JP2004208604A - 新規酵素活性測定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】簡便で、短時間で多量に処理できしかも感度の良く定量できる、ＳＨＡＰ−ＨＡの合成を触媒する酵素の測定方法を得る。
【解決手段】下記の工程を含むことを特徴とする酵素活性測定方法。
（１）検体にヒアルロン酸とインター−α−トリプシンインヒビターとを共存させ、酵素反応条件下に置く工程；
（２）酵素反応により単位時間内に検体中に形成された「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質」と「ヒアルロン酸」との結合体を定量する工程；
（３）前記結合体の定量値を、検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体合成酵素」の活性とする工程。
【選択図】 なし
【解決手段】下記の工程を含むことを特徴とする酵素活性測定方法。
（１）検体にヒアルロン酸とインター−α−トリプシンインヒビターとを共存させ、酵素反応条件下に置く工程；
（２）酵素反応により単位時間内に検体中に形成された「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質」と「ヒアルロン酸」との結合体を定量する工程；
（３）前記結合体の定量値を、検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体合成酵素」の活性とする工程。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規酵素活性測定方法に関し、より詳細には、「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との結合体」の形成を触媒する「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体合成酵素（以下「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」とも略記する）」の活性を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清中の蛋白質の１つとして高濃度（０．４ ｍｇ／ｍｌ）に存在しているインター−α−トリプシンインヒビター（以下、「ＩＴＩ」とも記載する）は、２本の重鎖（ＨＣ１およびＨＣ２）とビクニン（ｂｉｋｕｎｉｎ）と呼ばれる低分子コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの３種類の異なる蛋白質からなる複合体であり、同じく血清中に存在するプレ−α−インヒビター（ＰαＩ）は一本の重鎖（ＨＣ３）とビクニンとの複合体である。かかる重鎖は、ヒアルロン酸（以下「ＨＡ」とも略記する）との結合性を有することから、血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質（以下「ＳＨＡＰ」とも略記する）とも呼ばれている（非特許文献１）。血清中における「ＳＨＡＰとヒアルロン酸との結合体（以下「ＳＨＡＰ−ＨＡ」とも記載する）」は、リウマチ性関節炎や変形性膝関節症の患者で上昇することが知られている（非特許文献２）。
【０００３】
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡの定量方法としては、従来酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法を改変した方法でなされていた（特許文献１）。例えば血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体合成酵素の活性の測定は、かかる酵素反応の速度が遅いこと等の理由から、血清にヒアルロン酸を添加し、血清中の酵素でヒアルロン酸と血清中のＩＴＩとを２４時間反応させて、ＳＨＡＰ−ＨＡを形成させ、これを超遠心分離、ヒアルロニダーゼによる消化、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びウエスタンブロッティング法を組み合わせた方法で、行っていたため、全行程で約１週間の期間が必要とされていた（非特許文献１）。一方、長時間の酵素反応後、一回目の電気泳動により原点に残ったＳＨＡＰ−ＨＡをヒアルロニダーゼで処理し、遊離したＳＨＡＰを抗ＩＴＩ抗体を使った免疫電気泳動する二段階電気泳動により測定する方法も報告されている（非特許文献３）が、全行程で３ないし４日間の期間がかかり、定量性に問題があった。また、従来の方法は、検体内在性のＩＴＩをヒアルロン酸との反応に用いていたため、検体はＩＴＩを含む検体（実質的には血清、関節液）に限られていた。
【０００４】
【特許文献】特開平１０−８２７８４号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９３）２６８， ２６７２５−２６７３０
【非特許文献２】Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，（１９９９）２６，１２３０−１２３８
【非特許文献３】Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，（２００２）１２４，２４９−２５７
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性の増減は、各種の疾病とのつながりが深いと考えられ、その測定は重要視されているが、１週間程度の時間が要されるため、極めて煩雑であった。従って、様々な検体に含まれるＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性のより簡便な測定法の開発が大いに期待されていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を重ねた結果、簡便で、短時間で多量に処理できしかも感度良く定量できる、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性の測定方法を開発した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）下記の工程を含むことを特徴とする酵素活性測定方法。
（ａ）検体にヒアルロン酸とインター−α−トリプシンインヒビターとを共存させ、酵素反応条件下に置く工程；
（ｂ）酵素反応により単位時間内に検体中に形成された「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質」と「ヒアルロン酸」との結合体を定量する工程；
（ｃ）前記結合体の定量値を、検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体合成酵素」の活性とする工程。
（２）工程（ａ）において、更に二価金属陽イオンを共存させることを特徴とする（１）記載の酵素活性測定方法。
（３）工程（ｂ）における「結合体」の定量が、該結合体とヒアルロン酸親和性分子とを結合させる工程と、ヒアルロン酸親和性分子に結合した結合体を定量する工程を更に含むことを特徴とする（１）又は（２）記載の酵素活性測定方法。
（４）「ヒアルロン酸親和性分子」が、固相に固着していることを特徴とする（３）記載の酵素活性測定方法。
（５）結合体の定量が、前記結合体と「抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体」とを反応させて形成させた複合体を定量することによってなされることを特徴とする（１）〜（４）何れか記載の酵素反応測定方法。
（６）検体が細胞培養液、全血、血清、血漿、関節液、卵胞液、リンパ液、及び尿から選択される検体であることを特徴とする（１）〜（５）何れか記載の酵素活性測定方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳述する。
本発明測定法は、下記の工程を含むことを特徴とする酵素活性測定方法である。
（１）検体にＨＡとＩＴＩとを共存させ、酵素反応条件下に置く工程；
（２）酵素反応により単位時間内に検体中に形成された「ＳＨＡＰ」と「ＨＡ」との結合体を定量する工程；
（３）前記結合体の定量値を、検体中の「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」の活性とする工程。
【０００９】
本発明測定法における工程（１）は、検体にＨＡとＩＴＩとを共存させ、酵素反応条件下に置く工程である。ここで検体とは、生体内、好ましくは体内から取り出した液体状の検体（全血、血清、血漿、関節液、リンパ液、涙液、精液、乳汁、尿、卵胞液等）や細胞を培養した培養液（細胞培養液）、或いはＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の精製工程で得られた粗酵素液、精製酵素液等が例示され、特に全血、血清、血漿、関節液、リンパ液、尿、卵胞液、細胞培養液、及び精製酵素液が好ましくは挙げられるが、必ずしもこれらに限定はされない。
【００１０】
本発明測定法で「ヒアルロン酸（ＨＡ）」とは、グリコサミノグリカンの一種であり、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二糖の繰り返し構造からなる多糖である。本発明に使用するＨＡは、その由来は特に限定はされない。ＨＡの由来としては、例えばストレプトコッカス（培養法によって調製されたヒアルロン酸）や、鶏冠及び臍帯（抽出法によって調製されたヒアルロン酸）が挙げられ、何れも使用することができる。
【００１１】
本発明測定法に使用するＨＡの重量平均分子量は特に限定はされないが、例えば２，０００〜１０，０００，０００、好ましくは５，０００〜７，０００，０００、更に好ましくは１０，０００〜５，０００，０００、最も好ましくは３０，０００〜３，０００，０００が挙げられる。
【００１２】
本発明測定法に使用するＨＡは、適当な塩を形成した状態のＨＡも包含する概念である。かかる「塩」としては例えばナトリウム塩やカリウム塩等のアルカリ金属イオンとの塩、マグネシウム塩やカルシウム塩等のアルカリ土類金属イオンとの塩が例示され、特に限定はされないが、アルカリ金属イオンとの塩が好ましくは例示される。
【００１３】
検体へのＨＡを共存させる方法は、ＨＡを蒸留水、食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、或いはリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）等に予め溶解した溶液を添加して行うことが、酵素反応におけるＨＡの均一性を保つ観点から好ましい。検体中におけるＨＡの最終濃度は、５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ〜８０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌが挙げられ、５００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌが最も好ましい。しかし、これに限定はされず、本発明測定法が目的とする敏速な測定が可能な範囲において、当業者であれば適宜調整することが可能である。
【００１４】
本発明測定法に使用するＩＴＩは、内在性のものであっても遺伝子工学的に調製されたものであっても、又は生物由来の試料から抽出・精製して調製されたものであっても良く、またそのような抽出・精製を行なう前の試料で代用することも可能である。ＩＴＩは例えばＪ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２０（１９９６）， ｐｐ．１４５−１５２に記載された方法などに基づいて、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、サル或いはヒトなど、好ましくは哺乳動物の血清から精製することが可能であるが、測定対象となる酵素と由来が同一であることが好ましい。また、内在性のＩＴＩで代用する場合には、上述の哺乳動物の血清を使用することが可能である。ただし、このような血清には本発明測定法の測定対象となる「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」が含まれているため、対照として同様の検体を使用して対照の測定値を差し引く等、バックグラウンドの厳密な調整が必要となることに留意すべきである。
【００１５】
検体にＩＴＩを共存させる方法は、ＩＴＩを蒸留水、食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、或いはリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）等に予め溶解した溶液を添加して行うことが、酵素反応においてＩＴＩの均一性を保つ観点から好ましい。検体中におけるＩＴＩの最終濃度（酵素反応時の濃度）は、５ｎｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌが挙げられ、５００ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌが最も好ましい。しかしこれに限定はされず、本発明測定法が目的とする敏速な測定が可能な範囲において、当業者であれば適宜調整することが可能である。
【００１６】
尚、本発明測定法の測定対象となる「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」は、その反応に二価の金属陽イオンが必要なことが知られており（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８（１９９３）， ｐｐ．２６７２５−２６７３０）、検体にはＨＡ、ＩＴＩの他に、更に二価の金属陽イオンを共存させることが好ましい。このような金属陽イオンとしては、例えばカルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、及び亜鉛イオンが挙げられる。これらの金属陽イオンは、０．０１ｍｍｏｌ／ｌ〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜５０ｍｍｏｌ／ｌ、更に好ましくは１ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌが挙げられる。特にカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの両者を１ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌ程度含むように調製することが最も好ましい。
【００１７】
また、この様な二価金属陽イオンを反応に必要とするＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の性質から、二価金属陽イオンを捕獲する金属キレート剤を添加することにより、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の活性を完全に阻害することができる。従って「対照」として二価金属陽イオンの代わりに金属キレート剤を添加すると、内在的に検体中に存在していたＳＨＡＰ−ＨＡのみを定量することが可能となり、二価金属陽イオンを添加して反応させた場合の測定値から差し引くことで、正味の酵素活性を算出することができる。この様な金属キレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）が挙げられる。これらの金属キレート剤は、０．０１〜２０００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、更に好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／ｌ、特にＥＤＴＡを２〜４０ｍｍｏｌ／ｌ程度含むように調製すると対照として好ましい。また、反応液中のＮａＣｌ濃度は、０．１〜０．５ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．２〜０．３ｍｍｏｌ／ｌでＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の反応を行うことが最も好ましい。
【００１８】
本発明測定法における工程（２）は単位時間内に検体中に形成された「ＳＨＡＰ」と「ＨＡ」との結合体を定量する工程である。酵素反応を行なう時間は、５分以上であれば特に限定はされないが、好ましくは２０分〜２４時間、より好ましくは３０分〜１５時間、更に好ましくは１時間〜１０時間が挙げられる。しかし、操作上からは３０分〜２時間、或いは一晩（１２〜２０時間）が最も好ましい。また、酵素反応度行なう温度は４℃以上であることが好ましく、特に２０〜４２℃、より好ましくは３０〜４０℃、最も好ましくは３５〜３７℃が挙げられる。更に酵素反応を行なうｐＨは中性付近が好ましく、ｐＨ６．５〜７．５が更に好ましく、特にｐＨ７．０〜７．３程度が好ましい。
【００１９】
本発明測定法における「ＳＨＡＰ」と「ＨＡ」との結合体の定量は、ＳＨＡＰに対する抗体を用いて行うことが、操作の簡便性、検出感度の面から好ましい。このようなＳＨＡＰに対する抗体とは、市販の抗ＩＴＩ抗体が例示され、例えばヒトＩＴＩを「ＩＴＩ」として本発明測定法で使用する場合にはウサギ抗ヒトインター−α−トリプシンインヒビター抗体（例えばＤＡＫＯ社製等）等が挙げられる。かかる抗体は、ＩＴＩの重鎖を特異的に認識する抗体であれば何れの抗体であっても使用することができる。
【００２０】
かかる抗体を使用したＳＨＡＰ−ＨＡの定量は、例えばアクリルアミドゲルを用いて（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等）によりＳＨＡＰ−ＨＡを泳動し、かかる泳動の後のゲルを抗体で標識し、更に上記抗体に対する抗体（二次抗体：ペルオキシダーゼ、放射性物質、或いは蛍光物質などで標識物質で標識したもの）を用いてその検出量から行うことができる。しかし、より簡便な定量を行うためには、以下の方法が例示される。すなわち、固相にヒアルロン酸親和性分子を固着させ、そこにＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の反応によって生じたＳＨＡＰ−ＨＡを、ＳＨＡＰ−ＨＡのＨＡ部分を介して結合させ、固液分離手段を用いて上記「ヒアルロン酸に特異的に結合する物質」を介して固相に結合したＳＨＡＰ−ＨＡを検体から分離する。この固相に対して抗ＩＴＩ抗体と、その抗体に対する抗体であって標識物質を結合させてある抗体（標識された二次抗体）とを使用し、二次抗体を検出して定量を行うことが好ましい。
【００２１】
なお、本発明測定法における「ヒアルロン酸親和性分子」とは、例えばヒアルロン酸結合性プロテオグリカン（アグリカン、バーシカン／ＰＧ−Ｍ、ニューロカン等）や、それらの糖鎖を切断したコアタンパク質、及びヒアルロン酸結合領域を含むポリペプチド、抗ヒアルロン酸抗体、ヒアルロン酸結合性タンパク質（以下「ＨＡＢＰ」とも略記する）、ヒアルロン酸結合性の合成ペプチド等が挙げられ、天然物からの精製によって得られたものでも、化学合成で得られたものでも使用することが可能である。
【００２２】
また、上記「固相」とは、例えばマイクロプレート、ゲル（シリカゲル、アガロースゲルなど）、ビーズ、チューブ、メンブレン、微粒子状固相担体〔例えば、ゼラチン粒子、カオリン粒子、合成ポリマー粒子（ラテックス粒子等）〕などが例示され、マイクロプレート、ビーズ、チューブ又は微粒子固相担体が好ましく、特に取扱、測定の簡便性からマイクロプレートが好ましい。また、固相に固着したＳＨＡＰ−ＨＡは固液分離手段によって液相から分離するが、固相としてマイクロプレートやチューブ、メンブレンを使用する場合には溶液を廃棄する等の通常の手段で固液分離を行うことが可能である。固相としてゲル、ビーズ、微粒子状固相担体を使用する場合には、例えば濾紙による濾過、遠心分離等の手段で固液分離を行うことができる。
【００２３】
また、標識物質としては、例えば特異的結合対（例えばビオチンとストレプトアビジン等のアビジン類、又はレクチンと糖鎖）の一方の物質；フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン、ユーロピウム、フィコシアニン、ローダミン、テキサスレッド、ウンベリフェロン、トリカラー、シアニン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）等の蛍光物質；アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素類；ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、２，４−ジニトロアニリン等のハプテン；１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ等のアイソトープ等を用いることが可能であるが、検出、定量の容易性から酵素類及びアイソトープが好ましく、特に酵素類、その中でもペルオキシダーゼが取扱の容易性から好ましい。
【００２４】
このような方法によって得られた定量値を、工程（３）で検体中の「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」の活性とすることで本発明測定法はなされる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
＜精製方法＞
ＩＴＩはマウス血清から以下の方法で精製して使用した。
すなわち、２０ｍｌのマウスの血清に０．２ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１ｍｏｌ／ｌ：ｐＨ７．２）、０．２ｍｌのＮａＣｌ（３ｍｏｌ／ｌ）、０．２ｍｌのＥＤＴＡ（０．５ｍｏｌ／ｌ：ｐＨ８．０）を添加し、これを０．１５ｍｏｌ／ｌでＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（平衡化緩衝液）で平衡化したカラム容積１０ｍｌのＱ−セファロースカラム（ファルマシア社製）に通筒した。平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、次いで０．３ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で洗浄した。その後、０．４５ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でＩＴＩの溶出を行なった。溶出したＩＴＩは５０％の飽和硫酸アンモニウムで塩析により溶液から沈殿させた（この様にして得られたＩＴＩを以下「精製ｍＩＴＩ」と記載する）。タンパク質濃度はＭｉｃｒｏＢＣＡキット（ピアス社製）で説明書に従って行なった。
【００２６】
＜測定方法＞
ＳＨＡＰ−ＨＡの測定は、Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．， （１９９９）２６， ｐｐ．１２３０−１２３８及び特開平１０−８２７８４号に記載された方法を改変しておこなった。すなわち、
（１）ＨＡＢＰ（生化学工業株式会社製）を４μｇ／ｍｌで含む０．１ｍｏｌ／ｌの炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．２）を９６穴マルチプレート（ナルジェヌンク社製）に一穴あたり５０μｌずつ添加し、４℃で１４時間インキュベートした。
（２）このマルチプレートをＰＢＳにより３回洗浄し、その後３％の牛血清アルブミンを含むＰＢＳを一穴あたり２００μｌずつ添加して室温で２時間インキュベートし、ブロッキングを行なった。
（３）このマルチプレートをＴｗｅｅｎ２０（商標名）を０．１％（ｗ／ｖ）で含むＰＢＳ（以下「ＰＢＳＴ」とも記載する）で３回洗浄した。
（４）検体を一穴あたり５０μｌずつ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
（５）このマルチプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
（６）ＰＢＳＴでヒト由来の抗ＩＴＩ抗体（ウサギ抗ヒトＩＴＩ抗体：Ｄａｋｏ社製：一次抗体）を３，０００倍に希釈した一次抗体液を調製し、これを一穴あたり５０μｌずつ添加して、その後３７℃で１時間インキュベートした。
（７）このマルチプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
（８）ＰＢＳＴで西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼで標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を３，０００倍に希釈して二次抗体液を調製し、これを一穴あたり５０μｌずつ添加して、その後３７℃で１時間インキュベートした。
（９）このマルチプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
（１０）テトラメチルベンジジン発色液（ＫＰＬ社製）を一穴あたり５０μｌずつ添加し、３７℃で１５分間反応させ、その後１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌを５０μｌずつ添加して反応を停止させた。
（１１）ペルオキシダーゼによる発色を４５０ｎｍの吸光度により測定した。
【００２７】
＜検量線の作成＞
前記測定方法の（４）で検体に代えて、ＳＨＡＰ−ＨＡの標準液（特開平１０−８２７８４号）を加えて測定を行なった（図１）。
その結果、ＳＨＡＰ−ＨＡ濃度が０．１〜２μｇ／ｍｌの範囲内で確実に直線性が得られ、定量性が確認された。以下、この検量線を用いて、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の活性を算出した。すなわち１時間に１μｇ／ｍｌのＳＨＡＰ−ＨＡを合成する活性を１単位（ｕｎｉｔ）とした。
【００２８】
＜実施例１＞ 細胞培養液におけるＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性の測定
ラット脳腫瘍由来グリオーマ細胞株Ｃ６、ラット副腎由来交感神経様細胞株ＰＣ１２、ヒト肺由来線維芽細胞株ＩＭＲ９０、ヒト肝癌由来へパトーマ株ＨＬＦを１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むダルベッコの調整イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でコンフルエントに近くなるまで培養し（２〜３日程度）、ついで血清を添加しないコスメディウム００１培地に変えて２日に１回培地を交換し、最初の２回の培地は廃棄して、３回目から数回の培養液を集めて酵素標品とした。
【００２９】
培養液４０μｌに、精製ＩＴＩ（０．２ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）５μｌ（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）、鶏冠由来のヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量８００，０００；生化学工業株式会社製）（５０μｇ／ｍｌＰＢＳ）１μｌ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２溶液（０．１ｍｏｌ／ｌＰＢＳ）１μｌ、及びＰＢＳ ３μｌを混合し、全体を５０μｌに調製した（これを以下「反応液」とも記載する）。なお対照として、ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２溶液に代えてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（０．５ｍｏｌ／ｌ）１μｌを添加した対照を調製した。これらを３７℃で１４時間反応させ、その反応液中のＳＨＡＰ−ＨＡの含量を上記測定方法により測定した（表１）。
【００３０】
【表１】
【００３１】
その結果、ラット脳腫瘍由来グリオーマ細胞株Ｃ６が他の細胞に比べ非常に高い「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体合成酵素」の活性を示すことが明かとなった。
【００３２】
＜実施例２＞ ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の反応最適条件の決定
上記ラット脳腫瘍由来グリオーマ細胞株Ｃ６の細胞培養液を検体として、ＳＨＡＰ−ＨＡの形成反応の最適条件を決めた。反応液中、ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量８００，０００；生化学工業株式会社製）を０から２μｇ／ｍｌ、精製ｍＩＴＩを０から１６μｇ／ｍｌ、検体量を０から４５μｌそれぞれ添加量を変えて、実施例１と同様に反応を行い、上記測定方法に従って測定を行った（図２〜図４）。
【００３３】
その結果、反応液５０μｌの条件下において、ＨＡは０．５〜１μｇ／ｍｌが適当であるが、量をさらに過剰にしてもそれほど測定値は低下しなかった（図２）。精製ｍＩＴＩは１６μｇ／ｍｌ以上の量が必要であった（図３）。従って実施例１の２０μｇ／ｍｌが適当と考えられる。検体の量は用量依存的に測定値が増加するが、反応液量に対して２０％以上の添加が適当であった（図４）。
なお、酵素の活性化に必要な二価金属塩（ＣａＣｌ２，ＭｇＣｌ２）は１〜２ｍｍｏｌ／ｌ、酵素阻害剤であるＥＤＴＡは５〜１０ｍｍｏｌ／ｌが適当であった。
【００３４】
＜実施例３＞ 血清中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性の測定
ＰＢＳで５倍希釈した２種類のヒト標準血清（健常人から採取した血液から調製した血清：ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素及びＩＴＩを含有する：血清１、血清２）２５μｌ、ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量８００，０００；生化学工業株式会社製）Ｏ．５μｌ（最終濃度２μｇ／ｍｌ）として、実施例１と同様に１４時間反応させ、上記測定方法に従って測定を行った（表２）。
【００３５】
【表２】
【００３６】
原液のヒト標準血清で、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性が測定でき、「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」の存在が確認できた。
【００３７】
＜実施例４＞ ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素反応の反応時間による変化
実施例３のヒト標準血清を検体として用いて、実施例３に準じて酵素反応時間による変化を調べた。反応は３７℃で３０分から２４時間行った（表３）。
【００３８】
【表３】
【００３９】
その結果、約１４時間まで暫時ＳＨＡＰ−ＨＡは増加し、反応は一晩（１４時間程度）が適当であることが確認された。また、反応時間が３０分であっても測定値に差が現れていることからも、反応時間は３０分であっても本発明測定法は実施可能であることが示された。
【００４０】
＜実施例５＞ 卵胞液中に存在する酵素活性の測定
０．３ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ含有５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）で５０倍希釈したヒト卵胞液を１０μｌ用い、ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量８００，０００；生化学工業株式会社製）０．５μｌ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）として、精製ｍＩＴＩ２μｌ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）として実施例１と同様に反応し、上記測定方法に従って測定を行った（表４）。
【００４１】
【表４】
【００４２】
ヒト卵胞液は、非常に高い酵素活性を示し、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素が多く存在していることが分かった。
【００４３】
＜実施例６＞ ＲＡ患者血清中の酵素活性
慢性リウマチ関節炎（ＲＡ）の患者血清は、内在性のＳＨＡＰ−ＨＡ濃度が非常に高いことが知られている。内在性のＳＨＡＰ−ＨＡの影響を少なくするためにＲＡ患者血清（５検体）を希釈してその酵素活性の測定を行った。血清をＰＢＳで２０倍に希釈し、その５μｌを用い、ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量８００，０００：生化学工業株式会社製）（１００μｇ／ｍｌ）０．５μｌ、精製ｍＩＴＩ（０．２ｍｇ／ｍｌ）２μ１、ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２液（各０．１ｍｏｌ／ｌ）１μｌ（対照は代わりに０．５ｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ１μｌ）、ＰＢＳを加え、全量を５０μｌとして反応を行った（３７℃、一晩）、この反応液を用いて上記測定方法に従って測定を行った（表５）。
【００４４】
【表５】
【００４５】
内在性ＳＨＡＰ−ＨＡが多いＲＡ患者血清は希釈すると、対照の値が下がり、酵素反応との差がはっきりして、充分に酵素活性が測定できることが分かった。実施例３の測定結果と対比しても、ＲＡ患者においてＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の活性が大幅に高まっていることが明かとなったことから、本発明測定法が関節炎の血清診断にも応用できる可能性が示された。
【００４６】
【発明の効果】
細胞培養液、全血、血清、血漿、関節液、卵胞液などの体液等に含まれるＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の活性を迅速に定量でき、該酵素の精製のための手段として使用することも可能である。また、本発明測定法を使って、血清、関節液、卵胞液、リンパ液、尿などを測定することにより、ＲＡ等の関節炎、肝炎、婦人の不妊症の診断に有用となる可能性がある。本発明測定法により、該酵素の阻害剤や促進剤の働きを測定することが可能であり、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の阻害剤や促進剤の開発にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】作成したＳＨＡＰ−ＨＡの検量線を示す図である。横軸はＳＨＡＰ−ＨＡの検体中での濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は４５０ｎｍの波長の吸光度を示す。
【図２】本発明測定法における、ヒアルロン酸ナトリウムの反応液への添加量が測定値に与える影響を示す図である。横軸（ＨＡ）は反応液中のヒアルロン酸ナトリウムの濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は４５０ｎｍの波長の吸光度を示す。
【図３】本発明測定法における、ＩＴＩの反応液への添加量が測定値に与える影響を示す図である。横軸（ＩＴＩ）は反応液中のインター−α−トリプシンインヒビターの濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は４５０ｎｍの波長の吸光度を示す。
【図４】本発明測定法における、検体の反応液への添加量が測定値に与える影響を示す図である。横軸（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）は反応液中の検体（細胞培養液）の濃度（％）を示し、縦軸は４５０ｎｍの波長の吸光度を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規酵素活性測定方法に関し、より詳細には、「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロン酸との結合体」の形成を触媒する「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体合成酵素（以下「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」とも略記する）」の活性を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清中の蛋白質の１つとして高濃度（０．４ ｍｇ／ｍｌ）に存在しているインター−α−トリプシンインヒビター（以下、「ＩＴＩ」とも記載する）は、２本の重鎖（ＨＣ１およびＨＣ２）とビクニン（ｂｉｋｕｎｉｎ）と呼ばれる低分子コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの３種類の異なる蛋白質からなる複合体であり、同じく血清中に存在するプレ−α−インヒビター（ＰαＩ）は一本の重鎖（ＨＣ３）とビクニンとの複合体である。かかる重鎖は、ヒアルロン酸（以下「ＨＡ」とも略記する）との結合性を有することから、血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質（以下「ＳＨＡＰ」とも略記する）とも呼ばれている（非特許文献１）。血清中における「ＳＨＡＰとヒアルロン酸との結合体（以下「ＳＨＡＰ−ＨＡ」とも記載する）」は、リウマチ性関節炎や変形性膝関節症の患者で上昇することが知られている（非特許文献２）。
【０００３】
検体中のＳＨＡＰ−ＨＡの定量方法としては、従来酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法を改変した方法でなされていた（特許文献１）。例えば血清中のＳＨＡＰ−ＨＡ結合体合成酵素の活性の測定は、かかる酵素反応の速度が遅いこと等の理由から、血清にヒアルロン酸を添加し、血清中の酵素でヒアルロン酸と血清中のＩＴＩとを２４時間反応させて、ＳＨＡＰ−ＨＡを形成させ、これを超遠心分離、ヒアルロニダーゼによる消化、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びウエスタンブロッティング法を組み合わせた方法で、行っていたため、全行程で約１週間の期間が必要とされていた（非特許文献１）。一方、長時間の酵素反応後、一回目の電気泳動により原点に残ったＳＨＡＰ−ＨＡをヒアルロニダーゼで処理し、遊離したＳＨＡＰを抗ＩＴＩ抗体を使った免疫電気泳動する二段階電気泳動により測定する方法も報告されている（非特許文献３）が、全行程で３ないし４日間の期間がかかり、定量性に問題があった。また、従来の方法は、検体内在性のＩＴＩをヒアルロン酸との反応に用いていたため、検体はＩＴＩを含む検体（実質的には血清、関節液）に限られていた。
【０００４】
【特許文献】特開平１０−８２７８４号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（１９９３）２６８， ２６７２５−２６７３０
【非特許文献２】Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，（１９９９）２６，１２３０−１２３８
【非特許文献３】Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，（２００２）１２４，２４９−２５７
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性の増減は、各種の疾病とのつながりが深いと考えられ、その測定は重要視されているが、１週間程度の時間が要されるため、極めて煩雑であった。従って、様々な検体に含まれるＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性のより簡便な測定法の開発が大いに期待されていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を重ねた結果、簡便で、短時間で多量に処理できしかも感度良く定量できる、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性の測定方法を開発した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）下記の工程を含むことを特徴とする酵素活性測定方法。
（ａ）検体にヒアルロン酸とインター−α−トリプシンインヒビターとを共存させ、酵素反応条件下に置く工程；
（ｂ）酵素反応により単位時間内に検体中に形成された「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質」と「ヒアルロン酸」との結合体を定量する工程；
（ｃ）前記結合体の定量値を、検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体合成酵素」の活性とする工程。
（２）工程（ａ）において、更に二価金属陽イオンを共存させることを特徴とする（１）記載の酵素活性測定方法。
（３）工程（ｂ）における「結合体」の定量が、該結合体とヒアルロン酸親和性分子とを結合させる工程と、ヒアルロン酸親和性分子に結合した結合体を定量する工程を更に含むことを特徴とする（１）又は（２）記載の酵素活性測定方法。
（４）「ヒアルロン酸親和性分子」が、固相に固着していることを特徴とする（３）記載の酵素活性測定方法。
（５）結合体の定量が、前記結合体と「抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体」とを反応させて形成させた複合体を定量することによってなされることを特徴とする（１）〜（４）何れか記載の酵素反応測定方法。
（６）検体が細胞培養液、全血、血清、血漿、関節液、卵胞液、リンパ液、及び尿から選択される検体であることを特徴とする（１）〜（５）何れか記載の酵素活性測定方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳述する。
本発明測定法は、下記の工程を含むことを特徴とする酵素活性測定方法である。
（１）検体にＨＡとＩＴＩとを共存させ、酵素反応条件下に置く工程；
（２）酵素反応により単位時間内に検体中に形成された「ＳＨＡＰ」と「ＨＡ」との結合体を定量する工程；
（３）前記結合体の定量値を、検体中の「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」の活性とする工程。
【０００９】
本発明測定法における工程（１）は、検体にＨＡとＩＴＩとを共存させ、酵素反応条件下に置く工程である。ここで検体とは、生体内、好ましくは体内から取り出した液体状の検体（全血、血清、血漿、関節液、リンパ液、涙液、精液、乳汁、尿、卵胞液等）や細胞を培養した培養液（細胞培養液）、或いはＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の精製工程で得られた粗酵素液、精製酵素液等が例示され、特に全血、血清、血漿、関節液、リンパ液、尿、卵胞液、細胞培養液、及び精製酵素液が好ましくは挙げられるが、必ずしもこれらに限定はされない。
【００１０】
本発明測定法で「ヒアルロン酸（ＨＡ）」とは、グリコサミノグリカンの一種であり、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二糖の繰り返し構造からなる多糖である。本発明に使用するＨＡは、その由来は特に限定はされない。ＨＡの由来としては、例えばストレプトコッカス（培養法によって調製されたヒアルロン酸）や、鶏冠及び臍帯（抽出法によって調製されたヒアルロン酸）が挙げられ、何れも使用することができる。
【００１１】
本発明測定法に使用するＨＡの重量平均分子量は特に限定はされないが、例えば２，０００〜１０，０００，０００、好ましくは５，０００〜７，０００，０００、更に好ましくは１０，０００〜５，０００，０００、最も好ましくは３０，０００〜３，０００，０００が挙げられる。
【００１２】
本発明測定法に使用するＨＡは、適当な塩を形成した状態のＨＡも包含する概念である。かかる「塩」としては例えばナトリウム塩やカリウム塩等のアルカリ金属イオンとの塩、マグネシウム塩やカルシウム塩等のアルカリ土類金属イオンとの塩が例示され、特に限定はされないが、アルカリ金属イオンとの塩が好ましくは例示される。
【００１３】
検体へのＨＡを共存させる方法は、ＨＡを蒸留水、食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、或いはリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）等に予め溶解した溶液を添加して行うことが、酵素反応におけるＨＡの均一性を保つ観点から好ましい。検体中におけるＨＡの最終濃度は、５ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ〜８０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌが挙げられ、５００ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌが最も好ましい。しかし、これに限定はされず、本発明測定法が目的とする敏速な測定が可能な範囲において、当業者であれば適宜調整することが可能である。
【００１４】
本発明測定法に使用するＩＴＩは、内在性のものであっても遺伝子工学的に調製されたものであっても、又は生物由来の試料から抽出・精製して調製されたものであっても良く、またそのような抽出・精製を行なう前の試料で代用することも可能である。ＩＴＩは例えばＪ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２０（１９９６）， ｐｐ．１４５−１５２に記載された方法などに基づいて、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、サル或いはヒトなど、好ましくは哺乳動物の血清から精製することが可能であるが、測定対象となる酵素と由来が同一であることが好ましい。また、内在性のＩＴＩで代用する場合には、上述の哺乳動物の血清を使用することが可能である。ただし、このような血清には本発明測定法の測定対象となる「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」が含まれているため、対照として同様の検体を使用して対照の測定値を差し引く等、バックグラウンドの厳密な調整が必要となることに留意すべきである。
【００１５】
検体にＩＴＩを共存させる方法は、ＩＴＩを蒸留水、食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、或いはリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）等に予め溶解した溶液を添加して行うことが、酵素反応においてＩＴＩの均一性を保つ観点から好ましい。検体中におけるＩＴＩの最終濃度（酵素反応時の濃度）は、５ｎｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌが挙げられ、５００ｎｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌが最も好ましい。しかしこれに限定はされず、本発明測定法が目的とする敏速な測定が可能な範囲において、当業者であれば適宜調整することが可能である。
【００１６】
尚、本発明測定法の測定対象となる「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」は、その反応に二価の金属陽イオンが必要なことが知られており（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８（１９９３）， ｐｐ．２６７２５−２６７３０）、検体にはＨＡ、ＩＴＩの他に、更に二価の金属陽イオンを共存させることが好ましい。このような金属陽イオンとしては、例えばカルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、及び亜鉛イオンが挙げられる。これらの金属陽イオンは、０．０１ｍｍｏｌ／ｌ〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１ｍｍｏｌ／ｌ〜５０ｍｍｏｌ／ｌ、更に好ましくは１ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌが挙げられる。特にカルシウムイオン及びマグネシウムイオンの両者を１ｍｍｏｌ／ｌ〜１０ｍｍｏｌ／ｌ程度含むように調製することが最も好ましい。
【００１７】
また、この様な二価金属陽イオンを反応に必要とするＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の性質から、二価金属陽イオンを捕獲する金属キレート剤を添加することにより、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の活性を完全に阻害することができる。従って「対照」として二価金属陽イオンの代わりに金属キレート剤を添加すると、内在的に検体中に存在していたＳＨＡＰ−ＨＡのみを定量することが可能となり、二価金属陽イオンを添加して反応させた場合の測定値から差し引くことで、正味の酵素活性を算出することができる。この様な金属キレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）が挙げられる。これらの金属キレート剤は、０．０１〜２０００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、更に好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／ｌ、特にＥＤＴＡを２〜４０ｍｍｏｌ／ｌ程度含むように調製すると対照として好ましい。また、反応液中のＮａＣｌ濃度は、０．１〜０．５ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．２〜０．３ｍｍｏｌ／ｌでＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の反応を行うことが最も好ましい。
【００１８】
本発明測定法における工程（２）は単位時間内に検体中に形成された「ＳＨＡＰ」と「ＨＡ」との結合体を定量する工程である。酵素反応を行なう時間は、５分以上であれば特に限定はされないが、好ましくは２０分〜２４時間、より好ましくは３０分〜１５時間、更に好ましくは１時間〜１０時間が挙げられる。しかし、操作上からは３０分〜２時間、或いは一晩（１２〜２０時間）が最も好ましい。また、酵素反応度行なう温度は４℃以上であることが好ましく、特に２０〜４２℃、より好ましくは３０〜４０℃、最も好ましくは３５〜３７℃が挙げられる。更に酵素反応を行なうｐＨは中性付近が好ましく、ｐＨ６．５〜７．５が更に好ましく、特にｐＨ７．０〜７．３程度が好ましい。
【００１９】
本発明測定法における「ＳＨＡＰ」と「ＨＡ」との結合体の定量は、ＳＨＡＰに対する抗体を用いて行うことが、操作の簡便性、検出感度の面から好ましい。このようなＳＨＡＰに対する抗体とは、市販の抗ＩＴＩ抗体が例示され、例えばヒトＩＴＩを「ＩＴＩ」として本発明測定法で使用する場合にはウサギ抗ヒトインター−α−トリプシンインヒビター抗体（例えばＤＡＫＯ社製等）等が挙げられる。かかる抗体は、ＩＴＩの重鎖を特異的に認識する抗体であれば何れの抗体であっても使用することができる。
【００２０】
かかる抗体を使用したＳＨＡＰ−ＨＡの定量は、例えばアクリルアミドゲルを用いて（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等）によりＳＨＡＰ−ＨＡを泳動し、かかる泳動の後のゲルを抗体で標識し、更に上記抗体に対する抗体（二次抗体：ペルオキシダーゼ、放射性物質、或いは蛍光物質などで標識物質で標識したもの）を用いてその検出量から行うことができる。しかし、より簡便な定量を行うためには、以下の方法が例示される。すなわち、固相にヒアルロン酸親和性分子を固着させ、そこにＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の反応によって生じたＳＨＡＰ−ＨＡを、ＳＨＡＰ−ＨＡのＨＡ部分を介して結合させ、固液分離手段を用いて上記「ヒアルロン酸に特異的に結合する物質」を介して固相に結合したＳＨＡＰ−ＨＡを検体から分離する。この固相に対して抗ＩＴＩ抗体と、その抗体に対する抗体であって標識物質を結合させてある抗体（標識された二次抗体）とを使用し、二次抗体を検出して定量を行うことが好ましい。
【００２１】
なお、本発明測定法における「ヒアルロン酸親和性分子」とは、例えばヒアルロン酸結合性プロテオグリカン（アグリカン、バーシカン／ＰＧ−Ｍ、ニューロカン等）や、それらの糖鎖を切断したコアタンパク質、及びヒアルロン酸結合領域を含むポリペプチド、抗ヒアルロン酸抗体、ヒアルロン酸結合性タンパク質（以下「ＨＡＢＰ」とも略記する）、ヒアルロン酸結合性の合成ペプチド等が挙げられ、天然物からの精製によって得られたものでも、化学合成で得られたものでも使用することが可能である。
【００２２】
また、上記「固相」とは、例えばマイクロプレート、ゲル（シリカゲル、アガロースゲルなど）、ビーズ、チューブ、メンブレン、微粒子状固相担体〔例えば、ゼラチン粒子、カオリン粒子、合成ポリマー粒子（ラテックス粒子等）〕などが例示され、マイクロプレート、ビーズ、チューブ又は微粒子固相担体が好ましく、特に取扱、測定の簡便性からマイクロプレートが好ましい。また、固相に固着したＳＨＡＰ−ＨＡは固液分離手段によって液相から分離するが、固相としてマイクロプレートやチューブ、メンブレンを使用する場合には溶液を廃棄する等の通常の手段で固液分離を行うことが可能である。固相としてゲル、ビーズ、微粒子状固相担体を使用する場合には、例えば濾紙による濾過、遠心分離等の手段で固液分離を行うことができる。
【００２３】
また、標識物質としては、例えば特異的結合対（例えばビオチンとストレプトアビジン等のアビジン類、又はレクチンと糖鎖）の一方の物質；フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン、ユーロピウム、フィコシアニン、ローダミン、テキサスレッド、ウンベリフェロン、トリカラー、シアニン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）等の蛍光物質；アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素類；ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、２，４−ジニトロアニリン等のハプテン；１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ等のアイソトープ等を用いることが可能であるが、検出、定量の容易性から酵素類及びアイソトープが好ましく、特に酵素類、その中でもペルオキシダーゼが取扱の容易性から好ましい。
【００２４】
このような方法によって得られた定量値を、工程（３）で検体中の「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」の活性とすることで本発明測定法はなされる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
＜精製方法＞
ＩＴＩはマウス血清から以下の方法で精製して使用した。
すなわち、２０ｍｌのマウスの血清に０．２ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１ｍｏｌ／ｌ：ｐＨ７．２）、０．２ｍｌのＮａＣｌ（３ｍｏｌ／ｌ）、０．２ｍｌのＥＤＴＡ（０．５ｍｏｌ／ｌ：ｐＨ８．０）を添加し、これを０．１５ｍｏｌ／ｌでＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（平衡化緩衝液）で平衡化したカラム容積１０ｍｌのＱ−セファロースカラム（ファルマシア社製）に通筒した。平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、次いで０．３ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で洗浄した。その後、０．４５ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌを含む５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でＩＴＩの溶出を行なった。溶出したＩＴＩは５０％の飽和硫酸アンモニウムで塩析により溶液から沈殿させた（この様にして得られたＩＴＩを以下「精製ｍＩＴＩ」と記載する）。タンパク質濃度はＭｉｃｒｏＢＣＡキット（ピアス社製）で説明書に従って行なった。
【００２６】
＜測定方法＞
ＳＨＡＰ−ＨＡの測定は、Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．， （１９９９）２６， ｐｐ．１２３０−１２３８及び特開平１０−８２７８４号に記載された方法を改変しておこなった。すなわち、
（１）ＨＡＢＰ（生化学工業株式会社製）を４μｇ／ｍｌで含む０．１ｍｏｌ／ｌの炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．２）を９６穴マルチプレート（ナルジェヌンク社製）に一穴あたり５０μｌずつ添加し、４℃で１４時間インキュベートした。
（２）このマルチプレートをＰＢＳにより３回洗浄し、その後３％の牛血清アルブミンを含むＰＢＳを一穴あたり２００μｌずつ添加して室温で２時間インキュベートし、ブロッキングを行なった。
（３）このマルチプレートをＴｗｅｅｎ２０（商標名）を０．１％（ｗ／ｖ）で含むＰＢＳ（以下「ＰＢＳＴ」とも記載する）で３回洗浄した。
（４）検体を一穴あたり５０μｌずつ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
（５）このマルチプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
（６）ＰＢＳＴでヒト由来の抗ＩＴＩ抗体（ウサギ抗ヒトＩＴＩ抗体：Ｄａｋｏ社製：一次抗体）を３，０００倍に希釈した一次抗体液を調製し、これを一穴あたり５０μｌずつ添加して、その後３７℃で１時間インキュベートした。
（７）このマルチプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
（８）ＰＢＳＴで西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼで標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を３，０００倍に希釈して二次抗体液を調製し、これを一穴あたり５０μｌずつ添加して、その後３７℃で１時間インキュベートした。
（９）このマルチプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。
（１０）テトラメチルベンジジン発色液（ＫＰＬ社製）を一穴あたり５０μｌずつ添加し、３７℃で１５分間反応させ、その後１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌを５０μｌずつ添加して反応を停止させた。
（１１）ペルオキシダーゼによる発色を４５０ｎｍの吸光度により測定した。
【００２７】
＜検量線の作成＞
前記測定方法の（４）で検体に代えて、ＳＨＡＰ−ＨＡの標準液（特開平１０−８２７８４号）を加えて測定を行なった（図１）。
その結果、ＳＨＡＰ−ＨＡ濃度が０．１〜２μｇ／ｍｌの範囲内で確実に直線性が得られ、定量性が確認された。以下、この検量線を用いて、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の活性を算出した。すなわち１時間に１μｇ／ｍｌのＳＨＡＰ−ＨＡを合成する活性を１単位（ｕｎｉｔ）とした。
【００２８】
＜実施例１＞ 細胞培養液におけるＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性の測定
ラット脳腫瘍由来グリオーマ細胞株Ｃ６、ラット副腎由来交感神経様細胞株ＰＣ１２、ヒト肺由来線維芽細胞株ＩＭＲ９０、ヒト肝癌由来へパトーマ株ＨＬＦを１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むダルベッコの調整イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でコンフルエントに近くなるまで培養し（２〜３日程度）、ついで血清を添加しないコスメディウム００１培地に変えて２日に１回培地を交換し、最初の２回の培地は廃棄して、３回目から数回の培養液を集めて酵素標品とした。
【００２９】
培養液４０μｌに、精製ＩＴＩ（０．２ｍｇ／ｍｌＰＢＳ）５μｌ（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）、鶏冠由来のヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量８００，０００；生化学工業株式会社製）（５０μｇ／ｍｌＰＢＳ）１μｌ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）、ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２溶液（０．１ｍｏｌ／ｌＰＢＳ）１μｌ、及びＰＢＳ ３μｌを混合し、全体を５０μｌに調製した（これを以下「反応液」とも記載する）。なお対照として、ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２溶液に代えてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（０．５ｍｏｌ／ｌ）１μｌを添加した対照を調製した。これらを３７℃で１４時間反応させ、その反応液中のＳＨＡＰ−ＨＡの含量を上記測定方法により測定した（表１）。
【００３０】
【表１】
その結果、ラット脳腫瘍由来グリオーマ細胞株Ｃ６が他の細胞に比べ非常に高い「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体合成酵素」の活性を示すことが明かとなった。
【００３２】
＜実施例２＞ ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の反応最適条件の決定
上記ラット脳腫瘍由来グリオーマ細胞株Ｃ６の細胞培養液を検体として、ＳＨＡＰ−ＨＡの形成反応の最適条件を決めた。反応液中、ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量８００，０００；生化学工業株式会社製）を０から２μｇ／ｍｌ、精製ｍＩＴＩを０から１６μｇ／ｍｌ、検体量を０から４５μｌそれぞれ添加量を変えて、実施例１と同様に反応を行い、上記測定方法に従って測定を行った（図２〜図４）。
【００３３】
その結果、反応液５０μｌの条件下において、ＨＡは０．５〜１μｇ／ｍｌが適当であるが、量をさらに過剰にしてもそれほど測定値は低下しなかった（図２）。精製ｍＩＴＩは１６μｇ／ｍｌ以上の量が必要であった（図３）。従って実施例１の２０μｇ／ｍｌが適当と考えられる。検体の量は用量依存的に測定値が増加するが、反応液量に対して２０％以上の添加が適当であった（図４）。
なお、酵素の活性化に必要な二価金属塩（ＣａＣｌ２，ＭｇＣｌ２）は１〜２ｍｍｏｌ／ｌ、酵素阻害剤であるＥＤＴＡは５〜１０ｍｍｏｌ／ｌが適当であった。
【００３４】
＜実施例３＞ 血清中に存在するＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性の測定
ＰＢＳで５倍希釈した２種類のヒト標準血清（健常人から採取した血液から調製した血清：ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素及びＩＴＩを含有する：血清１、血清２）２５μｌ、ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量８００，０００；生化学工業株式会社製）Ｏ．５μｌ（最終濃度２μｇ／ｍｌ）として、実施例１と同様に１４時間反応させ、上記測定方法に従って測定を行った（表２）。
【００３５】
【表２】
原液のヒト標準血清で、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素活性が測定でき、「ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素」の存在が確認できた。
【００３７】
＜実施例４＞ ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素反応の反応時間による変化
実施例３のヒト標準血清を検体として用いて、実施例３に準じて酵素反応時間による変化を調べた。反応は３７℃で３０分から２４時間行った（表３）。
【００３８】
【表３】
その結果、約１４時間まで暫時ＳＨＡＰ−ＨＡは増加し、反応は一晩（１４時間程度）が適当であることが確認された。また、反応時間が３０分であっても測定値に差が現れていることからも、反応時間は３０分であっても本発明測定法は実施可能であることが示された。
【００４０】
＜実施例５＞ 卵胞液中に存在する酵素活性の測定
０．３ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ含有５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）で５０倍希釈したヒト卵胞液を１０μｌ用い、ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量８００，０００；生化学工業株式会社製）０．５μｌ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）として、精製ｍＩＴＩ２μｌ（最終濃度８μｇ／ｍｌ）として実施例１と同様に反応し、上記測定方法に従って測定を行った（表４）。
【００４１】
【表４】
ヒト卵胞液は、非常に高い酵素活性を示し、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素が多く存在していることが分かった。
【００４３】
＜実施例６＞ ＲＡ患者血清中の酵素活性
慢性リウマチ関節炎（ＲＡ）の患者血清は、内在性のＳＨＡＰ−ＨＡ濃度が非常に高いことが知られている。内在性のＳＨＡＰ−ＨＡの影響を少なくするためにＲＡ患者血清（５検体）を希釈してその酵素活性の測定を行った。血清をＰＢＳで２０倍に希釈し、その５μｌを用い、ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量８００，０００：生化学工業株式会社製）（１００μｇ／ｍｌ）０．５μｌ、精製ｍＩＴＩ（０．２ｍｇ／ｍｌ）２μ１、ＣａＣｌ２−ＭｇＣｌ２液（各０．１ｍｏｌ／ｌ）１μｌ（対照は代わりに０．５ｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ１μｌ）、ＰＢＳを加え、全量を５０μｌとして反応を行った（３７℃、一晩）、この反応液を用いて上記測定方法に従って測定を行った（表５）。
【００４４】
【表５】
内在性ＳＨＡＰ−ＨＡが多いＲＡ患者血清は希釈すると、対照の値が下がり、酵素反応との差がはっきりして、充分に酵素活性が測定できることが分かった。実施例３の測定結果と対比しても、ＲＡ患者においてＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の活性が大幅に高まっていることが明かとなったことから、本発明測定法が関節炎の血清診断にも応用できる可能性が示された。
【００４６】
【発明の効果】
細胞培養液、全血、血清、血漿、関節液、卵胞液などの体液等に含まれるＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の活性を迅速に定量でき、該酵素の精製のための手段として使用することも可能である。また、本発明測定法を使って、血清、関節液、卵胞液、リンパ液、尿などを測定することにより、ＲＡ等の関節炎、肝炎、婦人の不妊症の診断に有用となる可能性がある。本発明測定法により、該酵素の阻害剤や促進剤の働きを測定することが可能であり、ＳＨＡＰ−ＨＡ合成酵素の阻害剤や促進剤の開発にも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】作成したＳＨＡＰ−ＨＡの検量線を示す図である。横軸はＳＨＡＰ−ＨＡの検体中での濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は４５０ｎｍの波長の吸光度を示す。
【図２】本発明測定法における、ヒアルロン酸ナトリウムの反応液への添加量が測定値に与える影響を示す図である。横軸（ＨＡ）は反応液中のヒアルロン酸ナトリウムの濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は４５０ｎｍの波長の吸光度を示す。
【図３】本発明測定法における、ＩＴＩの反応液への添加量が測定値に与える影響を示す図である。横軸（ＩＴＩ）は反応液中のインター−α−トリプシンインヒビターの濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は４５０ｎｍの波長の吸光度を示す。
【図４】本発明測定法における、検体の反応液への添加量が測定値に与える影響を示す図である。横軸（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）は反応液中の検体（細胞培養液）の濃度（％）を示し、縦軸は４５０ｎｍの波長の吸光度を示す。
Claims (6)
- 下記の工程を含むことを特徴とする酵素活性測定方法。
（１）検体にヒアルロン酸とインター−α−トリプシンインヒビターとを共存させ、酵素反応条件下に置く工程；
（２）酵素反応により単位時間内に検体中に形成された「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質」と「ヒアルロン酸」との結合体を定量する工程；
（３）前記結合体の定量値を、検体中の「血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体合成酵素」の活性とする工程。 - 工程（１）において、更に二価金属陽イオンを共存させることを特徴とする請求項１記載の酵素活性測定方法。
- 工程（２）における「結合体」の定量が、該結合体とヒアルロン酸親和性分子とを結合させる工程と、ヒアルロン酸親和性分子に結合した結合体を定量する工程を更に含むことを特徴とする請求項１又は２記載の酵素活性測定方法。
- 「ヒアルロン酸親和性分子」が、固相に固着していることを特徴とする請求項３記載の酵素活性測定方法。
- 結合体の定量が、前記結合体と「抗インター−α−トリプシンインヒビター抗体」とを反応させて形成させた複合体を定量することによってなされることを特徴とする請求項１〜４何れか一項記載の酵素活性測定方法。
- 検体が細胞培養液、全血、血清、血漿、関節液、卵胞液、リンパ液、及び尿から選択される検体であることを特徴とする請求項１〜５何れか一項記載の酵素活性測定方法。
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