JP6659024B2 - 抗コンドロイチン硫酸e抗体 - Google Patents
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Description
CSA:コンドロイチン硫酸A
CSB:コンドロイチン硫酸B
CSC:コンドロイチン硫酸C
CSD:コンドロイチン硫酸D
CSE:コンドロイチン硫酸E
DS:デルマタン硫酸
Hep:ヘパリン
HS:ヘパラン硫酸
HPN:ヘパロサン
KS:ケラタン硫酸
HA:ヒアルロン酸
deS−CSC:完全脱硫酸化コンドロイチン硫酸C
de6S−CSE:6−O−脱硫酸化コンドロイチン硫酸E
CS:コンドロイチン硫酸
GAG:グリコサミノグリカン
GlcA:グルクロン酸
IdoA:イズロン酸
GalNAc: N−アセチルガラクトサミン
PE:ジパルミトイル−L−(α−ホスファチジル)エタノールアミン
C−ABC:コンドロイチナーゼABC
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
CSE−PE:ジパルミトイル−L−(α−ホスファチジル)エタノールアミン結合コンドロイチン硫酸E
本発明者は鋭意検討の結果、得られた抗体がCSEに反応し、CSA、CSB及びCSDに反応しないことを見出し、CSEと特異的に反応する抗CSE抗体を発明するに至った。
(1)コンドロイチン硫酸Eに反応し、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸B及びコンドロイチン硫酸Dに反応しない抗体。
(2)コンドロイチン硫酸C、完全脱硫酸化コンドロイチン硫酸C、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパロサン、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸及び6−O−脱硫酸化コンドロイチン硫酸Eのいずれにも反応しない、(1)に記載の抗体。
(3)硫酸化コンドロイチン硫酸Bに反応しない、(1)又は(2)に記載の抗体。
(4)脂質とコンドロイチン硫酸Eとが結合してなる物質を抗原として免疫することによって得られる(1)〜(3)のいずれかに記載の抗体。
(5)脂質がジパルミトイル−L−(α−ホスファチジル)エタノールアミンである、(4)に記載の抗体。
(6)モノクローナル抗体である、(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体。
(7)受領番号がNITE ABP−01808又はNITE ABP−01809であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
(8)(6)に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
(9)脂質とコンドロイチン硫酸Eとが結合してなる物質を抗原として免疫した動物由来の抗体産生細胞と腫瘍細胞との細胞融合により形成される(8)に記載のハイブリドーマ。
(10)脂質がジパルミトイル−L−(α−ホスファチジル)エタノールアミンである、(9)に記載のハイブリドーマ。
(11)受領番号がNITE ABP−01808又はNITE ABP−01809であるハイブリドーマ。
(12)(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するコンドロイチン硫酸Eの検出方法。
(13)(1)〜(7)のいずれかに記載の抗体を少なくとも含む、コンドロイチン硫酸Eの検出キット。
(14) 脂質とコンドロイチン硫酸Eとが結合してなる物質を抗原として免疫する工程を少なくとも含むことを特徴とする、コンドロイチン硫酸Eに反応し、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸B及びコンドロイチン硫酸Dに反応しない抗体の製造方法。
(15) 脂質がジパルミトイル−L−(α−ホスファチジル)エタノールアミンである、(14)に記載の製造方法。
本発明はCSEに反応し、CSA、CSB及びCSDに反応しない抗体を提供する。
ここで、硫酸化CSBとは、後述する実施例6(1)に記載の方法により得られたものを指す。
1.抗原の調製
2.免疫方法
3.ポリクローナル抗体の取得
4.モノクローナル抗体の取得
5.ハイブリドーマの作製
6.ハイブリドーマの選択とクローニング
本発明の抗体は、例えば、CSEの抗原性を高めるために、脂質とCSEとが結合してなる物質を抗原として抗体を産生しうる動物を免疫することにより得ることができる。CSEは特に限定されないが、イカ由来であるものが好ましい。脂質は、CSEと結合するものであれば特に限定されないが、リン脂質が好ましく、PEであることがさらに好ましい。脂質とCSEとの結合は特に限定されないが、化学的な結合であることが好ましく、共有結合であることがより好ましく、アミノアルキル結合であることがさらに好ましい。CSEとPEの結合に用いることができるGAGとPEの結合方法は、特開平4−80201に記載の還元末端をラクトン化する方法、特開平4−80202に記載の還元末端の限定酸化方法、特開2003−335801に記載のGAG−テトラブチルアンモニウム(GAG−But4N+)塩の中間体を経た調製方法等が挙げられる。
免疫される動物は、CSEに反応する抗体を産生しうる動物であれば特に限定されないが、ブタ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、ラット、マウス等の動物であることが好ましく、マウスであることが好ましい。
免疫のアジュバントは、特に使用しなくてもよいが、使用する場合は、ミョウバン、グラム陽性菌、グラム陰性菌、核酸等、アジュバント効果が期待されるものが好ましく、サルモネラ菌体膜がより好ましい。
免疫は、例えば、抗原とアジュバントを動物に静脈注射することで行うことができる。注射方法は、これに限らず、皮下注射、腹腔内注射でもよい。通常、投与は数回に分けて実施する。
ポリクローナル抗体は、免疫した動物より、血液を採取することで取得することができる。採取した血液中にポリクローナル抗体が存在するか否かは、抗体反応を指標に評価することができる。抗体反応の測定方法としては、ELISA法、RIA法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロット法等が挙げられる。ポリクローナル抗体は採取された血液そのものでもよく、遠心分離によって得られる血清でもよく、精製されたものでもよい。抗体の精製は、塩析、イオン交換、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的手法を適宜組み合わせることにより達成することができる。
モノクローナル抗体を取得する方法としては、得られたハイブリドーマを、in vitroあるいはin vivoで培養する方法が挙げられ、目的に応じて選択できる。in vitroの場合、ハイブリドーマを培養した際の細胞培養液を回収することで得られ、in vivoの場合、ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から得ることができる。
モノクローナル抗体は、細胞培養液や腹水をそのまま使用してもよく、遠心分離し細胞等を除いたものを使用してもよく、精製したものを使用してもよい。
抗体の精製は、塩析、イオン交換、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的手法を適宜組み合わせることにより達成することができる。
E−12C抗体およびE−18H抗体は、CSEに反応し、他の各種GAG(CSA、CSB、CSC、CSD、deS−CSC、Hep、HS、HPN、KS、HA、de6S−CSE、硫酸化CSB)には反応しない特徴を有する。
ハイブリドーマは免疫した動物から、リンパ節又は脾臓を摘出することで得られる抗体産生細胞と腫瘍細胞とを細胞融合することにより作製される。抗体産生細胞はリンパ球が好ましい。腫瘍細胞はミエローマ細胞が好ましく、由来は哺乳動物由来が好ましく、マウス由来がより好ましい。
ハイブリドーマの選択は、例えば、ハイブリドーマの増殖速度と抗体反応を指標に行うことができる。抗体反応の測定方法としては、ELISA法、RIA法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。
上記の「試料」とは、CSEを含むか、含む可能性を有する試料であれば特に限定されないが、試料の由来となるものとしては、例えば、尿、血液、血漿、血清、関節液、髄液等の体液、分泌物、動物細胞若しくは植物細胞等の細胞、組織、臓器、又は細胞若しくは微生物の培養物等が例示される。
CSEは、イカ軟骨よりプロテアーゼ処理、アルコール沈殿を経て抽出され(J.Biochem.60,317−321(1966))、酵素処理、カラムクロマトグラフィ法により調製することができる(J.Biol.Chem.236,983−987 (1961)、J.Biol.Chem.252,4570−4576(1977))。
(1)分子量解析
抗原CSEの分子量は、CSEの0.2%溶液50μlをHPLC (HLC−8220GPC, 東ソー)によるゲルろ過で分析した。ゲルろ過カラムは、TSKgel PWXLG4000(0008020, 7.8mm I.D.×30cm, 東ソー)、TSKgel PWXLG3000(0008021, 7.8mm I.D.×30cm, 東ソー)、TSKgel PWXLG 2500(0008022, 7.8mm I.D.×30cm, 東ソー)を連結させて用いた。移動相に0.2M NaClを使用して、カラム温度 40℃、流速 0.6 ml/minの条件で展開した。CSEの検出には示唆屈折計を用いた。平均分子量はCSの分子量標準品を対照にして求めた。尚、標準CSの分子量は光散乱法により測定した。当該標準品を対照として、算出されたCSEの重量平均分子量(Mw)と数平均分子量(Mn)はそれぞれ、14.6kDaと7.7kDaで、分子量分散度(Mw/Mn)は1.8であった。
抗原CSEにおける硫酸基の置換位置を確認する二糖分析は、C−ABCにより分解された二糖画分を、ポストカラム微量蛍光二糖分析HPLCシステム(Toypda H,et al.,J.Biol.Chem.(2000)275,2269−2275)を用い定量した。
上記手法により算出された二糖組成を次の表1に示す。
ΔDi-0S:ΔHexA1-3HexNAc
ΔDi-4S:ΔHexA1-3HexNAc(4S)
ΔDi-6S:ΔHexA1-3HexNAc(6S)
ΔDi-2S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc
ΔDi-(4,6)S:ΔHexA 1-3HexNAc(4S, 6S)
ΔDi-(2,4)S:ΔHexA (2S)1-3HexNAc(4S)
ΔDi-(2,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(6S)
ΔDi-(2,4,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(4S, 6S)
上記のΔHexAは不飽和ウロン酸、HexNAcはN-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。
上記により得られたCSEの6位硫酸基を選択的に脱硫酸化し、de6S−CSEを調製した。以下に工程を記す。プロトンフォームとしたCSEを無水ピリジンで中和し、CSEピリジニウム塩を得た。50mgのCSEピリジニウム塩と[ビス(トリエチルシリル)アセトアミド](BTSA)を無水ピリジン中で60℃、2時間反応させた。反応液に蒸留水を加え反応を停止させてから、透析により塩を除去した。透析後、溶液を30分間煮沸し、室温に戻してから0.5M NaOHでpHを9.5に調整した。再び透析した溶液を凍結乾燥させ、粉体として、40mg回収した。
CSCをメタノール/塩化アセチル中で反応させ、脱硫酸化させる方法 (Thomas G. Kantor, Maxwell Schubert.(1957)J.Am.Chem.Soc. 79,152−153)に従いdeS−CSCを調製した。
各種GAG(CSE、CSA、CSB、CSC、CSD、deS−CSC、Hep、HS、HPN、KS、HA、de6S−CSE)5 mgを2M NH4Cl溶液 1 mlに溶解した。その溶液にNaCNBH3 50 mgを添加し、70℃で48時間反応させた。更に、NaCNBH3 25 mg加え、70 ℃で48時間反応させた。反応溶液の塩を除去するため、透析膜(MWCO 12000〜14000)で一晩透析した。透析後の溶液を凍結乾燥し、粉体として回収した。
CSE抗原の調製
(1)CSEテトラブチルアンモニウム塩(以下「CSE-But4N+塩」)の調製
参考例1で調製したCSE1.0gを蒸留水50mlに溶解し、Dowex 50W-X8 H+ form(217514-500g,SIGMA)カラム(2.5 cmφ × 6.5 cm)にアプライした。溶出した溶液の酸性画分としてナトリウム塩フリーとなったCSEを回収した。当該集積通過液にテトラブチルアンモニウム(10% in Water)(T0955,東京化成工業)を添加し、pHを酸性から中性に調整した(pH 7.15)。溶液を室温で3日間凍結乾燥して、CSE-But4N+塩を乾燥粉末として1.85g回収した。
CSE-But4N+乾燥粉末1.85 g を脱水メタノール25 mlに溶解し、PE(163−161193, Wako)104 mg(150μmol)を添加した。アルゴンガス雰囲気下、50℃で1時間撹拌した後、トリメチルアミンボラン(T1181,東京化成工業)を36mg加え、継続して24時間、50℃で攪拌した。更に、トリメチルアミンボラン 36mgを24時間おきに2回に分けて添加し、50℃で反応させ、CSE−PE反応溶液を得た。
上記(2)記載の反応溶液を減圧濃縮後、メタノールを加え減圧濃縮を繰り返し、トリメチルアミンボランをメタノールとの共沸で除去した。その残渣に0.2M 酢酸ナトリウム40 mlを加え、室温で2時間撹拌した後、遠心分離(6000 rpm、30分間)により不溶物を除去した。その上清に酢酸ナトリウム飽和エタノールを3倍量(120ml)加えて目的物を沈殿させた。生成した沈殿を蒸留水に溶解し凍結乾燥により、0.83gの粉体を回収した。
CSEに反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの取得
(1)免疫用抗原の調製
実施例1で調製したCSE−PEを最終濃度2 mg/mlとなるようPBSに溶解させ、超音波処理後、最終濃度0.1 mg/mlとして、37℃に加温した。これに酸処理したSalmonella minnesota菌体膜をPBSで予め1 mg/mlに懸濁した溶液を1136μl加え、37℃、10分間静置させた。この混合溶液を200μl に分注し、−20℃に保存した。
上記(1)で作製した分注液を0、4、7、11、21、25日目にC3H/HeNマウス3匹(6週齢)に200μlずつ尾静注より注入した。また、抗体価をELISAにより確認するため、29日目に眼底採血をし、これを4℃、一晩静置後、5000 rpm、10分間遠心した後、血清を回収し、−80℃で保存した。
実施例1で調製したCSE−PEを70% EtOHで2.5μg/50 μlに溶解し、F底96穴マイクロタイタープレート(3355,サーモフィッシャーサイエンティフィック)に該溶液を50μl/well加えた。
PAI細胞(JCRB細胞バンク,JCRB0113)を10% FBS−RPMI [培地終濃度10% FBS,1% PSG,10mM HEPES,1 mM sodium pyruvate含有]で37℃、5%CO2存在下において培養した。
免疫開始後32日目(最終免疫7日後)のマウスから脾臓を無菌的に取り出し、10%FBS−RPMI培地を入れたシャーレ上で脾臓をほぐした。これを1300 rpm、5分間遠心後、10%FBS−RPMI培地で再懸濁し、懸濁液中の組織をセレストレーナーで取り除いた。1300 rpm、5分間遠心した沈殿を10% FBS−RPMI培地20 mlで再懸濁し、脾臓細胞を回収した。
上記で調製したPAI細胞と脾臓細胞をPAI細胞:脾臓細胞=1:5 cell/cellの比率で混合し、ポリエチレングリコール#4000にて融合させた。細胞融合の培養にはHATサプリメント(Gibco)を100倍希釈で加えた10%FBS−RPMI培地を使用した。HAT耐性コロニーの出現が観察できるまで、マウス1匹あたり2枚の96ウェルプレートで10〜14日間培養した。
前述(6)で培養上清が陽性であった細胞を限界希釈法によりクローニング操作した。クローニング操作では、クローニングメディウムCM−B(410022517,エーディア)を使用した。細胞数をそれぞれ1個/well(5.0 cells/ml)、0.5個/well(2.5 cells/ml)となるように希釈し、96穴マイクロプレートに播種し、1クローンあたり2枚の96穴プレートで10〜14日間培養した。前述(5)と同様に、4回のスクリーニング試験を経て陽性であったクローンを選択した。
前述(7)で選択したクローンのCSEに対する特異性を評価し、2つのクローンを得た。この2つのクローン名をそれぞれE−12C、E−18Hとした。上記のハイブリドーマクローンは、2014年2月26日(寄託日)、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NPMD)に寄託し、それぞれ受託番号NITE P−01809、NITE P−01808が付与された。また、平成27年2月17日付で、国際寄託に移管されている(受領番号NITE ABP−01809、NITE ABP−01808)。
モノクローナル抗体の特徴
(1)モノクローナル抗体の生産
目的のCSEに反応するモノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマを培養し、その培養液から遠心分離により細胞を除去し取得した(培養上清)。ハイブリドーマE−12CよりE−12C抗体、ハイブリドーマE−18HよりE−18H抗体をそれぞれ取得した。
E−12C抗体及びE−18H抗体について、各種GAG(CSE、CSA、CSB、CSC、CSD、deS−CSC、Hep、HS、HPN、KS、HA、de6S−CSE)に対する反応性をビオチン標識化GAG固相化プレートによるELISA法で検討した。CSEはイカ由来、CSAはクジラ由来、CSBはブタ由来、CSCはサメ由来、CSDはサメ由来、Hepはウシ由来、HSはブタ由来、HPNはE.coli K5株由来、KSはサメ由来、HAは鶏由来のものを使用した。以下の表2に使用した各種GAGの分子量、分散値及び硫黄含量を示す。
抗体のサブタイプの測定
IsoQuick(TM)マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定キット(ISOQ5,シグマ)およびIsoQuick(TM)マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定用ストリップ(i9410−25EA,シグマ)を用い、E−12C抗体及びE−18H抗体のサブタイプを判定した。
CSE検出キットの作製
以下の構成からなるCSE検出キットを作製した。
1.実施例3(1)より得られるモノクローナル抗体
2.2次抗体(Horse−radish peroxidase 標識goat anti−mouse IgG+IgM)
3.用時調製 発色溶液セット(80 mM クエン酸−リン酸緩衝液(pH 5.6)、o−Phenylenediamine 、30% 過酸化水素水)
4.反応停止液(1 N HCl)
硫酸化CSA及び硫酸化CSBに対するE−12C抗体及びE−18H抗体の反応性
(1)硫酸化CSA及び硫酸化CSBの調製
CSA100mgを蒸留水50mlに溶解し、陽イオン交換樹脂ダイヤイオン(PK220、三菱化学)(2.5 cmφ × 6.5 cm)にアプライした。溶出した溶液の酸性画分としてナトリウム塩フリーとなったCSAを回収した。当該集積通過液にテトラブチルアミン(TBA)を添加し、pHを酸性から中性に調整した。溶液を室温で凍結乾燥して、CSA−TBA塩を得た。
当該CSA−TBA塩をホルムアミド/ジメチルホルムアミドを1:4で混合させた溶媒に溶解させ、硫酸化剤である三酸化硫黄ピリジンコンプレックスを添加した。硫酸化剤の添加量は、二糖ユニット当たり8当量となるよう添加した。硫酸化反応後の溶液に、蒸留水を添加し反応を停止させ、水酸化ナトリウムで中和させた。この溶液をMWCO12000から14000の透析膜で一晩透析させた後に、凍結乾燥により160mgの硫酸化CSAを得た。このようにしてCSAのGalNAcの6位に硫酸基を導入することで硫酸化CSAを調製することが可能である(Carbohydr.Res.158,183−190(1986))。CSBも同様に硫酸化させ、160mgの硫酸化CSBを得た。
解析は「(参考例2)の(1)分子量解析、(2)二糖組成解析」に記載の方法で実施した。結果を表4に示す。表中では、硫酸化剤を8当量添加した硫酸化CSAをCSA−8S、同様に硫酸化剤を8当量添加した硫酸化CSBをCSB−8Sとしている。
ΔDi-0S:ΔHexA1-3HexNAc
ΔDi-4S:ΔHexA1-3HexNAc(4S)
ΔDi-6S:ΔHexA1-3HexNAc(6S)
ΔDi-2S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc
ΔDi-(4,6)S:ΔHexA 1-3HexNAc(4S, 6S)
ΔDi-(2,4)S:ΔHexA (2S)1-3HexNAc(4S)
ΔDi-(2,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(6S)
ΔDi-(2,4,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(4S, 6S)
上記のΔHexAは不飽和ウロン酸、HexNAcはN-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。
表面プラズモン共鳴法による相互作用解析
(1)アミンカップリング法によるリガンドGAGの固定化
センサーチップCM5表面にコーティングされている直鎖デキストランには負に帯電したカルボキシル基が導入されている。カルボキシル基をNHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)により活性化し、pH5.5の10mM酢酸緩衝液に溶解させた50μg/mlのストレプトアビジンを固定化した。固定化後に残った活性NHS基をエタノールアミンによりブロッキングした。ブロッキング後、50RU(レゾナンスユニット)以上の固定化量が得られるようリガンドとなるビオチン化GAGを添加した。リファレンスセルも同様にビオチンを固定化させネガティブコントロールセルとした。ランニング緩衝液としてPBSを流速10μl/minで流し、温度25℃の条件で実施した。
0.22μmフィルターで透過させたE−12C抗体及びE−18H抗体の培養上清をアナライトとして、相互作用解析した。抗体培養上清はPBSにより希釈して、IgM濃度として2nMとなるように調製した。流速20μl/minで注入し、リガンドと相互作用させた。リファレンスセルのレスポンスを差し引いたセンサーグラムを表示させ、レスポンスがない場合は検出されないもの(ND)とした。解析可能なレスポンスが得られた場合は、1:1binding modelにより、結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)の値から解離定数(KD)値を算出した。KD値は、kd/kaにより求めることができる。
分子量の異なるCSEは、酵素処理、カラムクロマトグラフィ法により調製することができる(J.Biol.Chem.236,983−987 (1961)、J.Biol.Chem.252,4570−4576(1977))。当該文献を参考に分子量が異なる5種類のCSEを調製した。
ΔDi-0S:ΔHexA1-3HexNAc
ΔDi-4S:ΔHexA1-3HexNAc(4S)
ΔDi-6S:ΔHexA1-3HexNAc(6S)
ΔDi-2S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc
ΔDi-(4,6):ΔHexA 1-3HexNAc(4S, 6S)
ΔDi-(2,4):ΔHexA (2S)1-3HexNAc(4S)
ΔDi-(2,6):ΔHexA(2S)1-3HexNAc(6S)
ΔDi-(2,4,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(4S, 6S)
上記のΔHexAは不飽和ウロン酸、HexNAcはN-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。
上記表6に記載の5種類のCSEとde6S−CSEをセンサーチップに固定化させて相互作用解析した。試験は、「実施例7の(1)アミンカップリング法によるリガンドの固定化、(2)相互作用測定」に記載の方法で実施した。結果を表7に示す。
CSA−TBA塩に対して硫酸化剤である三酸化硫黄ピリジンコンプレックスを2、4、6当量添加して反応させた。以降の工程は実施例6(1)硫酸化CSA及びCSBの調製に記載の方法に従い調製した。調製された硫酸化CSAの分子量および二糖組成解析を参考例2(1)分子量解析、(2)二糖組成解析に記載の方法で実施した。結果を表8に示す。
ΔDi-0S:ΔHexA1-3HexNAc
ΔDi-4S:ΔHexA1-3HexNAc(4S)
ΔDi-6S:ΔHexA1-3HexNAc(6S)
ΔDi-2S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc
ΔDi-(4,6):ΔHexA 1-3HexNAc(4S, 6S)
ΔDi-(2,4):ΔHexA (2S)1-3HexNAc(4S)
ΔDi-(2,6):ΔHexA(2S)1-3HexNAc(6S)
ΔDi-(2,4,6)S:ΔHexA(2S)1-3HexNAc(4S, 6S)
上記のΔHexAは不飽和ウロン酸、HexNAcはN-アセチルヘキソサミン、括弧内は硫酸基の結合位置を示す。
抗CSE抗体の組織染色性を以下の通り検討した。
(1)凍結切片における免疫組織染色
イカ軟骨を小片化し、ティシュー・テックO.C.T.コンパウンド(サクラファインテックジャパン株式会社)に組織片を埋め、液体窒素で凍らせて凍結切片を作製した。
イカ軟骨を小片化し、10%中性緩衝ホルマリン液に固定後、パラフィン包埋し、パラフィン切片を作製した。
C−ABC処理し、CSE等のコンドロイチン硫酸が除去された組織の染色性を検討した。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
Claims (7)
- コンドロイチン硫酸Eに反応し、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸B、コンドロイチン硫酸D、コンドロイチン硫酸C、完全脱硫酸化コンドロイチン硫酸C、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヘパロサン、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸及び6−O−脱硫酸化コンドロイチン硫酸E及び硫酸化コンドロイチン硫酸Bのいずれにも反応しない抗体であって、
当該「反応しない」とは、コンドロイチン硫酸Eに対する反応性を100%とした場合に、抗原と抗体の反応性と陰性対照又はブランクとの差が0.5%未満であることをいう、抗体。 - モノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 受託番号がNITE BP−01808又はNITE BP−01809であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
- 請求項2に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 受託番号がNITE BP−01808又はNITE BP−01809であるハイブリドーマ。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するコンドロイチン硫酸Eの検出方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体を少なくとも含む、コンドロイチン硫酸Eの検出キット。
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