NL8602869A

NL8602869A - Werkwijze voor het aantonen, identificeren en/of kwantificeren van circulerende immuuncomplexen in bloedserum.

Info

Publication number: NL8602869A
Application number: NL8602869A
Authority: NL
Original assignee: Univ Utrecht
Priority date: 1986-11-12
Filing date: 1986-11-12
Publication date: 1988-06-01
Also published as: AU8323587A; WO1988003649A1

Description

• 1 ί

V

Reg.Nr. 126072/IK/BE

- Werkwijze voor het aantonen, identificeren en/of kwantificeren van circulerende immuuncomplexen in bloedserum - (als uitvinders zijn genoemd:

Dr. H. van Dijk en Drs. P. Bloembergen)

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het aantonen, identificeren en/of kwantificeren van circulerende immuuncomplexen (CIC).

Deze ClC's zijn complexen van antigeen met 5 antistoffen, die bij een nog steeds toenemend aantal ziektebeelden worden aangetroffen. Bij bepaalde ziekten (systemische lupus erythematosus, rheumatoide arthritis, verwante auto-immuunziekten, nieraandoeningen en bacteriële endocarditis) worden zij als één van de primaire diagnosti-10 ca gebruikt. Het voorkomen van CIC bij andere ziekte beelden (vormen van kanker, verschillende infectieziekten enz.) wordt thans geïnventariseerd.

Gevonden werd nu, dat de CIC's in bloedserum kunnen worden aangetoond door gebruik te maken van 15 polyanionische stoffen als universele binders van CIC's.

Tevens werd gevonden dat de voornoemde CIC's door gebruikmaking van polyanionische stoffen naast elkaar geïdentificeerd kunnen worden op grond van de klasse van antistoffen (IgM-, IgG-,IgA- en/of igE-bevattende complexen).

20 Identificatie van de CIC's op grond van erin aanwezige antigenen is in voornoemde opstelling ook mogelijk.

Tenslotte werd gevonden dat de CIC's middels de aangehaalde methode gekwantificeerd kunnen worden op grond van anti-stofklasse en zo mogelijk ook antigeen.

25 De uitvinding betreft derhalve een werkwijze als in de aanhef genoemd die daardoor is gekenmerkt,dat men het te onderzoeken bloedserum in aanraking brengt met een 8602869 * 9 -« - 2 - polyanionische stof, waardoor één of meer in het serum aanwezige immuuncomplexen aan deze stof hechten en daarna met voor de immuuncomplexen specifieke reagentia (anti-immuun-globulinen en antigeen-specifieke antisera) worden aange-5 toond.

Bij voorkeur past men bij deze werkwijze een vaste fasetechniek toe, waarbij de polyanionische stof is aangebracht op een vaste ondergrond, bijvoorbeeld van kunststof. Polyvinylchloride is daarvoor geschikt gebleken.

10 Goede resultaten worden bereikt door als polyanionische stof een heparine-albumine conjugaat te gebruiken. Een dergelijk conjugaat is bekend uit het Amerikaan-• se octrooischrift 4.526.714. Bij voorkeur brengt men het heparine-conjugaat op de vaste ondergrond aan, nadat daarop 15 een onderlaag van een polykationische stof is aangebracht.

Als onderlaag kan protamine worden gebruikt.

Ook hoogmoleculair dextraansulfaat kan als polyanionische stof bij de werkwijze vplgens de uitvinding met succes worden toegepast. De aantoning van immuuncomplexen op de 20 laag van polyanionische stof kan geschieden door gebruik te maken van een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) opstelling .

De uitvinding heeft ook betrekking op een vaatje dat geschikt is voor de uitvoering van de werkwijze 25 volgens de uitvinding en daardoor is gekenmerkt dat het binnen-oppervlak tenminste gedeeltelijk is voorzien van een bekleding van een polyanionische stof, bijvoorbeeld een heparine-albumine conjugaat of hoogmoleculair dextraansulfaat .

Indien een heparine-albumine conjugaat op 30 de bodem van het vaatje aanwezig is is dit bij voorkeur aangebracht op een laagje van de polykationische stof protamine. Een bijzonder geschikt voorwerp ter uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding bestaat uit een microtiter-plaat met vaatvormige verdiepte gedeelten, waarvan het 8602869 - 3 -

J

* binnen-oppervlak voorzien is van een hierboven genoemde bekleding.

De uitvinding wordt nader toegelicht in het volgende voorbeeld, dat geen beperkend karakter heeft.

5

Voorbeeld

In een polyvinylchloride microtiterplaat met 96 incubatievaatjes met vlakke bodem (Costar 2595) wordt per vaatje 150^ul van een oplossing van 5 ^ul protaminesulfaat per ml in EDTA-veronal buffer (10 mM EDTA(=ethyleendiaminete- traazijnzuur), 150 mM NaCl, 5 mM veronal, pH = 7,4) gebracht.

De plaat wordt 1 uur bij 37°C geincubeerd en vervolgens gewassen met EDTA-spoelbuffer (2 mM EDTA, 150 niM NaCl, 0,03%

Tween 20, pH = 7,4). Hierna wordt 150^ul van een oplossing van 5^ug heparine-humaan serum albumine conjugaat per ml EDTA-veronal buffer toegevoegd. Bij deze en volgende stappen wcrdC wederom 1 uur bij 37°C geincubeerd en gewassen zoals na de eerste stap. Vervolgens worden de op CIC's te onderzoeken sera in de vaatjes gebracht en wel in een hoeveelheid en concentratie van 100,ul en 1:100 i,n EDTA-veronal buffer met 20 / 0,5% Tween 20. Bij de volgende stap wordt een peroxydase- gelabeld anti-IgA conjugaat in de vaatjes gebracht (100^ul 1:4000 in EDTA-veronal buffer met 0,5% Tween), waarna in de laatste stap 100^ul kleurvormend peroxydase-substraat (100^ug tetramethylbenzidine en 150 nl waterstofperoxyde per ml 0,1 M acetaatbuffer, pH= 5,5 ) wordt toegevoegd. Na een incubatie van 10 minuten bij kamertemperatuur wordt de pH verlaagd door middel van 100 ^ul 2N zwavelzuur. De al dan niet ontstane kleurreaktie wordt gemeten bij 450 nm in een ge-2Q automatiseerde colorimeter (Titertek Multiskan). De uitslag wordt verminderd met een blancowaarde (vaatje waaraan geen serum is toegevoegd).

8602869

Claims

1. Werkwijze voor het aantonen en/of kwantificeren van circulerende inrmuuncomplexen in bloedserum met het kenmerk,dat men het serum in aanraking brengt met een polyanionische stof, waardoor de in het serum aanwezige 5 immuuncomplexen aan deze stof hechten en daarna met voor bepaalde immuuncomplexen specifieke reagentia worden aangetoond.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de polyanionische stof is aangebracht op een ^ vaste ondergrond.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk,dat men als polyanionische stof een heparine-albumine conjugaat gebruikt.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ^ kenmerk, dat men het heparine-conjugaat op de vaste ondergrond aanbrengt nadat daarop een onderlaag van een polykationische stof.bijvoorbeeld protamine, is aangebracht.

5. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men door middel van een 20 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) immuuncomplex aan— toont.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat als enzym het mierikswortelperoxydase en als substraat tetramethylbenzidine en waterstofperoxyde worden 25 gebruikt.

7. Vaatje geschikt voor de werkwijze volgens de uitvinding, gekenmerkt doordat tenminste een deel van het binnenoppervlak voorzien is van een bekleding van een polyanionische stof.

8. Vaatje volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de bekleding bestaat uit een heparine-albumine conjugaat of hoogmoleculair dextraansulfaat. 8602869 * 1 - 5 -

9. Vaatje volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het heparine-albumine conjugaat op een onder-laagje van een polykationische stof, bijvoorbeeld protamine is aangebracht. 5

10. Microtiterplaat met vaatvormige verdiepte gedeelten overeenkomstig één van de conclusies 7,8 of 9. t 8602869