JP4942018B2 - 抗アカラン硫酸抗体とその応用 - Google Patents

Description

本発明は、抗アカラン硫酸抗体とその応用に関するものである。

本出願書類中で使用する略号を以下に示す。
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＨＥＰ：ヘパリン
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＥＨＳ−ＨＳ：マウスのエンジェルブレス−ホーム−スワーン腫瘍組織（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ ｓａｒｃｏｍａ）由来のＨＳ
Ｂｉ−ＧＡＧ：ビオチン標識ＧＡＧ
Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体：ビオチン標識ＨＥＰ誘導体
ＧｌｃＮＳ：Ｎ−硫酸化グルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＩｄｏＡ：イズロン酸
ＩｄｏＡ（２Ｓ）：２−Ｏ−硫酸化イズロン酸

ＮＡＨ：Ｎ−アセチルヘパロザン

ＡＳ：アカラン硫酸
Ｂｉ−ＡＳ：ビオチン標識ＡＳ
ＲＡ−ＡＳ：還元アミノ化ＡＳ
ＰＤＰ−ＡＳ：２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＡＳ
ＳＨ−ＡＳ：チオプロピオニル化ＡＳ

ＡＣＨ：２−Ｏ−脱硫酸化ＡＳ

ＮＨ₂−ＨＥＰ：Ｎ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−ＨＥＰ：Ｎ−アセチル化−ＨＥＰ

２ＤＳＨ；２−Ｏ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＨ₂−６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ

６ＤＳＨ：６−Ｏ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−６ＤＳＨ：Ｎ−アセチル化６ＤＳＨ
ＮＳＨ：（２−Ｏ・６−Ｏ）−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−ＮＳＨ；N-アセチル化ＮＳＨ
ＮＨ₂−２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ

ＮＨ₂−ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化ＨＥＰ
ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
Ｃｈ；コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳ−Ａ（Ｗ）；クジラ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ａ（Ｓ）；サメ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ｂ；コンドロイチン硫酸Ｂ
ＣＳ−Ｃ；コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳ−Ｄ；コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳ−Ｅ；コンドロイチン硫酸Ｅ

ＫＳ：ケラタン硫酸

ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ

ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＫＬＨ：ヘモシアニン
ＰＤＰ−ＫＬＨ：２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＫＬＨ

ＴＭＢ：テトラメチルベンジジン
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオン酸
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＬＩＳＡ法：酵素標識抗体測定法

ＡＳは、アフリカマイマイ(学名：Achatina fulica)から単離されたＧＡＧの一種として知られている。ＡＳは、Ｎ−アセチルグルコサミンと２−Ｏ−サルフォイズロン酸とからなる二糖（−［ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ］−）の繰り返し構造を基本糖鎖構造として有する多糖であり、ＨＳ及びＨＥＰと極めて類似した構造を有していることが知られている（非特許文献１）。ＡＳに反応する抗体としては、ＭＷ３Ｇ３が知られているが、ＡＳに反応し、ウシ腎臓由来のヘパラン硫酸に対して反応しない抗体は知られていない（非特許文献２）。

ヨン Ｓ．キムら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、１９９６年、２７１巻、２０号、１１７５０−１１７５５頁 ジェディー Ｂ．テン ダン（Gerdy B. ten Dam）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、（米国）、２００４年、第２７９巻、ｐ．３８３４６−３８３５２

本発明は、新規の抗ＡＳ抗体及びこれを産生するハイブリドーマ、並びに上記抗体を応用した検出方法及び検出キットを提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を鑑み鋭意検討を重ねた結果、タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質を抗原として用いることにより、ＡＳに対して反応し、ウシ腎臓由来のＨＳに対して実質的に反応しない抗体を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。

（１）ＡＳに対して反応し、ウシ腎臓由来のＨＳに対して実質的に反応しない抗体（以下、「本発明抗体」という）。
（２）ブタ腸由来のＨＥＰに対して実質的に反応しない、上記（１）に記載の抗体。
（３）ＥＨＳ−ＨＳに対して実質的に反応しない、上記（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）ウシ角膜由来のケラタン硫酸に対して実質的に反応しない、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の抗体。
（５）ＨＡに対して実質的に反応しない、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の抗体。
（６）ＮＡＨに対して実質的に反応しない、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の抗体。
（７）モノクローナル抗体である、上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の抗体。
（８）タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、上記（７）に記載の抗体。
（９）リンパ球及びミエローマ細胞がマウス由来である、上記（８）に記載の抗体。
（１０）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がFERM P-20823、FERM P-20824、FERM P-20825、FERM P-20826又はFERM P-20827であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（１１）タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質であって、ＡＳに対して反応する抗体を産生させ得る抗原性を有する物質（以下、「本発明抗原」という）。
（１２）タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマ（以下、「本発明ハイブリドーマ」という）。
（１３）リンパ球及びミエローマ細胞がマウス由来である、上記（１２）に記載のハイブリドーマ。
（１４）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20823、FERM P-20824、FERM P-20825、FERM P-20826又はFERM P-20827であるハイブリドーマ。
（１５）上記（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するＡＳの検出方法（以下、「本発明ＡＳ検出方法」という）。
（１６）試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、上記（１５）に記載の検出方法。
（１７）上記（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の抗体を少なくとも含む、試料中に存在するＡＳの検出キット（以下、「本発明ＡＳ検出キット」という）。
（１８）試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、上記（１７）に記載の検出キット。

本発明抗体は、ＡＳに対して反応するため、ＡＳの検出に好適に用いることができる。また、本発明抗原及び本発明ハイブリドーマを用いることにより、本発明抗体を効率的に産生させることができる。また、本発明ＡＳ検出方法により、試料中に存在するＡＳを効率的に検出することができる。また、本発明ＡＳ検出キットを用いることにより、本発明ＡＳ検出方法によるＡＳの検出をより効率的且つ簡便に行うことができる。

＜１＞本発明抗体
本発明抗体は、ＡＳに対して反応し、ウシ腎臓由来のＨＳに対して実質的に反応しない抗体である。

ＡＳは、Ｎ−アセチルグルコサミンと２−Ｏ−サルフォイズロン酸とからなる二糖（−［ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ］−）の繰り返し構造を基本糖鎖構造として有する多糖である。ＡＳは、例えば後述する実施例に記載の様に、アフリカマイマイ(学名:Achatina fulica)を原料とし、公知の方法により調製することができる。

また、上記において「反応」とは、免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味し、この反応性は例えば、ＥＬＩＳＡ法、RIA法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法などによって調べることができる。例えば、一定濃度の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行ったときに、抗原の濃度の増加に比例して反応シグナルが増強される場合に、該抗体は該抗原に反応するということができる。ただし本明細書に記載する、抗原に対する本発明抗体の反応性は、特に断りのない場合、後述する実施例５に記載の方法（抗原濃度：0.1 μg/ウェル）により測定される、本発明抗体のＡＳに対する反応性を１００％とした場合における、相対的な反応性を意味する。

また、本明細書において、「実質的に反応しない」とは、抗体と抗原との反応性が、後述する実施例５に記載の方法（抗原濃度：0.1 μg/ウェル）で測定を行った場合、反応シグナルを与えないか、極めて弱い反応シグナルしか与えない程度であることを意味するが、本明細書においては、例えば５％程度以下の反応性がある場合についても、反応シグナルを与えない程度であると解されるものとする。

本発明抗体は、ＡＳに対して反応し、ウシ腎臓由来のＨＳに対して実質的に反応しない抗体である限りにおいて特に限定されないが、なかでも、ブタ腸由来のＨＥＰに対して実質的に反応しない抗体は好ましく、また、ＥＨＳ−ＨＳに対して実質的に反応しない抗体も好ましく、ウシ角膜由来のＫＳに対して実質的に反応しない抗体も好ましく、HAに対して実質的に反応しない抗体も好ましく、ＮＡＨに対して実質的に反応しない抗体も好ましい。なかでも、ＡＳに対して反応し、ウシ腎臓由来のＨＳ及びブタ腸由来のＨＥＰに対して実質的に反応しない抗体はより好ましく、ＡＳに対して反応し、且つウシ腎臓由来のＨＳ、ブタ腸由来のＨＥＰ、ＥＨＳ−ＨＳ、ウシ角膜由来のＫＳ、ＨＡ及びＮＡＨのいずれに対しても実質的に反応しない抗体はさらに好ましい。また、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ及びＣｈに対して実質的に反応しない抗体も好ましい。

また本発明抗体は、下記のＨＥＰ誘導体群から選択される１又は２以上のＨＥＰ誘導体に対して実質的に反応しないことが好ましい；
ＨＥＰ誘導体群；６ＤＳＨ、ＮＨ₂−６ＳＨ、６ＳＨ、ＮＨ₂−２ＳＨ、ＮＳＨ、ＮＡｃ−ＮＳＨ、ＮＨ₂−ＣＤＳＨ、ＣＤＳＨ。

また本発明抗体のＡＣＨに対する反応性の好ましい例としては、実質的に反応しないことが挙げられ、また別の好ましい例としては５０〜６０％であることが挙げられる。

本発明抗体のその他のＨＥＰ誘導体に対する反応性は特に限定されないが、例えば下記の反応性が例示される。

ＮＡｃ−ＨＥＰに対する反応性の好ましい例としては、５〜１０％であることが挙げられ、また別の好ましい例としては８０〜１００％であることが挙げられる。

ＮＡｃ−ＨＥＰに対する反応性の好ましい例としては、３〜１５％であることが挙げられ、また別の好ましい例としては８０〜１００％であることが挙げられる。

ＮＡｃ−６ＤＳＨに対する反応性の好ましい例としては、実質的に反応しないことが挙げられ、また別の好ましい例としては７５〜１００％であることが挙げられる。

ＮＨ₂−２ＳＨに対する反応性の好ましい例としては、実質的に反応しないことが挙げられ、また別の好ましい例としては１５〜２５％であることが挙げられる。

２ＳＨに対する反応性の好ましい例としては２０〜４０％であることことが挙げられ、また別の好ましい例としては７０〜８０％であることが挙げられ、また別の好ましい例としては９０〜１１０％であることが挙げられ、また別の好ましい例としては１５０〜２００％であることが挙げられる。

ＣＤＳＨに対する反応性の好ましい例としては、実質的に反応しないことが挙げられ、また別の好ましい例としては１５〜２５％であることが挙げられる。

なお、上記の各種ＧＡＧ及び各種ＨＥＰ誘導体は、後述する実施例に記載の方法により、入手又は調製することができる。

本発明抗体のエピトープは特に限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミンと２−Ｏ−サルフォイズロン酸とからなる二糖（−［ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ］−）により構成されることが好ましい。

本発明抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることがより好ましい。また、モノクローナル抗体はそのフラグメントであってもよい。モノクローナル抗体のフラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）2化抗体、Ｆａｂ化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）及びミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）などが挙げられる。

本発明抗体がモノクローナル抗体である場合、本発明抗体は、例えば、タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生させることができる。

また本発明抗体がポリクローナル抗体である場合、本発明抗体は、例えば、タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物の血清から得ることができる。

タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質における「タンパク質」としては、例えばＢＳＡ及びＫＬＨが例示されるが、なかでもＫＬＨが好ましい。

上記において、タンパク質とＡＳとを化学的に結合させる方法としては、化学的な結合の様式は特に限定されないが、共有結合が好ましく、ジスルフィド結合（以下、「−ＳＳ−」と表記することがある）がより好ましい。ジスルフィド結合により化学的に結合する方法としては、例えば以下の方法を採用することができる。すなわち、ＡＳを還元アミノ化し、これと５ｍＭ ＳＰＤＰを反応させて、２−ピリジルジチオプロピニル化ＡＳを得る。これをジチオスレイトール等の還元剤で還元し、チオール化ＡＳを得る。同様に、タンパク質とＳＰＤＰを反応させ、２−ピリジルジチオプロピニル化タンパク質を得る。次に、チオール化ＡＳ溶液と２−ピリジルジチオプロピニル化タンパク質溶液を混合することによって、ＡＳとタンパク質との間にジスルフィド結合を生成させ、ＡＳ−ＳＳ−タンパク質を得る。

また、上記のリンパ球及びミエローマ細胞の由来は、哺乳動物由来である限りにおいて特に限定されず、哺乳動物としては、例えばブタ、ウシ、マウス、ラット等が例示されるが、なかでもマウスが好ましい。

また、上記において免疫は、例えば上記方法により調製した抗原を哺乳動物に皮下注射することにより行うことができる。注射方法はこれに限らず、腹腔内注射、静脈注射でも良い。通常、免疫は数回に分けて行うが、免疫はアジュバントと共に投与することが好ましい。アジュバンとしては、ミョウバン、結核死菌、核酸、完全フロインドアジュバント、不完全フロイントアジュバント等、アジュバント効果が期待できるもので有れば良いが、特に、ＴｉｔｅｒＭＡＸ Ｇｏｌｄ（シグマ社製）が良い。

また、上記の細胞融合は、例えば、マウスを最終免疫した後に、当該マウスのリンパ節或は脾臓から得られるリンパ球と、ミエローマ細胞等の腫瘍細胞株の細胞（通常、マウスのBALB/c 由来のP3 -NS-1/1-Ag4-1、P3 -X63-Ag8-U1(P3 U1)、P3 -X63-Ag8-653、SP2/0-Ag14 等）を用いて、公知の方法により行うことができる。

また、上記のハイブリドーマは、例えば下記に例示する方法により選択と単クローン化を行うことにより得ることができる。すなわち、ハイブリドーマの増殖の盛んな細胞培養上清から種々の分析法（例えばＲＩＡ法、プラーク法、凝集反応法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法 等）でＡＳに対して反応する目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次に、得られたハイブリドーマについてクローニングを行う。クローニングの方法としてはFACS（Fluorescent Activated Cell Sorter ）もしくは、一般によく用いられる限界希釈法等が挙げられる。例えば、限界希釈法では９６ウェルプレートの１ウェルあたり細胞が１個以下になるように行うことが好ましい。どの方法を用いてもクローニングは２回繰返し行うことが好ましく、単一クローンとすることが好ましい。

このようにして得られた単一クローンを、例えばin vitro で培養する方法、in vivo で培養（腹水化）する方法等により培養することにより、モノクロナール抗体を産生させることができる。また得られた培養液から、例えば塩析、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的一般的手法を適宜組み合わせることにより、上記抗体を分離、精製することができる。

本発明抗体の免疫グロブリンクラスおよびそのサブクラスは特に限定されないが、免疫グロブリンクラスはＩｇＭ又はＩｇGであることが好ましい。さらに免疫グロブリンクラスがＩｇGの場合、そのサブクラスはＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ１であることがより好ましい。

なお、本発明抗体の具体例としては、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20823、FERM P-20824、FERM P-20825、FERM P-20826又はFERM P-20827であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、AS１７抗体、AS２２抗体、AS２５抗体、AS３８抗体、AS４８抗体が挙げられる。具体的には後述する実施例を参照されたい。

＜２＞本発明抗原
本発明抗原は、タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質であって、ＡＳに対して反応する抗体を産生させ得る抗原性を有する物質である。

上記の「タンパク質」、「ＡＳ」なる用語、及びタンパク質とＡＳとを化学的に結合させる方法に関する説明については、上記＜１＞本発明抗体における説明を参照されたい。また、上記の「反応」は、上記＜１＞本発明抗体の場合と同様に、免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味する。具体的な説明は上記＜１＞本発明抗体を参照されたい。

また、ＡＳに対して反応する抗体を産生させ得る抗原性を有するか否かは、例えば上記＜１＞本発明抗体に記載の方法によりタンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質を用いて哺乳動物の免疫化を行い、免疫後の哺乳動物に由来する血清等の試料中に抗体が存在するか否かを、例えばRIA法、プラーク法、凝集反応法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法等の方法により確認することにより、判断することができる。

上記のＡＳに対して反応する抗体は、本発明抗体であることが好ましい。したがって本発明抗原は、本発明抗体を生産する目的で使用することができる。このような場合、例えば＜１＞本発明抗体に記載した免疫において用いる抗原として、本発明抗原を用いることができる。より具体的には、後述する実施例を参照されたい。

＜３＞本発明ハイブリドーマ
本発明ハイブリドーマは、タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマである。

上記の「タンパク質」、「ＡＳ」なる用語、及びタンパク質とＡＳとを化学的に結合させる方法、「免疫」、「哺乳動物由来のリンパ球」、「哺乳動物由来のミエローマ細胞」、「細胞融合」、「ハイブリドーマ」に関する説明については、上記＜１＞本発明抗体における説明を参照されたい。

なお、上記のような本発明ハイブリドーマの一例としては、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20823、FERM P-20824、FERM P-20825、FERM P-20826又はFERM P-20827であるハイブリドーマが挙げられる。

本発明ハイブリドーマは、本発明抗体（好ましくは、モノクローナル抗体である本発明抗体）を生産する目的で使用することができる。ここで本発明抗体は、例えば本発明ハイブリドーマを、in vitro で培養する方法、in vivo で培養（腹水化）する方法等により培養することにより産生させることができる。より具体的には、後述する実施例を参照されたい。

＜４＞本発明検出方法
以下、本発明検出方法について説明する。

本発明ＡＳ検出方法は、本発明抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するＡＳの検出方法である。

上記の「試料」とは、ＡＳを含むか、含む可能性を有する試料であれば特に限定されないが、試料の由来となるものとしては、例えば尿、血液、血漿、血清、関節液、髄等の体液、分泌物、動物細胞若しくは植物細胞等の細胞、組織、臓器、又は細胞若しくは微生物の培養物（例えば培養上清等を含む）等が例示される。上記において、試料の由来が動物細胞である場合、好ましい動物細胞の一例としてはプルキンエ細胞が例示される。また試料の由来が組織である場合、好ましい組織の一例としては小脳が例示される。また、上記「由来」とは、上記に例示したものに由来する精製物、抽出物、標本等であってもよく、そのもの自体であってもよいことを意味する。

本発明ＡＳ検出方法において、試料中に存在するＡＳの検出における具体的方法としては、例えば組織標本を試料として用いる場合は通常の免疫組織染色法などを用いることができ、例えば体液又は培養上清等を試料として用いる場合はＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、サンドイッチ法、競合法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロッティング法などを用いることができる。

上記のサンドイッチ法においては、例えば本発明抗体をプレート等に例示される固相に固着させて１次抗体として用いても良く、また、本発明抗体を標識して２次抗体として用いても良い。

本発明ＡＳ検出方法によれば、本発明の抗体の反応性を利用することにより、試料中に存在するＡＳを好適に検出することができる。さらに本発明ＡＳ検出方法は、＜１＞本発明抗体で述べた本発明抗体の各種抗原に対する特異的な反応性を利用することにより、ＡＳの特異的な検出に応用することができる。

なお、本発明ＡＳ検出方法における検出は、定量的な検出であってもよく、定性的な検出であってもよい。定量的な検出である場合、試料中に存在するＡＳ濃度は、例えば予め既知濃度のＡＳ標準液を用いてＡＳ濃度と検出結果との関係について検量線を作成し、ＡＳ濃度が未知の試料についての検出結果と前記検量線とを照らし合わせることにより行うことができる。

また、本発明検出方法は、本発明抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在する本発明抗体が反応する物質の検出方法を提供する。

上記において、「試料」、検出における具体的方法、検出の種類等についての説明については、上記の本発明ＡＳ検出方法における説明を参照されたい。また、上記「反応」は、免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味するが、より具体的な説明については＜１＞本発明抗体における説明を参照されたい。

＜５＞本発明検出キット
以下、本発明検出キットについて説明する。

本発明ＡＳ検出キットは、本発明抗体を少なくとも含む、試料中に存在するＡＳの検出キットである。本発明の検出キットによれば、本発明検出方法をより効率的に、且つ簡便に行うことができる。上記において、「本発明抗体を少なくとも含むキット」としては、例えば本発明抗体そのもの（例えば溶液に溶解した本発明抗体等も含む）を構成成分として含むキット、本発明抗体を固着させた固相を構成成分として含むキット、酵素等により標識した本発明抗体を構成成分として含むキット等が例示される。また、上記の「試料」なる用語については、上記＜４＞本発明検出方法で説明した通りである。

また本発明ＡＳ検出キットの構成成分には、本発明抗体に加えて、例えば１次抗体、2次抗体、反応バッファー、洗浄液、反応基質、ＡＳ標準液などを含むものであってもよい。

また、本発明検出キットは、本発明抗体を少なくとも含む、試料中に存在する本発明抗体が反応する物質の検出キットを提供する。

上記において、「本発明抗体を少なくとも含むキット」に関する具体的説明は、上記本発明ＡＳ検出キットにおける説明を参照されたい。

以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。

(参考例１) ＡＳ及びＡＣＨの調製
ＡＳはヨン Ｓ．キムらの方法（前記の非特許文献１に記載の方法）に従って、アフリカマイマイ（学名：Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ）から調製した。得られたＡＳを原料として、Ｍ．イシハラ（M. Ishihara）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、１９９７年、第１２１巻、第２号、ｐ．３４５−３４９に記載の方法に従ってＡＣＨを調製した。

(参考例２) ＰＤＰ−ＫＬＨの調製
ＫＬＨへの２−ピリジルジスルフィド構造の導入は、Ｃａｒｌｓｓｏｎ， Ｊ．らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， １７３， ７２３（１９７８））に従って行った。

すなわち、0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.5)/0.1M NaClに、終濃度が2.5mg/mlになるようにＫＬＨ（シグマ社製） 60mgを溶解した。この溶液に、終濃度が0.238mMになるように5mM ＳＰＤＰ（シグマ社製）エタノール溶液を添加・混合し、30分間室温に保持した。過剰のＳＰＤＰを除去するために蒸留水に対して透析した後に、混合液を凍結乾燥し、ＰＤＰ−ＫＬＨ 59.4mgを得た。

(参考例３) ウロン酸を介したＡＳ−ＢＳＡコンジュゲートの調製
ＡＳ及びＢＳＡ(バイエル社製)を、それぞれ0.1M ＭＥＳ緩衝液（pH5.5）に、終濃度が10mg/mlになるように溶解し、ＡＳ溶液及びBSA溶液を得た。ＡＳ溶液 300 μlとBSA溶液 150 μlとを混合し、ＥＤＣ（PIERCE社製） 400 μｇを添加した後、撹拌しながら20時間室温に保持した。得られた反応後の溶液は、蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥し、ウロン酸を介したＡＳ-BSAコンジュゲート 3.5mgを得た。

(参考例４) Ｂｉ−ＧＡＧ及びＢｉ−ＨＥＰ誘導体の調製
ＡＳおよび、ＡＣＨは参考例１で調製したものを使用した。ブタ皮由来のＨＡ（以下、単に「ＨＡ」と記載する）、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ、ウシ腎臓由来のＨＳ（以下、単に「ＨＳ」と記載する）、及びウシ角膜由来のＫＳ（以下、単に「ＫＳ」と記載する））は、生化学工業株式会社製のものを使用した。ＮＡＨは特開2004-18840に記載の方法に従って、大腸菌K5の培養物から調製した。ブタ腸由来のＨＥＰ（以下、単に「ＨＥＰ」と記載する）はサイエンティフィックプロテインラボラトリーズ社から購入した。また、ＥＨＳ−ＨＳは、特公平７−５３７５６号公報に記載の方法により調製した。

また、各種ＨＥＰ誘導体（ＮＨ_２−ＨＥＰ、ＮＡｃ−ＨＥＰ、６ＤＳＨ、ＮＡｃ−６ＤＳＨ、ＮＨ_２−６ＳＨ、６ＳＨ、ＮＨ_２−２ＳＨ、２ＳＨ、ＮＳＨ、ＮＡｃ−ＮＳＨ、ＮＨ_２−ＣＤＳＨ、ＣＤＳＨ）は、図１に示す方法で、各種脱硫酸化反応及び／又はＮ−アセチル化反応を、単独で、又は組み合わせて用いることにより調製した。図中、ＨＥＰの６−Ｏ、２−Ｏ、およびＮ−脱硫酸化はそれぞれ、高野ら、苅谷ら、Ａｙｏｔｔｅ， Ｌ．らの方法に従った（Ｔａｋａｎｏ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｃｈｅｍ． １４， ８８５（１９９５）， Ｔａｋａｎｏ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｌｅｔｔ． ３， ７１（１９９８）， Ｋａｒｉｙａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２３， ２４０（１９９８）， Ａｙｏｔｔｅ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， １４５， ２６７（１９８６））。

また、Ｎ−アセチル化は、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ， Ｉ．らの方法に従った。（Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， ５， ４０７（１９６５））。

高野らの方法に従って６−Ｏ−脱硫酸化を実施すると、副反応として若干のＮ−脱硫酸化も起きるので、得られた６ＤＳＨとＮＳＨの一部はＮ−アセチル化を行い、ＮＡｃ−６ＤＳＨとＮＡｃ−ＮＳＨを調製した。

上記の各種ＧＡＧ及び各種ＨＥＰ誘導体、並びに参考例１で調製したＡＳ及びＡＣＨを、それぞれ終濃度が10mg/mlになるように0.1M ＭＥＳ緩衝液（pH5.5）に溶解し、各種ＧＡＧ溶液及び各種ＨＥＰ誘導体溶液を得た。これらの各種ＧＡＧ溶液及び各種ＨＥＰ誘導体溶液 各 1mlに対して、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業社製）で２０ｍＭに調製したビオチン-LC-ヒドラジド（PIERCE社製）を、それぞれ２５μlずつ添加した。続いて、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で１００ｍｇ／ｍｌに調製したＥＤＣ溶液を１２．５μl添加した。これをよく撹拌した後、室温（１５℃〜２５℃）で２０時間撹拌して反応させた。反応終了後の反応物を、透析膜としてCellu Sep H1（フナコシ社製、カットオフ；分子量１，０００以下）を、透析液としてダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（pH7.2〜7.5、カルシウムイオン等の2価イオン不含：以下、「ＰＢＳ（−）」という）をそれぞれ用いて透析に付し、遊離のビオチンを充分に除去し、各種Ｂｉ−ＧＡＧ及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体を得た。透析終了後、Ｂｉ−ＧＡＧ濃度又はＢｉ−ＨＥＰ誘導体をそれぞれ５ｍｇ／ｍｌ に調整し、凍結保存した。

(参考例５) ストレプトアビジン固相化マイクロプレートの作製
ストレプトアビジン（Vector社製）をＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍｌに希釈し、マキシソープ（登録商標） ９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェルに５０μｌずつ加えた。このプレートを18時間、４℃で保存することにより、ストレプトアビジンをプレート上に均一に固相化した後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。続いて、ブロッキング剤としてApplieDuo（登録商標、生化学工業株式会社製）を用い、以下の方法によりストレプトアビジンでコーティングされていない部分をブロッキングした。すなわち、防腐剤として０．０５％プロクリン３００（登録商標、SUPELCO社製）を含むリン酸緩衝液（pH7.2〜7.5：以下、「ＰＢ」という）を用いて、ApplieDuo（登録商標）の５倍希釈液（以下、「ブロッキング液」という）を調製し、これを各ウェルに２５０μｌずつ加え、室温で2時間静置した。静置後、ブロッキング液を充分に除去し、３７℃で２時間乾燥させることにより、所望するストレプトアビジン固相化マイクロプレートを得た。得られたプレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入し、冷蔵保存した。

(参考例６) 各種ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートの作製
１） ＡＳ固相化マイクロプレートの作製
参考例３で調製したＡＳ−ＢＳＡ (50 ng)を、マキシソープ（登録商標） ９６ウェルマイクロプレートに添加し、18時間、4℃に保持した後、防腐剤として０．０５％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で4倍希釈したブロックエース(登録商標、大日本製薬社製)を用いてブロッキングした。１時間、室温で静置した後、所望のＡＳ固相化マイクロプレートを得た。このＡＳ固相化マイクロプレートは、後述する実施例３において血清中の抗体価の検証のために使用した。

２） 各種Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートの作製
上記参考例４に記載の各種Ｂｉ−ＧＡＧ及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体を、終濃度が1 μg/mlになるように、０．０５％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍希釈したApplieDuo（登録商標）溶液に溶解した（以下この溶液を、「各種Ｂｉ−ＧＡＧ溶液」及び「各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体溶液」という）。参考例５で作製したストレプトアビジン固相化マイクロプレートの各ウェルを、300 μlの０．０５％プロクリン300（登録商標）及び０．０５％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ（−）（以下、「洗浄緩衝液」と言う）で4回洗浄した。各種Ｂｉ−ＧＡＧ溶液及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体溶液をそれぞれ100 μlずつ各ウェルに分注し、室温で30分間静置したのち、各ウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄することにより、所望の各種Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートを得た。これらのプレートは、後述する実施例３におけるクローニング、及び後述する実施例５における反応性試験において使用した。

ＡＳ抗原の調製
１） ＲＡ−ＡＳの調製
実施例１の参考例１で調製したＡＳ ４ｍｇを、２Ｍ 塩化アンモニウム水溶液 １６０μｌに溶解した。この溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム１２ｍｇを添加し、７０℃で２日間、還元アミノ化反応を行った。反応後の溶液に、シアノ水素ホウ素ナトリウム ５ｍｇを添加し、さらに２日間、上記と同一の条件で反応を行った。反応後の溶液を氷浴中で冷却した後、酢酸 ３２μｌを添加して反応を完全に停止させた。２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法により、ＲＡ−ＡＳを回収した。得られた沈殿を、エタノール洗浄した後に凍結乾燥し、ＲＡ−ＡＳの凍結乾燥物 ３．３ｍｇを得た。

２） ＰＤＰ−ＡＳの調製
上記１）で調製したＲＡ−ＡＳ ３．３ｍｇを、０．１Ｍ食塩/０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５） １ｍｌに溶解した。この溶液に５ｍＭ ＳＰＤＰエタノール溶液 ８０μlを添加した後、室温にて一晩静置し、２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化反応（ＰＤＰ反応）を行った。過剰のＳＰＤＰを除くために蒸留水を用いて透析を行った後、凍結乾燥し、ＰＤＰ−ＡＳの凍結乾燥物 ３．８ｍｇを得た。

３） ＳＨ−ＡＳの調製
上記２）で調製したＰＤＰ−ＡＳ ２．０ｍｇを、０．１Ｍ食塩/０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５） １６０μｌに溶解した。この溶液に、終濃度が２５ｍＭになるようにジチオスレイトールを添加し、６０分間室温にて還元反応を行った。２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法でＳＨ−ＡＳを回収した。得られた沈殿を、エタノール洗浄した後に凍結乾燥し、ＳＨ−ＡＳの凍結乾燥物 １．５ｍｇを得た。

４） ジスルフィド結合を介したＡＳ−ＫＬＨコンジュゲートの調製
上記３）で調製したＳＨ−ＡＳ １．５ｍｇ及び参考例２で調製したＰＤＰ−ＫＬＨ ０．７５ｍｇを、０．１Ｍ食塩/０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５） １ｍｌに溶解し、２時間室温にてコンジュゲーション反応を行った。反応中に生成されるピリジル−２−チオンを除くため、上記反応後の溶液を、蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥し、ＡＳ−ＫＬＨコンジュゲートの凍結乾燥物１．９ｍｇを得た。得られた凍結乾燥物は、後述する実施例３において、ＡＳ抗原として用いた。

ＡＳに対して反応する抗体を生産するハイブリドーマ細胞株の樹立
１） マウスの免疫化
少量の蒸留水に溶解したＡＳ抗原 1 mgとTiterMAX Gold（登録商標、シグマ社製）2mlとを混合し、抗原溶液を調製した。また、免疫する動物としては、4匹のBALB/Cマウス(6週齢のメス、日本チャールズリバー社製)を用いた。上記の抗原溶液 100μｌ/匹 を、2週間毎に2又は3回皮下投与した。血清の抗体価が充分な値に達した時、最終免疫として、アジュバントを含まないＡＳ抗原溶液 100μｌ/匹を投与した。最終免疫から３日後、免疫したマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。

なお、上記において、血清中の抗体価の検証は、以下の方法により行った。すなわち、参考例６ １）で作製したＡＳ固相化マイクロプレート及びアルカリホスファターゼ標識抗−マウスＩｇＧ＋Ｍ＋Ａ抗体（以下、「ＡＬＰ−抗マウスＩｇ」という）を用い、ＥＬＩＳＡ法により血清中の抗体価を検証した。すなわち、ＰＢＳ（−）で1000倍希釈した血清 50 μlをＡＳ固相化マイクロプレートに分注し、３７℃で1時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ（−）で４回洗浄し、10% ブロックエース（登録商標）/ＰＢＳ（−） で1000倍希釈したALP-抗マウスIg 溶液 50 μlを各ウェルに分注した。さらに、ＰＢＳ（−）で４回洗浄した後、基質溶液(ALPローゼ, シノテスト社製) 50μlを各ウェルに分注し、20分間、室温にて静置した。さらに、発色試薬(シノテスト社製) 50μlを添加し、660nmをバックグラウンド補正として495nmの吸光度を測定した。

２）ハイブリドーマの創製
１）で摘出した脾臓から得られた免疫感作されたリンパ球と、マウスミエローマP3U1細胞(シマ研究所製)とを、4対1ないし5対1の混合比で混合した後、50%のポリエチレングリコール1500(ロシュ社製)中で共遠心分離することによって細胞融合を実施した。なお、上記の細胞融合に用いるミエローマ細胞には、細胞融合の1週間前より、8-アザグアニンを含んだHAT培地で生育させたものを用いた。細胞融合後、HAT培地中で細胞を生育させた細胞を、以下のクローンの選抜に用いた。

３）クローンの選抜及び評価
３−１） クローニング
クローニングには限界希釈法を採用した。すなわち、細胞数がウェル当り１以下になるようにHAT培地で細胞を希釈し、これを９６ウェルマイクロプレートに播種した。これを常法に従って培養し、培養上清液を得た。培養上清液の抗体価の評価を、参考例６ ２）で作製したＢｉ−ＡＳ固相化マイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により行い、クローンを選抜した。以上のクローンニングの工程は、少なくとも2回以上実行した。以上の結果として、６つのクローンを選抜し、取得した。

３−２） クローンの評価
上記３−１）で取得した各クローンの活性が維持されていることを確認するため、当該クローンを２４ウェルプレートの培養スケールにて培養し、得られた培養上清液の抗体価の評価を、参考例６ ２）で作製したＢｉ−ＡＳ固相化マイクロプレート、及びＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体(以下、「ＨＲＰ抗マウスＩｇ」と記載する、ダコ社製)を用いたＥＬＩＳＡ法により行った。以下に詳細を示す。
[クローンの抗体価の評価]
予め洗浄緩衝液によって4回洗浄した、Ｂｉ−ＡＳ固相化マイクロプレートに、培養上清液 100μlを分注し、室温にて1時間静置した。さらに洗浄緩衝液で4回洗浄した後に、反応緩衝液(0.05%プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍に希釈したApplieDuo（登録商標）溶液)で2000倍に希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇ 100μlを、各ウェルに分注した。このプレートを室温にて1時間静置した後、洗浄緩衝液で4回洗浄し、ＴＭＢ溶液（HRP基質溶液、BIOFX社製） 100μlを各ウェルに加え、30分間、37℃で酵素反応を行った。反応終了後、発色試薬（BIOFX社製） 100μlを各ウェルに添加し、630nmをバックグラウンド補正として、450nmの吸光度を測定した。なお、反応緩衝液をネガティブブランクとして用いた。その結果、各クローンが抗ＡＳ抗体を生産していることが確認された。樹立したハイブリドーマのクローン番号はＡＳ１７、ＡＳ２２、ＡＳ２５、ＡＳ３８、ＡＳ４８であったことから、このハイブリドーマによって産生される抗体を、それぞれＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＳ３８抗体及びＡＳ４８抗体と名付けた。上記のハイブリドーマは、平成１８年３月１日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、それぞれ受託番号として、FERM P-20823、FERM P-20824、FERM P-20825、FERM P-20826又はFERM P-20827が付与された。常法に従って抗体の免疫グロブリンクラスおよびそのサブクラスを調べた結果、ＡＳ１７抗体はIgG2aに分類され、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体はIgG1に分類され、ＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体はIgMに分類されることを確認した。

抗ＡＳモノクローナル抗体の調製
１） 抗ＡＳモノクローナル抗体の生産
目的の抗ＡＳモノクローナル抗体を生産する方法としては、マウス腹水法を採用した。すなわち、上記実施例３ ３）で樹立した各ハイブリドーマ(ＡＳ１７、ＡＳ２２、ＡＳ２５、ＡＳ３８、ＡＳ４８) 5×10⁶個を、それぞれ予めプリスタン（2,6,10,14-Tetrametylpentadecane：東京化成工業）処理した３匹のBALB/Cマウス(15週齢の雌)の腹腔に注入した。注射後10〜20日の間に、マウスの腹水を数回に分けて採取し、合計約10mlの腹水を得た。

２） 抗ＡＳモノクローナル抗体の精製
以下に、ＩｇＧタイプ抗体（ＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体）の精製方法を示す。すなわち、上記１）により得られた腹水を、それぞれ吸着バッファ1(20 mMリン酸緩衝液(pH 7.0))に対して一晩透析した。透析内液をメンブランフィルタ(孔径:0.45 μm)によって濾過した後、濾過液を事前に吸着バッファ1で平衡化したHiTrap Protein G HPカラム(5ml、アマシャム・バイオサイエンス社製)にアプライし、同バッファでカラムを洗浄した。通過液の280nmの吸収がほぼ0になった時、0.1 M グリシンバッファ(pH 2.7) をカラムに通過させ、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体をそれぞれ溶出した。各抗体を含む溶液をそれぞれ回収し、ＰＢＳ（−）に対して十分に透析した。透析内液は必要に応じて限外ろ過濃縮等で適切な濃度に適宜調整し、それらを精製抗体として使用した。精製したＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体の量はそれぞれ、30.8mg、4.6mg及び11.5mgであった。

以下にＩｇＭタイプ抗体（ＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体）の精製方法を示す。すなわち、上記１）により得られた腹水を、それぞれ吸着バッファ2(0.5M K₂SO₄を含む20mM リン酸緩衝液(pH 7.5))に対して一晩透析した。透析内液をメンブランフィルタ(孔径:0.45 μm)によって濾過した後、濾過液を事前に吸着バッファ1で平衡化したHiTrap IgY Purification HPカラム(5ml、アマシャム・バイオサイエンス社製)にアプライし、同バッファでカラムを洗浄した。通過液の280nmの吸収がほぼ0になった時、20 mMリン酸緩衝液(pH 7.5) をカラムに通過させ、ＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体をそれぞれ溶出した。溶出したＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体は、塩析 (NH₄SO₄:50%の飽和)することによって回収した。沈澱物をＰＢＳ（−）に対して透析し、得られた透析内液を精製抗体として使用した。精製したＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体の量はそれぞれ、2.7及び2.2 mgであった。

各精製抗体の反応性試験
各精製抗体の各種ＧＡＧ及び各種ＨＥＰ誘導体に対する反応性を検証した。
１） 各精製抗体の反応性試験その１−ＡＳに対する反応性試験
１）−１ 方法
Ｂｉ−ＧＡＧの固相化量の異なるマイクロプレートを作製するために、Ｂｉ−ＡＳ溶液中のＢｉ−ＡＳの終濃度を、0.001, 0.004, 0.012, 0.037, 0.111, 0.333, 1.000 μg/mlと変化させた溶液を用いて、参考例６ ２）と同様の方法でＢｉ−ＡＳ固相化マイクロプレートを作製した後、それぞれ洗浄緩衝液で4回洗浄した。その後各ウェルに、添加剤としてApplieDuo（登録商標。最終希釈率２０倍、生化学工業株式会社製）、防腐剤として０．０５％プロクリン３００を含むＰＢＳ（−）（以下、「反応液Ａ」という）を用いて、それぞれ、0.025 mg/ml（ＡＳ１７抗体）、0.07mg/ml（ＡＳ２２抗体）、0.006 mg/ml（ＡＳ２５抗体）、0.006 mg/ml（ＡＳ３８抗体）、0.1 mg/ml（ＡＳ４８抗体）に調製した各精製抗体からなる各試験溶液を１００μｌずつ加え、これを常温で６０分間静置し、抗原抗体反応させた。反応終了後、各ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄し、二次抗体溶液として、反応液Ａで２０００倍希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇ（ダコ社製）溶液を１００μｌずつ加え、これを常温で６０分間静置して抗原抗体反応させた。反応終了後、このプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ溶液（BIOFX社製）を１００μｌずつ 加え、常温で３０分間反応させて発色させた。続いて、プレートに反応停止液（BIOFX社製）を１００μｌずつ 加えて反応を停止させた後、ＴＭＢ分解によって増加する波長４５０nmの吸光度（対照波長６３０nm）をウェルリーダーＳＫ−６０３（登録商標、生化学工業株式会社販売）で測定した。なお、抗体の反応性は、上記の各濃度のＢｉ−ＧＡＧを用いて作製したＢｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレートを用いて上記測定を行った場合の吸光度から、Ｂｉ−ＧＡＧ溶液の代わりにＢｉ−ＧＡＧを含まない０．０５％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍希釈したApplieDuo（登録商標）溶液を用いることの他、参考例６ ２）と同様の方法により作製したコントロール測定用マイクロプレートを用いて上記の測定方法に準じて測定を行った場合の吸光度（ブランク値）を減算した吸光度差（以下、単に「吸光度差」と記載する）（以下、単に「吸光度差」と記載する）によって評価した。

１）−２ 結果
結果を、図２に示す。ＡＳに対するAS22抗体とAS48抗体の相対感度は、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体のそれよりも100倍の強度があった。Ｂｉ−ＡＳ濃度が1.0 μg/ mL（0.1μg/ウェル）のとき、すべての抗体は強い反応性（吸光度差；≧１）を示した。

２） 各精製抗体の反応性試験その２−各種ＧＡＧに対する反応性試験
２）−１ 方法
用いる各種Ｂｉ−ＧＡＧの濃度を、1.0 μg/ mL（0.1μg/ウェル）に固定することの他、上記１）−１と同様の方法により、各種ＧＡＧに対する各精製抗体の反応性を評価した。

２）−２ 結果
図３に各種ＧＡＧに対する各精製抗体の反応性の結果を示す。

上記１）と同様に、各抗体はＡＳに対して強く反応した。いずれの抗体についても、ＨＳ及びＨＥＰに対して反応しないことを確認した。また、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体については、その他のＧＡＧ、すなわち、ＡＣＨ、ＥＨＳ−ＨＳ、ＫＳ、ＨＡ、ＮＡＨ、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ及びＣｈのいずれに対しても実質的に反応しないことを確認した。一方ＡＳ４８抗体は、ＥＨＳ−ＨＳ、ＫＳ、ＨＡ、ＮＡＨ、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ及びＣｈのいずれに対しても反応しなかったが、ＡＣＨに対しては約５５％の反応性を有していることを確認した。

これらの結果から、２−サルフォイズロン酸（ＩｄｏＡ（２Ｓ））残基がこれらの抗体のエピトープに含まれていることが示唆された。さらに、各抗体が反応性を示さなかったＨＳ及びＨＥＰの分子中には、ＩｄｏＡ（２Ｓ）のα(1-4)結合が存在するが、その大部分はＧｌｃＮＳ又はＯ−硫酸化ＧｌｃＮＳと結合した二糖ユニットとして存在することから、グルコサミン残基の修飾も、これら抗体の反応にとって重要なマイナス要素であることが推察された。

３） 各精製抗体の反応性試験その３−各種ＨＥＰ誘導体に対する反応性試験
エピトープ解析の一助とするために、実施例１の参考例６に記載の各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化プレートを用いることの他、上記２）−１に記載の方法に準じて反応性の評価を行うことにより、抗原のグルコサミン残基のＮ位の修飾状態が、各抗体の反応性にどのように影響するかを検証した。以下、グルコサミン残基のＮ位が「ＮＨ_２−」となっている状態を「未修飾」と記載する。

結果を図４に示す。

いずれの抗体も２ＳＨと反応した。ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＳ３８抗体及びＡＳ４８抗体の反応性は、それぞれ１７２．２％、１０４．９％、７６．４％、３１．７％、１０４．８％であった。２ＳＨはグルクロン酸ユニット（−［ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ］−）と２−サルフォイズロン酸ユニット（−［ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＡｃ］−）により構成されており、また、２−サルフォイズロン酸ユニットの存在比が６０％以上と高いので、この結果は上記の１）及び２）の結果と矛盾しない。

一方、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体は、ＮＨ_２−２ＳＨに反応しなかった。ＮＨ_２−２ＳＨのグルコサミン残基のＮ位の大部分は未修飾となっている。したがって、これらの抗体のエピトープには、Ｎ−アセチル化したグルコサミン残基が含まれていることが示唆された。

また、ＮＡｃ−６ＤＳＨのグルコサミン残基のＮ位の一部はアセチル化されているにもかかわらず、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体はＮＡｃ−６ＤＳＨに実質的に反応せず、さらに、ＮＡｃ−ＨＥＰのグルコサミン残基のＮ位の大部分はアセチル化されているにもかかわらず、これらの抗体はＮＡｃ−ＨＥＰに実質的に反応しなかったことから、これら抗体の抗原に対する反応性は、グルコサミン残基のＮ−硫酸化及び／又はＯ−硫酸化によって阻害されることが示唆された。

ＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体は、ＮＨ_２−ＨＥＰ及び６ＤＳＨに対して実質的に反応しなかったが、それらをＮ−アセチル化したＮＡｃ−ＨＥＰ及びＮＡｃ−６ＤＳＨに対してはＡＳと同程度の反応性を示した。ＮＨ_２−ＨＥＰのグルコサミン残基のＮ位の大部分は未修飾となっている。また、６ＤＳＨのグルコサミン残基のＮ位の大部分は硫酸化されているが、その調製過程で一部にＮ−脱硫酸化が起きるため、一部は未修飾となっている。したがって、上記の結果から、ＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体のエピトープには、Ｎ位が何らかの形で修飾されたグルコサミン残基、特にＮ−アセチル化されたグルコサミン残基が含まれていることが示唆された。また、ＮＡｃ−ＨＥＰ及びＮＡｃ−６ＤＳＨとの反応性から、それぞれ、そのグルコサミン残基のＯ−硫酸化やＮ−硫酸化が抗体の反応性に実質的に影響しないことが示唆された。

組織染色
ラット小脳凍結切片を用いて免疫組織染色における染色性を検討した。

ＳＤラット（日本チャールスリバー社、８週齢、雄）をジエチルエーテル（和光純薬工業社製）で麻酔し、腹部大動脈より放血、屠殺後、小脳を摘出した。摘出した小脳をＯＣＴコンパウンド（三共マイルス社製）に包埋し、アセトン・ドライアイスで凍結させ、クリオスタット（ライカ社販売）にて厚さ6μmの切片を作製した。

作製した切片を２時間常温にて風乾後、冷アセトン（４℃）で固定を行い、さらに常温で１時間風乾した。この後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄し、０．１％アジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）/０．３％過酸化水素水（和光純薬工業社製）を含む蒸留水中に常温で１０分間浸漬し、内因性のペルオキシダーゼ活性を除去した後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ及び０．１％カゼイン（和光純薬工業社製）を含むＰＢＳ（−）でブロッキングを常温で６０分間行った。

０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、アビジン−ビオチンブロッキングキット（ＶＥＣＴＯＲ社製）にて内因性のビオチンのブロッキングを行った。
この後０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ及び０．１％カゼインを含むＰＢＳ（−）で１μg/mLに希釈したＡＳ２５抗体を４℃で一晩反応させた。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、１０％ラット血清を含むビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（ＪＡＣＫＳＯＮ社製）をＰＢＳで５００倍に希釈し、常温で３０分間反応させた。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ニチレイ社製）を常温にて３０分間反応させた。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、ＤＡＢ発色キット（Ｚｙｍｅｄ社製）にて茶色の発色反応を行った。

発色後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）に浸漬し反応を停止させ、常水にて５分間洗浄した。この後対比染色を行うためヘマトキシリン（ＤＡＫＯ社製）にて核染色（青色）を行った。常水にて５分間洗浄後、常法に従い脱水、透徹操作を行い封入した。

得られた染色像を図５に示す。分子層（ａ）に陽性反応が観察された。

本発明抗体は、ＡＳの検出に好適に用いることができることから極めて有用である。また、本発明抗原及び本発明ハイブリドーマは、本発明抗体の効率的な生産のために用いることができることから極めて有用である。また、本発明ＡＳ検出方法によれば、ＡＳを好適に検出することができることから極めて有用である。また、本発明検出キットは、これを用いることにより、本発明検出方法をより効率的且つ簡便に行うことを可能にすることから極めて有用である。

各種ＨＥＰ誘導体の製造方法の流れを示す図である。 ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＳ３８抗体及びＡＳ４８抗体の、ＡＳに対する反応性を示す図である。横軸のＢｉ−ＡＳ（μg/ml）は、Ｂｉ−ＡＳ固相化プレートの作製において用いたＢｉ−ＡＳ溶液におけるＢｉ−ＡＳの終濃度を示す。 ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＳ３８抗体及びＡＳ４８抗体の、各種ＧＡＧに対する反応性を示す図である。 ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＳ３８抗体及びＡＳ４８抗体の、各種ＨＥＰ誘導体等に対する反応性を示す図である。 ＡＳ２５抗体を用いたラット小脳の組織染色の結果を示す図である。

Claims (6)

1. 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２０８２４又はＦＥＲＭ Ｐ−２０８２７であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
2. 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２０８２４又はＦＥＲＭ Ｐ−２０８２７であるハイブリドーマ。
3. 請求項１に記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するアカラン硫酸の検出方法。
4. 試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、請求項３に記載の検出方法。
5. 請求項１に記載の抗体を少なくとも含む、試料中に存在するアカラン硫酸の検出キット。
6. 試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、請求項５に記載の検出キット。

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