JPS60173470A - 低密度のリポ蛋白質を測定する方法及び試薬 - Google Patents

低密度のリポ蛋白質を測定する方法及び試薬

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JPS60173470A JP59223130A JP22313084A JPS60173470A JP S60173470 A JPS60173470 A JP S60173470A JP 59223130 A JP59223130 A JP 59223130A JP 22313084 A JP22313084 A JP 22313084A JP S60173470 A JPS60173470 A JP S60173470A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、低密度のリボ蛋白質（ＬＤＬ　）を測定する
方法及び試薬に関する。
従来の技術 ＬＤＬ−フラクション（低密度のリボ蛋白質）（β−リ
ボ蛋白質フラクションとも呼ばれる）の測定は、リビド
の物質代謝障害の差別診断に重要性を有する。
過コレステリン血症及び過トリグリセリド面症によって
、アテローム性動脈硬化症及び心ぞう硬塞の発生が促進
される。それ故、血清中のコレステリン及びトリグリセ
リドの測定は、臨床化学上の日常の実験室で最も屡々行
われる試験に所属する。
脂肪の物質代謝に対する多くの検査は、トリグリセリド
及びコレステリンの含量の変化を測定するだけではなく
、リボ蛋白質の根底となる病理学的変位も測定する場合
Ｋ、個々の冠状弱〔ミュンヘナー・メディチニツシエ・
ボッヘンシュリフト（ＭＯｎｃｈｅｎｅｒ　Ｍｅｄｉｚ
ｉｎｉｓｃｈｅ　Ｗｏｃｈｅｎ　−５ｃｈｒｉｆｔ　）
　１２１巻（１９７９年、１６３９頁〕。
公知血漿リボ蛋白質は種々の高成分の蛋白質（アポリボ
蛋白質）、ホスホリボＦ、コレステリン及びトリグリセ
リ１７　全含有する。これらは、その挙動（異なる密度
）に基づいて分析用の超遠心分離機で及びその移動速度
に基づいてゲルの電気泳動で牛つの異なる群に分けるこ
とができる： 乳μ２脂粒 ブリーβ−リボ蛋白質二ＶＬＤＬ（著しい低密度のリボ
蛋白質） β−リボ蛋白質−ＬＤＩ・（低密度のリボ蛋白質）α−
ＩＪ　７ｆ’蛋白質−ＨＤＬ　（尚密度のリボ蛋白質）
リボ蛋白質の作用の試験に、Ｊ：す、リボ蛋白質中のＬ
ＤＬは決定的なアテローム成分であり、血液中でそれが
増加する場合には冠状心そう病の増大した危険が存在す
ることが判明した。この秋態の早期の発見及び処置は極
めて重要である。
萌細書の浄書（内容に変更なし） それ故、血清及び血漿中のＬＤＬ−濃度を定量的に測定
する実際的方法の必要が存在す。
従来ＬＤＬ−コレステリン値を測定するためには主とし
て３つの方法が使用されたが、これらは欠点を有する： （１）　超遠心分離 こ［有］方法は日常の実験室には不適当である。
それというのもこのためには特別の装置を必要とし、そ
の実施は超遠心分離で極めて慎重な操作技術及び著しく
長い時間（数日間の遠心分離）を要する。それ故、従来
この分析法は学術数学用の実験室に保留されたのに過き
ない。
（２）　続くポリアニオンの沈殿にょろりボ蛋白質バン
ドの視覚化を有する電気泳動による分離及びコレステリ
ン値の混濁単位の換算。
しかしながらこの方法は時間がかかり、特別の電気泳動
装置並びに測定するための密度計を必要とする〔ラボラ
トワル・メディカル（Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｉｒｅ　Ｍｅ
ｄｉｃａｌ　）第１巻（１９７７年）、第１４５頁〕。
明！ｍｆｆ１の浄鶏（内容に変更なし）（３）　フリー
デ、Ｓルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ　）の式によるＬＤ
Ｌ−コレステリン値の測定〔クリニカル・ケ　ミ　ス　
ト　リ　−　（Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　）　ｆＭ　Ｌ’８巻（１９７２年）、第４９９頁〕。
フリーデパルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ　）　の式によ
りＬＤＬ−コレステリン値を計算するためには、３つの
・ξラメータの測定が必要である°試料のコレステリン
値、ＨＤＬ−コレステリン値及びトリグリセリド値。そ
れ故この方法は全く実際的ではない。更にこの式は、乳
摩脂粒を含壕ない試料及びトリグリセリ１値４００　ｍ
９／ｄｉ以下を有する試料にあてはするのに過ぎない。
（４）　沈殿反応 ＬＤＬをレクチンを用いて沈殿させる方法は、ドイツ公
開特許明細書第２８５７７１０号に記載されている。し
かしながらこの方法では、ＬＤＬ−コレステリンの値は
沈殿物を再び溶解した後に初めてか又は沈殿前後のコレ
ステリン値の差異によって測定することができるのに過
ぎない。これは著しい欠点である。
Ｉ、ＤＬが沈殿の上澄み中に存在するリボ蛋白質の沈殿
法は、ドイツ特許明細書第２６００６６４号に記載され
ている。しかしこの方法は、日常の測定法としての使用
には実際に使用することができない。それというのもリ
ボ蛋白質の沈殿には、２丁和が必要だからである（２つ
の異なる因子−ポリエチレンイミン及びカチオン交換剤
の添加は、間にある培養用をともなう）。
発明が解決しようとする問題点 それ故、ＬＤＬ　−ＩＪボ蛋白質を測定するために、大
きい確実性及び分離性を有する簡単な方法及び試薬によ
る必要が存在する。ドイツ特許願Ｐ３２１５３１０．４
によれば、この問題は体液中の低密度のリボ蛋白質（Ｌ
ＤＬ　）を測定する方法によって解決される。この方法
は、検査すべき試料に高密度のリボ蛋白質（ＨＤＬ　）
−抗体を添加し、形成した不溶物を分離し、上澄みでＬ
ＤＬ又はその成分を測定することを特徴とする特に過リ
ピド血症の、即ちＶＬＤＬを多く含む血清で免疫沈殿物
の形成を促進し、免疫錯体をなお簡単で完全に遠心分離
によって除くことができる場合に好ましいことが判明し
た。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、この目的は抗体にポリアニオンと２価
のカチオンとからなる混合物を添加することによって解
決される。
本発明は、ポリアニオンと２１ｉｆｌｉのカチオンとの
混合物の添加によって抗体の性質は不利に影響されない
驚異的な確認に基づく。更に従来は４ｅ　Ｕアミンの添
加によって、ＶＩ、ＤＩ、及び他のリボ蛋白質フラクシ
ョンの所望の沈殿だけではなく、測定すべきＬＤＬの沈
殿も惹起されることが恐れらねていた。しかしながら、
意外なことにも約１５０ｍモル／ｌよりも大きい塩の濃
度で、迅速かつ完全なリボ蛋白質−抗体−錯体の集合が
、ポリアニオン及び２価のカチオンの存在によってＬＤ
Ｌの共沈殿が生じないで促進され、その遠心分離性が高
められる。ポリアニオン、例えばテキストランサルフェ
ート、ヘパリン、燐タングステン酸及びポリビニルサル
フェート及び２価のカチオンの塩化物、例えば塩化カル
シウム、−マグネシウム及び−マンがンの使用が有利な
ことが判明した。デキストランサルフェートは高分子（
分子量５　Ｘ　１０’〜２Ｘ１０’）か又は短連釦（分
子量５０００〜５００００　）であってもよい。抗体が
共有結合によってデキストランサルフェート又はヘパリ
ンに結合しているのが特に好ましく、その際結合は常法
によって行われ、こうして得られた共軛根は塩化カルシ
ウム、−マグネシウム又は−マンガントー緒拠試験に使
用する。
反応混合物中のボロアニオンの好ましい濃度範囲は、高
分子のデキストランザルフエ−１・では０．１〜８ｇ／
ｌ、短連釦のデキストランサルフェート及びヘプテンで
は１〜１５１／ｌ、ポリビニルザルフェートでは０．２
〜５ｆｌ／ｌ及び燐タングステン酸では０．６〜６　ｇ
／ｌである。
使用すべき２価の金属イオンの濃度は、反応混合物中で
好ましくは１０〜２５０ｍモル／ｌである。更に反応混
合物は、好ましくは塩化ナトリウムを濃度０．１〜１モ
ル／ｌで含有する。使用すべき緩衝剤としては、ＰＨ範
囲約６．５〜８．５の常用の緩衝液、常えばＭＦＢ（モ
ルホリンエタンスルホン酸）、トリエタノールアミン、
ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホンＭ）、ト１１ス
ー緩衝剤がこれに該当する。
抗体は、γ−グロブリン１〜”ＩｎＯｍｙ／ｍｌに相応
する濃度で存在する。
試薬の上澄み中に残留するＬＴ’）Ｌ−フラクションは
、常法によって測定することができろ。好ましくはこの
中に含まれた結合コレステリンの測定は、公知方法を使
用して行なう。このようにして測定は、例えばアルコー
ル性苛性カリでのけん化及びリーベルマン・プルチャー
Ｆ（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ−Ｂｕｒｃｈａｒｄ　）によ
る化学的測定によって行なうことができる。しかしなが
ら好ましくは酵素による測定を、コレステリンオキシダ
ーゼ及ヒコレステリンエステルを分離する酵素及び酵素
系、殊にコレステリンエステラーゼを使用して行なう。
最後の方法を使用する場合には、消費した酸素、生成し
たコレステノン又は最も好ましくは生成したＨ２Ｏ２を
公知方法によって徂Ｉ定することができる。結合したコ
レステリンの測定は公知であるので、この点で詳説する
ことは不必要である。しかしながら本発明方法の範囲内
では、ＶＴＪＤＴＪ及び乳魔脂粒のフラクションを除去
して、コレステノン又はＨ２Ｏ２の光学的測定が色反応
の範囲でさまたげられる。
混濁の生成を阻止する。それ故この方法は、特に比色に
よるコレステリンの測定法と連結するのが適当である。
しかしながら、ＬＤＬ−フラクション中に含まれたコレ
ステリン又は仙のＬＤＬ−成分、例えばアポリボ蛋白質
Ｂ、ホスホリピド及びトリグリセリげの代りにＬＤＬ−
フラクションそれ自体を測定することもでき、その際同
じようにして公知方法を使用することができる。例えば
比濁法による測定又はドイツ公開特許明細書第６００７
７６４号に記載の混濁法による計１定が挙げられる。
１（ＤＬ−抗体は、本発明の範囲内では好ましくは税脂
ＨＤＬ−抗血清の形か又はこれから精製したＨＤＬ−抗
体フラクションの形で使用する。ＨＤＬ−抗体フラグメ
ント、例えばＦａｂ　−、Ｆａｂ２−及びＦａｂ’−フ
ラグメントを使用することもできる。同じようにしてＨ
Ｔ）Ｌのアポリボ蛋白質Ａ、Ｃ又は／及びＥに対する抗
体又はそのシラグメントを使用することができる。ポ後
に、モノクロナルＨＤＬ−抗体を使用することもできる
。
本発明によって使用した抗体の製造は、免疫原として純
粋のＨＤＬ又は前記アポリボ蛋白質の１種を用いて行な
う。このようにして得られた抗血清はエーロゾルで処理
して脱すピドする；場合により続いて硫酸アンモニウム
の分別によってｒ−グロブリン−フラクションを単離す
る。
抗体を得るためには、通常使用される動物を使用するこ
とができる。好ましくは羊及び家うさぎを使用する。し
かしながら抗体を得るためには、既に挙げた動物又は比
較される生物の外に細胞培養物を使用することもできる
。
ＨＤＬ−抗体の添加で生成した免疫集合体の分離は、同
じようにして常法で行なうことができる。
溶解したＨＤＬ−抗体を使用するＪ＋Ｍ　会には、分離
は好ましくは遠心分離によって行なう。担体に結合１．
た固守Ｔ−ＩＴ’ｌＴ、−抗体を使用する場合には、免
疫集合体は緊密な同相、例えば抗体が被榎された固体か
ら液相を簡単に分肉（ｌすることによって分離すること
ができる。アポリボ蛋白質と共に免疫原として得られた
抗体を使用する場合には、好ましくは免疫原として使用
したアポリポ蛋白質がリピド被覆物を有するものを使用
する。
これは、例えばアポリボ蛋白質の常用の脱すピド及び絖
〈分別の後に、選んだアポリボ蛋白質Ａ−１Ｃ−又は／
及びＥ−フラクションを再びリビド化して得ることがで
きる。しかし好ましくは免疫原としでは、精製した完全
なＨＤＬ−フラクションを使用する。精製は、好ましく
は公知方法で超遠心分離での単離によって行なう。
付加的に場合により更に精製は、例えば固定コンカナバ
リン（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　）　Ａにより親和ク
ロマトグラフィー又は電気泳動の方法によって行なうこ
とができる。これらの方法は公知であり、詳説は不必要
である。
本発明のもう１つの課題は、体液のＬＤＬ−フラクショ
ンを測定する試薬であり、これはＨＤＬ−抗体を含有す
ることを特徴とする。好ましい実施形式では本発明によ
る試薬は、既に挙げたＨＤＬ−抗体又は前記方法で詳説
したフラグメント又は抗体又はＨＤＬ−成分のフラグメ
ントと共に、なおコレステリンを測定する試薬を含有す
る。
前棟の好ましい試薬は、コレステリンオキシダーゼ、コ
レステリンエステルを分解する酵素又は酵素系、Ｈ２Ｏ
２を測定する系及び界面活性剤を含有する。
前記試薬の特に好ましい実施形式によれば、これは主と
してＨＤＬ−抗体、コレステリンオキシダーゼ、コレス
テリンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、３，４−ジク
ロルフェノール、フェノール、４−アミノツェナ・パン
、非イオン性清浄剤、アスパラギン酸マグネシウム及び
緩衝剤（ｐＨ７〜８．５）からなる。
本発明による試薬は、抗体を、測定液に対して好ましく
は１０−７〜１０−３モル／Ａ（又は固体１ｋ）の濃度
帥囲内で含有する。抗体は固体形（好ましくは親液化）
か又は溶液形で存在していてもよい。溶剤としては、面
清環填、緩衝剤、例えば０．０１〜０．５　ｍのトリス
緩衝剤（Ｐ］１７〜８．５）又は０．０１〜０．５ｍの
モルホリノゾロパンスルホン酸（ｐ）１６．５〜７．５
）を、それぞれ０．１５〜１ｍの食塩を添加して使用す
ることができる。抗体を固定形で使用する場合には、適
当な担体の例は、ポリサッカライげ、例六ばセルロース
、デキストラン、終粉及びその誘導体、珪酸塩、ポリア
ミｒ、コラーダン、ラテックス、酸化アルミニウム、牛
の血清了ルプミンその他である。抗体は試験容器、例え
ばプラスチフクの試薬ガラスの表面に結合して存在して
いてもよい。
明線ｉ劣６′ａ吉（内容に変更なし） 本発明方法の重要な利点は、単独試薬の添加後に試１か
らリポ蛋白質群−ＬＤＬを除く−を除去することができ
、続いて診断上重要なＬＤＬ　−含量又はＬＤＬ−フラ
クションのコレステリン含量を、他に試料の予処理をし
ないで面接に測定に使えることである。更に好ましいの
は、試料中で混２蜀を惹起するトリグリセリドを多く含
んタリホ蛋白質群が除去されるので、快いてＬＤＬ又は
コレステリンを測定するために透明な試料をイ吏用する
ことである。
実施例 例　１ （Ａ＋　精製ＨＤＬの製造。
ＶＬＤＬ及びＬＤＬを超遠心分離機で分離した後に、超
遠心分Ｎ＋［ｉ　＋９中のＨＤＬ−フラクション（密１
隻１０８０〜１．２１０）を単離する〔スキプスキ（Ｖ
、Ｐ、　５ｋｉｐｓｋｉ　）著：すｅ　ｌ’　・コンポ
）／コン・オブ・リボプロティアｙＪニーイン会ノルマ
ルψアノ１５・デイジ−ズド・ステーノ：ブラ］″・リ
ーズ。アンド・リボプロテインズ：クアンテイ”１：！
Ｉ−）／７）浄）１１（内容に変更なし）ｉ−ノコン・
コンホクンヨ／・アントメタＪ？リズム（Ｌｉｐｉｄ　
ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉ
ｎｓｉｎｎｏｒｍａｌａｎｄｄｉｓｅａｓｅｄｓｔａｔ
ｅｓ、：ＢｌｏｏｄＬｉｐｉｄｓａｎｄ　Ｌｉｐｏｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ　：　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ、　Ｃｏ
ｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ’ｍ　
）出版ネー１：ネルノノ（ＮｅｌＳｏｎ）。
ライレイ（Ｗｉ　Ｉｅｙ　）　、　＝−＝−−ヨーク化
、］９９７２年４７１〜５δ３頁のようにして〕。続い
てフラクションをなｙＨ２度１０８０〜１２１０て２回
沈殿又は浮遊させる。
ＨＤＬ−フラクションを、固定コ／カナパリノ（Ｃｏｎ
ｃａｎａｖａｌｉｎ　）　Ａ　（フエブス・レター（Ｆ
ｅｂｓＬｅｔＡ、　）　９１巻（１９７４年）　１７４
〜１．９８頁〕を介して親和クロマトグラフィーによる
か又はゲオン、にビコン、ブロック（Ｇｅｏｎ　−Ｐｅ
ｖｉｃｏｎ　Ｂｌｏｃｋ　）の電気泳動〔マレイ（Ｒ，
Ｗ。
Ｍａｈｌｅｙ　）、ホルコン−’：　（Ｋ、Ｓ、Ｈｏｌ
ｃｏｍｂｅ　）　（１９７７年）、ジャーナル・オブ・
リピトリサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　１８巻、３１４〜３２４頁によ
る〕を用いて電気泳動に１って精製する。
明＜工ｊ：のご、”′（−’７−で（二″−〕ない（Ｂ
）　抗血清の製造。
動物の種類：羊及び家うさぎ。
（Ａ）　Ｋよって得られた免疫壓を用いて、次の免疫図
式を使用する： ／ ｆｃｌ　抗−ＨＤＬ−γ−グロブリン（脱すビド）の製
造。
柑血清１１を、エーロゾル３８０（デグンサ社製）１５
ｇと室温で１時間攪拌し、続いて５０００ｇで２０分間
遠心分離する。上澄みを、最終濃度１．７モル／ｌが得
られるまで硫酸アンモニウムを加え、２時間攪拌する。
２００００ｇで６０分間遠心分離した後に、沈殿物を、
燐酸塩で緩衝（ｐＨ７，４）した生理学的食塩水２０Ｑ
ｍｌに溶解し、透析によって硫酸アンモニウムを完全に
分離する。５００００．９で２時間遠心分離することに
よって、このようにして得られたγ−〃゛ロブリン−フ
ラクションから不溶の蛋白質を除去する。
例　２ デキストランサルフェート（平均分子ｆ＃５０００ＤＯ
１ｚｙ／１．塩化ナトリウム０．３モル／１．塩化カル
シウム５０ｍモル／ｌ及び例１のようにして得られた抗
−ＨＤＬ　−７−グロブリン（脱すピド）１５ｍｙを、
トリス／ＨＣＩ緩衝斉り（ｐＨ８，０）　０．１　モル
／ｉ！Ｋ）−かり、　タ？ｔＲ合物［１，４ｍｌに、血
清試料３０μｅを添加する。室温で３０分間培養後に、
１θ０００．？で２分間遠心分離する。デキストランサ
ルフェート及び塩化カルシウムを除いた相応する対照試
験を、相応する条件下に平行して行なった。
透明な沈殿の−Ｆ澄み３００μｌに、トリスー緩衝液（
ｐＨ＝　７．７　）　［１，１モル／１１、アスパラギ
ン酸マグネシウム０．０５モル／１．アミノフェナ１戸
ン１ｍモル／ｌ、７ｘノー／ｌ／／Ｓ　ｍ　モ／ｌ／／
　ｌ。
３．４−ジクロルフェノール４ｍセル／１．ＨＩｉｆ肪
７　／ｌ／−ｙ−ル＆　＋３　り１１コールエーテル０
．３％、コレステリンエステラーゼ４００　Ｕ／１．　
コレステリンオキシダーゼ２５０　Ｕ／ｌ及びペルオキ
シダーゼ２００　Ｕ／ｌを含有する試薬２　ｍｌを加え
る。
室温で２０分間培養後に、試薬の空試験値に対する試料
の吸光を測定する（試薬の空試験値は、抗血清５０μｌ
を含有し、抗血清のコレステリン含量を考えに入れる）
。
ハ、に＝Ａ　Ｂ試料−△８試薬の空試験値ＬＤＬ−：Ｉ
レステリ７Ｃｍ９／ｄｌｊ　）＝８９４Ｘ△Ｅ次の結果
が得られた： 比較し得る結果が、デキストランサルフェート（分子量
２００［］０００　）　１１／１１を用いて得られる。
カルシウムイオンの代りに、マグネシウムイオン又はマ
ンガンイオンを同濃度で使用することができる。好まし
いのは、次の濃度「囲である：高分子のデキストランサ
ルフェート０．１〜ＢＥ／ｌ、２価のカナオフ１０〜２
５ｍモル／１．塩化ナトリウム０．２〜１モル／１０蒼
対照法としては、ＮＩＨ法が役立つ（ＶＬＤＬ及び乳棄
脂粒を超遠心分離機で分離した後に、ＬＤＬを沈殿させ
る。沈殿前後のコレステリン値の差異からＬＤＬ−コレ
ステリンの値が得られる）。
マニコアル・オブφうがラトリー〇オノぐレーシコンズ
、リビドφリサーチ・クリニンクス・プログラム、リビ
ド・アンド・リボプロティン・アナリシス（Ｍａｎｕａ
ｌ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　０ｐｅｒａｔｉｏｎ
ｓ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｅｅｓｅａｒｃｈ　Ｃ１１ｎｉｃｓ
　Ｐｒｏｇｒａｍ、　Ｌｉｐｉｄ　ａｎｄ　Ｌｉｐｏｐ
ｒｏｔｅｉｎ　Ａｎａｌｙｓｉ、ｓ　）　ＤＨＦＷ出版
、Ａ６５〜６２８゜ 例　３ 短連鎖のデキストランサルフェート（平均分子量５００
０）５．９／ｌ、塩化ナトリウム０．２５モル／／！、
塩化ｆＪルシウム０．１５モル／　７　、＆び抗−ＨＤ
Ｔ、　−ｒ−グロブリン（脱すピド）１５ｍｑを、トリ
ス／　ＨＣＩ　ｆｆｌ　’ｌＪｉ剤（ｐｌ］８．１１　
）　［１，１モル／ｌにとかした混合物ｒｉ、、４ｍｇ
に、血清試料３０μｌを添加する。室温で３０分間培養
後に、１ｎｏｏｎｇで２分間遠心分＃ｌｔ　ｔ、、上澄
み中のコレステリン並びにトリグリセリドを狙１定する
。
相応する対照試験を、平行して相応する条件下にデキス
トランサルフェート及びカルシウムイオンを除いて行な
った。次の結果が得られた：比較し得る結果が、テ９キ
ストランザルフェート（分子部１５０００）０．５．９
／ｌ、ヘパリン０．８．９　／　ｌ　又ハｅリビニルサ
ルフエート１１．２　ｇ／ｌを用いて得られる。カルシ
ウムイオンの代りに、マグネシウムイオンｙはマンガン
イオンを相応するＰ度で使用することもできる。好まし
い濃度範囲は、次のものである：知連釦のデキストラン
サルフェート又はヘパリン１〜１５９／ｌ、ポリビニル
ザルフェート０．２〜５Ｉ／ｌ、２価のカチオ７２０〜
２５０　ｍモル／ｌ、塩化ナト１）ラム１１．１５〜０
．８モル／ｌ。
例　４ 燐タングステン酸１．１５ｆＪ／ｌ、　塩化マグネシウ
ム２０ｍモル／ｌ、　塩化ナトリウム０．３モル／ｌ及
びｉ：　−１１ｎＴ、−γ−グロブリン（脱すピド）１
５ｍダの混合物０．４ｍｌに、血清能′材３０μｌを添
加する。￥幌で６０分間培云後に１００００ｇで２分ｔ
Ｕｌ遠１１・分離シ、上澄み中のコレステリン並ひにト
リグリセリドを測定する。平行して対照試験を、デキス
トランザルフェート及び塩化カルシウムを除いて行なっ
た。次の結果が得られた： ／ ／ ／ 好ましい濃度範囲は、次のものである：燐タングステン
酸０．３〜６９／１．マグネシウムイオン１０〜２００
ｍモル／ｌ。
第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号［株］発
　明　者　シークベルト・シーク　ドイツ連邦共和国・
アー く−ル・モースシュトラーセ　３ 手続補正書（方式） 昭和６０年　３月２７日 特許庁長官殿 】　事件の表示　昭和５９年特許願第２２３１３０号２
、発明の名称 低密度のリポ蛋白質を測定する方法及び試薬３　補正を
する者 事件との関係　特許出願人 名　称　ベーリノガー・マン−・イム・ゲゼル／ヤフト
・ミツト・ベノユレンクテル・ハフノング４代理人 ６　補正の対象 ７、補正の内界 別紙のとおり 但し明細書の浄書（内容に変更なし）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、　検査すべき試料に高密度のリボ蛋白質（ＨＤＬ　
    ）−抗体を添加し、形成した不溶物を分離し、上澄みで
    低密度のリボ蛋白質（ＬＤＬ　）又はその成分を測定し
    て体液中の低密度のリボ蛋白質（ＬＤＬ　）を測定する
    方法において、抗体にポリアニオンと２価のカチオンと
    からなる混合物を添加することを特徴とする低密度のリ
    ボ蛋白質（ＬＤＬ　”）の測定法。 ２、　ポリアニオンとしてデキストランサルフェート、
    ヘパリン、燐タングステン酸又はポリビニルサルフェー
    ト及び２価のカチオンとしてカルシウム−、マグネシウ
    ム又はマンガンイオンを特徴する特許請求の範囲第１項
    記載の方法。 ６、　ポリアニオンは反応混合物中に濃度０．１〜１５
    １／ｌで、２価のカチオンは濃度１０〜２５０ｍモル／
    ｌで存在する、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
    方法。 ４、反応混合物中で濃度は、高分子のデキストランサル
    フェートでは０．１〜８ｇ／１．短連錯のデキストラン
    サルフェートでは１〜１５９／ｌ、ヘパリンでは１〜１
    ５９／ｌ、ポリビニルサルフェートでは０．２〜５９／
    ｌ、燐タングステン酸では０．３〜６　ｇ／ｌ、２価の
    カチオンでは１０〜２５０ｍモル／ｌである、特許請求
    の範囲第２項又は第３項記載の方法。 ５、ＬＤＬ−成分としてコレステリンを測定スル、特許
    請求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項記載の
    方法。 ６　抗体は、脱脂ＨＤＬ−抗血清の形でか又は精製抗体
    フラクションとして存在する、特許請求の範囲第１項か
    ら第５項までのいずれか１項記載の方法。 ７　ＨＤＬ−抗体のフラグメントを特徴する特許請求の
    範囲第１項から第６項までのいずれか１項記載の方法。 ８、　免疫原としてＮ製ＨＤＬと一緒に場合により再す
    ビド化アポリボ蛋白質Ａ、Ｃ又は／及びＥを含有、する
    抗体を特徴する特許請求の範囲第６項又は第７項記載の
    方法。 ９　羊又は家うさぎの抗体を特徴する特許請求の範囲第
    １項から第８項までのいずれか１項記載の方法。 １０　抗体は共有結合によってポリアニオンに結合して
    いる、特許請求の範囲第１項から第９項までのいずれか
    １項記載の方法。 １１、高密度のリボ蛋白質（ＥＤＬ　）−抗体が、ポリ
    アニオンと２価のカチオンとからなる混合物を含有する
    、体液中の低密度のリボ蛋白質（工ＩＬＬ　）−フラク
    ションを測定する試薬。 １２、　ＨＤＬ−抗体をクロプリン１〜Ｉ　Ｄ　Ｏｍ９
    ／ｍｅに相応する濃度で、ポリアニオンを濃度０．１〜
    １５ｆｉ／！！で及び２価のカチオンを濃度１０〜２５
    ０ｍモル／ｌで含有する、特許請求の範囲第１１項記載
    の試薬。 １６、コレステリンを測定する試薬を特徴する特許請求
    の範囲第１１項又は第１２項記載の試薬。 １４、コレステリンを測定するのにコレステリンオキシ
    ダーゼ、コレステリンエステラーゼ解する酵素又は酵素
    系、Ｈ２Ｏ２を測定する系及び界面活性剤を特徴する特
    許請求の範囲第１３項記載の試薬。 １５　主としてＨＤＬ抗体、コレステリンオキシダーゼ
    、コレステリンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、３．
    ４−ジクロルフェノール、フェノール、４−アミノツェ
    ナ・戸ン、非イオン性清浄剤、アスパラギン酸マグネシ
    ウム及び緩衝剤（ｐＨ７〜８゜５）からなる、特許請求
    の範囲第１４項記載の試薬。 １６、ＨＤＴ、−抗体を固定形で含有する、特許請求の
    範囲第１１項から第１５項までのいずれか１項記載の試
    薬。 １Ｚ　ポリアニオンと共有結合によって結合しているＨ
    ＤＬ−抗体を特徴する特許請求の範囲第１１項から第１
    ６項までのいずれか１項記載の試薬。
JP59223130A 1983-10-26 1984-10-25 低密度のリポ蛋白質を測定する方法及び試薬 Granted JPS60173470A (ja)

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