JP4787666B2 - 癌の検出方法及び検出キット - Google Patents

Description

本発明は、癌の検出方法及び検出キットに関する。

本出願書類中で使用する略号及びその意義は以下の通りである。
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＨＥＰ：ヘパリン
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＥＨＳ−ＨＳ：マウスのエンジェルブレス−ホーム−スワーン腫瘍組織（Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma）由来のＨＳ
Ｂｉ−ＧＡＧ：ビオチン標識ＧＡＧ
Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体：ビオチン標識ＨＥＰ誘導体
ＧｌｃＮＳ：Ｎ−硫酸化グルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＩｄｏＡ：イズロン酸
ＩｄｏＡ（２Ｓ）：２−Ｏ−硫酸化イズロン酸

ＮＡＨ：Ｎ−アセチルヘパロザン

ＡＳ：アカラン硫酸
Ｂｉ−ＡＳ：ビオチン標識ＡＳ
ＲＡ−ＡＳ：還元アミノ化ＡＳ
ＰＤＰ−ＡＳ：２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＡＳ
ＳＨ−ＡＳ：チオプロピオニル化ＡＳ

ＡＣＨ：２−Ｏ−脱硫酸化ＡＳ
Ｂｉ−ＡＣＨ：ビオチン標識ＡＣＨ
ＲＡ−ＡＣＨ：還元アミノ化ＡＣＨ
ＰＤＰ−ＡＣＨ：２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＡＣＨ
ＳＨ−ＡＣＨ：チオプロピオニル化ＡＣＨ

ＮＨ_２−ＨＥＰ：Ｎ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−ＨＥＰ：Ｎ−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ

２ＤＳＨ：２−Ｏ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＨ_２−６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ

６ＤＳＨ：６−Ｏ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−６ＤＳＨ：Ｎ−アセチル化６ＤＳＨ
ＮＳＨ：（２−Ｏ・６−Ｏ）−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−ＮＳＨ；Ｎ−アセチル化ＮＳＨ
ＮＨ_２−２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ

ＮＨ_２−ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化ＨＥＰ
ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ

Ｃｈ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳ−Ａ（Ｓ）：サメ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ａ（Ｗ）：クジラ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ｂ：コンドロイチン硫酸Ｂ
ＣＳ−Ｃ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳ−Ｄ：コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳ−Ｅ：コンドロイチン硫酸Ｅ

ＫＳ：ケラタン硫酸

ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート

ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ

ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＫＬＨ：ヘモシアニン
ＰＤＰ−ＫＬＨ：２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＫＬＨ

ＦＣＳ：子ウシ胎仔血清
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＴＭＢ：テトラメチルベンジジン
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオン酸
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＬＩＳＡ法：酵素標識抗体測定法

ＡＳは、アフリカマイマイ（学名：Achatina fulica）から単離されたＧＡＧの一種である。ＡＳは、ＧｌｃＮＡｃとＩｄｏＡ（２Ｓ）とからなる二糖（-[IdoA(2S)-GlcNAc]-）の繰り返し構造を基本糖鎖構造として有する多糖であり、ＨＳ及びＨＥＰと極めて類似した構造を有していることが知られている（非特許文献１）。ＡＳを化学的に脱硫酸化した化合物としては、ＡＣＨが知られている（非特許文献２）。ＡＳに結合する抗体としては、ＭＷ３Ｇ３が知られている（非特許文献３）。しかしながら、「ＡＣＨに結合する抗体」は知られていない。また、これらの抗体を癌の検出に用いることも知られていない。

ヨン Ｓ．キム（Yeong S. Kim）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、（米国）、１９９６年、第２７１巻、第２０号、ｐ．１１７５０−１１７５５ Ｍ．イシハラ（M. Ishihara）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、１９９７年、第１２１巻、第２号、ｐ．３４５−３４９ ジェディー Ｂ．テン ダン（Gerdy B. ten Dam）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、（米国）、２００４年、第２７９巻、ｐ．３８３４６−３８３５２

本発明は、新たな癌の検出方法及びそのために用いることができる検出キットを提供することを目的とする。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、抗ＡＣＨ抗体や抗ＡＳ抗体が、驚くべきことにヒトに由来する癌細胞に結合することを見出し、この知見に基づいて、癌を検出できる方法及びそのために用いることができる検出キットを提供するに至った。

すなわち本発明は、「ＡＣＨに結合する抗体」及び／又は「ＡＳに結合する抗体」を生体組織由来の試料に接触させるステップを少なくとも含む、癌の検出方法（以下、「本発明方法」という。）を提供する。
この「ＡＣＨに結合する抗体」は、ＡＳに実質的に結合しないものが好ましい。またこの「ＡＣＨに結合する抗体」は、ＮＡＨに実質的に結合しないものが好ましい。またこの「ＡＣＨに結合する抗体」は、ブタ腸由来のＨＥＰに実質的に結合しないものが好ましい。またこの「ＡＣＨに結合する抗体」は、ウシ腎臓由来のＨＳに実質的に結合しないものが好ましい。またこの「ＡＣＨに結合する抗体」は、ＥＨＳ−ＨＳに実質的に結合しないものが好ましい。
またこの「ＡＣＨに結合する抗体」は、モノクローナル抗体であることが好ましい。この「ＡＣＨに結合する抗体」は、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。このリンパ球及びミエローマ細胞は、マウス由来であることが好ましい。
またこの「ＡＣＨに結合する抗体」の免疫グロブリンクラスはＩｇＭであることが好ましい。またこの「ＡＣＨに結合する抗体」は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７９であるハイブリドーマにより産生される抗体であることが好ましい。
また、この「ＡＳに結合する抗体」は、ウシ腎臓由来のＨＳに実質的に結合しないものが好ましい。またこの「ＡＳに結合する抗体」は、ブタ腸由来のＨＥＰに実質的に結合しないものが好ましい。またこの「ＡＳに結合する抗体」は、ＥＨＳ−ＨＳに実質的に結合しないものが好ましい。またこの「ＡＳに結合する抗体」は、ウシ角膜由来のＫＳに実質的に結合しないものが好ましい。またこの「ＡＳに結合する抗体」は、ＨＡに実質的に結合しないものが好ましい。またこの「ＡＳに結合する抗体」は、ＮＡＨに実質的に結合しないものが好ましい。
またこの「ＡＳに結合する抗体」は、モノクローナル抗体であることが好ましい。この「ＡＳに結合する抗体」は、タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。このリンパ球及びミエローマ細胞は、マウス由来であることが好ましい。
またこの「ＡＳに結合する抗体」の免疫グロブリンクラスはＩｇＭ又はＩｇＧであることが好ましい。またこの「ＡＳに結合する抗体」は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７５、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７６、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７８であるハイブリドーマにより産生される抗体であることが好ましい。

また、前記の「生体組織」は脊椎動物の生体組織であることが好ましい。また前記の「癌」は、大腸癌又は扁平上皮癌であることが好ましい。

また本発明は、「ＡＣＨに結合する抗体」及び／又は「ＡＳに結合する抗体」を構成成分として少なくとも含む、癌の検出キット（以下、「本発明キット」という。）を提供する。

本発明方法及び本発明キットは、癌を簡便、迅速かつ安価に検出できることから、極めて有用である。

＜１＞本発明方法
本発明方法は、「ＡＣＨに結合する抗体」及び／又は「ＡＳに結合する抗体」を生体組織由来の試料に接触させるステップを少なくとも含む、癌の検出方法である。
（１）ＡＣＨに結合する抗体
ここで用いる「ＡＣＨに結合する抗体」は、ＡＣＨに結合する抗体である限りにおいて特に限定されない。この「ＡＣＨに結合する抗体」は、ＡＳに実質的に結合しないものが好ましく、またＮＡＨに実質的に結合しないものも好ましく、またブタ腸由来のＨＥＰに実質的に結合しないものも好ましく、またウシ腎臓由来のＨＳに実質的に結合しないものも好ましく、またＥＨＳ−ＨＳに実質的に結合しないものも好ましい。なかでも、これらの全ての性質を満たしているものが好ましい。
なお本明細書において「実質的に結合しない」とは、１分子たりとも結合しないことを意味するものではなく、結合が検出できないか又は結合が検出できたとしても弱いものであって本発明が属する技術分野における当業者から見て無視できる程度のものであることを意味する。例えば、ＡＣＨに対する結合性を１００％としたときに、ある物質への結合性が５％以下である場合には「実質的に結合しない」ということができる。したがって、後述する実施例において示されるＡＣＨ５５は、ＡＣＨに結合するが、ＡＳ、ＮＡＨ、ブタ腸由来のＨＥＰ、ウシ腎臓由来のＨＳ及びＥＨＳ−ＨＳのいずれにも実質的に結合しないものであるということができる。
また、この「ＡＣＨに結合する抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであっても良いが、継続的な生産性の確保や、抗体の均一性の観点からすればモノクローナル抗体であることが好ましい。

このような「ＡＣＨに結合する抗体」は、抗原としてＡＣＨ又はその修飾物を用いて、公知の方法で製造することができる。なかでも、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として用いることが好ましい。この「タンパク質」としては、ＫＬＨ又はＢＳＡを採用することが好ましい。

「ＡＣＨに結合する抗体」としてモノクローナル抗体を採用する場合には、例えば、「タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質」を抗原として哺乳動物を免疫し、当該動物からリンパ球を採取して、これを哺乳動物由来のミエローマ細胞と細胞融合させることによりハイブリドーマを形成させ、当該ハイブリドーマから抗体を採取すればよい。この「リンパ球」及び「ミエローマ細胞」は、マウス由来であることが好ましい。
「ＡＣＨに結合する抗体」の免疫グロブリンクラスも特に限定されないが、ＩｇＭであることが好ましい。
「ＡＣＨに結合する抗体」として最も好ましいのは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７９であるハイブリドーマにより産生される抗体である。
（２）ＡＳに結合する抗体
ここで用いる「ＡＳに結合する抗体」は、ＡＳに結合する抗体である限りにおいて特に限定されない。この「ＡＳに結合する抗体」は、ウシ腎臓由来のＨＳに実質的に結合しないものが好ましく、またブタ腸由来のＨＥＰに実質的に結合しないものも好ましく、またＥＨＳ−ＨＳに実質的に結合しないものも好ましく、またウシ角膜由来のＫＳに実質的に結合しないものも好ましく、またＣＳ及びＨＡに実質的に結合しないものも好ましく、またＮＡＨに実質的に結合しないものも好ましい。なかでも、これらの全ての性質を満たしているものが好ましい。
「実質的に結合しない」の意義は前記と同様である。例えば、ＡＳに対する結合性を１００％としたときに、ある物質への結合性が５％以下である場合には「実質的に結合しない」ということができる。したがって、後述する実施例において示されるＡＳ２２は、ＡＳに結合するが、ウシ腎臓由来のＨＳ、ブタ腸由来のＨＥＰ、ＥＨＳ−ＨＳ、ウシ角膜由来のＫＳ、ＨＡ及びＮＡＨのいずれにも実質的に結合しないものであるということができる。
また、この「ＡＳに結合する抗体」も、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであっても良いが、継続的な生産性の確保や、抗体の均一性の観点からすればモノクローナル抗体であることが好ましい。

このような「ＡＳに結合する抗体」は、抗原としてＡＳ又はその修飾物を用いて、公知の方法で製造することができる。なかでも、タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質を抗原として用いることが好ましい。この「タンパク質」としては、ＫＬＨ又はＢＳＡを採用することが好ましい。

「ＡＳに結合する抗体」としてモノクローナル抗体を採用する場合には、例えば、「タンパク質とＡＳとを化学的に結合させてなる物質」を抗原として哺乳動物を免疫し、当該動物からリンパ球を採取して、これを哺乳動物由来のミエローマ細胞と細胞融合させることによりハイブリドーマを形成させ、当該ハイブリドーマから抗体を採取すればよい。この「リンパ球」及び「ミエローマ細胞」は、マウス由来であることが好ましい。
「ＡＳに結合する抗体」の免疫グロブリンクラスも特に限定されないが、ＩｇＭ又はＩｇ
Ｇであることが好ましい。
「ＡＳに結合する抗体」として最も好ましいのは、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７５、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７６、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７８であるいずれかのハイブリドーマにより産生される抗体である。

このような「ＡＣＨに結合する抗体」や「ＡＳに結合する抗体」は、免疫グロブリンとして精製されたものであっても、未精製のもの（例えば、ハイブリドーマの培養上清、腹水、抗血清そのものなど）であっても良いが、免疫グロブリンとして精製されているものが好ましい。本明細書において「精製」という用語は、いわゆる部分精製（実質的に純粋とまではいえないが、画分中に占める精製目的物質の割合が多数となる程度にまで精製すること）も、完全精製（実質的に純粋となるまで精製すること）も含む概念として用いる。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で解析した場合に、免疫グロブリン以外の物質が検出されないか、又は検出されてもごく僅かである場合には、免疫グロブリンとして「精製」されているということができる。

免疫グロブリンの精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡやプロテインＧなどを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法および超遠心法等を挙げることができる。

なお「ＡＣＨに結合する抗体」や「ＡＳに結合する抗体」は、免疫グロブリンの分子構造を完全に保持しているものは勿論、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で処理してＦａｂを含むフラグメントとしたものであっても良い。抗体のＦａｂを含むフラグメントとしては、Ｆａｂ以外に、Ｆａｂｃ、(Ｆａｂ')₂等が例示される。

また「ＡＣＨに結合する抗体」や「ＡＳに結合する抗体」は、これらの抗体をコードする遺伝子の塩基配列やこれらの抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的にこれらの抗体、Ｆａｂを含むフラグメント、キメラ抗体（例えば「ＡＣＨに結合する抗体」や「ＡＳに結合する抗体」のＦａｂ部分を含むキメラ抗体等）等を作製することもできる。 以上のような「ＡＣＨに結合する抗体」や「ＡＳに結合する抗体」のＦａｂを含むフラグメントやキメラ抗体等も、ＡＣＨ又はＡＳに結合する限りにおいて、本出願書類における「ＡＣＨに結合する抗体」や「ＡＳに結合する抗体」の概念に包含される。製造された抗体がＡＣＨ又はＡＳに結合するか否か等は、後述する実施例に記載の方法等によって容易に判別することができる。
（３）生体組織由来の試料との接触
本発明方法では、以上のような「ＡＣＨに結合する抗体」及び／又は「ＡＳに結合する抗体」を生体組織由来の試料に接触させるステップを少なくとも含んでいる。

生体組織由来の試料に接触させる抗体は、「ＡＣＨに結合する抗体」及び「ＡＳに結合する抗体」の一方であっても、双方であってもよい。
また、これらの抗体以外の抗体をさらに接触させてもよい。このような抗体としては、例えば「ＮＡＨに結合する抗体」等を例示することができる。

複数種類の抗体を生体組織由来の試料に接触させる場合には、その目的に応じて、これら複数種類の抗体を混合した状態で生体組織に由来する１つの試料に接触させてもよく、また同一の生体組織に由来する複数の試料に、それぞれの抗体を１種類づつ接触させてもよい。

抗体と生体組織由来の試料とを「接触」させる方法は、抗体分子と、生体組織由来の試料中に含有されている分子とが接触する状態となる限りにおいて特に限定されない。
また本発明における「生体組織」は、生体に由来する組織である限りにおいて特に限定されないが、脊椎動物の生体組織であることが好ましい。脊椎動物としては、例えば魚類、両生類、は虫類、鳥類、哺乳類等が例示されるが、哺乳類であることが好ましい。なかでもヒトの生体組織であることがより好ましい。
また「生体組織由来の試料」も、このような生体組織から得ることができる試料である限りにおいて特に限定されない。このような生体組織由来の試料としては、例えば、生体組織そのもの、その生体組織に由来する細胞、その細胞の細胞膜を含有する画分、その生体組織から抽出された分子（例えば糖鎖分子）等を例示することができる。なかでも、その生体組織に由来する細胞であることが好ましい。
（４）癌の検出
「ＡＣＨに結合する抗体」及び／又は「ＡＳに結合する抗体」をこのような生体組織由来の試料に接触させ、当該試料における生体組織、細胞、細胞膜画分、生体組織から抽出された分子（例えば糖鎖分子）等への当該抗体の結合を検出することにより、癌を検出することができる。すなわち、これらの抗体が生体組織由来の試料におけるこれらのものに結合すれば、当該生体組織が癌であるということを検出することができる。
抗体の結合の検出は、公知の免疫学的手法により行うことができる。例えば、抗体（又はさらに当該抗体に結合する抗体（二次抗体））に、最終的に何らかの特殊なシグナルとして検出されうる物質を結合させて、これを生体組織由来の試料（生体組織、細胞、細胞膜画分、生体組織から抽出された分子（例えば糖鎖分子）等）に接触させ、洗浄した後に、当該試料に当該シグナルが残存している場合には、その抗体は当該試料に結合したと判断することができる。

「最終的に何らかの特殊なシグナルとして検出されうる物質」としては、例えば酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性同位元素（¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³Ｈなど）、蛍光色素（ＦＩＴＣ、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸(AMCA)、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン(DTAF)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、リスアミンローダミンＢ(Lissamine Rhodamine B)、テキサスレッド(Texas Red)、フィコエリスリン(Phycoerythrin；PE)、ウンベリフェロン、ユーロピウム、フィコシアニン、トリカラー、シアニンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）、ハプテン（ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸(AMP)、２，４−ジニトロアニリンなど）、金属粒子（フェリチン粒子、金コロイド粒子など）、特異的結合対（ビオチンとアビジン類（ストレプトアビジンなど）、レクチンと糖鎖、アゴニストとアゴニストの受容体、ＨＥＰとアンチトロンビンIII(ATIII)など）のいずれか一方の物質等が例示される。

このようなシグナルの検出は、用いる試料の種類・状態や、「最終的に何らかの特殊なシグナルとして検出されうる物質」の種類等に応じて、公知の方法から当業者が適宜設定して行うことができる。例えば、生体組織の切片標本を試料とした場合には顕微鏡を用いて検出することができ、色素を肉眼で観察したり、金属粒子の密度、放射能のカウント、蛍光強度、蛍光偏光、発光強度等を観察・測定すればよい。また細胞の懸濁液を試料とした場合には、顕微鏡や、フローサイトメトリー等の手法を採用することができる。また、細胞膜画分、生体組織から抽出された分子（例えば糖鎖分子）を試料とした場合には、ＥＬＩＳＡ法等の手法を採用することができる。

本発明方法は、以上のような、「『ＡＣＨに結合する抗体』及び／又は『ＡＳに結合する抗体』を生体組織由来の試料に接触させるステップ」を少なくとも含む限りにおいて、他のステップをさらに含んでいてもよい。
本発明方法における検出の対象となる「癌」の種類も特に限定されないが、大腸癌又は扁平上皮癌であることが好ましい。
なお、本発明における「癌の検出」は、癌であるということの検出は勿論、癌の種類の検出（鑑別）等も含む概念である。
例えば、「ＡＣＨに結合する抗体」や「ＡＳに結合する抗体」は、癌のなかでも大腸癌や扁平上皮癌の生体組織由来の試料に結合しやすいことから、これらの抗体がある生体組織に結合した場合には「当該生体組織が癌である」ということを検出できるとともに、「当該生体組織が大腸癌又は扁平上皮癌である」ということも検出（鑑別）することができる。
また、同一の生体組織に由来する複数の試料に、複数種類の抗体を１種類づつ接触させることによっても、癌の種類の検出（鑑別）をすることができる。この場合にはその検出（鑑別）の精度をさらに高めうる。例えば、同一の生体組織に由来する複数の試料に、「ＡＣＨに結合する抗体」、「ＡＳに結合する抗体」をそれぞれ接触させて、これらの抗体の結合性のパターンを調べることにより、より精度の高い検出（鑑別）をなしうる。例えば後述する実施例に示す通り、ある生体組織に由来する複数の試料に、ＡＳ１７抗体（ＡＳに結合する抗体）、ＡＳ２２抗体（ＡＳに結合する抗体）、ＡＳ２５抗体（ＡＳに結合する抗体）、ＡＣＨ５５（ＡＣＨに結合する抗体）のそれぞれを接触させたときに、ＡＳ２２抗体及びＡＣＨ５５抗体のみが結合し、ＡＳ１７抗体及びＡＳ２５抗体が結合しない場合には、当該生体組織は大腸癌であると検出（鑑別）することができる。また後述の実施例に示すとおり、「ＮＡＨに結合する抗体」（例えばＮＡＨ４６抗体）は癌組織に結合することから、さらにこの抗体を組み合わせることによって、このような癌の検出の精度をさらに高めることができる。
また、ここにいう「癌の検出（鑑別）」は、その可能性の検出（鑑別）をも包含する概念である。すなわち例えば、少なくとも「ＡＣＨに結合する抗体」及び／又は「ＡＳに結合する抗体」が生体組織由来の試料に結合した場合には、「当該生体組織が癌である可能性がある」ということを検出できるとともに、「当該生体組織が大腸癌又は扁平上皮癌である可能性がある」ということも検出（鑑別）することができる。

また本発明方法は、癌組織において発現している「『ＡＣＨに結合する抗体』や『ＡＳに結合する抗体』が認識する糖鎖」の化学構造の検出や分析等の概念を含むものである。例えば、後述するＡＣＳ２２抗体は、ＮＡｃ−ＨＥＰ（Ｎ−アセチル基、６−Ｏ硫酸基及び２−Ｏ硫酸基を保持している点が１つの特徴である）とＮＡｃ−６ＤＳＨ（Ｎ−アセチル基、Ｎ−硫酸基及び２−Ｏ硫酸基を保持している点が１つの特徴である）に高い結合性を有している。したがって、ある生体組織由来の試料にＡＣＳ２２抗体を接触させたときに、この抗体が結合すれば、癌の検出ができるとともに、当該癌組織にはＮ−アセチル基、６−Ｏ硫酸基及び２−Ｏ硫酸基を保持している糖鎖又はＮ−アセチル基、Ｎ−硫酸基及び２−Ｏ硫酸基を保持している糖鎖が発現しているということを検出・分析することができる。
＜２＞本発明キット
本発明キットは、「ＡＣＨに結合する抗体」及び／又は「ＡＳに結合する抗体」を構成成分として少なくとも含む、癌の検出キットである。

本発明キットの構成成分である「ＡＣＨに結合する抗体」や「ＡＳに結合する抗体」についての説明は、前記＜１＞と同様である。本発明キットは、このような「ＡＣＨに結合する抗体」及び「ＡＳに結合する抗体」の一方のみを含んでいてもよく、双方を含んでいてもよい。

本発明キットは、前記の本発明方法に従って使用することができる。本発明キットの構成成分である抗体と生体組織由来の試料との接触方法、「生体組織」や「生体組織由来の試料」の意義、癌の検出の方法、検出対象となる「癌」の種類、「癌の検出」の意義等も、全て前記＜１＞と同様である。

本発明キットは、「ＡＣＨに結合する抗体」及び／又は「ＡＳに結合する抗体」を構成成分として少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに標識物質の検知試薬等を構成成分として加えることができる。

また、これらの構成成分の他に、洗浄液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。さらに本発明キットには、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール（ＱＣコントロール）を含有させることもできる。

これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容し保存しておくことができる。

以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。

ＡＣＨに結合する抗体の調製
（参考例１） ＡＳ及びＡＣＨの調製
ＡＳは、Kim, Y. S.らの方法（前記の非特許文献１に記載された方法）に従ってアフリカマイマイ（学名:Achatina fulica）から調製した。得られたＡＳを原料として、Ishihara, M.らの方法（前記の非特許文献２に記載された方法）に従ってＡＣＨを調製した。

（参考例２） ＰＤＰ−ＫＬＨの調製
ＫＬＨへの２−ピリジルジスルフィド構造の導入は、Carlsson, J.らの方法（Biochem. J., 173, 723 (1978)）に従って行った。

すなわち、0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.5)-0.1M NaClに、終濃度が2.5mg/mlになるようにＫＬＨ（シグマ社製） 60mgを溶解した。この溶液に、終濃度が0.238mMになるように5mM ＳＰＤＰ（シグマ社製）エタノール溶液を添加・混合し、30分間室温に保持した。過剰のＳＰＤＰを除去するために蒸留水に対して透析した後に、混合液を凍結乾燥し、ＰＤＰ−ＫＬＨ 59.4mgを得た。

（参考例３） ウロン酸を介したＡＣＨ−ＢＳＡコンジュゲートの調製
ＡＣＨ及びＢＳＡ（バイエル社製）を、それぞれ0.1M ＭＥＳ緩衝液（pH5.5）に、終濃度が10mg/mlになるように溶解し、ＡＣＨ溶液及びＢＳＡ溶液を得た。ＡＣＨ溶液 300 μlとＢＳＡ溶液 150 μlとを混合し、ＥＤＣ（PIERCE社製）400 μｇを添加した後、撹拌しながら20時間室温に保持した。得られた反応後の溶液は、蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥し、ウロン酸を介したＡＣＨ−ＢＳＡコンジュゲート 3.5mgを得た。

（参考例４） Ｂｉ−ＧＡＧ及びＢｉ−ＨＥＰ誘導体の調製
ＡＳおよび、ＡＣＨは参考例１で調製したものを使用した。ブタ皮由来のＨＡ（以下、単に「ＨＡ」と記載する）、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ、ウシ腎臓由来のＨＳ（以下、単に「ＨＳ」と記載する）、及びウシ角膜由来のＫＳ（以下、単に「ＫＳ」と記載する）は、生化学工業株式会社製のものを使用した。ＮＡＨは特開2004-18840に記載の方法に従って、大腸菌Ｋ５の培養物から調製した。ブタ腸由来のＨＥＰ（以下、単に「ＨＥＰ」と記載する）は、サイエンティフィックプロテインラボラトリーズ社から購入した。また、ＥＨＳ−ＨＳは、特公平７−５３７５６号公報に記載の方法により調製した。

また、各種ＨＥＰ誘導体（ＮＨ₂−ＨＥＰ、ＮＡｃ−ＨＥＰ、６ＤＳＨ、ＮＡｃ−６ＤＳＨ、ＮＨ₂−６ＳＨ、６ＳＨ、ＮＨ₂−２ＳＨ、２ＳＨ、ＮＳＨ、ＮＡｃ−ＮＳＨ、ＮＨ₂−ＣＤＳＨ、ＣＤＳＨ）は、図１に示す方法で、各種脱硫酸化反応及び／又はＮ−アセチル化反応を、単独で、又は組み合わせて用いることにより調製した。図中、ＨＥＰの６−Ｏ、2２−Ｏ及びＮ−脱硫酸化は、それぞれ、高野ら、苅谷ら及びAyotte, L.らの方法に従った（Takano, R. et al., J. Carbohydr. Chem. 14, 885 (1995), Takano, R. et al., Carbohydr. Lett. 3, 71 (1998), Kariya, Y. et al., J. Biochem., 123, 240(1998), Ayotte, L. et al., Carbohydr. Res., 145, 267 (1986))。

また、Ｎ−アセチル化は、 Danishefsky, I.らの方法に従った（Danishefsky, I. et al., Methods Carbohydr. Res., 5, 407(1965)）。

高野らの方法に従って６−Ｏ脱硫酸化を実施すると、副反応として若干のＮ−脱硫酸化も起きるので、得られた６ＤＳＨとＮＳＨの一部はＮ−アセチル化を行い、ＮＡｃ−６ＤＳＨとＮＡｃ−ＮＳＨを調製した。

上記の各種GAG及び各種ＨＥＰ誘導体、並びに参考例１で調製したＡＳ及びＡＣＨを、それぞれ終濃度が10mg/mlになるように0.1M ＭＥＳ緩衝液（pH5.5）に溶解し、各種ＧＡＧ溶液及び各種ＨＥＰ誘導体溶液を得た。これらの各種ＧＡＧ溶液及び各種ＨＥＰ誘導体溶液 各１mlに対して、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社製）で20mMに調製したビオチン−ＬＣ−ヒドラジド（PIERCE社製）を、それぞれ25μlずつ添加した。続いて、0.1M ＭＥＳ緩衝液（pH5.5）で100mg/mlに調製したＥＤＣ溶液を12.5μl添加した。これをよく撹拌した後、室温（15℃〜25℃）で20時間撹拌して反応させた。反応終了後の反応物を、透析膜（商品名：Cellu Sep H1（フナコシ社製）、カットオフ：分子量1,000以下）を、透析液としてダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（pH7.2〜7.5、カルシウムイオン等の二価イオン不含；以下、「ＰＢＳ（−）」という。）をそれぞれ用いて透析に付し、遊離のビオチンを充分に除去し、各種Ｂｉ−ＧＡＧ及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体を得た。透析終了後、Ｂｉ−ＧＡＧ濃度及びＢｉ−ＨＥＰ誘導体をそれぞれ5ng/mlに調整し、凍結保存した。

（参考例５） ストレプトアビジン固相化マイクロプレートの作製
ストレプトアビジン（Vector社製）をＰＢＳ（−）で20μg/mlに希釈し、マキシソープ（登録商標）９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェルに50μlずつ加えた。このプレートを18時間、４℃で保存することにより、ストレプトアビジンをプレート上に均一に固相化した後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。続いて、ブロッキング剤としてApplieDuo（登録商標、生化学工業株式会社製）を用い、以下の方法によりストレプトアビジンでコーティングされていない部分をブロッキングした。すなわち、防腐剤として0.05％プロクリン３００（登録商標、SUPELCO社製）を含むリン酸緩衝液（pH7.2〜7.5：以下、「ＰＢ」という）を用いて、ApplieDuo（登録商標）の５倍希釈液（以下、「ブロッキング液」という）を調製し、これを各ウェルに250μlずつ加え、室温で２時間静置した。静置後、ブロッキング液を充分に除去し、37℃で２時間乾燥させることにより、所望するストレプトアビジン固相化マイクロプレートを得た。得られたプレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入し、冷蔵保存した。

（参考例６） 各種ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートの作製
１） ＡＣＨ固相化マイクロプレートの作製
参考例３で調製したＡＣＨ-BSAコンジュゲート (50 ng)を、マキシソープ（登録商標） ９６ウェルマイクロプレートに添加し、18時間、４℃に保持した後、防腐剤として0.05％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で４倍希釈したブロックエース（登録商標；大日本製薬株式会社製）を用いてブロッキングした。１時間、室温で静置した後、所望のＡＣＨ固相化マイクロプレートを得た。このＡＣＨ固相化マイクロプレートは、後述する参考例８において血清中の抗体価を検証のために使用した。
２） 各種Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートの作製
上記参考例４に記載の各種Ｂｉ−ＧＡＧ及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体を、終濃度が1 μg/mlになるように、0.05％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍希釈したApplieDuo（登録商標）溶液に溶解した（以下この溶液を、「各種Ｂｉ−ＧＡＧ溶液」及び「各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体溶液」という）。参考例５で作製したストレプトアビジン固相化マイクロプレートの各ウェルを、300μlの0.05％プロクリン300（登録商標）及び0.05％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ（−）（以下、「洗浄緩衝液」と言う）で４回洗浄した。各種Ｂｉ−ＧＡＧ溶液及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体溶液をそれぞれ100 μlずつ各ウェルに分注し、室温で30分間静置したのち、各ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄することにより、所望の各種Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートを得た。これらのプレートは、後述する参考例８におけるクローニング、及び後述する参考例１０における反応性試験において使用した。

（参考例７） ＡＣＨ抗原の調製
１） ＲＡ−ＡＣＨの調製
参考例１で調製したＡＣＨ 4.5mgを、２Ｍ 塩化アンモニウム水溶液 160μlに溶解した。この溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム 12mgを添加し、70℃で２日間、還元アミノ化反応を行った。反応後の溶液に、シアノ水素ホウ素ナトリウム ５ｍｇを添加し、さらに２日間、上記と同一の条件で反応を行った。反応後の溶液を氷浴中で冷却した後、酢酸 32μlを添加して反応を完全に停止させた。２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法により、ＲＡ−ＡＣＨを回収した。得られた沈殿を、エタノール洗浄した後に凍結乾燥し、ＲＡ−ＡＣＨの凍結乾燥物2.1mgを得た。
２） ２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＡＣＨの調製
上記１）で調製したＲＡ−ＡＣＨ 2.1mgを、0.1M NaCl−0.1M リン酸緩衝液（pH7.5） １mlに溶解した。この溶液に５mM ＳＰＤＰエタノール溶液 80μlを添加した後、室温にて一晩静置し、２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化反応（ＰＤＰ反応）を行った。過剰のＳＰＤＰを除くために蒸留水を用いて透析を行った後、凍結乾燥し、ＰＤＰ−ＡＣＨの凍結乾燥物 1.7mgを得た。
３） ＳＨ−ＡＣＨの調製
上記２）で調製したＰＤＰ−ＡＣＨ 1.7mgを、0.1M NaCl−0.1M 酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5） 160μlに溶解した。この溶液に、終濃度が25mMになるようにジチオスレイトールを添加し、60分間室温にて還元反応を行った。２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法でＳＨ−ＡＣＨを回収した。得られた沈殿を、エタノール洗浄した後に凍結乾燥し、ＳＨ−ＡＣＨの凍結乾燥物 1.3mgを得た。
４） ジスルフィド結合を介したＡＣＨ−ＫＬＨコンジュゲートの調製
上記３）で調製したＳＨ−ＡＣＨ 1.3mg及び参考例２で調製したＰＤＰ−ＫＬＨ 0.65mgを、0.1M NaCl−0.1M リン酸緩衝液（pH7.5） １ｍｌに溶解し、２時間室温にてコンジュゲーション反応を行った。反応中に生成されるピリジル−２−チオンを除くため、上記反応後の溶液を、蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥し、ＡＣＨ−ＫＬＨコンジュゲートの凍結乾燥物1.5mgを得た。得られた凍結乾燥物は、後述する参考例８において、ＡＣＨ抗原として用いた。

（参考例８） ＡＣＨに対して反応する抗体を生産するハイブリドーマ細胞株の樹立
１） マウスの免疫化
前記参考例７の４）で得られたＡＣＨ抗原１ｍｇを少量の蒸留水に溶解し、これをTiterMAX Gold（登録商標；シグマ社製）２ｍｌと混合し、抗原溶液を調製した。また、免疫する動物としては、４匹のBALB/Cマウス(６週齢のメス；日本チャールズリバー社製)を用いた。上記の抗原溶液 100μl/匹 を、２週間毎に２又は３回皮下投与した。血清の抗体価が十分な値に達した時、最終免疫として、アジュバントを含まないＡＣＨ抗原溶液 100μl/匹を投与した。最終免疫から３日後、免疫したマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。

なお、上記において、血清中の抗体価の検証は、以下の方法により行った。すなわち、参考例６の１）で作製したＡＣＨ固相化マイクロプレート及びアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ＋Ｍ＋Ａ抗体（以下、「ＡＬＰ−抗マウスＩｇ」という）を用い、ＥＬＩＳＡ法により血清中の抗体価を検証した。すなわち、ＰＢＳ（−）で1000倍希釈した血清 50μlをＡＣＨ固相化マイクロプレートに分注し、37℃で１時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ（−）で４回洗浄し、10％ブロックエース（登録商標）／ＰＢＳ（−）で1000倍希釈したＡＬＰ−抗マウスＩｇ溶液 50 μlを各ウェルに分注した。さらに、ＰＢＳ（−）で４回洗浄した後、基質溶液（ＡＬＰローゼ；株式会社シノテスト製) 50μlを各ウエルに分注し、20分間、室温にて静置した。さらに、発色試薬（株式会社シノテスト製）50μlを添加し、660nmをバックグラウンド補正として、495nmの吸光度を測定した。２）ハイブリドーマの創製
１）で摘出した脾臓から得られた免疫感作されたリンパ球と、マウスミエローマＰ３Ｕ１細胞（株式会社シマ研究所製）とを、４対１ないし５対１の混合比で混合した後、50％のポリエチレングリコール1500（ロシュ社製）中で共遠心分離することによって細胞融合を実施した。なお、上記の細胞融合に用いるミエローマ細胞には、細胞融合の１週間前より、８−アザグアニンを含んだＨＡＴ培地で生育させたものを用いた。細胞融合後、ＨＡＴ培地中で細胞を生育させた細胞を、以下のクローンの選抜に用いた。
３）クローンの選抜及び評価
３−１） クローニング
クローニングには限界希釈法を採用した。すなわち、細胞数がウエル当り１以下になるようにＨＡＴ培地で細胞を希釈し、これを９６ウェルマイクロプレートに播種した。これを常法に従って培養し、培養上清液を得た。培養上清液の抗体価の評価を、参考例６の２）で作製したＢｉ−ＡＣＨ固相化マイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により行い、クローンを選抜した。以上のクローンニングの工程は、少なくとも２回以上実行した。以上の結果として、１つのクローンを選抜し、取得した。
３−２） クローンの評価
上記３）−１で取得したクローンの活性が維持されていることを確認するため、当該クローンを２４ウェルプレートの培養スケールにて培養し、得られた培養上清液の抗体価の評価を、参考例６の２）で作製したＢｉ−ＡＣＨ固相化マイクロプレート、及びＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（以下、「ＨＲＰ抗マウスＩｇ」という；ダコ社製)を用いたＥＬＩＳＡ法により行った。以下に詳細を示す。
［クローンの抗体価の評価]
予め洗浄緩衝液によって４回洗浄したＢｉ−ＡＣＨ固相化マイクロプレートに、培養上清液 100μlを分注し、室温にて１時間静置した。さらに洗浄緩衝液で４回洗浄した後に、反応緩衝液（0.05％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍に希釈したApplieDuo（登録商標）溶液）で2000倍に希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇ 100μlを、各ウェルに分注した。このプレートを室温にて１時間静置した後、洗浄緩衝液で４回洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＨＲＰ基質溶液；BIOFX社製） 100μlを各ウェルに加え、30分間、常温で酵素反応を行った。反応終了後、発色試薬（BIOFX社製）100μlを各ウェルに添加し、630nmをバックグラウンド補正として、450nmの吸光度を測定した。なお、反応緩衝液をネガティブブランクとして用いた。その結果、当該クローンが抗ＡＣＨ抗体を生産していることが確認された。樹立したハイブリドーマのクローン番号はＡＣＨ５５であったことから、このハイブリドーマによって産生される抗体を、ＡＣＨ５５抗体と名付けた。上記のハイブリドーマは、平成１８年３月１日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７９として受託された。常法に従って抗体の免疫グロブリンクラスを調べた結果、ＡＣＨ５５抗体の免疫グロブリンクラスはＩｇＭであることを確認した。

（参考例９） 抗ＡＣＨモノクローナル抗体の調製
１） 抗ＡＣＨモノクローナル抗体の生産
目的の抗ＡＣＨモノクローナル抗体を生産する方法としては、マウス腹水法を採用した。すなわち、上記参考例８の３）で樹立したハイブリドーマ（クローン番号：ＡＣＨ５５）5×106個を、予めプリスタン（2,6,10,14-Tetrametylpentadecane：東京化成工業株式会社）処理した３匹のBALB/Cマウス（15週齢の雌）の腹腔に注入した。注射後10〜20日の間に、マウスの腹水を数回に分けて採取し、合計約10mlの腹水を得た。
２） 抗ＡＣＨモノクローナル抗体の精製
上記１）で得た腹水を、吸着バッファ２（0.5M K2SO4を含む20のmMリン酸緩衝液(pH 7.5)）に対して一晩透析した。透析内液をメンブランフィルタ（孔径:0.45 mm）によって濾過し、得られた濾過液を、予め吸着バッファ１（20 mMリン酸緩衝液(pH 7.0)）で平衡化したHiTrap IgY Purification HPカラム（5ml；アマシャム・バイオサイエンス社製）にアプライした後、吸着バッファ１でカラムを洗浄した。通過させた洗浄液の280nmの吸収がほぼ0になったとき、20 mMリン酸緩衝液(pH 7.5)をカラムに通過させ、ＡＣＨ５５抗体を溶出した。溶出したＡＣＨ５５抗体をNH4SO4（50％の飽和）を用いて塩析することによって回収した。得られた沈澱物をＰＢＳ（−）に対して透析し、精製ＡＣＨ５５抗体 2.2mgを含む透析内液を得た。

（参考例１０） 抗ＡＣＨモノクローナル抗体の反応性試験
１） ＡＣＨ５５抗体の各種ＧＡＧに対する反応性
１）−１ 方法
Ｂｉ−ＧＡＧの固相化量の異なるマイクロプレートを作製するために、固相化に用いるＢｉ−ＧＡＧ溶液中のＢｉ−ＧＡＧの終濃度を、0.001、0.004、0.012、0.037、0.111、0.333、1.000μg/mlと変化させて参考例６の２）と同様の方法で作製したＢｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレートを、それぞれ洗浄緩衝液で４回洗浄した。その後、各ウェルに、添加剤としてApplieDuo（登録商標；最終希釈率20倍；生化学工業株式会社製）及び防腐剤として0.05％プロクリン３００を含有するＰＢＳ（−）（以下、「反応液Ａ」という）を用いて濃度0.06 μg/mlに調整したＡＣＨ５５抗体からなる各試験溶液を100μlずつ加え、これを常温で60分間静置し、抗原抗体反応させた。反応終了後、各ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄し、二次抗体溶液として、反応液Ａで2000倍に希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇ溶液を100μlずつ加え、これを常温で60分間静置して抗原抗体反応させた。反応終了後、このプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、ＨＲＰの基質としてＴＭＢ溶液（ＨＲＰ基質溶液、BIOFX社製）を100μlずつ加え、常温で30分間反応させて発色させた。続いて、プレートに反応停止液（BIOFX社製）を100μlずつ加えて反応を停止させた後、ＴＭＢ分解によって増加する波長450nmの吸光度（対照波長630nm）をウェルリーダーＳＫ−６０３（登録商標；生化学工業株式会社販売）で測定した。なお、抗体の反応性は、上記の各濃度のＢｉ−ＧＡＧを用いて作製したＢｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレートを用いて上記測定を行った場合の吸光度から、Ｂｉ−ＧＡＧ溶液の代わりにＢｉ−ＧＡＧを含まない０．０５％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍希釈したApplieDuo（登録商標）溶液を用いることの他、参考例６ ２）と同様の方法により作製したコントロール測定用マイクロプレートを用いて上記の測定方法に準じて測定を行った場合の吸光度（ブランク値）を減算した吸光度差（以下、単に「吸光度差」と記載する）によって評価した。
１）−２ 結果
Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレートのＧＡＧとして、ＮＡＨ、ＡＳ、ＡＣＨ、ＨＳ、ＨＥＰ及びＥＨＳ−ＨＳを用いた場合の結果を、図２に示す。

ＡＣＨ５５抗体は、ＡＣＨに対しては、Ｂｉ−ＡＣＨ濃度を0.01μg/mL（0.001μg/ウェル）とした場合においても強く反応（吸光度差＝約1.0）した一方で、ＡＳ、ＨＥＰ、ＨＳ、ＮＡＨ及びＥＨＳ−ＨＳに対しては、Ｂｉ−ＧＡＧ濃度を1.0μg/mL（0.1μg/ウェル）にまで上げた場合においても反応しなかった（図２）。

また、ＡＣＨ５５抗体は上述したＨＥＰの場合と同様に、ＨＡ、各種ＣＳ（ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ）及びＫＳに対しても反応しなかった。
２） ＡＣＨ５５抗体の各種ＨＥＰ誘導体に対する反応性
各種ＨＥＰ誘導体に対する反応性を評価した。Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートのＨＥＰ誘導体として、ＮＨ₂−ＨＥＰ、ＮＡｃ−ＨＥＰ、６ＤＳＨ、ＮＡｃ−６ＤＳＨ、ＮＨ₂−６ＳＨ、６ＳＨ、ＮＨ₂−２ＳＨ、２ＳＨ、ＮＳＨ、ＮＡｃ−ＮＳＨ、ＮＨ₂−ＣＤＳＨ及びＣＤＳＨを用いた。なおこの試験においては、固相化に用いるＢｉ−ＨＥＰ誘導体を含む溶液の濃度を1μg/mlに固定した（0.1 μg/ウェル）。結果を図３に示す。

ＡＣＨ５５抗体は、ＣＤＳＨに対しては強く反応し、また、２ＳＨ、６ＳＨとＮＡｃ−ＮＳＨに対しては、極弱く反応した（図３）。

ＡＣＨ５５抗体が強く反応したＡＣＨは、イズロン酸ユニット（-[IdoA-GlcNAc]-）を主な構成二糖としていることから、ＡＣＨ５５抗体のエピトープは、イズロン酸ユニットから構成されていると考えられる。また、当該抗体が反応しなかったＮＡＨは、グルクロン酸ユニット（- [GlcA-GlcNAc]-）からなるＡＣＨのウロン酸Ｃ５−エピマーであることから、特にイズロン酸残基がＡＣＨ５５抗体の抗原認識において必須であることが示唆された。さらに、ＡＳ（イズロン酸残基の２位水酸基が硫酸化されている）に対して反応性が見られないことから、イズロン酸の硫酸化（IdoA(2S)）は、ＡＣＨ５５抗体の抗原に対する反応性を阻害することが示唆された。

ＣＤＳＨはグルクロン酸ユニット及びイズロン酸ユニットにより主に構成される多糖であり、イズロン酸ユニットの存在比は60％以上と高い。したがって、ＣＤＳＨが当該抗体と反応した結果に矛盾はない。また、この反応性はＧｌｃＮＡｃ残基のＮ−脱アセチル化（ＮＨ_２−ＣＤＳＨ）及びＮ−硫酸化（ＮＳＨ）によって消失したので、グルコサミン残基のアミノ基がアセチル化されていることも、ＡＣＨ５５抗体の抗原の認識において重要であることが示唆された。

ＡＳと反応しない抗体ＡＣＨ５５が２ＳＨ、６ＳＨやＮＡｃ−ＮＳＨと弱く反応した理由は、ＨＥＰがＮ−脱硫酸化、２−Ｏ脱硫酸化及び６−Ｏ脱硫酸化等、複数の修飾を経る過程で、イズロン酸ユニットがＨＥＰ誘導体中に顕在化したためと推察した。

ＡＳに結合する抗体の調製
（参考例１１） ウロン酸を介したＡＳ−ＢＳＡコンジュゲートの調製
ＡＣＨに代えてＡＳを用い、前記の参考例３と同様に行った。最終的に、ウロン酸を介したＡＳ−ＢＳＡコンジュゲート 3.5mgを得た。

（参考例１２） Ｂｉ−ＧＡＧ及びＢｉ−ＨＥＰ誘導体の調製
ＡＣＨに代えてＡＳを用い、前記の参考例４と同様に行った。

（参考例１３） ストレプトアビジン固相化マイクロプレートの作製
前記の参考例５と同様に行った。

（参考例１４） 各種ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートの作製
１） ＡＳ固相化マイクロプレートの作製
参考例１１で調製したＡＳ−ＢＳＡ（50 ng）を用いて、参考例６の１）と同様に行った。このＡＳ固相化マイクロプレートは、後述する参考例１６において血清中の抗体価を検証するために使用した。
２） 各種Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートの作製
参考例６の２）と同様に行った。

（参考例１５） ＡＳ抗原の調製
１） ＲＡ−ＡＳの調製
参考例１で調製したＡＳ ４ｍｇを秤量し、２Ｍ 塩化アンモニウム水溶液 160μlに溶解した。この溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム12mgを添加し、70℃で２日間、還元アミノ化反応を行った。反応後の溶液に、シアノ水素ホウ素ナトリウム ５ｍｇを添加し、さらに２日間、上記と同一の条件で反応を行った。反応後の溶液を氷浴中で冷却した後、酢酸 32μlを添加して反応を完全に停止させた。２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法により、ＲＡ−ＡＳを回収した。得られた沈殿を、エタノール洗浄した後に凍結乾燥し、ＲＡ−ＡＳの凍結乾燥物3.3mgを得た。
２） ＰＤＰ−ＡＳの調製
上記１）で調製したＲＡ−ＡＳ 3.3mgを、0.1M NaCl−0.1M リン酸緩衝液（pH7.5） １mlに溶解した。この溶液に5mM ＳＰＤＰエタノール溶液 80μlを添加した後、室温にて一晩静置し、２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化反応（ＰＤＰ反応）を行った。過剰のＳＰＤＰを除くために蒸留水を用いて透析を行った後、凍結乾燥し、ＰＤＰ−ＡＳの凍結乾燥物3.8mgを得た。
３） ＳＨ−ＡＳの調製
上記２）で調製したＰＤＰ−ＡＳ 2.0mgを秤量し、0.1M NaCl−0.1M 酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）160μlに溶解した。この溶液に、終濃度が25mMになるようにジチオスレイトールを添加し、60分間室温にて還元反応を行った。２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法でＳＨ−ＡＳを回収した。得られた沈殿を、エタノール洗浄した後に凍結乾燥し、ＳＨ−ＡＳの凍結乾燥物1.5mgを得た。
４） ジスルフィド結合を介したＡＳ−ＫＬＨコンジュゲートの調製
上記３）で調製したＳＨ−ＡＳ 1.5mg及び参考例２で調製したＰＤＰ−ＫＬＨ 0.75mgを、0.1M NaCl−0.1M リン酸緩衝液（pH7.5） １mlに溶解し、２時間室温にてコンジュゲーション反応を行った。反応中に生成されるピリジル−２−チオンを除くため、上記反応後の溶液を、蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥し、ＡＳ−ＫＬＨコンジュゲートの凍結乾燥物1.9mgを得た。得られた凍結乾燥物は、後述する参考例１６において、ＡＳ抗原として用いた。

（参考例１６） ＡＳに対して反応する抗体を生産するハイブリドーマ細胞株の樹立
１） マウスの免疫化
少量の蒸留水に溶解したＡＳ抗原 1mgとTiterMAX Gold（登録商標；シグマ社製）2mlとを混合し、抗原溶液を調製した。また、免疫する動物としては、４匹のBALB/Cマウス(６週齢のメス；日本チャールズリバー社製)を用いた。上記の抗原溶液 100μl/匹を、２週間毎に２又は３回皮下投与した。血清の抗体価が十分な値に達した時、最終免疫として、アジュバントを含まないＡＳ抗原溶液 100μ1/匹を投与した。最終免疫から３日後、免疫したマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。

なお、上記において、血清中の抗体価の検証は、以下の方法により行った。すなわち、参考例１４の１）で作製したＡＳ固相化マイクロプレート及びＡＬＰ−抗マウスＩｇを用い、ＥＬＩＳＡ法により血清中の抗体価を検証した。すなわち、ＰＢＳ（−）で1000倍希釈した血清 50 μlをＡＳ固相化マイクロプレートに分注し、３７℃で1時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ（−）で４回洗浄し、10％ ブロックエース（登録商標）／ＰＢＳ（−）で1000倍希釈したＡＬＰ−抗マウスＩｇ溶液 50μlを各ウェルに分注した。さらに、ＰＢＳ（−）で４回洗浄した後、基質溶液（ＡＬＰローゼ；株式会社シノテスト製）50μlを各ウェルに分注し、20分間、室温にて静置した。さらに、発色試薬（株式会社シノテスト製)50μlを添加し、660nmをバックグラウンド補正として、495nmの吸光度を測定した。
２）ハイブリドーマの創製
１）で摘出した脾臓から得られた免疫感作されたリンパ球と、マウスミエローマＰ３Ｕ１細胞（株式会社シマ研究所製)とを、４対１ないし５対１の混合比で混合した後、50％のポリエチレングリコール1500（ロシュ社製）中で共遠心分離することによって細胞融合を実施した。なお、上記の細胞融合に用いるミエローマ細胞には、細胞融合の１週間前より、８−アザグアニンを含んだＨＡＴ培地で生育させたものを用いた。細胞融合後、ＨＡＴ培地中で細胞を生育させた細胞を、以下のクローンの選抜に用いた。
３）クローンの選抜及び評価
３−１） クローニング
クローニングには限界希釈法を採用した。すなわち、細胞数がウェル当り１以下になるようにＨＡＴ培地で細胞を希釈し、これを９６ウェルマイクロプレートに播種した。これを常法に従って培養し、培養上清液を得た。培養上清液の抗体価の評価を、参考例１４の２）で作製したＢｉ−ＡＳ固相化マイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により行い、クローンを選抜した。以上のクローンニングの工程は、少なくとも２回以上実行した。以上の結果として、６つのクローンを選抜し、取得した。
３−２） クローンの評価
上記３）−１で取得した各クローンの活性が維持されていることを確認するため、当該クローンを２４ウェルプレートの培養スケールにて培養し、得られた培養上清液の抗体価の評価を、参考例１４の２）で作製したＢｉ−ＡＳ固相化マイクロプレート及びＨＲＰ抗マウスＩｇを用いたＥＬＩＳＡ法により行った。以下に詳細を示す。
[クローンの抗体価の評価]
予め洗浄緩衝液によって４回洗浄した、Ｂｉ−ＡＳ固相化マイクロプレートに、培養上清液 100μlを分注し、室温にて１時間静置した。さらに洗浄緩衝液で４回洗浄した後に、反応緩衝液(0.05％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍に希釈したApplieDuo（登録商標；生化学工業株式会社製）溶液)で2000倍に希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇ 100μlを、各ウェルに分注した。このプレートを室温にて１時間静置した後、洗浄緩衝液で４回洗浄し、ＴＭＢ（ＨＲＰ基質溶液；BIOFX社製）100μlを各ウェルに加え、30分間、常温で酵素反応を行った。反応終了後、発色試薬（BIOFX社製）100μlを各ウェルに添加し、630nmをバックグラウンド補正として、450nmの吸光度を測定した。なお、反応緩衝液をネガティブブランクとして用いた。その結果、各クローンが抗ＡＳ抗体を生産していることが確認された。樹立したハイブリドーマのクローン番号はＡＳ１７、ＡＳ２２、ＡＳ２５、ＡＳ３８及びＡＳ４８であったことから、このハイブリドーマによって産生される抗体を、それぞれＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＳ３８抗体及びＡＳ４８抗体と名付けた。上記のハイブリドーマは、平成１８年３月１日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７５、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７６、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７８としてそれぞれ受託された。常法に従って抗体の免疫グロブリンクラスおよびそのサブクラスを調べた結果、ＡＳ１７抗体はIgG2aに分類され、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体はIgG1に分類され、ＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体はIgMに分類されることを確認した。

（参考例１７） 抗ＡＳモノクローナル抗体の調製
１） 抗ＡＳモノクローナル抗体の生産
目的の抗ＡＳモノクローナル抗体を生産する方法としては、マウス腹水法を採用した。すなわち、上記参考例１６の３）で樹立した各ハイブリドーマ（ＡＳ１７、ＡＳ２２、ＡＳ２５、ＡＳ３８、ＡＳ４８）それぞれ5×106個を、それぞれ予めプリスタン（2,6,10,14-Tetrametylpentadecane：東京化成工業株式会社）処理した３匹のBALB/Cマウス（15週齢の雌）の腹腔に注入した。注射後10〜20日の間に、マウスの腹水を数回に分けて採取し、合計約10mlの腹水を得た。
２） 抗ＡＳモノクローナル抗体の精製
以下に、IgGタイプ抗体（ＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体)の精製方法を示す。すなわち、上記１）により得られた腹水を、それぞれ吸着バッファ１（20 mMリン酸緩衝液(pH 7.0))に対して一晩透析した。透析内液をメンブランフィルタ（孔径：0.45 mm）によって濾過し、得られた濾過液を、予め吸着バッファ１で平衡化したHiTrap Protein G HPカラム（5ml；アマシャム・バイオサイエンス社製）にアプライし、同バッファでカラムを洗浄した。通過液の280nmの吸収がほぼ０になった時、0.1 M グリシンバッファ（pH 2.7）をカラムに通過させ、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ２８抗体をそれぞれ溶出した。各抗体を含む溶液をそれぞれ回収し、ＰＢＳ（−）に対して十分に透析した。透析内液は必要に応じて限外ろ過濃縮等で適切な濃度に適宜調整し、それらを精製抗体として使用した。精製したＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体の量はそれぞれ、30.8mg、4.6mg及び11.5mgであった。

以下にIgMタイプ抗体（ＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体）の精製方法を示す。すなわち、上記１）により得られた腹水を、それぞれ吸着バッファ２（0.5M K₂SO₄を含む20mM リン酸緩衝液（pH 7.5））に対して一晩透析した。透析内液をメンブランフィルタ（孔径：0.45 mm）によって濾過した後、濾過液を予め吸着バッファ１で平衡化したHiTrap IgY Purification HPカラム（5ml；アマシャム・バイオサイエンス社製）にアプライし、同バッファでカラムを洗浄した。通過液の280nmの吸収がほぼ0になった時、20 mMリン酸緩衝液（pH 7.5）をカラムに通過させ、ＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体をそれぞれ溶出した。溶出したＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体は、塩析（NH₄SO₄：50％の飽和）することによって回収した。沈澱物をPBS(-)に対して透析し、得られた透析内液を精製抗体として使用した。精製したAS２２抗体及びＡＳ４８抗体の量はそれぞれ、2.7及び2.2 mgであった。

（参考例１８） 各抗ＡＳモノクローナル抗体の反応性試験
各抗ＡＳモノクローナル抗体（精製抗体）の各種ＧＡＧ及び各種ＨＥＰ誘導体に対する反応性を検証した。
１） 各精製抗体の反応性試験その１−ＡＳに対する反応性試験
１）−１ 方法
Ｂｉ−ＧＡＧの固相化量の異なるマイクロプレートを作製するために、固相化に用いるＢｉ−ＡＳ溶液中のＢｉ−ＡＳの終濃度を、0.001、0.004、0.012、0.037、0.111、0.333、1.000 μg/mlと変化させて参考例１４の２）と同様の方法により作製したＢｉ−ＡＳ固相化マイクロプレートを、それぞれ洗浄緩衝液で4回洗浄した後、各ウェルに、添加剤としてApplieDuo（登録商標；最終希釈率２０倍、生化学工業株式会社製）、防腐剤として0.05％プロクリン３００を含むＰＢＳ（−）（以下、「反応液Ａ」という）を用いて、それぞれ、0.025 mg/ml（ＡＳ１７抗体）、0.07mg/ml（ＡＳ２２抗体）、0.006 mg/ml（ＡＳ２５抗体）、0.006 mg/ml（ＡＳ３８抗体）、0.1 mg/ml（ＡＳ４８抗体）に調製した各精製抗体を含む各試験溶液を100μｌずつ加え、これを常温で60分間静置し、抗原抗体反応させた。反応終了後、各ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄し、二次抗体溶液として、反応液Ａで2000倍希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇ（ダコ社製）溶液を100μlずつ加え、これを常温で60分間静置して抗原抗体反応させた。反応終了後、このプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、ＨＲＰの基質としてＴＭＢ溶液（ＨＲＰ基質溶液；BIOFX社製）を100μlずつ 加え、常温で30分間反応させて発色させた。続いて、プレートに反応停止液（BIOFX社製）を100μlずつ 加えて反応を停止させた後、ＴＭＢ分解によって増加する波長450nmの吸光度（対照波長630nm）をウェルリーダーＳＫ−６０３（登録商標；生化学工業株式会社販売）で測定した。なお、抗体の反応性は、上記の各濃度のＢｉ−ＧＡＧを用いて作製したＢｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレートを用いて上記測定を行った場合の吸光度から、Ｂｉ−ＧＡＧ溶液の代わりにＢｉ−ＧＡＧを含まない０．０５％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍希釈したApplieDuo（登録商標）溶液を用いることの他、参考例６ ２）と同様の方法により作製したコントロール測定用マイクロプレートを用いて上記の測定方法に準じて測定を行った場合の吸光度（ブランク値）を減算した吸光度差（以下、単に「吸光度差」と記載する）によって評価した。
１）−２ 結果
結果を、図４に示す。ＡＳに対するＡＳ２２抗体とＡＳ４８抗体の相対感度は、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体のそれよりも100倍の強度があった。Ｂｉ−ＡＳ濃度が1.0 μg/ml（0.1μg/ウェル）のとき、すべての抗体は強い反応性（吸光度差；≧１）を示した。
２） 各精製抗体の反応性試験その２−各種ＧＡＧに対する反応性試験
２）−１ 方法
用いる各種Ｂｉ−ＧＡＧの濃度を、1.0 μg/ ml（0.1μg/ウェル）に固定することの他、上記１）−１と同様の方法により、各種ＧＡＧ及び各種ＨＥＰ誘導体に対する各精製抗体の反応性を評価した。

２）−２ 結果
図５に各種ＧＡＧに対する各精製抗体の反応性の結果を示す。

上記１）と同様に、各抗体はＡＳに対して強く反応した。いずれの抗体についても、ＨＳ及びＨＥＰに対して反応しないことを確認した。また、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体については、その他のＧＡＧ、すなわち、ＡＣＨ、ＥＨＳ−ＨＳ、ＫＳ、ＨＡ、ＮＡＨ、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ及びＣｈのいずれに対しても実質的に反応しないことを確認した。一方ＡＳ４８抗体は、ＥＨＳ−ＨＳ、ＫＳ、ＨＡ、ＮＡＨ、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ及びＣｈのいずれに対しても反応しなかったが、ＡＣＨに対しては約５５％の反応性を有していることを確認した。

これらの結果から、２−Ｏ硫酸化イズロン酸（IdoA(2S))残基がこれらの抗体のエピトープに含まれていることが示唆された。さらに、各抗体が反応性を示さなかったＨＳ及びＨＥＰの分子中には、IdoA(2S)のα(1-4)結合が存在するが、その大部分はGlcNS又はO-硫酸化GlcNSと結合した二糖ユニットとして存在することから、グルコサミン残基の修飾も、これら抗体の反応にとって重要なマイナス要素であることが推察された。
３） 各精製抗体の反応性試験その３−各種ＨＥＰ誘導体に対する反応性試験
エピトープ解析の一助とするために、前記の参考例１４に記載の各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化プレートを用いることの他、上記２）−１に記載の方法に準じて反応性の評価を行うことにより、抗原のグルコサミン残基のＮ位の修飾状態が、各抗体の反応性にどのように影響するかを検証した。以下、グルコサミン残基のＮ位が「ＮＨ_２−」となっている状態を「未修飾」と記載する。結果を図６に示す。

いずれの抗体も２ＳＨと反応した。ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＳ３８抗体及びＡＳ４８抗体の反応性は、それぞれ172.2％、104.9％、76.4％、31.7％、104.8％であった。２ＳＨは主としてグルクロン酸ユニット（- [GlcA-GlcNAc]-）と２−Ｏ硫酸化イズロン酸ユニット（- [IdoA（2S）-GlcNAc]-）により構成されており、また、２−Ｏ硫酸化イズロン酸ユニットの存在比が60％以上と高いので、この結果は上記の１）及び２）の結果と矛盾しない。

一方、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体は、ＮＨ_２−２ＳＨに反応しなかった。ＮＨ_２−２ＳＨのグルコサミン残基のＮ位の大部分は未修飾となっている。したがって、これらの抗体のエピトープには、Ｎ−アセチル化したグルコサミン残基が含まれていることが示唆された。

また、ＮＡｃ−６ＤＳＨのグルコサミン残基のＮ位の一部はアセチル化されているにもかかわらず、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２５抗体及びＡＳ３８抗体はＮＡｃ−６ＤＳＨに実質的に反応せず、さらに、ＮＡｃ−ＨＥＰのグルコサミン残基のＮ位の大部分はアセチル化されているにもかかわらず、これらの抗体はＮＡｃ−ＨＥＰに実質的に反応しなかったことから、これら抗体の抗原に対する反応性は、グルコサミン残基のＮ−硫酸化及び／又はＯ−硫酸化によって阻害されることが示唆された。

ＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体は、ＮＨ_２−ＨＥＰ及び６ＤＳＨに対して実質的に反応しなかったが、それらをＮ−アセチル化したＮＡｃ−ＨＥＰ及びＮＡｃ−６ＤＳＨに対してはＡＳと同程度の反応性を示した。ＮＨ_２−ＨＥＰのグルコサミン残基のＮ位の大部分は未修飾となっている。また、６ＤＳＨのグルコサミン残基のＮ位の大部分は硫酸化されているが、その調製過程で一部にＮ−脱硫酸化が起きるため、一部は未修飾となっている。したがって、上記の結果から、ＡＳ２２抗体及びＡＳ４８抗体のエピトープには、Ｎ位が何らかの形で修飾されたグルコサミン残基、特にＮ−アセチル化されたグルコサミン残基が含まれていることが示唆された。また、ＮＡｃ−ＨＥＰ及びＮＡｃ−６ＤＳＨとの反応性から、それぞれ、そのグルコサミン残基のＯ−硫酸化やＮ−硫酸化が抗体の反応性に実質的に影響しないことが示唆された。

これらの抗体の各種糖鎖に対する反応性を表１に示す。

なお表１中の「ＡＣＳ」はＡＳを、「Heparin」はＨＥＰを、「NH2-Heparin」はＮＨ_２−ＨＥＰを、「NAc-Heparin」はＮＡｃ−ＨＥＰを、「Acetylated 6DSH」はＮＡｃ−６ＤＳＨを、「Acetylated NSH」はＮＡｃ−ＮＳＨを、「NH2-CDSH」はＮＨ_２−ＣＤＳＨを、「Acetylated NAH」はＮＡＨをそれぞれ意味する。
また表１中の「NH2」、「N-Acetyl」、「NS」、「6S」、「2S」は、それぞれ糖鎖骨格中のアミノ基、Ｎ−アセチル基、Ｎ−硫酸基、６−Ｏ硫酸基、２−Ｏ硫酸基を示す。また、表１中の◎の記号、○の記号、△の記号及び×の記号は、糖鎖中における当該基の存在量のイメージを示すものである。
◎の記号は当該基が糖鎖中に多く存在するというイメージ、○の記号は当該基が糖鎖中に比較的多く存在するというイメージ、△の記号は当該基が糖鎖中にあまり存在しないというイメージ又は不明であること、×の記号は当該基が糖鎖中に実質的に存在しないというイメージをそれぞれ示す。ただし◎、○及び△は、あくまでイメージであって、当該基の絶対量を意味するものではなく、それぞれの記号相互間において必ずしも同レベルであることを意味しない。
表１中の各抗体の名称の直下に示した数字（左から、0.02、0.05、0.01、0.005、0.15、0.05）は、反応させた各抗体の濃度（μg/ml）を示す。これらの抗体を、左に列記した各種ＧＡＧのビオチン標識物（１μg/ml）と反応させてその反応性を評価した。
表１から、例えばＡＣＳ２２抗体は、ＮＡｃ−ＨＥＰ（６−Ｏ硫酸基及び２−Ｏ硫酸基を保持している点が１つの特徴である）とＮＡｃ−６ＤＳＨ（Ｎ−硫酸基及び２−Ｏ硫酸基を保持している点が１つの特徴である）に高い結合性を有していることがわかる。

フローサイトメトリー
扁平上皮癌由来細胞株であるＨＳＣ−４株（Anticancer Res., 2005 Nov-Dec; 25(6B): 4053-4059）、ＨＯ−１−ｕ−１株（Oncol. Rep., 2004 Aug; 12(2): 339-345）及びＨＯ−１Ｎ−１株（Cancer. Lett. 2000 Apr 14; 151(2): 199-208）、並びに大腸癌由来細胞株であるＬＳ１７４Ｔ株（Clin. Cancer Res., 2006 Mar 1; 12(5): 1606-1614）及びＣ−１株（Cancer Res. 2001 Jun 1; 61(11): 4620-4627）を生体組織由来の試料として用いた。コントロールとして、大腸癌由来細胞株であるＣＯＬＯ２０１株（Cancer Res. 1994 Jan 1; 54(1): 272-275）を用いた。

また実験によっては、これらの細胞をへパリチナーゼＩ（Flavobacterium heparinum由来；生化学工業株式会社製）で処理して用いた。

また抗体（一次抗体）として、前記の抗体、及び１０Ｅ４及びＪＭ４０３（いずれも抗ＨＳモノクローナル抗体）、３Ｇ１０（抗−Δ−ＨＳモノクローナル抗体）、ＮＡＨ４６（抗ＮＡＨモノクローナル抗体（「抗ＨＳ抗体」として販売されている。）；いずれも生化学工業株式会社製）を用いた。

前記の細胞の懸濁液に、終濃度５μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌとなるように一次抗体を添加して４℃で３０分間インキュベートした。その後、終濃度２％のＦＣＳを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで添付の説明書に記載されている推奨希釈倍率（1/20から1/400）に従って1/200に希釈した二次抗体（ＦＩＴＣ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Chemicon；カタログ番号AQ326F））を添加して４℃で３０分間インキュベートした。その後、終濃度２％のＦＣＳを含有するＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーにより解析した。なお、一次抗体を用いずに二次抗体のみでインキュベートしたものをコントロールとした。結果を図７〜図２０に示す。なお各図とも、左側の一番上のグラフは、解析に付した細胞のポピュレーションを示すものである。また各図とも、左側の一番上以外のグラフの横軸は蛍光強度を、縦軸は細胞数を示す。また各図とも、左側の一番上以外のグラフ中の左側の位置に存在する山型の実線はコントロールを示す。このコントロールよりも実線のピークが右側にシフトしている場合には、一次抗体が細胞に結合している（一次抗体によって細胞が染色されている）ことになる。

図７〜図２０より、いずれの癌由来細胞株もＮＡＨ４６で染色されることが示された。

そのうちＨＳＣ−４株、ＨＯ−１Ｎ−１株についてはＮＡＨ４６に加えて、１０Ｅ４、ＪＭ４０３によっても染色された。この染色性は細胞をヘパリチナーゼＩで処理してもほとんど変化しなかった。またＣ−１株についても、ＨＳＣ−４株やＨＯ−１Ｎ−１株よりは若干弱いながらも１０Ｅ４、ＪＭ４０３によって染色された。

またＬＳ１７４Ｔ株については、ＮＡＨ４６に加えて、１０Ｅ４、ＪＭ４０３によって染色された。さらに驚くべきことに、ＬＳ１７４Ｔ株はＡＳ２２、ＡＣＨ５５によっても染色された。この染色性は細胞をヘパリチナーゼ処理してもほとんど変化しなかった。

以上の結果から、「ＡＣＨに結合する抗体」及び／又は「ＡＳに結合する抗体」を生体組織由来の試料に接触させることにより、癌の検出ができることが示された。

以下の構成成分からなる本発明キットを作製した。
精製したＡＳ２２抗体 １本（一次抗体）
精製したＡＣＨ５５抗体 １本（一次抗体）
３．ＦＩＴＣ標識した抗マウスイムノグロブリン抗体 １本（二次抗体）
４．ＡＳ（標準品） １本
５．ＡＣＨ（標準品） １本
６．洗浄液（ＰＢＳ） １本

各種ＨＥＰ誘導体の製造方法の流れを示す図である。 ＡＣＨ５５抗体の各種ＧＡＧに対する反応性を示す図である。横軸のＢｉ−ＧＡＧ（μg/ml）は、Ｂｉ−ＧＡＧ固相化プレートの作製において用いたＢｉ−ＧＡＧ溶液におけるＢｉ−ＧＡＧの終濃度を示す。 ＡＣＨ５５抗体の各種ＨＥＰ誘導体等に対する反応性を示す図である。 ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＳ３８抗体及びＡＳ４８抗体の、ＡＳに対する反応性を示す図である。横軸のＢｉ−ＡＳ（μg/ml）は、Ｂｉ−ＡＳ固相化プレートの作製において用いたＢｉ−ＡＳ溶液におけるＢｉ−ＡＳの終濃度を示す。 ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＳ３８抗体及びＡＳ４８抗体の、各種ＧＡＧに対する反応性を示す図である。 ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＳ３８抗体及びＡＳ４８抗体の、各種ＨＥＰ誘導体等に対する反応性を示す図である。 ＣＯＬＯ２０１株における、各抗体の結合の程度を示す図である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも５μg/mlとした。 ＣＯＬＯ２０１株における、各抗体の結合の程度を示す図である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 ＨＳＣ−４株における、各抗体の結合の程度を示す図である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 ＨＯ−１−ｕ−１株における、各抗体の結合の程度を示す図である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 ＨＯ−１Ｎ−１株における、各抗体の結合の程度を示す図である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 ＨＳＣ−４株における、各抗体の結合の程度を示す図（図９と別途独立に試験した結果）である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ２２抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６、３Ｇ１０をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 ヘパリチナーゼＩで処理したＨＳＣ−４株における、各抗体の結合の程度を示す図である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ２２抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６、３Ｇ１０をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 ＬＳ１７４Ｔ株における、各抗体の結合の程度を示す図である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ２２抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６、３Ｇ１０をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 ヘパリチナーゼＩで処理したＬＳ１７４Ｔ株における、各抗体の結合の程度を示す図である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ２２抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６、３Ｇ１０をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 ＨＳＣ−４株における、各抗体の結合の程度を示す図（図９及び図１２と別途独立に試験した結果）である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６、３Ｇ１０をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 ヘパリチナーゼＩで処理したＨＳＣ−４株における、各抗体の結合の程度を示す図（図１３と別途独立に試験した結果）である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６、３Ｇ１０をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 Ｃ−１株における、各抗体の結合の程度を示す図である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６、３Ｇ１０をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 ＬＳ１７４Ｔ株における、各抗体の結合の程度を示す図（図１４と別途独立に試験した結果）である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６、３Ｇ１０をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。 ヘパリチナーゼＩで処理したＬＳ１７４Ｔ株における、各抗体の結合の程度を示す図（図１５と別途独立に試験した結果）である。左側の上から２番目のグラフから下に向かって順に、ＡＳ１７抗体、ＡＳ２２抗体、ＡＳ２５抗体、ＡＣＨ５５抗体をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。また、右側の一番上のグラフから下に向かって順に１０Ｅ４、ＪＭ４０３、ＮＡＨ４６、３Ｇ１０をそれぞれ一次抗体として用いた結果を示す。なお、一次抗体の終濃度はいずれも２０μg/mlとした。

Claims (17)

1. 「２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に結合する抗体」及び／又は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７５、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７６、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７８であるハイブリドーマにより産生される抗体である「アカラン硫酸に結合する抗体」を生体組織由来の試料に接触させるステップを少なくとも含む、癌の検出方法。
2. 「２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に結合する抗体」が、アカラン硫酸に結合しないものである、請求項１に記載の方法。
3. 「２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に結合する抗体」が、Ｎ−アセチルヘパロザンに結合しないものである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 「２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に結合する抗体」が、ブタ腸由来のヘパリンに結合しないものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 「２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に結合する抗体」が、ウシ腎臓由来のヘパラン硫酸に結合しないものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 「２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に結合する抗体」が、マウスのエンジェルブレス−ホーム−スワーン腫瘍組織由来のヘパラン硫酸に結合しないものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 「２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に結合する抗体」が、モノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 「２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に結合する抗体」が、タンパク質と２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸とを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
9. リンパ球及びミエローマ細胞が、マウス由来である、請求項８に記載の方法。
10. 「２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に結合する抗体」の免疫グロブリンクラスがＩｇＭである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 「２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に結合する抗体」が、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７９であるハイブリドーマにより産生される抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 「アカラン硫酸に結合する抗体」が、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７５であるハイブリドーマにより産生される抗体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 生体組織が、脊椎動物の生体組織である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 癌が、大腸癌又は扁平上皮癌である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 癌が、大腸癌である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 「２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸抗体に結合する抗体」及び／又は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７４、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７５、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７６、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７７又はＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７８であるハイブリドーマにより産生される抗体である「アカラン硫酸に結合する抗体」を構成成分として少なくとも含む、癌の検出キット。
17. 「アカラン硫酸に結合する抗体」が、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−１０７７５であるハイブリドーマにより産生される抗体である、請求項１６に記載のキット。

Images