（以下ｒ　０Ｍ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）
Ｊ　という）を特異的に認識する七ツクローナル抗体及
び該抗体を産生ずるハイブリドーマの作成方法に関する
ものである。

（従来の技術及びその問題点）糖脂質は細胞膜の構成成分であり、構成糖の種類、数、
結合方法の違いにより多様な分子種が存在し、種特異的
、臓器特異的、細胞特異的な分布を示す、その機能とし
ては、細菌毒素、ホルモン等の受容体として、また、血
液型物質等、免疫学的決定基としての働きの他、増殖又
は文化の制御や細胞間の相互作用に関し、重要な役割り
を演じていることが明らかになりつつある。更に、Ａｌ
’Ｂ胞のガン化に伴い、質的、量的な組成変化が起こり
、一部はガン抗原となリラることが示され、また、ある
種の糖脂質が増殖因子、タンパク質キナーゼを介する細
胞増殖機構の調節者として働く例など、その組成変化が
、ガン化機構に直接的に関与している可能性も示唆され
ている。

一方、１種類の抗原決定基に対し特異性を有する、均〜
　な抗体を産生ずる細胞株の樹立方法がミルスタインら
により報告され［Ｎａｔｕｒｅ、出。

４９５（１９７，５）］、微量物質の定性、定量が可能
となった。ガン抗原の検索を行うため、この技術を用い
、ガン細胞に特異的な多くのモノクローナル抗体が作製
されたが、このうちのいくつかは糖脂質あるいは糖タン
パク質の糖鎖を認識する抗体であることが明らかにされ
た［Ｊ、　Ｗａｔｔ、　ＣａｎｃｓｒＩｎｓｔ、、　７
１　、２３１（１９８３）　］　−例えば、人のメラノ
ーマに対するモノクローナル抗体としてＧＤ、ガングリ
オシド、あるいはＧＤ３ガングリオシドなどの糖脂質と
反応する抗体が得られている。また、膵ガンに特異的な
モノクローナル抗体ＮＳ　１９−９は、シアロシルルイ
スＡ型の糖鎖を有するｔＪＭ＠質及び糖タンパク質と反
応する。これらの抗体はガンの診断、治療経過の観察に
有用であり、更に治療への利用も試みられている。ａ！
脂質のガン化に伴う質的、ｆｌ的変化は、遺伝子の発現
異常により糖鎖生合成機構における種々の糖転移酵素の
活性が変化することに起因しており、その結果、正常組
織に存在しないような糖鎖構造が作り出される。その糖
鎖構造は。

ガンマ−カーとしての利用が可能である。

こめように、ガン化機構解明の手掛りとして、また、ガ
ン抗原及びガンマ−カーとしての糖脂質の重要性、有用
性が注目されており、診断、治療等、臨床分野への応用
が期待される。

糖脂質のうち、Ｓ性糖であるシアル酸をその糖鎖中に含
有するものはガングリオシドと総称される。シアル酸は
、Ｎ−アセチルノイラミン酸とＮ−グリコリルノイラミ
ン酸に大別され、更に、それぞれのシアル酸の水酸基が
アシル化されたものも存在する。

近年、９−０−アセチル化されたＮ−アセチルノイラミ
ン酸を含む複合糖質がインフルエンザＣ型のレセプター
として働くことが明らかにされた［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅ＋ｓ、、　２８１　、５９４７（１９８Ｂ）］　
、また、大メラノーマ細胞に特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体が認識する人ガン抗原としてシアル酸の９位
が０−アセチル化されたＧＤ、ガングリオシドが同定さ
れた［Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅ＋ｓ、、　２５９　。

７４５３（１９８４）］　、このように、］０−アシル
シアル酸含有糖鎖びそれに対する抗体はガンを含む各種
疾患め診断・治療への応用が期待される。

一方、シアル酸は動物種の諸臓器、細胞、体液中に広く
検出されるがＮ−グリコリルノイラミン酸については、
正常人及びニワトリには今までのところ見出されていな
い。

血清病患者に検出され、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、
モルモットの赤血球を凝集する異好性抗体はハンガナチ
ウーダイヘル（Ｈａｎｇａｎａｔｚｉｕ−Ｄｅｉｃｈｅ
ｒ　、以下ｒＨ−ＤＪという）抗体と呼ばれる。この抗
体により認識される抗原はＨ−Ｄ抗原と呼ばれる。Ｎ−
グリコリルノイラミン酸含有ガングリオシドがＨ−Ｄ抗
原活性を有することが報告され［Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、　
Ｂｉｏｐｈ７ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　７９
゜３８８（１９７７）　］　、　ＮｅｕＧｃ　ａ２−３
　（ｉａｌの糖鎖構造が主な抗原決定基として同定され
た。

近年、Ｈ−Ｄ抗原活性を有するガングリオシドであるＮ
−グリコリルノイラミニルラクトシルセラミド（以下ｒ
　Ｇ　Ｍ　３　（ＮｅｕＧｃ）という）をニワトリに免
疫して、血清からＨ−Ｄ抗原活性を有する種々のガング
リオシドと反応する抗体が作製された’［Ｎｏ１ｅｃ、
　ｌｍ５ｕｎ、、　１９　、８７（１９８２）］　、更
に、この抗体を用いて、Ｎ−グリコリルノイラミン酸が
大ガン組織に特徴的に存在することが報告された［Ｂｉ
ｋｅｎ　Ｊ、、　２５．４７（１９８２）］　、また、
人大腸ガン組織より抽出された糖脂質中に、数種のＨ−
Ｄ抗原活性なＮ−グリコリルノイラミン酸含有ガングリ
オシドが検出され、奇形腫の組織中からは、Ｈ−Ｄ抗原
活性な糖鎖を有する糖タンパク質が検出された［Ｇａｎ
ｎ、　７５．　ｉｏ’２５（１９８４）］　、ニワトリ
にて作製した抗体を用いて人大腸ガン組織より検出され
るＨ−Ｄ抗原活性を有する糖脂質を分析したところ、Ｇ
　Ｍ２　（ＮｅｕＧｃ）、Ｇ　Ｍ３　（ＮｅｕＧｃ）　
、　ｒＶ　”ＮｅｕＧｃ−ｎＬｃＯｓｅ４　Ｃｅｒのほ
かにＯ−アシル化されたグリコリルノイラミン酸を有す
るＧＭ、が検出された。ニワトリにて作成した抗体の反
応性から、このガングリオシドはグリコリルノイラミン
酸の４位がアセチル化されたものであり、０Ｍ３（４−
０−Ａｃ　−ＮｅｕＧｃ）と推定された。その確認のた
め、　Ｇ　Ｍｓ　（４−０−Ａｃ　−ＮｅｕＧｃ）と反
応し、０Ｍ３（ＮｅｕＧｃ）　　と交叉反応しないポリ
クローナル抗体がニワトリにて作成され、これを用いて
人大腸ガン組織を検討したところ、確かに０Ｍ３（４−
０−Ａｃ　−ＮｅｕＧｃ）が見出された［Ｍｏ１ｅｃ。

Ｉｍｍｕｎ、、　２３．　ｆ１３１（１９１３６）　］
　。

このように、ある種のＯ−アシルシアル酸含有糖鎖、特
に０Ｍ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）はガン関連抗
原と考えられ、これを高感度に精度よく検出することは
ガン診断上極めて重要である。このような糖鎖抗原を効
率よく検出するには、検出感度、精度の面から、免疫学
的測定法が優れていると考えられる。

０−アシルシアル酸含有糖鎖に対するポリクローナル抗
体についてはほとんど報告がないが、０Ｍ３（４−０−
Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）　　と反応する抗体は。

従来、ニワトリに精製糖脂質抗原を免疫し、その血清よ
り分離することにより得られた［Ｍｏ１ｅｃ。

Ｉｍｍｕｎ、、　２３．　［１３１（ｆ９８Ｂ）　］　
、　Ｉ、かしながら、この方法はいくつかの欠点を有し
ている。即ち、（１）抗血清を得るためには、そのたび
ごとに大量の精製抗原が必要である。（２）主として免
疫動物の個体差に起因する、親和性や力価のバラツキが
ある。（３）目的とする抗体以外の抗体も混在するため
、目的の抗体を精製するためには繁雑な操作が必要であ
る。（４）一度に作製できる量に限度がある等の欠点で
ある。それ故、正確にかつ最大の効果を持って免疫学的
測定を行うためには、他の抗体の混入しない品質の安定
した均一な抗体が大量に供給できることが望まれていた
。このような抗体の作製は、既に、モノクローナル抗体
産生技術として報告されている。

しかしながら、０−アシルシアル酸含有糖鎖に特異的に
反応するモノクローナル抗体及び該抗体産生能を有する
ハイブリドーマについての報告は、前記のＮ−アセチル
ノイラミン酸の９位がアセチル化されたＧＤ、に対する
もののみであり、９位以外の水酸基が置換されたもの又
はＮ−グリコリルノイラミン酸の水酸基が置換されたも
のについての報告はない。

そこで、本発明者は、０−アシルシアル酸含有糖鎖と特
異的に反応するモノクローナル抗体、特に、°４位がア
セチル化されたＮ−グリコリルノイラミン酸を有するガ
ングリオシドであるＧＭ。

（４−０−Ａｃ　−ＮｅｕＧｃ）と反応するモノクロー
ナル抗体を作成すべく鋭意研究を本発明を完成するに至
った。

［発明の構成］（問題点を解決するための手段）本発明は、０−アシルシアル酸含有糖鎖を特異的に認識
することを特徴とするモノクローナル抗体及び該抗体を
産生ずるハイブリドーマの作成方法に関するものである
。

ここで、０−アシルシアル酸含有糖鎖を特異的に認識す
るとは、０−アシルシアル酸含有糖鎖と反応し、０−ア
シル化されていないシアル酸含有ｔｙＪｒＪとは反応し
ないことを意味する。

木明細書に記述される糖脂質の構造を下記に示す。

０Ｍ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）　　［ｌｌ３Ｎｅ
ｕ４＾ｃＧｃ−Ｌａｃ　Ｃｅｒ］ｋｌβ１→４Ｇｌｃβ
１−＋ＩＣ：ｅｒ↑ ２　ａＮｅｕＡＡｃＧｃＧ　Ｍ　、　（ＮｅｕＧｃ）　　［■”　ＮｅｕＧｃ−
Ｌａｃ　ＣｅｒｌＧａｌβｌ→４Ｇｌｃβｌ　→ＩＣｅ
ｒ↑ ２　ａＮｅｕＧｃＧ　Ｍ　３　（ＮｅｕＡｃ）　　［１１３ＮｅｕＡｃ−
ＬａｃＣｅｒ］Ｇａｌβｌ→４ＧＩｃβＩ　＝ｌＣｅｒ
↑ ２　ａＮｅｕＡｃＣＤ　Ｈ［Ｌａｃ　ＣｅｒｌＧａｌβ１＋４ＧＩｃβｌ　−＋１Ｃｅｒ［式中、Ｇａ
ｌはガラクトース、Ｇｌｃはグルコース、Ｇａ１ＮＡｃ
はＮ−アセチルガラクトサミン、ＧＩｃＮＡｃはＮ−ア
セチルグルコサミン、Ｎｅｕ　ＧｃはＮ−グリコリルノ
イラミン酸、Ｎｅｕ　ＡｃはＮ−７セチルノイラミン酸
、４−０−　Ａｃ　−ＮｅｕＧｃ及びＮｅｕ４ＡｃＧｃ
は４−０−アセチル−Ｎ−グリコリルノイラミン酸、　
Ｃｅｒはセラミドを意味する。］本発明のモノクローナル抗体は大ガン関連抗原と考えら
れる　Ｇ　Ｍ３　（４−０−Ａｃ　−ＮａｕＧｃ）との
反応性を有し、０−アセチル化されていない構造をもつ
Ｇ　Ｍ　３　（ＮｅｕＧｃ）及びシアル酸を含まない糖
脂質とは反応しない。

本発明のモノクローナル抗体により認識される糖鎖構造
は、糖脂質だけでなく糖タンパク質にも存在する可能性
がある。従って、大ガン関連抗原と考えられるこれらの
糖鎖を認識する本発明のモノクローナル抗体は、ガン診
断上極めて有用である。

本発明のモノクローナル抗体は、組織、細胞診断又は血
液、尿診断又は画像診断等による人ガン診断に極めて有
用であり、また、抗体に薬物を結合させるミサイル療法
や細胞傷害性を利用した治療への応用が可能である。更
に、本発明のモノクローナル抗体は、Ｈ−Ｄ抗体の検出
にも使用可能である。また、ニワトリのマレック病の診
断、治療にも適用可能である。

本発明のモノクローナル抗体は、糖鎖とガン化機構との
関連や、糖鎖の生体内での役割り等についての基礎的研
究において、有用な道具として用いることがＵ（能であ
る。

本発明のモノクローナル抗体は次のような方法で得られ
る。

まず、免疫原を哺乳動物に免疫する。この際、免疫する
哺乳動物は細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を
考慮して選択するのが好ましく、マウス、ラットを用い
るのがより好ましい０本発明において対象とするＯ−ア
シルシアル酸含有ガングリオシド、特に０Ｍ３（４−０
−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）の場合には、自己免疫疾患動物を
用いることが更に好ましく、自己免疫マウスを用いるこ
とが特に好ましい、使用可能な自己免疫疾患マウスとし
てはＮＺＢ、ＮＺＷ、Ｂ／ＷＦ１．ＭＲＬ／ｌ、ＢＸＳ
Ｂ雄、ＳＬ／Ｎｉ等が挙げられる。

また、ダラム陰性菌脂質多糖体（Ｌ　Ｐ　Ｓ）、デキス
トラン硫酸等のポリクローナルＢ細胞活性化剤ズＰＢＡ
）を投与することにより自己抗体産生能を高めさせた、
Ｂａ１ｂ／ｃ等の正常マウスを自己免疫疾患状態にし、
免疫動物として用いてもよい。

Ｏ−アシルシアル酸はマウスを含む多くの動物体内に存
在する。

本発明において対象とするＯ−アシルシアル醜含有ガン
グリオシドはマウス組織内に広く存在することが考えら
れ、マウスにとっては、これらの糖脂質は自己抗原であ
り、免疫原性は極めて弱いと考えられる。Ｂａ１ｂ／ｃ
マウス等の正常マウスを免疫動物として用いる従来の方
法においては、Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖又
はＯ−アシルシアル酸含有糖鎖に対するモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマを得ることは極めて困難である
。他方、自己免疫疾患マウスは、抗核抗体や抗赤血球抗
体等の自己抗原に対する抗体を産生ずることが知られて
いる。

本発明者は０−アシルシアル酸、特に０Ｍ３（４−Ｑ　
−Ａｃ　−Ｎｅｕにｃ）に対するモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマの作製を試み、自己免疫疾患マウスに
免疫することにより、極めて容易に目的のハイブリドー
マが作製されることを見出し、本発明を完成した。

免疫原としては、　Ｇ　Ｍ３　（４−０−Ａｃ　−Ｎｅ
ｕＧｃ）を有する細胞自体、該細胞より分離した細胞膜
成分及び該細胞より分離した　ＧＭＩ（４−０−Ａｃ　
−ＮｅｕＧｃ）のいずれも用いることが可能である。ま
た、糖脂質をリン脂質とコレステロールと共にリポソー
ムとして用いることも可能である。免疫は一般的方法に
より行われ、上記免疫原をリン酸緩衝溶液（以下ｒＰＢ
ＳＪいう）等にて希釈し、腹腔内若しくは静脈内に投手
すればよい、その際、免疫原を牛血清アルブミン（Ｂ　
Ｓ　Ａ）や菌体等の相体に担持させてもよく、また、フ
ロインドアジュバントや菌体アジュバント等のアジュバ
ントを共に注射してもよい、免疫原を、酢酸処理したサ
ルモネラミネソタバクテリアに吸着させて投与すること
が更に好ましい。

免疫動物から採取した牌細胞はマウス骨髄腫細胞と融合
させる。骨髄腫細胞としては、既に公知の種々の細胞、
例えばＭＳ−１，５Ｐ−２、Ｘ８３．８．５．３　、　
　Ｐ３−Ｕｌ等が使用さレル。

融合方法は公知の手法に準じて行われる。融合促進剤と
しては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、セ
ンダイウィルス（ＨＶ　Ｊ　）等が使用される。牌細胞
と骨髄腫細胞との使用比は一般的方法と同様であり、１
対１〜１０対ｌが好ましい。

融合終了後、通常の選択用培地にて培養することにより
ハイブリドーマを選択する。前記した骨髄腫細胞はＨＡ
Ｔ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
を含む培＃１）中では生育できないため、ＨＡＴ培地中
で生育する細胞を選択すればよい。

ハイブリドーマのコロニーが充分大きくなったところで
目的とする抗体の産生株の検索及びクローニングが行わ
れる。

該抗体産生株の検索は一般に抗体の検出に用いられてい
る方法、例えばＥＬＩＳＡ法［Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚ７’ｍｏ１．、７０．４１９（１９８０）　］　
、凝集反応法、ＲＩＡ法、二重免疫拡散法などにより行
われる。

具体的には、精製した糖脂質抗原を付着させたプレート
をＢＳＡにてブロッキングした後、被検ハイブリドーマ
の培養上清と反応させ、更に、酵素標識したマウス抗体
に対する抗体を反応させ、該抗原に結合した抗体の存在
を、酵素活性を測定することにより確認し、所望の抗体
産生株を選択する。

また、クローニングは限界希釈法により行われる。即ち
、９６穴マイクロタイタープレート上に、ハイブリドー
マが各ウェル当り１個以下になるよう分配し、単一コロ
ニーを生育させる。この際、フィーダー細胞としてマウ
ス胸腺細胞を添加することが好ましい。

上述のクローニングを繰返し、モノクローン化されたハ
イブリドープを得る。

本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
は液体窒素内で長期保存が可能であり、分譲可能な状態
に保持されている。

本発明のモノクローナル抗体を得るには、ハイブリドー
マを培地中にて培養し、培養上清から分離する方法、あ
るいはハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹
水より回収する方法がある。更に、一般的な方法、即ち
硫安沈殿、ゲルが過、イオン交換カラムクロマトグラフ
ィー等を用いて精製することも可能である。

（発明の実施例）以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

実施例１１）各種糖脂質の単離、精製生理食塩水にて充分に洗浄した馬券血球を多量の冷アセ
トン中に加え、得られた沈殿物より、容量比クロロホル
ム：メタノール：水（１０：２０：１）　（１０：１０
：０）　（２０：１０：ｌ）の各混合溶液にて順次抽出
操作を行った。得られた粗製糖脂質をＤＥＡＥ−セフア
ゾ７クスＡ−２５カラムクロマトグラフイーにかけ、酸
性画分と中性画分に分け、酸性画分をイアトロビーズ力
ラムグロマトグラフィーにかけ、　０Ｍ３（４０−ＡＣ
−ＮｅｕＧｃ）及び　０Ｍ３（ＮｅｕＧｃ）を得た。可
様にして人赤血球よりＣＤＨ及び　Ｇ　Ｍ３　（Ｎｅｕ
Ａｃ）を得た。

２）免疫法及び細胞融合ＮＺＢマウス（雄、Ｌ２ｉＩ！！齢）に百日ぜき死菌５
ｘｔｏδ個のＰＢＳ溶液３００用文を腹腔内注射し、同
時に酢酸で処理したサルモネラミネソタバクテリアａｏ
ｐｇに吸着させた０Ｍ３（４−０−Ａｃ　−ＮｅｕＧｃ
）　２０　ｋ　ｇのＰＢＳ溶液２００ｐｕを静脈注射し
た。以後、バクテリアに吸着させた　ＧＭ、　（４−０
−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）を同様に３週問おきに４回静脈注
射した。

最終免疫の３日後にマウスより肺臓を取出し、単細胞に
解した後、牌細胞を、ＲＰＭ１１６４０培地にて洗浄し
た。一方、対数増殖期にあるマウス骨髄腫細胞Ｘ８３．
８．５．３　ヲ集め、ＲＰＭＩ１６４０培地にて洗浄し
た。肺細胞４．０×１０６個の浮遊液とマウスミエロー
マ８．０×１０７個の浮遊液を混合し、遠心分離にて培
地を除去した。３７℃に加温した水浴中にて、混合した
細胞に５０％ポリエチレングリコール−ＲＰＭＩ　１６
４０培地２−を１分間かけて徐々に加え、１分間ゆるや
かに攪拌させ融合を行った。

ＲＰＭＩ１６４０培地４ｗＪを２培地４叶Ｊ更に１４−
を２分間かけてゆるやかに攪拌しつつ添加した。遠心分
離にて培地を除去し、細胞に１０％牛脂児血清含有ＲＰ
Ｍ１１６４０培地１００−を加え・、９６穴プレー）１
０枚に１六ちり０．１４ずつ分配した。翌日、ＨＡＴ培
地（４Ｘ１０−’Ｍアミノプテリン、１．６Ｘ１０’Ｍ
チミジン。

ｌ　Ｘ　１０４Ｍヒボキサンチン、１０％牛脂児血清を
含むＲＰＭＩ１６４０培地）Ｏ．１４を各ウェルに加え
た。各ウェルの培地は、更に、３日又は４日ごとにＨＡ
Ｔ培地に半量ずつ交換した。３ｉ１ｑ間後、９０％のウ
ェルにハイブリドーマの生育が見られた。

３）ハイプリドーマの選択ハイプリドーマ培養上清中の抗体の検索はＥＬＩＳＡ法
にて行った。抗原として、　０Ｍ２　（ＮｅｕＧｃ）。

０Ｍ３（ＮｅｕＧｃ）及びＧ　Ｍ３　（４−０−Ａｃ　
−ＮｅｕＧｃ）を用いた。抗原５００ｎｇをＥＬＩＳＡ
用マイクロタイタープレートに吸着させ、１％ＢＳＡ・
ＰＢＳ溶液にてブロッキングした後、培養上清を反応さ
せた。更に、パーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グ
ロブリン抗体を反応させ、基質としてオルトフェニレン
ジアミンを用い、４９２ｎｍの吸光度を測定することに
より、目的の抗体を検出した。

その結果、免疫、細胞融合にて作製したハイプリドーマ
中、　０Ｍ３（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）と反応する
抗体が４つのウェルに検出された。

抗体活性が検出されたハイブリドーマはＨＡＴ培地から
アミノプテリンを除いたＨＴ培地に移し、更に１０％牛
脂児血清（Ｆｅ２）含有ＲＰＭＩ１６４０培地に移し培
養した。

このハイブリドーマを限定希釈法により、クローニング
した。即ち、９６穴プレートに１穴当り０．８個の密度
に細胞を希釈してｌ大当り４×１０５個のマウス胸腺細
胞と共に培養し、２週間後にＥＬ　ＩＳＡ法にて抗体産
生細胞を選択した。

クローニングを更に繰返し、安定なハイブリドーマ、Ｙ
ＨＤ−０８、ＹＨＤ−０９，ＹＨＤ−１０及びＹＨＤ−
１１を得た。

モノクローナル抗体ＹＨＤ−０８、ＹＨＤ−０９、ＹＨ
Ｄ−１０及びＹＨＤ−１１は、　ＥＬＩＳＡ法にて、ク
ラスは全てＩｇＭと決定された。

ハイブリドーマ、ＹＨＤ−０８、ＹＨＤ−Ｏ９、ＹＨＤ
−１０及びＹＨＤ−１１は、Ｅｕｒｏｏｐｅａｎ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌに寄
託され、それぞれ受理番号（Ｐｒａｙ　ｉｓ　１ｏｎａ
　Ｉ＾ｃｃｅｇｓ　１ｏｎＮｕ＋ｗｂｅｒ）　　８７０
６０３０１、８７０６０３０２．８７０６０３０３及び
８７０６０３０４が付されている。

実施例２１　）　ＥＬＩＳＡ法によるＹＨＤ−０８，ＹＨＤ−０
９、ＹＨＤ−１０及びＹＨＤ−１１の抗原特異性の測定各種糖脂質０　、２ｎ■ｏｆを抗原とし、ＥＬＩＳＡ法
を行った。プレート上に吸着させた抗原とハイプリドー
マ培養上清を反応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ
抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させた。オルトフェ
ニレンジアミンを基質とし、４９２ｎ腸の吸光度を測定
し、各種抗原に対するモノクローナル抗体の反応性を調
べた。その結果を表に示す。

＋：反応する　　　−二反応しないいずれのモノクローナル抗体も４位が０−アセチル化さ
れたＮ−グリコリルノイラミン酸含有ガングリオシドで
ある　Ｇ　Ｍ３　（４−０−Ａｃ　−ＮａｕＧｃ）と反
応し、０−アセチル化されていないシアル酸含有ガング
リオシドである　０Ｍ３　（ＮｅｕＧｃ）及び　Ｇ’Ｍ
３　（ＮｅｕＡｃ）とは反応しなかった。

２）薄層クロマトグラフィー（以下ｒＴＬｃ」という）
プレート上でのＹＨＤ−０８、ＹＨＤ−０９，ＹＨＤ−
１０及びＹＨＤ−１１の反応性の測定ＴＬＣプレートの下端からｌｃ＋ｗの場所に５■の幅で
種々の糖脂質をスポツティングし、展開した。同じ操作
を行ったプレートのうち、１枚はオルシノール試薬にて
発色させ、他のプレートには酵素免疫染色を行った。即
ち、本発明抗体を反応させ、更にパーオキシダーゼ標識
ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させた。基質と
して４−クロロ−１−ナフトールを用い、青紫色の発色
スポットを検出した。

図に抗原として０Ｍ３　（ＮｅｕＡｃ）、０Ｍ３　（Ｎ
ｅｕＧｃ）及び０Ｍ３　（４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）
の３種のガングリオシドを用いた結果を示す、展開溶媒
としてクロロホルム：メタノール：２．５Ｎアンモニア
水（５５：４５：１０容量比）を用いた。Ａはオルシノ
ール試薬による発色を、Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥは、それぞれ
本発明のモノクローナル抗体ＹＨＤ−０８、ＹＨＤ−０
９、ＹＨＤ−１０及びＹＨＤ−１１を用いて酵素免疫染
色を行ったプレートである。

本発明のモノクローナル抗体は、いずれも　０Ｍ３　（
４−０−Ａｃ−ＮｅｕＧｃ）と反応し、０Ｍ３（Ｎｅｕ
Ｇｃ）及び　Ｇ　Ｍ　３　（ＮｓｕＡｃ）とは反応しな
いことがわかる。

［発明の効果］本発明によれば、Ｎ−アシルシアル酸含有ｗＩｍと特異
的に反応する新規モノクローナル抗体及び該抗体を産生
ずるハイブリドーマを提供することができる。該抗体は
、ガンの発生機構の解明、診断及び治療に非常に有効な
ものである。

【図面の簡単な説明】図は、本発明のモノクローナル抗体ＹＨＤ−０８：　　
ＹＨＤ−０９、ＹＨＤ−１０及びＹＨＤ−１１と各種糖
脂質との反応性を示す図である。手続補正誉昭和６３年　５月２４日特許庁長官　　小　川　邦　夫　殿１、事件の表示昭和６２年特許Ｍ第１３８８７１号２、発明の名称３、補正をする者事件との関係　　特許出願人名称ｆ＋２７１コニカ株式会社４、代　理　人　　　　　　　　　　　　　昭和６２年
１２１１１１０名称変更済（一括）５、補正命令の日付
　　自　発 ■、明細書の特許請求の範囲の欄を別紙のとおり補正す
る。ＴＩ、明細書の発明の詳細な説明の欄において、明細書
筒６頁９行目の「文化」を「分化」と補正する。特許請求の範囲（１）ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖を特異的に認識する
ことを特徴とするモノクローナル抗体。（２）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−〇−アセチル
シアル酸含有糖鎖である特許請求の範囲第１項記載のモ
ノクローナル抗体。（３）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖がＯ−アシル−Ｎ−
グリコリルノイラミン酸含有糖鎖である特許請求の範囲
第１項記載のモノクローナル抗体。（４）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−Ｏ−アセチル
−Ｎ−グリコリル／イラミン酸含有糖鎖である特許請求
の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。（５）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が糖脂質の構成要素
である特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に
記載のモノクローナル抗体。（６）４−０−アセチル−Ｎ−グリコリルノイラミニル
ラクトシルセラミドと反応し、Ｎ−グリコリルノイラミ
ニルラクトシルセラミドと実質的に反応しない特許請求
の範囲第５項記載のモノクローナル抗体。（７）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖を特異的に認識する
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを作成す
る方法において、免疫動物として自己免疫疾患動物を使
用することを特徴とするハイブリドーマの作成方法。（８）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−０−アセチル
シアル酸含有糖鎖である特許請求の範囲第７項記載のハ
イブリドーマの作成方法。（９）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が０−アシル二Ｎ−
グリコリル／イラミン酸含有糖鎖である特許請求の範囲
第７項記載のハイブリドーマの作成方法。（１０）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−Ｏ−アセチ
ル−Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖である特許請
求の範囲第７項記載のハイブリドーマの作成方法。（１１）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が糖脂質の構成要
素である特許請求の範囲第７項〜第１０項のいずれか１
項に記載のハイブリドーマの作成方法。（１２）Ｍモノクローナル抗体が４−Ｏ−アセチル−Ｎ
−グリコリルノイラミニルラクトシルセラミドと反応し
、Ｎ−グリコリルノイラミニルラクトシルセラミドと実
質的に反応しない特許請求の範囲第１１項記載のハイブ
リドーマの作成方法。（１３）自己免疫疾患動物が自己免疫疾患マウスである
特許請求の範囲第７項〜第１２項のいずれか１項に記載
のハイブリドーマの作成方法。（１４）免疫原として該糖鎖含有物質をサルモネラミネ
ソタバクテリアに吸着させたものを使用する特許請求の
範囲第７項〜第１１項及び第１３項のいずれか１項に記
載のハイブリドーマの作成方法。（１５）免疫原として０−アシルシアル　　　糖脂質を
サルモネラミネソタバクテリアに吸着させたものを使用
する特許請求の範囲第１２項又は第１３項のいずれか１
項に記載のハイブリドーマの作成方法。（１６）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖を特異的に認識す
るモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを作成
する方法において、免疫原として該糖鎖含有物質をサル
モネラミネソタバクテリアに吸着させたものを使用する
ことを特徴とするハイブリドーマの作成方法。（１７）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−〇−アセチ
ルシアル酸含有糖鎖である特許請求の範囲第１６項記載
のハイブリドーマの作成方法。（１８）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が０−アシル−Ｎ
−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖である特許請求の範
囲第１６項記載のハイブリドーマの作成方法。（１９）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−Ｏ−アセチ
ル−Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖である特許請
求の範囲第１６項記載のハイブリドーマの作成方法・（２０）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が糖脂質の構成要
素である特許請求の範囲第１６項〜第１９項のいずれか
１項に記載のハイブリドーマの作成方法。（２１）該モノクローナル抗体が４−Ｏ−アセチル−Ｎ
−グリコリルノイラミニルラクトシルセラミドと反応し
、Ｎ−グリコリルノイラミニルラクトシルセラミドと実
質的に反応しない特許請求の範囲第２０項記載のハイブ
リドーマの作成方法。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖を特異的に認識する
ことを特徴とするモノクローナル抗体。
（２）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−Ｏ−アセチル
シアル酸含有糖鎖である特許請求の範囲第１項記載のモ
ノクローナル抗体。
（３）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖がＯ−アシル−Ｎ−
グリコリルノイラミン酸含有糖鎖である特許請求の範囲
第１項記載のモノクローナル抗体。
（４）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−Ｏ−アセチル
−Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖である特許請求
の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。
（５）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が糖脂質の構成要素
である特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に
記載のモノクローナル抗体。
（６）４−Ｏ−アセチル−Ｎ−グリコリルノイラミニル
ラクトシルセラミドと反応し、Ｎ−グリコリルノイラミ
ニルラクトシルセラミドと実質的に反応しない特許請求
の範囲第５項記載のモノクローナル抗体。
（７）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖を特異的に認識する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成す
る方法において、免疫動物として自己免疫疾患動物を使
用することを特徴とするハイブリドーマの作成方法。
（８）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−Ｏ−アセチル
シアル酸含有糖鎖である特許請求の範囲第７項記載のハ
イブリドーマの作成方法。
（９）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖がＯ−アシル−Ｎ−
グリコリルノイラミン酸含有糖鎖である特許請求の範囲
第７項記載のハイブリドーマの作成方法。
（１０）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−Ｏ−アセチ
ル−Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖である特許請
求の範囲第７項記載のハイブリドーマの作成方法。
（１１）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が糖脂質の構成要
素である特許請求の範囲第７項〜第１０項のいずれか１
項に記載のハイブリドーマの作成方法。
（１２）該モノクローナル抗体が４−Ｏ−アセチル−Ｎ
−グリコリルノイラミニルラクトシルセラミドと反応し
、Ｎ−グリコリルノイラミニルラクトシルセラミドと実
質的に反応しない特許請求の範囲第１１項記載のハイブ
リドーマの作成方法。
（１３）自己免疫疾患動物が自己免疫疾患マウスである
特許請求の範囲第７項〜第１２項のいずれか１項に記載
のハイブリドーマの作成方法。
（１４）免疫原として該糖鎖含有物質をサルモネラミネ
ソタバクテリアに吸着させたものを使用する特許請求の
範囲第７項〜第１１項及び第１３項のいずれか１項に記
載のハイブリドーマの作成方法。
（１５）免疫原として該糖脂質をサルモネラミネソタバ
クテリアに吸着させたものを使用する特許請求の範囲第
１２項又は第１３項のいずれか１項に記載のハイブリド
ーマの作成方法。
（１６）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖を特異的に認識す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成
する方法において、免疫原として該糖鎖含有物質をサル
モネラミネソタバクテリアに吸着させたものを使用する
ことを特徴とするハイブリドーマの作成方法。
（１７）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−Ｏ−アセチ
ルシアル酸含有糖鎖である特許請求の範囲第１６項記載
のハイブリドーマの作成方法。
（１８）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖がＯ−アシル−Ｎ
−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖である特許請求の範
囲第１６項記載のハイブリドーマの作成方法。
（１９）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が４−Ｏ−アセチ
ル−Ｎ−グリコリルノイラミン酸含有糖鎖である特許請
求の範囲第１６項記載のハイブリドーマの作成方法。
（２０）Ｏ−アシルシアル酸含有糖鎖が糖脂質の構成要
素である特許請求の範囲第１６項〜第１９項のいずれか
１項に記載のハイブリドーマの作成方法。
（２１）該モノクローナル抗体が４−Ｏ−アセチル−Ｎ
−グリコリルノイラミニルラクトシルセラミドと反応し
、Ｎ−グリコリルノイラミニルラクトシルセラミドと実
質的に反応しない特許請求の範囲第２０項記載のハイブ
リドーマの作成方法。