JP2920044B2 - 水溶性酸化脂質の生成方法及び酸化脂質の確認・測定方法 - Google Patents
水溶性酸化脂質の生成方法及び酸化脂質の確認・測定方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、水溶性酸化脂質の生
成方法と、被検査物が水溶性酸化脂質であることを簡易
に確認する酸化脂質の確認・測定方法に関するものであ
る。
成方法と、被検査物が水溶性酸化脂質であることを簡易
に確認する酸化脂質の確認・測定方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】酸化脂質は、生体内において障害性に働
くと考えられており、動脈硬化、発癌・炎症等へ関与が
うたわれている。そして、血液における脂質の多くを占
める低比重リポ蛋白は、前記各病態へ大きく関与してい
ると考えられている。
くと考えられており、動脈硬化、発癌・炎症等へ関与が
うたわれている。そして、血液における脂質の多くを占
める低比重リポ蛋白は、前記各病態へ大きく関与してい
ると考えられている。
【０００３】一方、生体内酵素で制御、生産されたプロ
スタグランジンやロイコトリエン等の酸化脂質は、生体
に大きな作用を及ぼす物質となる。
スタグランジンやロイコトリエン等の酸化脂質は、生体
に大きな作用を及ぼす物質となる。
【０００４】これら酸化脂質の生成方法は、従来から種
々報告されている。例えば、脂質試料に銅（Ｃｕ＋）又
は鉄（Ｆｅ２＋）等の遷移金属を添加し、室温約３７度
の暗所に数時間静置する方法、感光物質を予め添加した
試料に光を照射する方法、リポキシゲナーゼやサイクロ
ペルオキシダーゼ等の酵素で酸化する方法等である。
々報告されている。例えば、脂質試料に銅（Ｃｕ＋）又
は鉄（Ｆｅ２＋）等の遷移金属を添加し、室温約３７度
の暗所に数時間静置する方法、感光物質を予め添加した
試料に光を照射する方法、リポキシゲナーゼやサイクロ
ペルオキシダーゼ等の酵素で酸化する方法等である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、生体内
に特殊な作用を及ぼすハイドロペルオキサイド基を有す
る水溶性酸化脂質の生成方法は未だ開発されておらず、
また、ハイドロペルオキサイド基を有する水溶性酸化脂
質を正確に測定する方法も開発されていないため、特殊
な水溶性酸化脂質の生成を評価できなかった。
に特殊な作用を及ぼすハイドロペルオキサイド基を有す
る水溶性酸化脂質の生成方法は未だ開発されておらず、
また、ハイドロペルオキサイド基を有する水溶性酸化脂
質を正確に測定する方法も開発されていないため、特殊
な水溶性酸化脂質の生成を評価できなかった。
【０００６】そこで、この発明は、上述した課題を解消
すべく創出されたもので、生体内に特殊な作用を及ぼす
ハイドロペルオキサイド基を有する水溶性酸化脂質の生
成方法と、被検査物が酸化脂質であることを簡易、且
つ、正確に測定する酸化脂質の確認・測定方法を提供す
るものである。また、本発明は、血漿等の生体材料中の
酸化脂質を直接測定可能にする方法を提供するものであ
る。
すべく創出されたもので、生体内に特殊な作用を及ぼす
ハイドロペルオキサイド基を有する水溶性酸化脂質の生
成方法と、被検査物が酸化脂質であることを簡易、且
つ、正確に測定する酸化脂質の確認・測定方法を提供す
るものである。また、本発明は、血漿等の生体材料中の
酸化脂質を直接測定可能にする方法を提供するものであ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上述の目的を
達成すべく、リノール酸を重水素化メチルアルコールに
溶解し、それを重水素化したリン酸緩衝液に添加攪拌し
て作成したリノール酸乳濁液、または、重水素化してい
ないリン酸緩衝液で充分に透析した低比重リポ蛋白質溶
液に、スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、Ｃ
ｕイオンを添加し、長波紫外線を照射することで、ハイ
ドロペルオキサイド基を含む水溶性酸化脂質を生成し
た。
達成すべく、リノール酸を重水素化メチルアルコールに
溶解し、それを重水素化したリン酸緩衝液に添加攪拌し
て作成したリノール酸乳濁液、または、重水素化してい
ないリン酸緩衝液で充分に透析した低比重リポ蛋白質溶
液に、スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、Ｃ
ｕイオンを添加し、長波紫外線を照射することで、ハイ
ドロペルオキサイド基を含む水溶性酸化脂質を生成し
た。
【０００８】また、リノール酸を重水素化メチルアルコ
ールに溶解し、それを重水素化したリン酸緩衝液に添加
攪拌して作成したリノール酸乳濁液、または、重水素化
していないリン酸緩衝液で充分に透析した低比重リポ蛋
白質溶液に、スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）、Ｃｕイオンを添加し、長波紫外線を照射して生成
した酸化脂質に、ジスプロジウム トリポリリン酸を添
加し、これを核磁気共鳴装置にてプロトン原子核の分光
分析をすることで、被検査物が酸化脂質であることを確
認・測定した。
ールに溶解し、それを重水素化したリン酸緩衝液に添加
攪拌して作成したリノール酸乳濁液、または、重水素化
していないリン酸緩衝液で充分に透析した低比重リポ蛋
白質溶液に、スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）、Ｃｕイオンを添加し、長波紫外線を照射して生成
した酸化脂質に、ジスプロジウム トリポリリン酸を添
加し、これを核磁気共鳴装置にてプロトン原子核の分光
分析をすることで、被検査物が酸化脂質であることを確
認・測定した。
【０００９】
【作用】本発明は、低比重リポ蛋白又は脂肪酸を用いて
生体に重要な作用を及ぼすハイドロペルオキサイド基を
有する水溶性酸化脂質を生成するものである。
生体に重要な作用を及ぼすハイドロペルオキサイド基を
有する水溶性酸化脂質を生成するものである。
【００１０】また、被検査物にランサニドシフト試薬を
添加し、これを核磁気共鳴装置にて水素原子核（プロト
ン）の分光分析をすることで、被検査物が酸化脂質であ
ることを確認・測定する。これは、被検査物にランサニ
ドシフト試薬を添加すると、被検査物が酸化脂質である
場合とそうでない場合とでプロトンシグナルに違いが出
るため、そのシグナルの違いを分光分析により測定して
被検査物が酸化脂質であることを確認・測定するもので
ある。
添加し、これを核磁気共鳴装置にて水素原子核（プロト
ン）の分光分析をすることで、被検査物が酸化脂質であ
ることを確認・測定する。これは、被検査物にランサニ
ドシフト試薬を添加すると、被検査物が酸化脂質である
場合とそうでない場合とでプロトンシグナルに違いが出
るため、そのシグナルの違いを分光分析により測定して
被検査物が酸化脂質であることを確認・測定するもので
ある。
【００１１】
【００１２】（酸化脂質の生成方法）
【００１３】脂質試料としては、リノール酸乳濁液又は
低比重リポ蛋白を用いる。
低比重リポ蛋白を用いる。
【００１４】リノール酸乳濁液は、リノール酸を０．１
Ｍの濃度で重水素化メチルアルコールに溶解し、それを
２０ｍＭ重水素化リン酸緩衝液に添加攪拌することによ
り４ｍＭリノール酸乳濁液を作成する。
Ｍの濃度で重水素化メチルアルコールに溶解し、それを
２０ｍＭ重水素化リン酸緩衝液に添加攪拌することによ
り４ｍＭリノール酸乳濁液を作成する。
【００１５】一方、低比重リポ蛋白は、超遠心法により
人血漿より分離する。この、低比重リポ蛋白は窒素飽和
下で重水素化していない２０ｍＭリン酸緩衝液により充
分に透析を行なった。低比重リポ蛋白は、その後Ｌｏｗ
ｒｙ法により１ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度になるように２０
ｍリン酸緩衝液により容量を調節した（ｐＨ７．０）。
人血漿より分離する。この、低比重リポ蛋白は窒素飽和
下で重水素化していない２０ｍＭリン酸緩衝液により充
分に透析を行なった。低比重リポ蛋白は、その後Ｌｏｗ
ｒｙ法により１ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度になるように２０
ｍリン酸緩衝液により容量を調節した（ｐＨ７．０）。
【００１６】そして、０．１Ｕ／ｍｌスーパーオキサイ
ドジスムターゼ（ＳＯＤ）と５μＭのＣｕイオンを、紫
外線照射前にそれぞれの脂質試料に予め添加しておく。
ドジスムターゼ（ＳＯＤ）と５μＭのＣｕイオンを、紫
外線照射前にそれぞれの脂質試料に予め添加しておく。
【００１７】作成した脂質試料は、ケイ酸ボロンやクオ
ーツ製等の容器に移す。その後、３６５ｎｍにエネルギ
ー最強点を有する長波紫外線ランプを各種時間照射する
ことで酸化脂質を生成する。
ーツ製等の容器に移す。その後、３６５ｎｍにエネルギ
ー最強点を有する長波紫外線ランプを各種時間照射する
ことで酸化脂質を生成する。
【００１８】これは、長波紫外線によりＵｕ２＋の不対
電子が励起され、その電子が不飽和脂肪酸のダブルボン
ドを有するカーボンに電子を供給することで、そのカー
ボン原子に結合している水素原子を引き抜くと考えられ
る。そして、引き抜かれた部位に酸素分子が結合し、酸
化が行なわれるものと思量される。
電子が励起され、その電子が不飽和脂肪酸のダブルボン
ドを有するカーボンに電子を供給することで、そのカー
ボン原子に結合している水素原子を引き抜くと考えられ
る。そして、引き抜かれた部位に酸素分子が結合し、酸
化が行なわれるものと思量される。
【００１９】尚、Ｃｕ２＋含有試料から酸化脂質を生成
するには、最強エネルギーが３６５ｎｍ付近にある長波
紫外線が最適であり、最強エネルギーが２５４ｎｍを中
心とする短波紫外線の照射ではハイドロペルオキサイド
基を含む過酸化脂質を生成できなかった。
するには、最強エネルギーが３６５ｎｍ付近にある長波
紫外線が最適であり、最強エネルギーが２５４ｎｍを中
心とする短波紫外線の照射ではハイドロペルオキサイド
基を含む過酸化脂質を生成できなかった。
【００２０】また、Ｆｅ３＋等に紫外線を照射しても同
様にハイドロペルオキサイド基を含む酸化脂質を生成で
きると考えられる。更に、アラヒドン酸も上記の酸化法
により生体に重要な作用を有すると考えられるハイドロ
ペルオキサイド基を含む水溶性酸化脂質を作成できる。
様にハイドロペルオキサイド基を含む酸化脂質を生成で
きると考えられる。更に、アラヒドン酸も上記の酸化法
により生体に重要な作用を有すると考えられるハイドロ
ペルオキサイド基を含む水溶性酸化脂質を作成できる。
【００２１】（ジスプロジウム トリポリリン酸の生成
方法）
方法）
【００２２】生成した酸化脂質には、ランサニドシフト
試薬として、ジスプロジウム トリ
試薬として、ジスプロジウム トリ
【００２３】塩化ジスプロジウム（ＤｙＣｌ２）２００
ｍＭとペンタソジウム トリポリリン酸４８０ｍＭは重
水にて充分に撹拌した。その溶液は沈渣が生じている
が、重水素化塩酸にてｐＨ７．４に調整した。それによ
り沈渣は溶け易くなる。その後、３０００ｇ、３０分の
遠沈にて残りの沈渣を取り除いた。
ｍＭとペンタソジウム トリポリリン酸４８０ｍＭは重
水にて充分に撹拌した。その溶液は沈渣が生じている
が、重水素化塩酸にてｐＨ７．４に調整した。それによ
り沈渣は溶け易くなる。その後、３０００ｇ、３０分の
遠沈にて残りの沈渣を取り除いた。
【００２４】 速やかに４０ｍＭの濃度で添加するのである。
【００２５】（１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰ
Ｙ測定法による酸化脂質の測定）
Ｙ測定法による酸化脂質の測定）
【００２６】本発明は、被検査物にランサニドシフト試
薬を添加し、これを分光分析することで被検査物が酸化
脂質であることを確認・測定するものであるが、分光分
析には、核磁気共鳴装置を用いた水素原子核（プロト
ン）の共鳴分析法（１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣ
ＯＰＹ測定法）を用いる。
薬を添加し、これを分光分析することで被検査物が酸化
脂質であることを確認・測定するものであるが、分光分
析には、核磁気共鳴装置を用いた水素原子核（プロト
ン）の共鳴分析法（１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣ
ＯＰＹ測定法）を用いる。
【００２７】ＮＭＲは３６０ＭＨｚの核磁気共鳴装置を
用いた。ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ ｍｏｄｅで、プローブ
温度は３０８Ｋにした。Ｆｒｅｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｄｅｃａｙの重積回数はリノール酸サンプルの場合５
１２回、低比重リポ蛋白のサンプルの場合３２回にし
た。ＨＤＯ及びＨ２Ｏのプロトンシグナルは４秒で２０
０ｍＷのｇａｔｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｗａｖｅ
ｓｉｎｇｌｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｒｒａｄｉａ
ｔｉｏｎでｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎした。ｓｐｅｃ
ｔｒａｌ ｗｉｔｈは７２４６Ｈｚ，ａｃｑｕｉｓｉｔ
ｉｏｎ ｔｉｍｅは０．５６５秒にした。
用いた。ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ ｍｏｄｅで、プローブ
温度は３０８Ｋにした。Ｆｒｅｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｄｅｃａｙの重積回数はリノール酸サンプルの場合５
１２回、低比重リポ蛋白のサンプルの場合３２回にし
た。ＨＤＯ及びＨ２Ｏのプロトンシグナルは４秒で２０
０ｍＷのｇａｔｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｗａｖｅ
ｓｉｎｇｌｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｒｒａｄｉａ
ｔｉｏｎでｐｒｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎした。ｓｐｅｃ
ｔｒａｌ ｗｉｔｈは７２４６Ｈｚ，ａｃｑｕｉｓｉｔ
ｉｏｎ ｔｉｍｅは０．５６５秒にした。
【００２８】（測定結果）
【００２９】リノール酸のＣｕ２＋と紫外線照射による
酸化のパターンは、ダイズリポキシゲナーゼによるもの
と比べ、プロトン核磁気共鳴スペクトラム上非常に類似
したパターンを示す。
酸化のパターンは、ダイズリポキシゲナーゼによるもの
と比べ、プロトン核磁気共鳴スペクトラム上非常に類似
したパターンを示す。
【００３０】図１は、前述のように作成したリノール酸
試料にスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）と５
μＭのＣｕイオンを予め添加し、長波紫外線を照射して
酸化させた試料を、プロトン核磁気共鳴装置により経時
的に測定した結果を示す。図１のｂは、長波紫外線を試
料に５分間照射したものである。また、図１のｃ，ｄ，
ｅは、長波紫外線を夫々試料に１０分間、２０分間、３
０分間照射したものである。尚、ａは、長波紫外線を照
射していないものである。
試料にスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）と５
μＭのＣｕイオンを予め添加し、長波紫外線を照射して
酸化させた試料を、プロトン核磁気共鳴装置により経時
的に測定した結果を示す。図１のｂは、長波紫外線を試
料に５分間照射したものである。また、図１のｃ，ｄ，
ｅは、長波紫外線を夫々試料に１０分間、２０分間、３
０分間照射したものである。尚、ａは、長波紫外線を照
射していないものである。
【００３１】図１のピーク１は、ハイドロペルオキサイ
ド基（−ＯＯＨ）に影響を受けたプロトンシグナルであ
ることが判明している。尚、ピーク２及びピーク３は、
ハイドロペルオキサイド基（−ＯＯＨ）と他の酸化基に
影響を受けたプロトンピークと考えられるが、未だ、ど
の様な酸化基であるかは確認されていない。
ド基（−ＯＯＨ）に影響を受けたプロトンシグナルであ
ることが判明している。尚、ピーク２及びピーク３は、
ハイドロペルオキサイド基（−ＯＯＨ）と他の酸化基に
影響を受けたプロトンピークと考えられるが、未だ、ど
の様な酸化基であるかは確認されていない。
【００３２】図２も、長波紫外線を照射して酸化させた
リノール酸試料をプロトン核磁気共鳴装置により経時的
に測定した結果を示し、下方のスペクトラムは酸化した
リノール酸試料に何も加えずに１０分間放置したもの
で、上方のスペクトラムは酸化したリノール酸試料に５
０ｎＭ（ナノモル）のグルタチオンと終濃度０．２Ｕ／
ｍｌのグルタチオンペルオキシダーゼを添加し１０分間
放置したものである。
リノール酸試料をプロトン核磁気共鳴装置により経時的
に測定した結果を示し、下方のスペクトラムは酸化した
リノール酸試料に何も加えずに１０分間放置したもの
で、上方のスペクトラムは酸化したリノール酸試料に５
０ｎＭ（ナノモル）のグルタチオンと終濃度０．２Ｕ／
ｍｌのグルタチオンペルオキシダーゼを添加し１０分間
放置したものである。
【００３３】上方のスペクトラムでは、グルタチオンの
影響を受けてピーク１が消失している。このことより、
ピーク１がハイドロペルオキサイド基に影響を受けたプ
ロトンピークであることを追認した。これは、グルタチ
オンペルオキシダーゼは、グルタチオンの存在下でハイ
ドロペルオキサイド基をハイドロオキサイド基に変換さ
せることが証明されているという根拠に基づく。
影響を受けてピーク１が消失している。このことより、
ピーク１がハイドロペルオキサイド基に影響を受けたプ
ロトンピークであることを追認した。これは、グルタチ
オンペルオキシダーゼは、グルタチオンの存在下でハイ
ドロペルオキサイド基をハイドロオキサイド基に変換さ
せることが証明されているという根拠に基づく。
【００３４】試料中の酸化リノール酸は生体に重要な作
用を及ぼすハイドロペルオキサイド基と水溶化に関与し
たエポキシ基やエンドペルオキシ基極性酸化基も共存し
た水溶性酸化リノール酸も考えられる。なぜなら、ハイ
ドロペルオキサイド基のみを含む酸化脂質では未だに水
溶性ではなくエーテルのような有機溶媒に溶け易いから
である。しかし、ハイドロペルオキサイド基のみでもリ
ノール酸は水溶性なのかもしれない。このハイドロペル
オキサイド基はスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）の存在により安定化させることができる。
用を及ぼすハイドロペルオキサイド基と水溶化に関与し
たエポキシ基やエンドペルオキシ基極性酸化基も共存し
た水溶性酸化リノール酸も考えられる。なぜなら、ハイ
ドロペルオキサイド基のみを含む酸化脂質では未だに水
溶性ではなくエーテルのような有機溶媒に溶け易いから
である。しかし、ハイドロペルオキサイド基のみでもリ
ノール酸は水溶性なのかもしれない。このハイドロペル
オキサイド基はスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯ
Ｄ）の存在により安定化させることができる。
【００３５】（酸化低比重リポ蛋白質のＣｕ２＋と紫外
線照射による生成）
線照射による生成）
【００３６】図３はスーパーオキサイドジスムターゼ
（ＳＯＤ）と５μＭのＣｕＳＯ４を低比重リポ蛋白溶液
に添加した後、長波紫外線照射により低比重リポ蛋白を
酸化さ をプロトン核磁気共鳴装置を用いて測定した結果を示し
ている。図３のｂは、長波紫外線を試料に３０分間照射
したものである。また、図３のｃ，ｄは、長波紫外線を
夫々試料に６０分間、９０分間照射したものである。
尚、ａは、長波紫外線を照射していないものである。
（ＳＯＤ）と５μＭのＣｕＳＯ４を低比重リポ蛋白溶液
に添加した後、長波紫外線照射により低比重リポ蛋白を
酸化さ をプロトン核磁気共鳴装置を用いて測定した結果を示し
ている。図３のｂは、長波紫外線を試料に３０分間照射
したものである。また、図３のｃ，ｄは、長波紫外線を
夫々試料に６０分間、９０分間照射したものである。
尚、ａは、長波紫外線を照射していないものである。
【００３７】図中のＣＨ２及びＣＨ３はそれぞれ低比重
リポ蛋白溶液中の脂肪酸骨格中のＣＨ２及びＣＨ３に相
当するプロトンシグナルを示している。
リポ蛋白溶液中の脂肪酸骨格中のＣＨ２及びＣＨ３に相
当するプロトンシグナルを示している。
【００３８】ピーク１及びピーク２はそれぞれシフト試
薬の添加によりＣＨ２及びＣＨ３から分離してきたもの
である。脂肪酸によりエステル化させたコレステロール
ハイドロペルオキサイド基により影響を受けたプロトン
シグナルであると考えられる。なぜなら、低比重リポ蛋
白中に存在する脂質の中で量的に図に示される程大きな
ピークを占める事ができるのは脂肪酸にエステル結合し
たコレステロール以外ないからである。
薬の添加によりＣＨ２及びＣＨ３から分離してきたもの
である。脂肪酸によりエステル化させたコレステロール
ハイドロペルオキサイド基により影響を受けたプロトン
シグナルであると考えられる。なぜなら、低比重リポ蛋
白中に存在する脂質の中で量的に図に示される程大きな
ピークを占める事ができるのは脂肪酸にエステル結合し
たコレステロール以外ないからである。
【００３９】即ち、これらのピークが認められれば試料
中にコレステロールハイドロペルオキサイド基が存在し
ていることになる。
中にコレステロールハイドロペルオキサイド基が存在し
ていることになる。
【００４０】（脂質中のハイドロペルオキサイド基の溶
液酸性化又はエチレンジアミントリメチール酢酸（ＥＤ
ＴＡ）添加による安定化）
液酸性化又はエチレンジアミントリメチール酢酸（ＥＤ
ＴＡ）添加による安定化）
【００４１】図４は、低比重リポ蛋白質中のハイドロペ
ルオキサイド基に影響を受けたピーク１の高さを測定す
ることにより大まかな定量を試みたものを示している。
ｐＨ６．６の状態で低比重リポ蛋白中のハイドロペルオ
キサイドコレステロールの量がピークを示している。そ
れ以下の酸性下でもハイドロペルオキサイド基は安定化
すると考えられるが、低比重リポ蛋白等のようなリポ蛋
白の形ではｐＨ６以下では蛋白が変性凝集してしまうこ
とにより、見かけ上、ハイドロペルオキサイド基の量が
ｐＨ６以下では低下しているように測定される。リノー
ル酸を使用した場合、リノール酸内のハイドロペルオキ
サイド基はｐＨ３からｐＨ４以下の強酸性下でも安定化
を示した。また、ＥＤＴＡ等のキレート剤の添加は、ｐ
Ｈ７．０付近の中性下でも上記ハイドロペルオキサイド
基を安定化することが証明された。これらの現象から、
上記により作成された酸化脂質資料を強酸性化、又はキ
レート剤の投与をすれば保存が可能であることを示す。
ルオキサイド基に影響を受けたピーク１の高さを測定す
ることにより大まかな定量を試みたものを示している。
ｐＨ６．６の状態で低比重リポ蛋白中のハイドロペルオ
キサイドコレステロールの量がピークを示している。そ
れ以下の酸性下でもハイドロペルオキサイド基は安定化
すると考えられるが、低比重リポ蛋白等のようなリポ蛋
白の形ではｐＨ６以下では蛋白が変性凝集してしまうこ
とにより、見かけ上、ハイドロペルオキサイド基の量が
ｐＨ６以下では低下しているように測定される。リノー
ル酸を使用した場合、リノール酸内のハイドロペルオキ
サイド基はｐＨ３からｐＨ４以下の強酸性下でも安定化
を示した。また、ＥＤＴＡ等のキレート剤の添加は、ｐ
Ｈ７．０付近の中性下でも上記ハイドロペルオキサイド
基を安定化することが証明された。これらの現象から、
上記により作成された酸化脂質資料を強酸性化、又はキ
レート剤の投与をすれば保存が可能であることを示す。
【００４２】（酸化低比重リポ蛋白質を用いたチオバル
ビタール酸反応物質測定法と１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰＥＣＴ
ＲＯＳＣＯＰＹ測定法との比較）
ビタール酸反応物質測定法と１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰＥＣＴ
ＲＯＳＣＯＰＹ測定法との比較）
【００４３】図５は、長波紫外線を照射した低比重リポ
蛋白の酸化の経時的変化を、旧来から広く用いられてい
るチオバルビタール酸反応物質測定法（図５の白抜き
円）と、１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ測定
法（図５の白抜き三角）とで示した結果を示す。
蛋白の酸化の経時的変化を、旧来から広く用いられてい
るチオバルビタール酸反応物質測定法（図５の白抜き
円）と、１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ測定
法（図５の白抜き三角）とで示した結果を示す。
【００４４】チオバルビタール酸反応物質測定法では、
紫外線照射直後から酸化度を示すチオバルビタール酸反
応物質が急速に増加を示し３０分後にはその増加量は緩
やかになった。ピーク１の高さも２０分後には最高に達
した。しかし、その後、チオバルビタール酸反応物質値
は６０分以上経過後も上昇が続いているにもかかわらず
ピーク１の高さは低下していき、両者に解離がみられ
た。チオバルビタール酸反応物質は脂質酸化後のメチル
マロンアルデヒド等の分解産物を測定しているためにそ
の値は過去の酸化の程度の蓄積を示していることにな
る。
紫外線照射直後から酸化度を示すチオバルビタール酸反
応物質が急速に増加を示し３０分後にはその増加量は緩
やかになった。ピーク１の高さも２０分後には最高に達
した。しかし、その後、チオバルビタール酸反応物質値
は６０分以上経過後も上昇が続いているにもかかわらず
ピーク１の高さは低下していき、両者に解離がみられ
た。チオバルビタール酸反応物質は脂質酸化後のメチル
マロンアルデヒド等の分解産物を測定しているためにそ
の値は過去の酸化の程度の蓄積を示していることにな
る。
【００４５】しかし、本発明に係る１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰ
ＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ測定法では、ハイドロペルオキサ
イド基を有する水溶性酸化脂質そのものを測定している
ため、不安定なヒドロペルオキサイド基が消失するに従
いピーク１も直接それを反映して低下する。
ＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ測定法では、ハイドロペルオキサ
イド基を有する水溶性酸化脂質そのものを測定している
ため、不安定なヒドロペルオキサイド基が消失するに従
いピーク１も直接それを反映して低下する。
【００４６】このように、従来のチオバルビタール酸反
応物質測定法では、脂質の酸化が行われたことは解る
が、試料中にある種の酸化脂質が存在していることは証
明出来ない。
応物質測定法では、脂質の酸化が行われたことは解る
が、試料中にある種の酸化脂質が存在していることは証
明出来ない。
【００４７】
【発明の効果】従来、酸化脂質を生成するには、Ｃｕ
２＋や、Ｆｅ３＋等の遷移金属を脂質試料に添加し、数
十時間放置する方法や、試料中に光感受性物質を添加し
紫外線や可視光を照射する方法、又は、リポキシゲナー
ゼ等による酵素学的手段がとられてきた。これらの方法
では安定化した酸化脂質は生成できるものの、生体に重
要な作用を及ぼすハイドロペルオキサイド基を含む水溶
化した不安定な酸化脂質を効率良く生成できない。
２＋や、Ｆｅ３＋等の遷移金属を脂質試料に添加し、数
十時間放置する方法や、試料中に光感受性物質を添加し
紫外線や可視光を照射する方法、又は、リポキシゲナー
ゼ等による酵素学的手段がとられてきた。これらの方法
では安定化した酸化脂質は生成できるものの、生体に重
要な作用を及ぼすハイドロペルオキサイド基を含む水溶
化した不安定な酸化脂質を効率良く生成できない。
【００４８】これは、生体に重要な影響を及ぼす水溶性
酸化脂質は、ハイドロペルオキサイド基等に加え、水溶
化に必要な他の極性酸化基が共存した不安定な物質であ
ると考えられるからである。
酸化脂質は、ハイドロペルオキサイド基等に加え、水溶
化に必要な他の極性酸化基が共存した不安定な物質であ
ると考えられるからである。
【００４９】本発明では、不安定なハイドロペルオキサ
イド基を含み、生体に重要な作用を及ぼすと考えられる
水溶性酸化脂質を生成することに成功した。
イド基を含み、生体に重要な作用を及ぼすと考えられる
水溶性酸化脂質を生成することに成功した。
【００５０】また、Ｃｕ２＋と紫外線照射によるハイド
ロペルオキサイド基を有する水溶性酸化脂質生成に伴う
相乗効果を発見し、１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣ
ＯＰＹ測定法によりハイドロペルオキサイド基を含む水
溶性酸化脂質を確認・測定することに成功した。
ロペルオキサイド基を有する水溶性酸化脂質生成に伴う
相乗効果を発見し、１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣ
ＯＰＹ測定法によりハイドロペルオキサイド基を含む水
溶性酸化脂質を確認・測定することに成功した。
【００５１】更に、重水素化することなしに人の血漿中
に含まれる以下の濃度の低比重リポ蛋白に含まれる酸化
コレステロール・脂肪酸エステルの存在を検知すること
ができた。
に含まれる以下の濃度の低比重リポ蛋白に含まれる酸化
コレステロール・脂肪酸エステルの存在を検知すること
ができた。
【００５２】以上の結果より、血漿等の挟雑物が多く含
まれる生体材料中の酸化脂質の存在を直接、検出測定で
きる方法として、核磁気共鳴装置を用いるプロトン原子
核の分光分析方法は、有効なものと考えられる。
まれる生体材料中の酸化脂質の存在を直接、検出測定で
きる方法として、核磁気共鳴装置を用いるプロトン原子
核の分光分析方法は、有効なものと考えられる。
【図１】リノール酸試料に予めスーパーオキサイドジス
ムーターゼ（ＳＯＤ）５μＭのＣｕＳＯ４を添加し、長
波紫外線を照射して酸化させた試料を、プロトン核磁気
共鳴装置により経時的に測定した結果を示すグラフであ
る。
ムーターゼ（ＳＯＤ）５μＭのＣｕＳＯ４を添加し、長
波紫外線を照射して酸化させた試料を、プロトン核磁気
共鳴装置により経時的に測定した結果を示すグラフであ
る。
【図２】長波紫外線を照射して酸化させたリノール酸試
料を、プロトン核磁気共鳴装置により経時的に測定した
結果を示すグラフである。
料を、プロトン核磁気共鳴装置により経時的に測定した
結果を示すグラフである。
【図３】スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）と
５μＭのＣｕＳＯ４を低比重リポ蛋白溶液に添加した
後、長波紫外線照射により低比重リポ蛋白を酸化させた
ものにジスプロジウム トリポリフォスフェイト溶液を
添加し、これをプロトン核磁気共鳴装置を用いて測定し
た結果を示すグラフである。
５μＭのＣｕＳＯ４を低比重リポ蛋白溶液に添加した
後、長波紫外線照射により低比重リポ蛋白を酸化させた
ものにジスプロジウム トリポリフォスフェイト溶液を
添加し、これをプロトン核磁気共鳴装置を用いて測定し
た結果を示すグラフである。
【図４】低比重リポ蛋白質中のハイドロペルオキサイド
基に影響を受けたピーク１の高さを測定することにより
大まかな定量を試みた結果を示すグラフである。
基に影響を受けたピーク１の高さを測定することにより
大まかな定量を試みた結果を示すグラフである。
【図５】長波紫外線を照射した低比重リポ蛋白の酸化の
経時的変化を、チオバルビタール酸反応物質測定法と、
１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ測定法とで示
すグラフである。
経時的変化を、チオバルビタール酸反応物質測定法と、
１Ｈ−ＮＭＲ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ測定法とで示
すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/92 Ｇ０１Ｎ 33/92 Ａ Ｇ０１Ｒ 33/30 24/02 ５１０Ｚ
Claims (2)
- 【請求項１】 リノール酸を重水素化メチルアルコール
に溶解し、それを重水素化したリン酸緩衝液に添加攪拌
して作成したリノール酸乳濁液、または、重水素化して
いないリン酸緩衝液で充分に透析した低比重リポ蛋白質
溶液に、スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、
Ｃｕイオンを添加し、長波紫外線を照射する水溶性酸化
脂質の生成方法。 - 【請求項２】 リノール酸を重水素化メチルアルコール
に溶解し、それを重水素化したリン酸緩衝液に添加攪拌
して作成したリノール酸乳濁液、または、重水素化して
いないリン酸緩衝液で充分に透析した低比重リポ蛋白質
溶液に、スーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、
Ｃｕイオンを添加し、長波紫外線を照射して生成した酸
化脂質に、ジスプロジウム トリポリリン酸を添加し、
これを核磁気共鳴装置にてプロトン原子核の分光分析を
する酸化脂質の確認・測定方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5144170A JP2920044B2 (ja) | 1993-05-12 | 1993-05-12 | 水溶性酸化脂質の生成方法及び酸化脂質の確認・測定方法 |
| DE1993629697 DE69329697T2 (de) | 1993-05-12 | 1993-07-14 | Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von oxidierten Lipiden |
| EP93111276A EP0631138B1 (en) | 1993-05-12 | 1993-07-14 | Process for detecting and determining oxidized lipid |
| US08/446,082 US5561052A (en) | 1992-06-18 | 1995-05-19 | Process for detecting oxidized lipids and process for forming oxidized lipids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5144170A JP2920044B2 (ja) | 1993-05-12 | 1993-05-12 | 水溶性酸化脂質の生成方法及び酸化脂質の確認・測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06324132A JPH06324132A (ja) | 1994-11-25 |
| JP2920044B2 true JP2920044B2 (ja) | 1999-07-19 |
Family
ID=15355836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5144170A Expired - Lifetime JP2920044B2 (ja) | 1992-06-18 | 1993-05-12 | 水溶性酸化脂質の生成方法及び酸化脂質の確認・測定方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0631138B1 (ja) |
| JP (1) | JP2920044B2 (ja) |
| DE (1) | DE69329697T2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2523114A (en) * | 2014-02-12 | 2015-08-19 | Kratos Analytical Ltd | Oxidized lipid detection |
| CN103868942B (zh) * | 2014-03-07 | 2016-07-06 | 许昌学院 | 半导体微纳米结构光生活性氧物种定性分析方法 |
| CN116559216B (zh) * | 2023-04-28 | 2024-01-05 | 齐鲁制药有限公司 | 一种测定蔗糖月桂酸酯中伯醇酯化度的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5343389A (en) | 1991-07-30 | 1994-08-30 | North Carolina State University | Method and apparatus for measuring classes and subclasses of lipoproteins |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4206132A (en) * | 1971-09-24 | 1980-06-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force | Lanthanide chelate of a fluorinated ligand |
| JPS6058538A (ja) * | 1983-09-09 | 1985-04-04 | Daikin Ind Ltd | 含フツ素光学分析試薬 |
| DE3338836A1 (de) * | 1983-10-26 | 1985-05-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung der low density lipoproteine (ldl) und reagenz zu seiner durchfuehrung |
| JPS6156027A (ja) * | 1984-08-27 | 1986-03-20 | パーデュー・リサーチ・ファウンデーション | 遺伝的に無臭である大豆の生産方法 |
| JPS63233374A (ja) * | 1987-03-20 | 1988-09-29 | Tohoku Denshi Sangyo Kk | 過酸化脂質の測定方法およびその測定装置 |
-
1993
- 1993-05-12 JP JP5144170A patent/JP2920044B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-14 DE DE1993629697 patent/DE69329697T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-14 EP EP93111276A patent/EP0631138B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5343389A (en) | 1991-07-30 | 1994-08-30 | North Carolina State University | Method and apparatus for measuring classes and subclasses of lipoproteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69329697D1 (de) | 2000-12-28 |
| EP0631138A1 (en) | 1994-12-28 |
| EP0631138B1 (en) | 2000-11-22 |
| JPH06324132A (ja) | 1994-11-25 |
| DE69329697T2 (de) | 2001-05-10 |
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