JP6659024B2 - 抗コンドロイチン硫酸e抗体 - Google Patents

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Description

本発明はコンドロイチン硫酸Eに反応し、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸B及びコンドロイチン硫酸Dに反応しない、新規な抗コンドロイチン硫酸E抗体に関する。
本出願書類中で使用する略号は以下の通りである。
CSA:コンドロイチン硫酸A
CSB:コンドロイチン硫酸B
CSC:コンドロイチン硫酸C
CSD:コンドロイチン硫酸D
CSE:コンドロイチン硫酸E
DS:デルマタン硫酸
Hep:ヘパリン
HS:ヘパラン硫酸
HPN:ヘパロサン
KS:ケラタン硫酸
HA:ヒアルロン酸
deS−CSC:完全脱硫酸化コンドロイチン硫酸C
de6S−CSE:6−O−脱硫酸化コンドロイチン硫酸E
CS:コンドロイチン硫酸
GAG:グリコサミノグリカン
GlcA:グルクロン酸
IdoA:イズロン酸
GalNAc: N−アセチルガラクトサミン
PE:ジパルミトイル−L−(α−ホスファチジル)エタノールアミン
C−ABC:コンドロイチナーゼABC
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
CSE−PE:ジパルミトイル−L−(α−ホスファチジル)エタノールアミン結合コンドロイチン硫酸E
CSはGAGの一種で、GlcAとGalNAcの二糖の繰り返し構造からなる直鎖状高分子多糖である。二糖単位に結合した硫酸基の数とその結合位置の違い及びウロン酸異性体の存在が、CSの構造を多様化させる。CSの異性体としてCSA、CSB(DSとも称される)、CSC、CSD、CSE等が存在する。
CSEは、GlcAとGalNAcの4位と6位が硫酸化修飾を受けた基本二糖単位[GlcAβ1−3GalNAc(4S、6S)]の繰り返し構造を有する硫酸化多糖である。
CSEに対する抗体として、CSE及び基本二糖単位[IdoAβ1−3GalNAc(4S)]の繰り返し構造を有するCSBに反応することが報告されているCh−1抗体やCh−3抗体(特許文献1)、CSDの基本二糖単位であるD構造[GlcA(2S)β1−3GalNAc(6S)]を主に認識するが、CSEにも反応することが報告されているMO−225抗体(非特許文献1、2、3)、CSE、サメ皮膚由来DS、及びCSAに反応することが報告されているGD3G7抗体(非特許文献4)等が知られている。
特開2006−129701号公報
山形方人著、「ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(Journal of Biological Chemistry)」、 262巻、9号、1987年3月25日、p. 4146−4152 Ito Yumi著、「グライコバイオロジー(Glycobiology)」、15巻、6号、2005年、p. 593-603 福井成行著、「ネイチャー バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)」、20号、2002年、p. 1011-1017 Gerdy B. ten Dam著、「アメリカンジャーナルオブパソロジー(The American Journal of Pathology)」、171巻、4号、2007年10月、p. 1324−1333
本発明はCSEに高い特異性をもって反応し、特定の硫酸化多糖の検出や単離等に用いることができる抗体を提供することを課題とする。
本発明者は上記課題の解決を目指し、脂質とCSEとを結合させた物質を抗原として新規抗CSE抗体の作製を試みた。
本発明者は鋭意検討の結果、得られた抗体がCSEに反応し、CSA、CSB及びCSDに反応しないことを見出し、CSEと特異的に反応する抗CSE抗体を発明するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)コンドロイチン硫酸Eに反応し、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸B及びコンドロイチン硫酸Dに反応しない抗体。
(2)コンドロイチン硫酸C、完全脱硫酸化コンドロイチン硫酸C、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパロサン、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸及び6−O−脱硫酸化コンドロイチン硫酸Eのいずれにも反応しない、(1)に記載の抗体。
(3)硫酸化コンドロイチン硫酸Bに反応しない、(1)又は(2)に記載の抗体。
(4)脂質とコンドロイチン硫酸Eとが結合してなる物質を抗原として免疫することによって得られる(1)〜(3)のいずれかに記載の抗体。
(5)脂質がジパルミトイル−L−(α−ホスファチジル)エタノールアミンである、(4)に記載の抗体。
(6)モノクローナル抗体である、(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体。
(7)受領番号がNITE ABP−01808又はNITE ABP−01809であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
(8)(6)に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
(9)脂質とコンドロイチン硫酸Eとが結合してなる物質を抗原として免疫した動物由来の抗体産生細胞と腫瘍細胞との細胞融合により形成される(8)に記載のハイブリドーマ。
(10)脂質がジパルミトイル−L−(α−ホスファチジル)エタノールアミンである、(9)に記載のハイブリドーマ。
(11)受領番号がNITE ABP−01808又はNITE ABP−01809であるハイブリドーマ。
(12)(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するコンドロイチン硫酸Eの検出方法。
(13)(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体を少なくとも含む、コンドロイチン硫酸Eの検出キット。
(14) 脂質とコンドロイチン硫酸Eとが結合してなる物質を抗原として免疫する工程を少なくとも含むことを特徴とする、コンドロイチン硫酸Eに反応し、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸B及びコンドロイチン硫酸Dに反応しない抗体の製造方法。
(15) 脂質がジパルミトイル−L−(α−ホスファチジル)エタノールアミンである、(14)に記載の製造方法。
本発明抗体は、CSEに特異的に反応するため、CSEの検出に好適に用いることができる。また、本発明ハイブリドーマを用いることにより、本発明抗体を効率的に産生させることができる。また、本発明CSE検出方法により、CSEを高精度に検出することができる。また、本発明CSE検出キットを用いることにより、本発明CSE検出方法によるCSEの検出をより効率的且つ簡便に行うことができる。
各種GAGへのE−12C抗体およびE−18H抗体の反応性を示す図である。 硫酸化CSAや硫酸化CSB等の各種GAGへのE−12C抗体およびE−18H抗体の反応性を示す図である。 E−12C抗体およびE−18H抗体を用いた凍結切片組織染色の図(写真)である。 E−12C抗体およびE−18H抗体を用いたパラフィン切片組織染色の図(写真)である。 C−ABCで処理した組織に対するE−12C抗体の染色性を示した図(写真)である。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明はCSEに反応し、CSA、CSB及びCSDに反応しない抗体を提供する。
CSEは、GlcAとGalNAcの4位と6位が硫酸化修飾を受けた基本二糖単位[GlcAβ1−3GalNAc(4S、6S)]の繰り返し構造を有する硫酸化多糖である。本発明抗体が反応するCSEは、このような硫酸化多糖であれば、天然のものであっても、化学的に合成されたものであってもよい。天然のものとしては、例えばイカ由来のものが挙げられる。化学的に合成されたものとしては、例えば、後述する実施例6(1)に記載の方法によりCSAから化学的に合成されたもの(以下、硫酸化CSAともいう)が挙げられる。このようなCSEにおける当該基本二糖単位の存在比は、15%以上であることが好ましく、30%以上であることがより好ましく、40%以上であることがさらに好ましく、50%以上であることが極めて好ましく、60%以上であることが特に好ましく、70%以上であることが最も好ましい。基本二糖単位の存在比は後述する実施例に記載の方法により求めることができる。
本発明において、特に断らない限り抗体の「反応」とは免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味し、抗原との結合により評価することができる。抗体と抗原との結合は、常法であるELISA法、RIA法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法等によって調べることができる。ELISA法としては、例えば、後述する実施例3(2)に記載の方法を挙げることができる。例えば、抗体を用いてELISA法を行ったときに、抗原の濃度の増加に比例して反応シグナルが増強される場合に、当該抗体は当該抗原に反応するということができる。
また、抗原に対する本発明抗体の反応性は、例えば、後述する実施例3(2)に記載の方法により測定される本発明抗体のCSEに対する反応性を基準とした、相対的な反応性とすることができる。
本願明細書において、「反応しない」とは、抗原と抗体の反応性が、陰性対照又はブランクと同程度であることを意味する。例えば、上記反応性を測定する方法において、CSEに対する反応性を100%とした場合に、抗原と抗体の反応性と陰性対照又はブランクとの差が、10%未満であるとき、好ましくは5%未満、より好ましくは4%未満、さらに好ましくは3%未満、極めて好ましくは2%未満、特に好ましくは1%未満、最も好ましくは0.5%未満であるときは、「反応しない」と判断することができる。
本発明の抗体は、CSEに反応し、CSA、CSB及びCSD に反応しない抗体であれば特に限定されないが、CSC、deS−CSC、Hep、HS、HPN、KS、HA、de6S−CSEにも反応しない抗体であることが好ましく、硫酸化CSBにも反応しない抗体であることがより好ましい。
ここで、硫酸化CSBとは、後述する実施例6(1)に記載の方法により得られたものを指す。
本発明の抗体のクラスは、特に制限されないが、IgMであることが好ましく、IgM、κ鎖であることがより好ましい。
本発明の抗体の種類は、特に限定されず、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、抗体の一部、すなわち、抗体断片であってもよい。前記抗体断片としては、Fab、F(ab’)2、Fab'、Fv等が挙げられる。かかる抗体断片は、例えば、ペプチダーゼ等により、モノクローナル抗体を消化することにより得られうる。例えば、Fabフラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をパパインで処理することにより得られ、F(ab’)2フラグメントは、本発明のモノクローナル抗体をペプシンで処理することにより得られうる。
本発明の抗体を得るための方法について、下記の項目に分けて説明する。ただし、本発明の抗体を得る方法は、以下のものには限定されない。
1.抗原の調製
2.免疫方法
3.ポリクローナル抗体の取得
4.モノクローナル抗体の取得
5.ハイブリドーマの作製
6.ハイブリドーマの選択とクローニング
<1.抗原の調製>
本発明の抗体は、例えば、CSEの抗原性を高めるために、脂質とCSEとが結合してなる物質を抗原として抗体を産生しうる動物を免疫することにより得ることができる。CSEは特に限定されないが、イカ由来であるものが好ましい。脂質は、CSEと結合するものであれば特に限定されないが、リン脂質が好ましく、PEであることがさらに好ましい。脂質とCSEとの結合は特に限定されないが、化学的な結合であることが好ましく、共有結合であることがより好ましく、アミノアルキル結合であることがさらに好ましい。CSEとPEの結合に用いることができるGAGとPEの結合方法は、特開平4−80201に記載の還元末端をラクトン化する方法、特開平4−80202に記載の還元末端の限定酸化方法、特開2003−335801に記載のGAG−テトラブチルアンモニウム(GAG−But4+)塩の中間体を経た調製方法等が挙げられる。
<2.免疫方法>
免疫される動物は、CSEに反応する抗体を産生しうる動物であれば特に限定されないが、ブタ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、ラット、マウス等の動物であることが好ましく、マウスであることが好ましい。
免疫のアジュバントは、特に使用しなくてもよいが、使用する場合は、ミョウバン、グラム陽性菌、グラム陰性菌、核酸等、アジュバント効果が期待されるものが好ましく、サルモネラ菌体膜がより好ましい。
免疫は、例えば、抗原とアジュバントを動物に静脈注射することで行うことができる。注射方法は、これに限らず、皮下注射、腹腔内注射でもよい。通常、投与は数回に分けて実施する。
<3.ポリクローナル抗体の取得>
ポリクローナル抗体は、免疫した動物より、血液を採取することで取得することができる。採取した血液中にポリクローナル抗体が存在するか否かは、抗体反応を指標に評価することができる。抗体反応の測定方法としては、ELISA法、RIA法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロット法等が挙げられる。ポリクローナル抗体は採取された血液そのものでもよく、遠心分離によって得られる血清でもよく、精製されたものでもよい。抗体の精製は、塩析、イオン交換、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的手法を適宜組み合わせることにより達成することができる。
<4.モノクローナル抗体の取得>
モノクローナル抗体を取得する方法としては、得られたハイブリドーマを、in vitroあるいはin vivoで培養する方法が挙げられ、目的に応じて選択できる。in vitroの場合、ハイブリドーマを培養した際の細胞培養液を回収することで得られ、in vivoの場合、ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から得ることができる。
モノクローナル抗体は、細胞培養液や腹水をそのまま使用してもよく、遠心分離し細胞等を除いたものを使用してもよく、精製したものを使用してもよい。
抗体の精製は、塩析、イオン交換、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的手法を適宜組み合わせることにより達成することができる。
CSEに反応するモノクローナル抗体としては、E−12CおよびE−18Hと名付けられたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体 (以下、E−12C抗体、E−18H抗体という)を挙げることができる。
E−12C抗体およびE−18H抗体は、CSEに反応し、他の各種GAG(CSA、CSB、CSC、CSD、deS−CSC、Hep、HS、HPN、KS、HA、de6S−CSE、硫酸化CSB)には反応しない特徴を有する。
<5.ハイブリドーマの作製>
ハイブリドーマは免疫した動物から、リンパ節又は脾臓を摘出することで得られる抗体産生細胞と腫瘍細胞とを細胞融合することにより作製される。抗体産生細胞はリンパ球が好ましい。腫瘍細胞はミエローマ細胞が好ましく、由来は哺乳動物由来が好ましく、マウス由来がより好ましい。
<6.ハイブリドーマの選択とクローニング>
ハイブリドーマの選択は、例えば、ハイブリドーマの増殖速度と抗体反応を指標に行うことができる。抗体反応の測定方法としては、ELISA法、RIA法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。
上記方法によりCSEに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、得られたハイブリドーマについてクローニングを実施する。クローニングの方法としては、限界希釈法等が挙げられる。限界希釈法では、96ウェルプレートに1ウェルあたりの細胞数を1個/ウェル(5.0 cells/ml)又は0.5個/ウェル(2.5cells/ml)となるように播種するのが好ましい。クローニング操作は2回以上繰り返すことが好ましく、単一クローンとすることが好ましい。
具体的なハイブリドーマとしては、E−12CおよびE−18Hと名付けられたハイブリドーマを挙げることができる。
上記ハイブリドーマは2014年2月26日 (寄託日)、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)(〒292−0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8−122号室)に寄託し、それぞれ受託番号NITE P−01809、NITE P−01808が付与された。また、平成27年2月17日付で、国際寄託に移管されている(受領番号NITE ABP−01809、NITE ABP−01808)。
本発明のCSE検出方法は、本発明抗体を試料に接触させる工程が含まれている限り、特に限定されない。
上記の「試料」とは、CSEを含むか、含む可能性を有する試料であれば特に限定されないが、試料の由来となるものとしては、例えば、尿、血液、血漿、血清、関節液、髄液等の体液、分泌物、動物細胞若しくは植物細胞等の細胞、組織、臓器、又は細胞若しくは微生物の培養物等が例示される。
本発明のCSE検出方法において、試料中に存在するCSEの検出における具体的方法としては、特に限定されないが、ELISA法、RIA法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。
本発明のCSE検出方法における検出は、定量的な検出であってもよく、定性的な検出であってもよい。定量的な検出である場合、試料中に存在するCSE濃度は、例えば、予め既知濃度のCSE標準溶液を用いてCSE濃度と検出結果との関係について検量線を作成し、CSE濃度が未知の試料についての検出結果と前記検量線とを照らし合わせることにより行うことができる。
本発明CSE検出キットは、本発明抗体を少なくとも含んでいれば、特に限定されない。本発明CSE検出キットによれば、本発明CSE検出方法をより簡便に行うことができる。上記において、「本発明抗体を少なくとも含むキット」は、例えば本発明抗体そのもの(例えば、溶液に溶解した本発明抗体等も含む)を構成成分として含むキット、本発明抗体を固着させた固相を構成成分として含むキット、酵素等により標識した本発明抗体を構成成分として含むキット等が挙げられる。また本発明CSE検出キットの構成成分には、本発明抗体に加えて、例えば2次抗体、反応バッファー、洗浄液、反応基質、CSE標準液などを含むものであってもよい。
本発明抗体の製造方法は、脂質とコンドロイチン硫酸Eとが結合してなる物質を抗原として免疫する工程を少なくとも含んでいれば、特に限定されない。抗体の具体的な製造方法は、上記1.〜6.に記載した方法や後述する実施例に記載の方法を用いることができる。
以下、本発明を参考例、実施例を挙げて具体的に説明する。なお、本発明は本参考例、実施例に限定されるものではない。
(参考例1)CSEの調製
CSEは、イカ軟骨よりプロテアーゼ処理、アルコール沈殿を経て抽出され(J.Biochem.60,317−321(1966))、酵素処理、カラムクロマトグラフィ法により調製することができる(J.Biol.Chem.236,983−987 (1961)、J.Biol.Chem.252,4570−4576(1977))。
上記工程を経て、重量平均分子量14.6kDa、硫黄含量10.0%、E構造含有率70%以上のCSEを得た(CSEの分析方法は以下の通りである)。当該CSEを抗原CSEとした。
(参考例2)CSEの分子量および二糖組成の解析
(1)分子量解析
抗原CSEの分子量は、CSEの0.2%溶液50μlをHPLC (HLC−8220GPC, 東ソー)によるゲルろ過で分析した。ゲルろ過カラムは、TSKgel PWXLG4000(0008020, 7.8mm I.D.×30cm, 東ソー)、TSKgel PWXLG3000(0008021, 7.8mm I.D.×30cm, 東ソー)、TSKgel PWXLG 2500(0008022, 7.8mm I.D.×30cm, 東ソー)を連結させて用いた。移動相に0.2M NaClを使用して、カラム温度 40℃、流速 0.6 ml/minの条件で展開した。CSEの検出には示唆屈折計を用いた。平均分子量はCSの分子量標準品を対照にして求めた。尚、標準CSの分子量は光散乱法により測定した。当該標準品を対照として、算出されたCSEの重量平均分子量(Mw)と数平均分子量(Mn)はそれぞれ、14.6kDaと7.7kDaで、分子量分散度(Mw/Mn)は1.8であった。
(2)二糖組成解析
抗原CSEにおける硫酸基の置換位置を確認する二糖分析は、C−ABCにより分解された二糖画分を、ポストカラム微量蛍光二糖分析HPLCシステム(Toypda H,et al.,J.Biol.Chem.(2000)275,2269−2275)を用い定量した。
二糖組成はHPLC(Waters)を用いて分析した。逆相カラム(Senshu Pak DOCOSIL SP100,DC−A151−SP,1 mm ID×15 cm,センシュー科学)を使用し、励起波長 346nm、測定波長 410nmでの蛍光波長を測定した。溶離液は、A)DW(グラジェント),B)0.2M NaCl(グラジェント),C)10 mM Tetra−n−butylammonium hydrogen sulfate 12%(常時),D)50% Acetonitrile 17%(常時)を流速1.1 ml/min(Alliance2695)で流し、0.5% 2−シアノアセトアミド及び0.25M 水酸化ナトリウムを0.7 ml/min(600E)で流した。カラム温度が55℃の条件で展開した。
二糖組成の解析は酵素消化による二糖分析で得られた特定が可能な不飽和二糖の量(ΔDi-0S、ΔDi-4S、ΔDi-6S、ΔDi-2S、ΔDi-(4,6)S、ΔDi-(2,4)S、ΔDi-(2,6)S、ΔDi-(2,4,6)Sのモル%の合計)を100%として、特定の構造を持つ二糖の割合を示したものであり、当該数値は酵素消化前の硫酸化多糖の硫酸化を反映するものである。標準物質は、CSA、CSC、CSD、DS及びHAの酵素分解物を分離、精製した不飽和二糖を用いた(J.Biol.Chem.234,1543−1550 (1968)、Anal. Biochem. 146,327−335 (1985)。
上記手法により算出された二糖組成を次の表1に示す。
上記略語の示す構造は以下の通り表記される。
ΔDi-0S:ΔHexA1-3HexNAc
ΔDi-4S:ΔHexA1-3HexNAc(4S)
ΔDi-6S:ΔHexA1-3HexNAc(6S)
ΔDi-2S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc
ΔDi-(4,6)S:ΔHexA 1-3HexNAc(4S, 6S)
ΔDi-(2,4)S:ΔHexA (2S)1-3HexNAc(4S)
ΔDi-(2,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(6S)
ΔDi-(2,4,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(4S, 6S)
上記のΔHexAは不飽和ウロン酸、HexNAcはN-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。
(参考例3)6−O−脱硫酸化CSE(de6S−CSE)の調製
上記により得られたCSEの6位硫酸基を選択的に脱硫酸化し、de6S−CSEを調製した。以下に工程を記す。プロトンフォームとしたCSEを無水ピリジンで中和し、CSEピリジニウム塩を得た。50mgのCSEピリジニウム塩と[ビス(トリエチルシリル)アセトアミド](BTSA)を無水ピリジン中で60℃、2時間反応させた。反応液に蒸留水を加え反応を停止させてから、透析により塩を除去した。透析後、溶液を30分間煮沸し、室温に戻してから0.5M NaOHでpHを9.5に調整した。再び透析した溶液を凍結乾燥させ、粉体として、40mg回収した。
当該粉体を上記の(1)分子量解析および(2)二糖組成解析に従って分析した。重量平均分子量(Mw)と数平均分子量(Mn)はそれぞれ、12.7 kDaと6.5 kDaで、分子量分散度(Mw/Mn)は1.9であった。二糖組成は、ΔDi-0S 18.0%、ΔDi-4S 82.0%、ΔDi-6S 0%、ΔDi-2S 0%、ΔDi-(4,6)S 0%、ΔDi-(2,4)S 0%、ΔDi-(2,6)S 0%、ΔDi-(2,4,6)S 0%であり、選択的に6位硫酸基が脱硫酸化されたことを確認した。
(参考例4)完全脱硫酸化CSC(deS−CSC)の調製
CSCをメタノール/塩化アセチル中で反応させ、脱硫酸化させる方法 (Thomas G. Kantor, Maxwell Schubert.(1957)J.Am.Chem.Soc. 79,152−153)に従いdeS−CSCを調製した。
CSC粉体を上記の(1)分子量解析及び(2)二糖組成解析に従って分析した。脱硫酸化前のCSCの二糖組成は、ΔDi-0S 1.9%、ΔDi-4S 17.8%、ΔDi-6S 68.2%、ΔDi-2S 0%、ΔDi-(4,6)S 1.3%、ΔDi-(2,4)S 0%、ΔDi-(2,6)S 10.8%、ΔDi-(2,4,6)S 0%であった。上記調製工程を経て、重量平均分子量(Mw)と数平均分子量(Mn)はそれぞれ5.9kDaと3.9kDa、分子量分散度(Mw/Mn)は1.5となった。二糖組成は、ΔDi-0S 91.2%、ΔDi-4S 0%、ΔDi-6S 8.7%、ΔDi-2S 0%、ΔDi-(4,6)S 0%、ΔDi-(2,4)S 0%、ΔDi-(2,6)S 0%、ΔDi-(2,4,6)S 0%となり、脱硫酸化されていることを確認した。
(参考例5)ビオチン標識化GAGの調製
各種GAG(CSE、CSA、CSB、CSC、CSD、deS−CSC、Hep、HS、HPN、KS、HA、de6S−CSE)5 mgを2M NH4Cl溶液 1 mlに溶解した。その溶液にNaCNBH3 50 mgを添加し、70℃で48時間反応させた。更に、NaCNBH3 25 mg加え、70 ℃で48時間反応させた。反応溶液の塩を除去するため、透析膜(MWCO 12000〜14000)で一晩透析した。透析後の溶液を凍結乾燥し、粉体として回収した。
凍結乾燥させた粉体をPBS 450μlに溶解させ、ビオチン溶液(Biotin 10 mg/222 μl in DMF)を50 μl添加し、室温で30分間反応させた。反応後、透析膜(MWCO 12000〜14000)で一晩透析し、その溶液を凍結乾燥し、ビオチン標識化GAG(CSE、CSA、CSB、CSC、CSD、deS−CSC、Hep、HS、HPN、KS、HA、de6S−CSE)の粉体として回収した。
(実施例1)
CSE抗原の調製
(1)CSEテトラブチルアンモニウム塩(以下「CSE-But4+塩」)の調製
参考例1で調製したCSE1.0gを蒸留水50mlに溶解し、Dowex 50W-X8 H+ form(217514-500g,SIGMA)カラム(2.5 cmφ × 6.5 cm)にアプライした。溶出した溶液の酸性画分としてナトリウム塩フリーとなったCSEを回収した。当該集積通過液にテトラブチルアンモニウム(10% in Water)(T0955,東京化成工業)を添加し、pHを酸性から中性に調整した(pH 7.15)。溶液を室温で3日間凍結乾燥して、CSE-But4+塩を乾燥粉末として1.85g回収した。
(2)CSE−PEの調製
CSE-But4+乾燥粉末1.85 g を脱水メタノール25 mlに溶解し、PE(163−161193, Wako)104 mg(150μmol)を添加した。アルゴンガス雰囲気下、50℃で1時間撹拌した後、トリメチルアミンボラン(T1181,東京化成工業)を36mg加え、継続して24時間、50℃で攪拌した。更に、トリメチルアミンボラン 36mgを24時間おきに2回に分けて添加し、50℃で反応させ、CSE−PE反応溶液を得た。
(3)CSE−PEの精製
上記(2)記載の反応溶液を減圧濃縮後、メタノールを加え減圧濃縮を繰り返し、トリメチルアミンボランをメタノールとの共沸で除去した。その残渣に0.2M 酢酸ナトリウム40 mlを加え、室温で2時間撹拌した後、遠心分離(6000 rpm、30分間)により不溶物を除去した。その上清に酢酸ナトリウム飽和エタノールを3倍量(120ml)加えて目的物を沈殿させた。生成した沈殿を蒸留水に溶解し凍結乾燥により、0.83gの粉体を回収した。
0.8gの粉体のうち0.7gを水25 mlおよびメタノール25 mlに溶解させ、セルファインブチル(19905,JNC)ゲルを20g添加し、懸濁液を撹拌しながら、1 M NaCl 10 mlを滴下し、4℃で2時間撹拌した。そして、懸濁液をカラム(2.5 cmφ × 25 cm)に充填した。
カラムの溶液を抜き、0.2 M NaCl 200 mlで洗浄した後、蒸留水50 ml及び30%(v/v) メタノール−蒸留水混液200 mlで溶出した(メタノール溶出画分)。メタノール溶出画分を減圧濃縮で乾固し蒸留水で再溶解した後、MWCO 12000〜14000の透析膜で流水透析後に凍結乾燥により粉体を回収した。回収したCSE−PEの粉体の重量は、50mgであった。
(実施例2)
CSEに反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの取得
(1)免疫用抗原の調製
実施例1で調製したCSE−PEを最終濃度2 mg/mlとなるようPBSに溶解させ、超音波処理後、最終濃度0.1 mg/mlとして、37℃に加温した。これに酸処理したSalmonella minnesota菌体膜をPBSで予め1 mg/mlに懸濁した溶液を1136μl加え、37℃、10分間静置させた。この混合溶液を200μl に分注し、−20℃に保存した。
(2)マウス免疫
上記(1)で作製した分注液を0、4、7、11、21、25日目にC3H/HeNマウス3匹(6週齢)に200μlずつ尾静注より注入した。また、抗体価をELISAにより確認するため、29日目に眼底採血をし、これを4℃、一晩静置後、5000 rpm、10分間遠心した後、血清を回収し、−80℃で保存した。
(3)ELISA法による抗体反応測定
実施例1で調製したCSE−PEを70% EtOHで2.5μg/50 μlに溶解し、F底96穴マイクロタイタープレート(3355,サーモフィッシャーサイエンティフィック)に該溶液を50μl/well加えた。
減圧乾燥下で溶液を蒸発させ固相化後、ブロッキング溶液として1% human serum albumin−PBS を200 μl/wellとなるように加え、室温で1時間放置した。ブロッキング溶液を除去後、PBS 200 μl/wellで1回洗浄した。
PBSで希釈した、上記(1)で作製したマウス血清を50 μl/well加え、室温にて1時間反応させた。血清を除去し、PBS 200 μl/wellで3回洗浄した。2次抗体として、1% human serum albumin−PBSで2000倍に希釈したHorse−radish peroxidase 標識goat anti−mouse IgG+IgMを50 μl/wellとなるように加え、室温で1時間反応させた。2次抗体溶液を除去後、PBS 200 μl/wellで3回洗浄した。
発色及び測定は、発色溶液[80 mM クエン酸−リン酸緩衝液(pH 5.6)5 mlにo−Phenylenediamine 2mgを溶解させた後、30% 過酸化水素水2 μlを加えて調製した溶液]を100 μl/well添加した。遮光放置して発色が見られたところで1 N HCl 溶液100 μl/wellで発色を停止させた。測定波長λ1=492 nm、対照波長λ2=630 nmに設定したマイクロプレートリーダー(SK603)で吸光度を測定した。
3匹のマウスの血清が、濃度依存的にCSE−PEに反応したため、抗原により免疫されたことを確認した。
(4)マウス骨髄腫細胞由来PAI細胞の培養
PAI細胞(JCRB細胞バンク,JCRB0113)を10% FBS−RPMI [培地終濃度10% FBS,1% PSG,10mM HEPES,1 mM sodium pyruvate含有]で37℃、5%CO2存在下において培養した。
(5)マウス脾臓細胞の調製
免疫開始後32日目(最終免疫7日後)のマウスから脾臓を無菌的に取り出し、10%FBS−RPMI培地を入れたシャーレ上で脾臓をほぐした。これを1300 rpm、5分間遠心後、10%FBS−RPMI培地で再懸濁し、懸濁液中の組織をセレストレーナーで取り除いた。1300 rpm、5分間遠心した沈殿を10% FBS−RPMI培地20 mlで再懸濁し、脾臓細胞を回収した。
(6)ハイブリドーマの作製
上記で調製したPAI細胞と脾臓細胞をPAI細胞:脾臓細胞=1:5 cell/cellの比率で混合し、ポリエチレングリコール#4000にて融合させた。細胞融合の培養にはHATサプリメント(Gibco)を100倍希釈で加えた10%FBS−RPMI培地を使用した。HAT耐性コロニーの出現が観察できるまで、マウス1匹あたり2枚の96ウェルプレートで10〜14日間培養した。
培養上清が陽性であり、増殖が速いコロニーは、ウェル面積を変更し、6ウェルプレートで培養させた。6ウェルプレートまでに、4回のスクリーニング試験を実施して、抗体価を測定した。
(7)クローニング
前述(6)で培養上清が陽性であった細胞を限界希釈法によりクローニング操作した。クローニング操作では、クローニングメディウムCM−B(410022517,エーディア)を使用した。細胞数をそれぞれ1個/well(5.0 cells/ml)、0.5個/well(2.5 cells/ml)となるように希釈し、96穴マイクロプレートに播種し、1クローンあたり2枚の96穴プレートで10〜14日間培養した。前述(5)と同様に、4回のスクリーニング試験を経て陽性であったクローンを選択した。
続いて、一次クローニングで得られたクローンを用い、2回目のクローニング操作を実施した。上述と同様の操作で、陽性であったクローンを選択した。
(8)ハイブリドーマの選択
前述(7)で選択したクローンのCSEに対する特異性を評価し、2つのクローンを得た。この2つのクローン名をそれぞれE−12C、E−18Hとした。上記のハイブリドーマクローンは、2014年2月26日(寄託日)、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)に寄託し、それぞれ受託番号NITE P−01809、NITE P−01808が付与された。また、平成27年2月17日付で、国際寄託に移管されている(受領番号NITE ABP−01809、NITE ABP−01808)。
(実施例3)
モノクローナル抗体の特徴
(1)モノクローナル抗体の生産
目的のCSEに反応するモノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマを培養し、その培養液から遠心分離により細胞を除去し取得した(培養上清)。ハイブリドーマE−12CよりE−12C抗体、ハイブリドーマE−18HよりE−18H抗体をそれぞれ取得した。
(2)各種GAGによるELISA試験
E−12C抗体及びE−18H抗体について、各種GAG(CSE、CSA、CSB、CSC、CSD、deS−CSC、Hep、HS、HPN、KS、HA、de6S−CSE)に対する反応性をビオチン標識化GAG固相化プレートによるELISA法で検討した。CSEはイカ由来、CSAはクジラ由来、CSBはブタ由来、CSCはサメ由来、CSDはサメ由来、Hepはウシ由来、HSはブタ由来、HPNはE.coli K5株由来、KSはサメ由来、HAは鶏由来のものを使用した。以下の表2に使用した各種GAGの分子量、分散値及び硫黄含量を示す。
ストレプトアビジンコートプレートであるBioBind ストリップアセンブリ (95029 293,サーモフィッシャーサイエンティフィック)にPBSで希釈した各種ビオチン標識化GAG 1 μg/mlを加え、室温で1時間放置することで固相化した。同様に、同濃度のBiotin溶液とPBSを各々50 μl/wellとなるようにプレートに加え、陰性対照及びブランクとした。
固相化に用いた溶液を除去後、ブロッキング溶液として1% human serum albumin−PBSを200 μl/wellとなるように加え、室温で1時間放置した。ブロッキング溶液を除去後、PBS 200 μl/wellで1回洗浄し、培養上清を50 μl/well加え、室温にて1時間反応させた。以降の二次抗体からの工程は実施例2(3)に記載の ELISA法による抗体反応測定と同様の方法で吸光度を測定した(図1)。得られた吸光度の値から、抗体のCSEに対する反応性(吸光度の値)を100%とし、抗体と各固相化物質との相対的な反応性(%)を算出した。結果を次の表3に示す。
CSEと、E−12C抗体及びE−18H抗体との反応性から陰性対照を差し引いた値はいずれも98%以上であり、E−12C抗体及びE−18H抗体がいずれも強力にCSEと反応することが示された。
CSE以外のGAG(CSA、CSB、CSC、CSD、Hep、HS、HPN、KS、HA、deS−CSC、de6S−CSE)に対する吸光度はPBSやBiotinを固相化したブランク及び陰性対照の吸光度と同程度であった(図1)。CSE以外のGAGと抗体の反応性から、陰性対照を差し引くと、いずれも0.5%未満であった。これにより、E−12C抗体とE−18H抗体は、共にCSE以外のGAGとは反応せず、CSEと特異的に反応することが示された。
(実施例4)
抗体のサブタイプの測定
IsoQuick(TM)マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定キット(ISOQ5,シグマ)およびIsoQuick(TM)マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定用ストリップ(i9410−25EA,シグマ)を用い、E−12C抗体及びE−18H抗体のサブタイプを判定した。
実施例3(1)より得られるE−12C抗体及びE−18H抗体(培養上清)にIsoQuick kitの先端を5分間浸し、バンドが確認できたところで終了した。出現したバンドの位置から抗体が属するタイプを判定した。その結果、E−12C抗体及びE−18H抗体は共にIgMの単一バンドであり、L鎖はκ鎖であった。
(実施例5)
CSE検出キットの作製
以下の構成からなるCSE検出キットを作製した。
1.実施例3(1)より得られるモノクローナル抗体
2.2次抗体(Horse−radish peroxidase 標識goat anti−mouse IgG+IgM)
3.用時調製 発色溶液セット(80 mM クエン酸−リン酸緩衝液(pH 5.6)、o−Phenylenediamine 、30% 過酸化水素水)
4.反応停止液(1 N HCl)
(実施例6)
硫酸化CSA及び硫酸化CSBに対するE−12C抗体及びE−18H抗体の反応性
(1)硫酸化CSA及び硫酸化CSBの調製
CSA100mgを蒸留水50mlに溶解し、陽イオン交換樹脂ダイヤイオン(PK220、三菱化学)(2.5 cmφ × 6.5 cm)にアプライした。溶出した溶液の酸性画分としてナトリウム塩フリーとなったCSAを回収した。当該集積通過液にテトラブチルアミン(TBA)を添加し、pHを酸性から中性に調整した。溶液を室温で凍結乾燥して、CSA−TBA塩を得た。
当該CSA−TBA塩をホルムアミド/ジメチルホルムアミドを1:4で混合させた溶媒に溶解させ、硫酸化剤である三酸化硫黄ピリジンコンプレックスを添加した。硫酸化剤の添加量は、二糖ユニット当たり8当量となるよう添加した。硫酸化反応後の溶液に、蒸留水を添加し反応を停止させ、水酸化ナトリウムで中和させた。この溶液をMWCO12000から14000の透析膜で一晩透析させた後に、凍結乾燥により160mgの硫酸化CSAを得た。このようにしてCSAのGalNAcの6位に硫酸基を導入することで硫酸化CSAを調製することが可能である(Carbohydr.Res.158,183−190(1986))。CSBも同様に硫酸化させ、160mgの硫酸化CSBを得た。
(2)硫酸化CSA及び硫酸化CSBの分子量および二糖組成の解析
解析は「(参考例2)の(1)分子量解析、(2)二糖組成解析」に記載の方法で実施した。結果を表4に示す。表中では、硫酸化剤を8当量添加した硫酸化CSAをCSA−8S、同様に硫酸化剤を8当量添加した硫酸化CSBをCSB−8Sとしている。
上記略語の示す構造は以下の通り表記される。
ΔDi-0S:ΔHexA1-3HexNAc
ΔDi-4S:ΔHexA1-3HexNAc(4S)
ΔDi-6S:ΔHexA1-3HexNAc(6S)
ΔDi-2S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc
ΔDi-(4,6)S:ΔHexA 1-3HexNAc(4S, 6S)
ΔDi-(2,4)S:ΔHexA (2S)1-3HexNAc(4S)
ΔDi-(2,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(6S)
ΔDi-(2,4,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(4S, 6S)
上記のΔHexAは不飽和ウロン酸、HexNAcはN-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。
基本二糖単位が[GlcAβ1−3GalNAc(4S)]であるCSAの6位が硫酸化されたCSA−8SのΔDi-(4,6)S構造の含有率は59.4%であった。これにより、CSEの基本二糖単位[GlcAβ1−3GalNAc(4S, 6S)](以下、E構造ともいう)を主に含有する硫酸化CSAが調製されたことを確認した。また、基本二糖単位が[IdoAβ1−3GalNAc(4S)]であるCSBの6位が硫酸化されたCSB−8SのΔDi-(4,6)S構造の含有率は66.0%であった。これにより、基本二糖単位[IdoAβ1−3GalNAc(4S, 6S)]を主に含有する硫酸化CSBが調製されたことを確認した。
上記で調製した硫酸化CSA及び硫酸化CSBを「参考例5のビオチン標識化GAGの調製」に記載の方法によりビオチン化し、ビオチン化硫酸化CSA及びビオチン化硫酸化CSBを調製した。
E−12C抗体及びE−18H抗体の硫酸化CSAと硫酸化CSBに対する反応性をELISAにより評価するため、「実施例3のモノクローナル抗体の特徴」に記載の方法に従い試験した。結果を表5及び図2に示す。
硫酸化CSAと、E−12C抗体及びE−18H抗体との反応性から陰性対照を差し引いた値はいずれも96%以上であり、その反応性はCSEとほぼ同等であった。E−12C抗体及びE−18H抗体はいずれも強力に硫酸化CSAと反応した。
E−12C抗体及びE−18H抗体は、イカ由来のCSEのみではなく、CSAより化学的に合成されたCSE(硫酸化CSA)にも反応することが確認された。
CSA、CSB、硫酸化CSBの吸光度はブランク及び陰性対照の吸光度と同程度であった。これにより、E−12C抗体及びE−18H抗体は、CSA、CSB、硫酸化CSBには反応しないことが確認された。
(実施例7)
表面プラズモン共鳴法による相互作用解析
(1)アミンカップリング法によるリガンドGAGの固定化
センサーチップCM5表面にコーティングされている直鎖デキストランには負に帯電したカルボキシル基が導入されている。カルボキシル基をNHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)により活性化し、pH5.5の10mM酢酸緩衝液に溶解させた50μg/mlのストレプトアビジンを固定化した。固定化後に残った活性NHS基をエタノールアミンによりブロッキングした。ブロッキング後、50RU(レゾナンスユニット)以上の固定化量が得られるようリガンドとなるビオチン化GAGを添加した。リファレンスセルも同様にビオチンを固定化させネガティブコントロールセルとした。ランニング緩衝液としてPBSを流速10μl/minで流し、温度25℃の条件で実施した。
(2)相互作用測定
0.22μmフィルターで透過させたE−12C抗体及びE−18H抗体の培養上清をアナライトとして、相互作用解析した。抗体培養上清はPBSにより希釈して、IgM濃度として2nMとなるように調製した。流速20μl/minで注入し、リガンドと相互作用させた。リファレンスセルのレスポンスを差し引いたセンサーグラムを表示させ、レスポンスがない場合は検出されないもの(ND)とした。解析可能なレスポンスが得られた場合は、1:1binding modelにより、結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)の値から解離定数(KD)値を算出した。KD値は、kd/kaにより求めることができる。
(3)分子量の異なるCSEの調製
分子量の異なるCSEは、酵素処理、カラムクロマトグラフィ法により調製することができる(J.Biol.Chem.236,983−987 (1961)、J.Biol.Chem.252,4570−4576(1977))。当該文献を参考に分子量が異なる5種類のCSEを調製した。
調製した5種類の分子量が異なるCSEについて解析した。解析は「参考例2(1)分子量解析、(2)二糖組成解析」に記載の方法で実施した。結果を表6に示す。
上記略語の示す構造は以下の通り表記される。
ΔDi-0S:ΔHexA1-3HexNAc
ΔDi-4S:ΔHexA1-3HexNAc(4S)
ΔDi-6S:ΔHexA1-3HexNAc(6S)
ΔDi-2S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc
ΔDi-(4,6):ΔHexA 1-3HexNAc(4S, 6S)
ΔDi-(2,4):ΔHexA (2S)1-3HexNAc(4S)
ΔDi-(2,6):ΔHexA(2S)1-3HexNAc(6S)
ΔDi-(2,4,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(4S, 6S)
上記のΔHexAは不飽和ウロン酸、HexNAcはN-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。
重量平均分子量(Mw)が68.0kDa、E構造含有率が61.4%のCSEをCSE−68Kとした。重量平均分子量(Mw)が56.7kDa、E構造含有率が61.0%のCSEをCSE−56Kとした。重量平均分子量(Mw)が24.1kDa、E構造含有率が63.0%のCSEをCSE−24Kとした。重量平均分子量(Mw)が14.6kDa、E構造含有率が70.4%のCSEをCSE−14Kとした。このCSE−14Kは抗体作製の免疫抗原に使用したものと同一である。重量平均分子量(Mw)が8.7kDa、E構造含有率が66.7%のCSEをCSE−8Kとした。これら上記5種類のCSEを使用した。
(4)分子量の異なるCSEに対する相互作用解析
上記表6に記載の5種類のCSEとde6S−CSEをセンサーチップに固定化させて相互作用解析した。試験は、「実施例7の(1)アミンカップリング法によるリガンドの固定化、(2)相互作用測定」に記載の方法で実施した。結果を表7に示す。
CSE−14KとE−12C抗体及びE−18H抗体とのKD値はそれぞれ3.6×10-10(M)、2.5×10-10(M)となり、抗原抗体反応として強い相互作用を示した。E−12C抗体及びE−18H抗体と抗原CSEの6位を選択的に脱硫酸化したde6S−CSEとの反応性は検出されなかった(ND)。
E−12C抗体とCSE−68KとのKD値は1.7×10-11(M)、CSE−56Kでは3.4×10-11(M)、CSE−24Kでは2.3×10-10(M)、CSE−14Kでは3.6×10-10(M)、CSE−8Kでは3.7×10-10(M)となった。E−18H抗体とCSE−68KとのKD値は1.5×10-11(M)、CSE−56Kでは2.5×10-11(M)、CSE−24Kでは1.2×10-10(M)、CSE−14Kでは2.6×10-10(M)、CSE−8Kでは2.9×10-10(M)となった。いずれのKD値も1×10-9(M)以下であり、強力な相互作用を示すことが確認された。
(5)E構造含有率の異なる硫酸化CSAに対する相互作用解析
CSA−TBA塩に対して硫酸化剤である三酸化硫黄ピリジンコンプレックスを2、4、6当量添加して反応させた。以降の工程は実施例6(1)硫酸化CSA及びCSBの調製に記載の方法に従い調製した。調製された硫酸化CSAの分子量および二糖組成解析を参考例2(1)分子量解析、(2)二糖組成解析に記載の方法で実施した。結果を表8に示す。
上記略語の示す構造は以下の通り表記される。
ΔDi-0S:ΔHexA1-3HexNAc
ΔDi-4S:ΔHexA1-3HexNAc(4S)
ΔDi-6S:ΔHexA1-3HexNAc(6S)
ΔDi-2S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc
ΔDi-(4,6):ΔHexA 1-3HexNAc(4S, 6S)
ΔDi-(2,4):ΔHexA (2S)1-3HexNAc(4S)
ΔDi-(2,6):ΔHexA(2S)1-3HexNAc(6S)
ΔDi-(2,4,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(4S, 6S)
上記のΔHexAは不飽和ウロン酸、HexNAcはN-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。
硫酸化剤である三酸化硫黄ピリジンコンプレックスを2当量添加して調製した生成物をCSA−2S、4当量添加して調製した生成物をCSA−4S、6当量添加して調製した生成物をCSA−6Sと表記した。CSA−2SのE構造含有率は14.1%、CSA−4SのE構造含有率は32.7%、CSA−6SのE構造含有率は45.9%となり、添加した硫酸化剤の当量に応じて、E構造が生成された。「実施例6の表4」に記載したCSA、CSA−8S、CSB、CSB−8Sの結果を合わせて、表9に表記した。
E−12C抗体とCSA及びCSA−2Sとの反応性は検出されなかった。E−12C抗体とCSA−4SとのKD値は1.0×10-8(M)、CSA−6Sでは3.5×10-9(M)、CSA−8Sでは7.8×10-10(M)となった。E−18H抗体とCSA及びCSA−2Sとの反応性は検出されなかった。E−18H抗体とCSA−4SとのKD値は9.4×10-9(M)、CSA−6Sでは1.8×10-9(M)、CSA−8Sでは4.3×10-10(M)となった。
E−12C抗体及びE−18H抗体のCSB、硫酸化CSBに対する反応性は検出されなかった。
(実施例8)
抗CSE抗体の組織染色性を以下の通り検討した。
(1)凍結切片における免疫組織染色
イカ軟骨を小片化し、ティシュー・テックO.C.T.コンパウンド(サクラファインテックジャパン株式会社)に組織片を埋め、液体窒素で凍らせて凍結切片を作製した。
作製した切片を、10%中性緩衝ホルマリン液により室温で10分間固定後、50mmol/Lトリス塩酸緩衝液で2回洗浄した。
0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、0.3%過酸化水素加メタノールでブロッキングを室温で10分間行った。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、0.1%カゼイン溶液(和光純薬工業株式会社)でブロッキングを室温で60分間行った。
0.1%カゼイン溶液で12μg/mlに希釈した抗CSE抗体(E−12C又はE−18H)を37℃で60分間反応させた。この際、陰性対照として、mouse IgM(シグマ)を使用した。
0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄後、ビオチン標識抗マウスIgG+IgA+IgM抗体(ヒストファイン SAB−PO(M)キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス)を室温にて10分間反応させた。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(ヒストファイン SAB−PO(M)キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス)を室温にて5分間反応させた。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄後し、50mmol/Lトリス塩酸緩衝液に5分間浸漬した後、5分間DAB(同仁化学研究所)で発色させた。超純水で洗浄後、常法に従い、脱水、透徹操作を行い、封入した。
得られた染色像を図3に示す。E−12C抗体及びE−18H抗体いずれでも染色が見られた。陰性対照として用いたmouse IgMでは染色は見られなかった。
(2)パラフィン切片における免疫組織染色
イカ軟骨を小片化し、10%中性緩衝ホルマリン液に固定後、パラフィン包埋し、パラフィン切片を作製した。
作製した切片を、脱パラフィン処理(キシレン) 、親水化処理 (アルコール下降系列:99.9%、95%、80%、70%エタノール)した後、50mmol/Lトリス塩酸緩衝液で2回洗浄した。
0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、0.3%過酸化水素加メタノールでブロッキングを室温で10分間行った。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、アビジン溶液(ヒストファイン 内因性アビジン・ビオチンブロッキングキット、株式会社ニチレイバイオサイエンス)でブロッキングを室温で10分間行った。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、ビオチン溶液(ヒストファイン 内因性アビジン・ビオチンブロッキングキット、株式会社ニチレイバイオサイエンス)でブロッキングを室温で10分間行った。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、0.1%カゼイン溶液(和光純薬工業株式会社)でブロッキングを室温で60分間行った。
0.1%カゼイン溶液で12μg/mlに希釈した抗CSE抗体(E−12C又はE−18H)を37℃で60分間反応させた。この際、陰性対照として、mouse IgM(シグマ)を使用した。
0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄後、ビオチン標識抗マウスIgG+IgA+IgM抗体を室温にて10分間反応させた。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを室温にて5分間反応させた。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄後し、50mmol/Lトリス塩酸緩衝液に5分間浸漬した後、5分間DAB(同仁化学研究所)で発色させた。超純水で洗浄後、常法に従い、脱水、透徹操作を行い、封入した。
得られた染色像を図4に示す。E−12C抗体及びE−18H抗体のいずれでも染色が見られた。陰性対照として用いたmouse IgMでは染色は見られなかった。
(3)C−ABC処理した凍結切片の免疫組織染色
C−ABC処理し、CSE等のコンドロイチン硫酸が除去された組織の染色性を検討した。
イカ軟骨を小片化し、ティシュー・テックO.C.T.コンパウンド(サクラファインテックジャパン株式会社)に組織片を埋め、液体窒素で凍らせて凍結切片を作成した。
作製した切片を、10%中性緩衝ホルマリン液により室温で10分間固定後 、50mmol/Lトリス塩酸緩衝液で2回洗浄し、その後50mmol/Lトリス塩酸緩衝液で250mU/mlに希釈したC−ABCで37℃にて120〜180分間消化した。C−ABC未処理の対照切片は、50mmol/Lトリス塩酸緩衝液で37℃にて120〜180分間浸漬させた。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、0.3%過酸化水素加メタノールでブロッキングを室温にて10分間行った。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、0.1%カゼイン溶液(和光純薬工業株式会社)でブロッキングを室温にて60分間行った。
0.1%カゼイン溶液で12μg/mlに希釈した抗CSE抗体(E−12C)を37℃で60分間反応させた。この際、陰性対照として、mouse IgM(シグマ)を使用した。
0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄後、ビオチン標識抗マウスIgG+IgA+IgM抗体(ヒストファイン SAB−PO(M)キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス)を室温にて10分間反応させた。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(ヒストファイン SAB−PO(M)キット、株式会社ニチレイバイオサイエンス)を室温にて5分間反応させた。0.01mol/Lリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄後し、50mmol/Lトリス塩酸緩衝液に5分間浸漬した後、5分間DAB(同仁化学研究所)で発色させた。超純水で洗浄後、常法に従い、脱水、透徹操作を行い、封入した。
得られた染色像を図5に示す。C−ABC未処理の切片は染色が見られたが、C−ABC処理した切片では、染色性は完全に消失した。なお、E−18H抗体についても同様の結果が得られた。
日本特許出願2014−072431号(出願日:2014年3月31日)及び日本特許出願2014−162968号(出願日;2014年8月8日)の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (7)

  1. コンドロイチン硫酸Eに反応し、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸Bコンドロイチン硫酸D、コンドロイチン硫酸C、完全脱硫酸化コンドロイチン硫酸C、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパロサン、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸及び6−O−脱硫酸化コンドロイチン硫酸E及び硫酸化コンドロイチン硫酸Bのいずれにも反応しない抗体であって、
    当該「反応しない」とは、コンドロイチン硫酸Eに対する反応性を100%とした場合に、抗原と抗体の反応性と陰性対照又はブランクとの差が0.5%未満であることをいう、抗体
  2. モノクローナル抗体である、請求項1記載の抗体。
  3. 番号がNITE P−01808又はNITE P−01809であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
  4. 請求項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  5. 番号がNITE P−01808又はNITE P−01809であるハイブリドーマ。
  6. 請求項1〜のいずれか1項に記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するコンドロイチン硫酸Eの検出方法。
  7. 請求項1〜のいずれか1項に記載の抗体を少なくとも含む、コンドロイチン硫酸Eの検出キット。
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