JP3694121B2 - Ｈｄｌコレステロールの特異的測定用組成物及び測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの特異的測定用組成物及び測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血漿又は血清中の各リピドフラクション中に含有されるコレステロールは、近年アテローム性動脈硬化症や心筋梗塞の危険度を示す診断材料として重要視されている。血清のリピドフラクションはそれぞれ脂質複合体粒子としての大きさが異なり、比重の差を利用した分離法である超遠心法に従って、カイロミクロン、超低密度リポプロテイン（Very low density lipoprotein；以下ＶＬＤＬともいう）、低密度リポプロテイン（Low density lipoprotein ；以下ＬＤＬともいう）、及び高密度リポプロテイン（High density lipoprotein；以下ＨＤＬともいう）の４種類に分別されている。各リピドフラクションは、アポリポタンパク質と脂質に大別され、脂質は更に遊離型コレステロール、エステル型コレステロール、トリグリセリド及びリン脂質から構成されている。このため、コレステロールの測定は遊離型とエステル型の両者について行われている。
【０００３】
日常的な臨床検査では、自動分析装置を使用して酵素法による総コレステロールの測定が広く行われているが、リピドフラクションについては、試料の前処理（分画・分離操作）を行うことが必要なため、酵素法による自動分析測定（自動化）の普及が遅れていた。この試料の前処理としては、種々の沈殿法が行われており、例えばリンタングステン酸とマグネシウムイオン、デキストランサルフェートとマグネシウムイオン、ヘパリンとカルシウムイオンあるいはマンガンイオン（M. Burstein and H. R. Scholnick; Adv. Lipid Res., 11, 67, 1973, G. R. Warnick et al.; Clin. Chem., 25, 596, 1979）、又はポリエチレングリコールを添加してＬＤＬ等を沈殿させて遠心操作によって上澄み液を被検試料とする方法が繁用されている。詳細には、沈殿剤としてリンタングステン酸とマグネシウムイオンを使った場合、これらを含む溶液に試料（血清や血漿）を加え、ＨＤＬ以外のリピドフラクションを不溶性の複合体とする。これを遠心分離することによって沈殿を除き、ＨＤＬを含む上清を回収する。分画されたＨＤＬは総コレステロール測定用の酵素試薬で自動分析システムによる測定が可能となる。
また、免疫法（C-C. Heuck, 31, 252, 1985)においても沈殿剤としてアポリポタンパク質Ｂ（ＨＤＬには含まれない）に対する抗体を試料（血清や血漿）に加え、ＨＤＬ以外のリピドフラクションを沈殿させる。以下同様に分画した後、はじめて上清中のＨＤＬ含有コレステロールの測定を行うことができる。このように、従来の方法ではいずれも多くの工程と時間を要するという欠点があった。
【０００４】
最近、これら分画操作を必要としない測定法について報告が出されている（例えば、特公平６−１６７２０号、特公平７−３４７６０号、特開昭５８−１６５８００号各公報）。すなわち、従来より用いられている総コレステロール測定のための酵素法としては、コレステロールエステラーゼによりコレステロールエステルを加水分解し、この酵素反応生成物であるコレステロールをコレステロールオキシダーゼにより、溶存酸素を使って酸化反応を行わせて生成される過酸化水素を、適当な被酸化性発色剤の存在下でペルオキシダーゼ反応により発色させて比色定量したり、あるいは、前記のコレステロールオキシダーゼによる酸化反応の際に消費される溶存酸素量を酸素電極で測定する方法が知られていた。
【０００５】
例えば、前記の各特許公報の記載によれば、前記の反応系において胆汁酸塩と共に非イオン系のポリエチレンオキシド基含有界面活性剤の存在はコレステロールエステラーゼの活性発現に重要であり、この界面活性剤なしには活性を発現しないとされている。そして、特公平６−１６７２０号公報には、この胆汁酸塩には、脂質が豊富で比較的わずかなタンパク質を有するリポタンパク質である乳び脂粒、ＶＬＤＬ及びＬＤＬのみを溶かし、その中に含有されるコレステロールを酵素反応に関与させる効果があるため、ＨＤＬコレステロールの測定にさきがけて、これを反応させ、次いで前記の界面活性剤を添加し、ＨＤＬフラクション中に含有されるコレステロールと酵素とを反応させることによってＨＤＬコレステロールを特異的に分別測定する方法が記載されている。また、特公平７−３４７６０号公報には、前記と同様の系において、更に、使用する酵素を膵臓由来のコレステロールエステラーゼとし、抗ＬＤＬ抗体を反応系へ添加しておくことにより、ＬＤＬやＶＬＤＬの主要構成タンパク質であるアポリポタンパク質Ｂと前記抗体との間に抗原抗体反応による複合体を形成させ、当該酵素との反応を阻害することで総合的にＨＤＬフラクションに対する特異性を上げる工夫を行っている。しかし、これらの方法は試薬へ新たに抗体を添加したり、反応時間が２０分以上かかるなど、製造コストや測定操作上、日常使われている自動分析機への対応が不十分なものであった。
【０００６】
他方、H. Sugiuchi ら（Clin. Chem., 41, 717, 1995）は自動分析機へ適応した新しい方法について報告している。すなわち、使用する当該酵素（コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼ）にポリエチレングリコールを結合させ、化学修飾して高分子化した酵素を用いるものである。更に、前記の高分子化酵素に加えて、種々のリピドフラクションと親和性があるとされるシクロデキストリン誘導体（具体的には、硫酸化α−シクロデキストリン）を共存させることでＨＤＬ以外のリピドフラクションに対して複合体を形成させることができることが記載されている。この複合体は、前記高分子化酵素による反応を受けにくいためＨＤＬフラクションを特異的に測定することができる。しかし、このような手段を採用した場合、酵素の修飾は新たな工程の増加と、酵素標品の精製度の管理や化学修飾の程度差による酵素活性変動の抑制と管理、更には修飾酵素の安定性の維持等、新たな問題点を付随することになる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、現在の臨床検査試験では、迅速で簡便な手段である自動分析装置による測定が主流である点を鑑み、ＨＤＬコレステロールの測定方法において、試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく簡便な操作で、且つ高精度の測定結果が得られる方法の開発を目的として、鋭意研究を重ねた結果、ＨＤＬコレステロールの測定方法において利用する酵素（コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレステロールとの反応に関して、ＨＤＬフラクションのコレステロールとの反応には影響しないが、ＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールとの反応を阻害する化合物が存在することを見出し、これらの化合物を用いることにより、試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールを高精度に測定することができることを見出した。本発明は、こうした知見に基づくものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コレステロールを特異的に定量するための試薬組成物において、オクチルチオグルコシドを含有することを特徴とする、高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定用組成物に関する。
また、本発明は、生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コレステロールを特異的に定量する方法において、オクチルチオグルコシドを、分画操作を行っていない被検試料と接触させ、高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとの酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定することを特徴とする、高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法にも関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明においては、生体試料として、特に哺乳動物（特にヒト）の血清又は血漿をそのまま用いることができる。すなわち、血清又は血漿を分画処理したり、抗体で処理する必要がない。
また、本発明においては、前記の生体試料をコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼと接触させる際に、それらの酵素とＨＤＬコレステロールとの反応には影響しないが、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールとの反応を阻害する化合物（以下、ブロッカーと称することがある）として、
（１）カラギナン、
（２）アクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー（ＣＬＡ）、若しくはメタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー（ＭＡＬＡ）、又は
（３）オクチルチオグルコシド
の少なくとも１種を共存させる。
【００１０】
カラギナンは、硫酸基を結合したガラクトース及び３，６−アンヒドロガラクトースからなるアニオン性天然多糖類であり、水溶性やゲル化性などの物理的性質が異なるι型、λ型及びκ型が存在する。本発明では、こられのι型、λ型及びκ型のいずれも用いることができるが、ι型及びλ型が好ましい。
【００１１】
アニオン性合成高分子化合物であるアクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー（ＣＬＡ）、若しくはメタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー（ＭＡＬＡ）としては、好ましくは、一般式（Ｉ）：
〔但し、Ｒ1 は水素原子又はメチル基であり、Ｒ2 は−（ＣＨ2 ）11−ＣＨ3 基であり、ｘは、Ｒ1 が水素原子である場合には、６５〜８９、好ましくは７０〜８０であり、Ｒ1 がメチル基である場合には、７８〜９３であり、好ましくは８３〜９３である〕
で表される化合物又はその塩を用いることができる。なお、一般式（Ｉ）において、アクリル酸繰り返し単位とメタクリル酸繰り返し単位は、それぞれアトランダムにコポリマー内に含まれている。
前記一般式（Ｉ）で表されるコポリマーの塩は、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、又はカリウム）の塩を挙げることができる。
【００１２】
オクチルチオグルコシドは、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドである。
本発明においては、前記のカラギナン、ＣＬＡ、ＭＡＬＡ、又はオクチルチオグルコシドを単独で又は２種以上を任意に組み合わせて用いることができる。
【００１３】
なお、本発明において、カラギナン以外のアニオン性多糖類、例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、アルギン酸及びその誘導体、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸及びその誘導体、カラギナンの誘導体、カルボキシメチルセルロース、リン酸化セルロース、硫酸化セルロース、カルボキシメチルキチン、硫酸化キチン、デキストラン硫酸などは、ブロッカーとしての作用を示さない。
また、前記のＣＬＡ又はＭＡＬＡ以外のアニオン性ポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリル酸とオクチルアクリレイトとのコポリマー、ポリスチレンスルホン酸、スチレンスルホン酸と２−エチルヘキシルアクリレートとのコポリマー、スチレンスルホン酸とラウリルアクリレートとのコポリマーなども、ブロッカーとしての作用を示さない。
【００１４】
更に、オクチルチオグルコシド以外のアルキル基含有糖類、例えば、オクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、ドデシルマルトシド、シュクロースモノカプレイトなども、ブロッカーとしての作用を示さない。
更にまた、カチオン性ポリマー、例えば、ポリ〔（ジメチルイミニオ）ヘキサメチレン（ジメチルイミニオ）メチレン−１，４−フェニレンメチレンジクロライド〕、ポリ〔（ジメチルイミニオ）エチレン（ジメチルイミニオ）メチレン−１，４−フェニレンメチレンジチロライド〕、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（トリメチルアリルアンモニウムクロライド）など；カチオン性多糖類、例えば、キトサン、脱アセチル化キトサン；中性多糖類、例えば、デキストラン、セルロース、マンナン、アガロース等、他にこれらの中性多糖類のジエチルアミノエチル誘導体；及びヘパリンなども、ブロッカーとしての作用を示さない。
【００１５】
本発明において、ブロッカーは、水溶液として用いるのが好ましい。水溶液中のブロッカー濃度は、好ましくは０．０００２重量％〜１．０重量％、より好ましくは０．０００５重量％〜０．５重量％、最も好ましくは０．００１重量％〜０．２重量％である。ブロッカーの濃度が０．０００２重量％より少ないと、ＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールとの酵素反応に対する阻害効果が見られず、正確な測定を行うことができない。逆に１．０重量％を越える濃度では、フラクションのコレステロールとの酵素反応に対する特異性が全く見られなくなり、またブロッカーの溶解度が悪化する。
【００１６】
コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を結合させて化学修飾した酵素、又は化学修飾していない酵素のいずれも用いることができる。酵素の由来も限定されず、コレステロールエステラーゼとしては、例えば、シュードモナス属の微生物や、牛又は豚の膵臓由来のコレステロールエステラーゼを用いることができる。コレステロールエステラーゼとして微生物由来のコレステロールエステラーゼを使用した場合に、前記のブロッカーは特に有効である。また、コレステロールオキシダーゼとしては、例えば、ストレプトマイセス属又はノカルディヤ属の微生物由来のコレステロールオキシダーゼを用いることができる。それらの酵素の添加量も特に限定されないが、例えば、好ましくは０．１ｕ／ｍｌ〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．２ｕ／ｍｌ〜２０ｕ／ｍｌである。
【００１７】
本発明において、前記のブロッカーに加えて、アルカリ土類金属イオンを更に存在させると、リピドフラクションのコレステロールに対する前記酵素の特異性が向上するので好ましい。アルカリ土類金属は、特に限定されないが、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、又はバリウムを用いることができ、マグネシウムが好ましい。アルカリ土類金属イオンは、水溶性無機塩、例えば、ハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、又はヨウ化物）又は硫酸化物、あるいは、水溶性有機塩、例えば、酢酸塩又はクエン酸塩として用いることができる。アルカリ土類金属イオンは、好ましくは５〜３００ｍＭ、より好ましくは１０〜１５０ｍＭの量で用いることができる。
【００１８】
本発明によれば、被検試料（血清又は血漿）について遠心分離等の操作を行わずに、前記のブロッカーを、場合によりアルカリ土類金属の存在下に、被検試料（血清又は血漿）と接触（共存）させ、被検試料中のＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールと酵素との反応を阻害するとともに、ＨＤＬコレステロールと酵素との反応は阻害せずに進行させ、コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物（例えば、酸素）又は生成される化合物（例えば、過酸化水素）を、公知の手段により検出し、ＨＤＬコレステロールを定量することができる。例えば、過酸化水素を検出する場合には、適当な被酸化性発色剤とペルオキシダーゼの存在下に生成するＨ2 Ｏ2 を発色させて、分光学的に比色測定する。
【００１９】
Ｈ2 Ｏ2 は、公知の方法で、例えば、適当な被酸化性発色剤の存在下にペルオキシダーゼの反応により発色させることができる。被酸化性発色剤としては、３−ハイドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイックアシド（ＨＴＩＢＡ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）と４−アミノアンチピリン（４−ＡＰ）が好適であり、ＨＴＩＢＡやＥＳＰＴは０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして４−ＡＰは０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有させることができる。自動分析装置による測定では、波長５１０ｎｍ（ＨＴＩＢＡを使用する場合）、又は５４６ｎｍ（ＥＳＰＴを使用する場合）における吸光度を測定すればよい。
【００２０】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬を、現在汎用されている自動分析装置に合わせて、２試薬系にすることができる。この場合、第一試薬にブロッカー及び場合によりアルカリ土類金属を含有させ、第二試薬にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含有させることができる。第一試薬及び第二試薬の緩衝剤としては、リン酸緩衝液、ＢＥＳ，ＨＥＰＥＳ，ＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液、トリス緩衝液、イミダゾール緩衝液等を使用することができる。緩衝液の濃度としては、好ましくは１０〜１０００ｍＭ、より好ましくは２０〜５００ｍＭ、最も好ましくは２０〜２００ｍＭである。また、それらの緩衝液のｐＨは、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくはＬＤＬのコレステロール及びＶＬＤＬのコレステロールと酵素との阻害が良好なｐＨ６．５−８．０の範囲内で適宜選択することができる。アルキル土類金属イオンは、第一試薬及び／又は第二試薬に含有させることができるが、第一試薬に含有させることが好ましい。
【００２１】
２試薬系の本発明試薬を用いて、ＨＤＬコレステロールを測定する場合の反応系を模式的に示せば以下のとおりである。
【００２２】
自動分析装置による測定では、主に前記反応式（２）で生成するＨ2 Ｏ2 を比色法によって測定するが、これら溶液中での反応だけでなく、例えば、濾紙試験片などによる乾式測定系（ドライケミストリー）でも同様に用いることができる。また、このＨ2 Ｏ2 は、フェロシアン化カリウムなどの適当なメディエーターとペルオキシダーゼの存在下に反応させることにより、生成する酸化電位差を電気化学的に測定することもできる。他方、酵素反応により消費される化合物、例えば、前記反応式（２）で消費される酸素（溶存酸素）を、従来公知の方法、例えば、酸素電極で測定することもできる。また、酵素反応により生成される化合物としては、前記の過酸化水素以外にも、例えば、前記反応式（１）の生成物である脂肪酸、あるいは前記反応式（２）の生成物であるΔ４−コレステン−３−オンを適当な方法で測定してもよい。
【００２３】
【作用】
以下の説明に限定されるものではないが、本発明においては、ＨＤＬコレステロールの測定方法において利用する酵素（コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレステロールとの反応に際して、前記のブロッカーとして用いる化合物が、直接にリピドフラクションのアポリポタンパク質に親和性を示すか、あるいは間接的にリピドフラクションのコレステロールと酵素との反応時に酵素と相互作用するものと考えられる。
すなわち、各リピドフラクションは、脂質とアポリポタンパク質とからなる脂質複合体となっているが、その脂質構成比の違いとアポリポタンパク質のタイプ（Ａ−１，Ａ−１，Ｂ−１００，Ｂ−４８，Ｃ，Ｅなど）の差による物理化学的性質及び量的（被検試料中に含まれる量）な違いによって識別される。ＨＤＬフラクションとＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションとの間で最も大きく異なるアポリポタンパク質のタイプ（前者がＡ−１，Ａ−２、後者がＢ−１００，Ｃ，Ｅ）の違いが明らかなため、従来、アポリポタンパク質に対する抗体を用いる方法も開発されてきた。この従来法はアポリポタンパク質Ｂ及びＣに対する抗体を試料に混和し、免疫複合体を形成させることが特徴である。この免疫複合体は酵素反応阻害を惹起するため、次に酵素を加えるとＨＤＬコレステロールのみが酵素と反応するので、ＨＤＬコレステロールのみを測定することができる。しかし、免疫複合体を形成することができる抗体の反応性を一定に維持することは難しく、また免疫複合体自体の濁りが著しいため、コレステロール測定のための比色定量に際して誤差が大きくなるという欠点があった。
これに対し、本発明では、前記のブロッカーがアポリポタンパク質を中心とする脂質複合体と相互に作用し、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼによる、各リピドフラクションのコレステロールに対する反応性を特異的に変化させることができ、しかも、前記のブロッカーは、抗体とは異なり、安定な化合物である。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：超遠心法によるリピドフラクションの分画
超遠心法による脂質フラクションの分画は、工藤明生等（動脈硬化、6, 39, 1978)の方法に準じて行った。具体的には、プール血清１６ｍｌへ、ＥＤＴＡナトリウム塩１６ｍｇ、ショ糖４ｇ、臭化カリウム３．２ｇ、及び塩化ナトリウム０．８ｇを加え溶解した。これとは別に３種類の比重液を作成した。すなわち、比重１．２１の比重液は、ショ糖２０ｇ、臭化カリウム１５ｇ、及び塩化ナトリウム５ｇを精製水１００ｍｌに溶解して調製した。比重１．０６３の比重液は、比重１．２１の前記比重液３０ｍｌと精製水７０ｍｌを混和して調製した。また比重１．００６の比重液は、ショ糖２．５ｇを精製水９７．５ｍｌに溶解して調製した。
１０ｍｌ容量の遠心管に上記の血清１．９ｍｌを入れ、この上層に比重１．２１の比重液０．８ｍｌを注射器で静かに重層し、遠心管を１０℃で５００００ｒｐｍ２０時間遠心した。遠心処理終了後、最上層部には比重１．２１以下の全てのリピドフラクションが集まるが、この最上層部の上に更に比重１．０６３の比重液１．６ｍｌと比重１．００６の比重液２ｍｌとを重層した。
この遠心管を５００００ｒｐｍで４時間更に遠心し、各リピドフラクションを回収した。
各画分は生理的食塩水に一夜透析後（冷蔵下）、冷蔵保存した。
【００２５】
実施例２：ブロッカーの検索例
実施例１で得られたリピドフラクションのうち、ＬＤＬの１０μｌ、及びＨＤＬの２０μｌに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍｌ、５０ｍＭ−３−ハイドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイックアシド（ＨＴＩＢＡ）溶液０．０２ｍｌ、及び被検物質（ブロッカーなど）水溶液０．４３ｍｌを添加し、３７℃で５分間加温した。続いて、予め混和しておいた０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍｌ、１０ｍＭ−４−ＡＰの０．０５ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ濃度のペルオキシダーゼ溶液５μｌ、コレステロールエステラーゼ（シュードモナス属の微生物由来）及びコレステロールオキシダーゼ（ノカルディヤ属の微生物由来）各１０ｕ／ｍｌ（終濃度；但し、以下の表３のｎ−ＯＴＧ、ｎ−ＨＴＧ及びＳＭＬでは０．４ｕ／ｍｌを使用した）を加えた。３７℃で５分間放置した後、波長５１０ｎｍにおける吸光度を測定した。
また被検物質（ブロッカーなど）を添加しないことを除いて前記と同様の操作によって吸光度測定を行い、この対照試験の値を１００％として各脂質フラクションに対する反応阻害率を調べた。なお、表１〜表３中の（）内の値は、カラギナンでは終濃度０．１Ｍ塩化マグネシウム、他は全て終濃度１３ｍＭ塩化マグネシウム共存下の反応阻害率を示す。
なお、表１〜表３（及び以下の実施例）において、被検物質の略号は以下の意味である。
ＣＬＡ：アクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマーであり、ＣＬＡの後に記載する数字は、前記一般式（Ｉ）におけるｘの数値を意味する。
ＭＡＬＡ：メタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマーであり、ＭＡＬＡの後に記載する数字は、前記一般式（Ｉ）におけるｘの数値を意味する。
ＳＯＡ：スチレンスルホン酸とオクチルアクリレートとのコポリマーであり、ＳＯＡの後に記載する数字は、単位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。
ＣＳＡ：アクリル酸とスチリルアクリレートとのコポリマーであり、ＣＳＡの後に記載する数字は、単位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。
ＣＯＡ：アクリル酸とオクチルアクリレートとのコポリマーであり、ＣＯＡの後に記載する数字は、単位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。
ＳＬＡ：スチレンスルホン酸とラウリルアクリレートとのコポリマーであり、ＳＬＡの後に記載する数字は、単位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。
ｎ−ＯＴＧ：ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドである。
ｎ−ＨＴＧ：ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドである。
ＳＭＬ：シュクロースモノラウレートである。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】
表１〜表３の結果から、カラギナン、ＣＬＡ、及びＭＡＬＡは、ＨＤＬフラクションのコレステロールと酵素との反応には影響しないが、ＬＤＬフラクションのコレステロールとの反応を阻害することがわかる。特に好ましい化合物は、水溶解性が良好なι型カラギナン及びλ型カラギナン、前記一般式（Ｉ）でｘが７０〜８０のＣＬＡ、又は同じくｘが８３−９３のＭＡＬＡである。これらは、いずれもＨＤＬフラクションのコレステロールと酵素との反応においては２０％未満の阻害率を示すのに対し、ＬＤＬフラクションでは７０％以上の阻害率を示した。また、塩化マグネシウムの存在下では、ＨＤＬフラクションのコレステロールと酵素との反応においては１０％未満の阻害率であるのに対し、ＬＤＬフラクションでは９０％以上の阻害率を示し、以下のように実用的なものであった。
【００３０】
実施例３：反応経時変化
０．００２％−ＭＡＬＡ８９、２０ｍＭ塩化マグネシウム、及び１ｍＭ−ＨＴＩＢＡを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．７５ｍｌに、試料として、実施例１の方法で得られたリピドフラクションＨＤＬの２０μｌ、ＬＤＬの１０μｌ、ＶＬＤＬの１０μｌ、及び正常プール血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。これに０．５ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ、終濃度各１０ｕ／ｍｌのコレステロールエステラーゼ（シュードモナス属の微生物由来）及びコレステロールオキシダーゼ（ノカルディヤ属の微生物由来）を含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２５ｍｌを添加し、波長５１０ｎｍでの吸光度変化を記録した。結果を図１に示す。ＨＤＬフラクションに比べＬＤＬフラクション及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールに対する反応阻害が明らかであった。
【００３１】
実施例４：実検体の測定
ＣＬＡ８０をブロッカーに用いる場合、０．００２％−ＣＬＡ８０、２０ｍＭ塩化マグネシウム、及び１ｍＭ−ＥＳＰＴを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．７５ｍｌに血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。これに０．５ｍＭ−４−ＡＰ、０．４％ｎ−ＯＴＧ、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ、４ｕ／ｍｌのコレステロールエステラーゼ（シュードモナス属の微生物由来）、及び４ｕ／ｍｌのコレステロールオキシダーゼ（ノカルディヤ属の微生物由来）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．２５ｍｌを添加し、波長５４６ｎｍの吸光度を測定した。また、ブロッカーにカラギナンλを用いる場合には、０．００２％−ＣＬＡ８０及び２０ｍＭ塩化マグネシウムの代わりに、０．０５％カラギナンλ及び１００ｍＭ塩化マグネシウムを用いることを除いて、前記のＣＬＡ８０を用いた場合と同様の操作によって吸光度測定を行った。他方、同じ検体についてゲルロ過カラムによる反応液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法、W, Marz 等，Clin. Chem., 39, 2276, 1993)での測定を実施し、その測定値と比較対照した。また、各測定法での標準物質としては、予め超遠心法で分画したＨＤＬフラクションの総コレステロール値を酵素法で測定したものを用いた。
血清９例の測定値を表４に示す。
【００３２】
【表４】
【００３３】
【発明の効果】
試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく、簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールの高精度の測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるブロッカーの存在下における、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及び正常プール血清の吸光度の経時変化を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールの特異的測定用組成物及び測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血漿又は血清中の各リピドフラクション中に含有されるコレステロールは、近年アテローム性動脈硬化症や心筋梗塞の危険度を示す診断材料として重要視されている。血清のリピドフラクションはそれぞれ脂質複合体粒子としての大きさが異なり、比重の差を利用した分離法である超遠心法に従って、カイロミクロン、超低密度リポプロテイン（Very low density lipoprotein；以下ＶＬＤＬともいう）、低密度リポプロテイン（Low density lipoprotein ；以下ＬＤＬともいう）、及び高密度リポプロテイン（High density lipoprotein；以下ＨＤＬともいう）の４種類に分別されている。各リピドフラクションは、アポリポタンパク質と脂質に大別され、脂質は更に遊離型コレステロール、エステル型コレステロール、トリグリセリド及びリン脂質から構成されている。このため、コレステロールの測定は遊離型とエステル型の両者について行われている。
【０００３】
日常的な臨床検査では、自動分析装置を使用して酵素法による総コレステロールの測定が広く行われているが、リピドフラクションについては、試料の前処理（分画・分離操作）を行うことが必要なため、酵素法による自動分析測定（自動化）の普及が遅れていた。この試料の前処理としては、種々の沈殿法が行われており、例えばリンタングステン酸とマグネシウムイオン、デキストランサルフェートとマグネシウムイオン、ヘパリンとカルシウムイオンあるいはマンガンイオン（M. Burstein and H. R. Scholnick; Adv. Lipid Res., 11, 67, 1973, G. R. Warnick et al.; Clin. Chem., 25, 596, 1979）、又はポリエチレングリコールを添加してＬＤＬ等を沈殿させて遠心操作によって上澄み液を被検試料とする方法が繁用されている。詳細には、沈殿剤としてリンタングステン酸とマグネシウムイオンを使った場合、これらを含む溶液に試料（血清や血漿）を加え、ＨＤＬ以外のリピドフラクションを不溶性の複合体とする。これを遠心分離することによって沈殿を除き、ＨＤＬを含む上清を回収する。分画されたＨＤＬは総コレステロール測定用の酵素試薬で自動分析システムによる測定が可能となる。
また、免疫法（C-C. Heuck, 31, 252, 1985)においても沈殿剤としてアポリポタンパク質Ｂ（ＨＤＬには含まれない）に対する抗体を試料（血清や血漿）に加え、ＨＤＬ以外のリピドフラクションを沈殿させる。以下同様に分画した後、はじめて上清中のＨＤＬ含有コレステロールの測定を行うことができる。このように、従来の方法ではいずれも多くの工程と時間を要するという欠点があった。
【０００４】
最近、これら分画操作を必要としない測定法について報告が出されている（例えば、特公平６−１６７２０号、特公平７−３４７６０号、特開昭５８−１６５８００号各公報）。すなわち、従来より用いられている総コレステロール測定のための酵素法としては、コレステロールエステラーゼによりコレステロールエステルを加水分解し、この酵素反応生成物であるコレステロールをコレステロールオキシダーゼにより、溶存酸素を使って酸化反応を行わせて生成される過酸化水素を、適当な被酸化性発色剤の存在下でペルオキシダーゼ反応により発色させて比色定量したり、あるいは、前記のコレステロールオキシダーゼによる酸化反応の際に消費される溶存酸素量を酸素電極で測定する方法が知られていた。
【０００５】
例えば、前記の各特許公報の記載によれば、前記の反応系において胆汁酸塩と共に非イオン系のポリエチレンオキシド基含有界面活性剤の存在はコレステロールエステラーゼの活性発現に重要であり、この界面活性剤なしには活性を発現しないとされている。そして、特公平６−１６７２０号公報には、この胆汁酸塩には、脂質が豊富で比較的わずかなタンパク質を有するリポタンパク質である乳び脂粒、ＶＬＤＬ及びＬＤＬのみを溶かし、その中に含有されるコレステロールを酵素反応に関与させる効果があるため、ＨＤＬコレステロールの測定にさきがけて、これを反応させ、次いで前記の界面活性剤を添加し、ＨＤＬフラクション中に含有されるコレステロールと酵素とを反応させることによってＨＤＬコレステロールを特異的に分別測定する方法が記載されている。また、特公平７−３４７６０号公報には、前記と同様の系において、更に、使用する酵素を膵臓由来のコレステロールエステラーゼとし、抗ＬＤＬ抗体を反応系へ添加しておくことにより、ＬＤＬやＶＬＤＬの主要構成タンパク質であるアポリポタンパク質Ｂと前記抗体との間に抗原抗体反応による複合体を形成させ、当該酵素との反応を阻害することで総合的にＨＤＬフラクションに対する特異性を上げる工夫を行っている。しかし、これらの方法は試薬へ新たに抗体を添加したり、反応時間が２０分以上かかるなど、製造コストや測定操作上、日常使われている自動分析機への対応が不十分なものであった。
【０００６】
他方、H. Sugiuchi ら（Clin. Chem., 41, 717, 1995）は自動分析機へ適応した新しい方法について報告している。すなわち、使用する当該酵素（コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼ）にポリエチレングリコールを結合させ、化学修飾して高分子化した酵素を用いるものである。更に、前記の高分子化酵素に加えて、種々のリピドフラクションと親和性があるとされるシクロデキストリン誘導体（具体的には、硫酸化α−シクロデキストリン）を共存させることでＨＤＬ以外のリピドフラクションに対して複合体を形成させることができることが記載されている。この複合体は、前記高分子化酵素による反応を受けにくいためＨＤＬフラクションを特異的に測定することができる。しかし、このような手段を採用した場合、酵素の修飾は新たな工程の増加と、酵素標品の精製度の管理や化学修飾の程度差による酵素活性変動の抑制と管理、更には修飾酵素の安定性の維持等、新たな問題点を付随することになる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、現在の臨床検査試験では、迅速で簡便な手段である自動分析装置による測定が主流である点を鑑み、ＨＤＬコレステロールの測定方法において、試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく簡便な操作で、且つ高精度の測定結果が得られる方法の開発を目的として、鋭意研究を重ねた結果、ＨＤＬコレステロールの測定方法において利用する酵素（コレステロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレステロールとの反応に関して、ＨＤＬフラクションのコレステロールとの反応には影響しないが、ＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールとの反応を阻害する化合物が存在することを見出し、これらの化合物を用いることにより、試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールを高精度に測定することができることを見出した。本発明は、こうした知見に基づくものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コレステロールを特異的に定量するための試薬組成物において、オクチルチオグルコシドを含有することを特徴とする、高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定用組成物に関する。
また、本発明は、生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コレステロールを特異的に定量する方法において、オクチルチオグルコシドを、分画操作を行っていない被検試料と接触させ、高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとの酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定することを特徴とする、高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法にも関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明においては、生体試料として、特に哺乳動物（特にヒト）の血清又は血漿をそのまま用いることができる。すなわち、血清又は血漿を分画処理したり、抗体で処理する必要がない。
また、本発明においては、前記の生体試料をコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼと接触させる際に、それらの酵素とＨＤＬコレステロールとの反応には影響しないが、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールとの反応を阻害する化合物（以下、ブロッカーと称することがある）として、
（１）カラギナン、
（２）アクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー（ＣＬＡ）、若しくはメタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー（ＭＡＬＡ）、又は
（３）オクチルチオグルコシド
の少なくとも１種を共存させる。
【００１０】
カラギナンは、硫酸基を結合したガラクトース及び３，６−アンヒドロガラクトースからなるアニオン性天然多糖類であり、水溶性やゲル化性などの物理的性質が異なるι型、λ型及びκ型が存在する。本発明では、こられのι型、λ型及びκ型のいずれも用いることができるが、ι型及びλ型が好ましい。
【００１１】
アニオン性合成高分子化合物であるアクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー（ＣＬＡ）、若しくはメタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー（ＭＡＬＡ）としては、好ましくは、一般式（Ｉ）：
で表される化合物又はその塩を用いることができる。なお、一般式（Ｉ）において、アクリル酸繰り返し単位とメタクリル酸繰り返し単位は、それぞれアトランダムにコポリマー内に含まれている。
前記一般式（Ｉ）で表されるコポリマーの塩は、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、又はカリウム）の塩を挙げることができる。
【００１２】
オクチルチオグルコシドは、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドである。
本発明においては、前記のカラギナン、ＣＬＡ、ＭＡＬＡ、又はオクチルチオグルコシドを単独で又は２種以上を任意に組み合わせて用いることができる。
【００１３】
なお、本発明において、カラギナン以外のアニオン性多糖類、例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、アルギン酸及びその誘導体、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸及びその誘導体、カラギナンの誘導体、カルボキシメチルセルロース、リン酸化セルロース、硫酸化セルロース、カルボキシメチルキチン、硫酸化キチン、デキストラン硫酸などは、ブロッカーとしての作用を示さない。
また、前記のＣＬＡ又はＭＡＬＡ以外のアニオン性ポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリル酸とオクチルアクリレイトとのコポリマー、ポリスチレンスルホン酸、スチレンスルホン酸と２−エチルヘキシルアクリレートとのコポリマー、スチレンスルホン酸とラウリルアクリレートとのコポリマーなども、ブロッカーとしての作用を示さない。
【００１４】
更に、オクチルチオグルコシド以外のアルキル基含有糖類、例えば、オクチルグルコシド、ヘプチルチオグルコシド、ドデシルマルトシド、シュクロースモノカプレイトなども、ブロッカーとしての作用を示さない。
更にまた、カチオン性ポリマー、例えば、ポリ〔（ジメチルイミニオ）ヘキサメチレン（ジメチルイミニオ）メチレン−１，４−フェニレンメチレンジクロライド〕、ポリ〔（ジメチルイミニオ）エチレン（ジメチルイミニオ）メチレン−１，４−フェニレンメチレンジチロライド〕、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（トリメチルアリルアンモニウムクロライド）など；カチオン性多糖類、例えば、キトサン、脱アセチル化キトサン；中性多糖類、例えば、デキストラン、セルロース、マンナン、アガロース等、他にこれらの中性多糖類のジエチルアミノエチル誘導体；及びヘパリンなども、ブロッカーとしての作用を示さない。
【００１５】
本発明において、ブロッカーは、水溶液として用いるのが好ましい。水溶液中のブロッカー濃度は、好ましくは０．０００２重量％〜１．０重量％、より好ましくは０．０００５重量％〜０．５重量％、最も好ましくは０．００１重量％〜０．２重量％である。ブロッカーの濃度が０．０００２重量％より少ないと、ＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールとの酵素反応に対する阻害効果が見られず、正確な測定を行うことができない。逆に１．０重量％を越える濃度では、フラクションのコレステロールとの酵素反応に対する特異性が全く見られなくなり、またブロッカーの溶解度が悪化する。
【００１６】
コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を結合させて化学修飾した酵素、又は化学修飾していない酵素のいずれも用いることができる。酵素の由来も限定されず、コレステロールエステラーゼとしては、例えば、シュードモナス属の微生物や、牛又は豚の膵臓由来のコレステロールエステラーゼを用いることができる。コレステロールエステラーゼとして微生物由来のコレステロールエステラーゼを使用した場合に、前記のブロッカーは特に有効である。また、コレステロールオキシダーゼとしては、例えば、ストレプトマイセス属又はノカルディヤ属の微生物由来のコレステロールオキシダーゼを用いることができる。それらの酵素の添加量も特に限定されないが、例えば、好ましくは０．１ｕ／ｍｌ〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．２ｕ／ｍｌ〜２０ｕ／ｍｌである。
【００１７】
本発明において、前記のブロッカーに加えて、アルカリ土類金属イオンを更に存在させると、リピドフラクションのコレステロールに対する前記酵素の特異性が向上するので好ましい。アルカリ土類金属は、特に限定されないが、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、又はバリウムを用いることができ、マグネシウムが好ましい。アルカリ土類金属イオンは、水溶性無機塩、例えば、ハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、又はヨウ化物）又は硫酸化物、あるいは、水溶性有機塩、例えば、酢酸塩又はクエン酸塩として用いることができる。アルカリ土類金属イオンは、好ましくは５〜３００ｍＭ、より好ましくは１０〜１５０ｍＭの量で用いることができる。
【００１８】
本発明によれば、被検試料（血清又は血漿）について遠心分離等の操作を行わずに、前記のブロッカーを、場合によりアルカリ土類金属の存在下に、被検試料（血清又は血漿）と接触（共存）させ、被検試料中のＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールと酵素との反応を阻害するとともに、ＨＤＬコレステロールと酵素との反応は阻害せずに進行させ、コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物（例えば、酸素）又は生成される化合物（例えば、過酸化水素）を、公知の手段により検出し、ＨＤＬコレステロールを定量することができる。例えば、過酸化水素を検出する場合には、適当な被酸化性発色剤とペルオキシダーゼの存在下に生成するＨ2 Ｏ2 を発色させて、分光学的に比色測定する。
【００１９】
Ｈ2 Ｏ2 は、公知の方法で、例えば、適当な被酸化性発色剤の存在下にペルオキシダーゼの反応により発色させることができる。被酸化性発色剤としては、３−ハイドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイックアシド（ＨＴＩＢＡ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）と４−アミノアンチピリン（４−ＡＰ）が好適であり、ＨＴＩＢＡやＥＳＰＴは０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして４−ＡＰは０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有させることができる。自動分析装置による測定では、波長５１０ｎｍ（ＨＴＩＢＡを使用する場合）、又は５４６ｎｍ（ＥＳＰＴを使用する場合）における吸光度を測定すればよい。
【００２０】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬を、現在汎用されている自動分析装置に合わせて、２試薬系にすることができる。この場合、第一試薬にブロッカー及び場合によりアルカリ土類金属を含有させ、第二試薬にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを含有させることができる。第一試薬及び第二試薬の緩衝剤としては、リン酸緩衝液、ＢＥＳ，ＨＥＰＥＳ，ＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液、トリス緩衝液、イミダゾール緩衝液等を使用することができる。緩衝液の濃度としては、好ましくは１０〜１０００ｍＭ、より好ましくは２０〜５００ｍＭ、最も好ましくは２０〜２００ｍＭである。また、それらの緩衝液のｐＨは、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくはＬＤＬのコレステロール及びＶＬＤＬのコレステロールと酵素との阻害が良好なｐＨ６．５−８．０の範囲内で適宜選択することができる。アルキル土類金属イオンは、第一試薬及び／又は第二試薬に含有させることができるが、第一試薬に含有させることが好ましい。
【００２１】
２試薬系の本発明試薬を用いて、ＨＤＬコレステロールを測定する場合の反応系を模式的に示せば以下のとおりである。
自動分析装置による測定では、主に前記反応式（２）で生成するＨ2 Ｏ2 を比色法によって測定するが、これら溶液中での反応だけでなく、例えば、濾紙試験片などによる乾式測定系（ドライケミストリー）でも同様に用いることができる。また、このＨ2 Ｏ2 は、フェロシアン化カリウムなどの適当なメディエーターとペルオキシダーゼの存在下に反応させることにより、生成する酸化電位差を電気化学的に測定することもできる。他方、酵素反応により消費される化合物、例えば、前記反応式（２）で消費される酸素（溶存酸素）を、従来公知の方法、例えば、酸素電極で測定することもできる。また、酵素反応により生成される化合物としては、前記の過酸化水素以外にも、例えば、前記反応式（１）の生成物である脂肪酸、あるいは前記反応式（２）の生成物であるΔ４−コレステン−３−オンを適当な方法で測定してもよい。
【００２３】
【作用】
以下の説明に限定されるものではないが、本発明においては、ＨＤＬコレステロールの測定方法において利用する酵素（コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレステロールとの反応に際して、前記のブロッカーとして用いる化合物が、直接にリピドフラクションのアポリポタンパク質に親和性を示すか、あるいは間接的にリピドフラクションのコレステロールと酵素との反応時に酵素と相互作用するものと考えられる。
すなわち、各リピドフラクションは、脂質とアポリポタンパク質とからなる脂質複合体となっているが、その脂質構成比の違いとアポリポタンパク質のタイプ（Ａ−１，Ａ−１，Ｂ−１００，Ｂ−４８，Ｃ，Ｅなど）の差による物理化学的性質及び量的（被検試料中に含まれる量）な違いによって識別される。ＨＤＬフラクションとＬＤＬ及びＶＬＤＬフラクションとの間で最も大きく異なるアポリポタンパク質のタイプ（前者がＡ−１，Ａ−２、後者がＢ−１００，Ｃ，Ｅ）の違いが明らかなため、従来、アポリポタンパク質に対する抗体を用いる方法も開発されてきた。この従来法はアポリポタンパク質Ｂ及びＣに対する抗体を試料に混和し、免疫複合体を形成させることが特徴である。この免疫複合体は酵素反応阻害を惹起するため、次に酵素を加えるとＨＤＬコレステロールのみが酵素と反応するので、ＨＤＬコレステロールのみを測定することができる。しかし、免疫複合体を形成することができる抗体の反応性を一定に維持することは難しく、また免疫複合体自体の濁りが著しいため、コレステロール測定のための比色定量に際して誤差が大きくなるという欠点があった。
これに対し、本発明では、前記のブロッカーがアポリポタンパク質を中心とする脂質複合体と相互に作用し、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼによる、各リピドフラクションのコレステロールに対する反応性を特異的に変化させることができ、しかも、前記のブロッカーは、抗体とは異なり、安定な化合物である。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：超遠心法によるリピドフラクションの分画
超遠心法による脂質フラクションの分画は、工藤明生等（動脈硬化、6, 39, 1978)の方法に準じて行った。具体的には、プール血清１６ｍｌへ、ＥＤＴＡナトリウム塩１６ｍｇ、ショ糖４ｇ、臭化カリウム３．２ｇ、及び塩化ナトリウム０．８ｇを加え溶解した。これとは別に３種類の比重液を作成した。すなわち、比重１．２１の比重液は、ショ糖２０ｇ、臭化カリウム１５ｇ、及び塩化ナトリウム５ｇを精製水１００ｍｌに溶解して調製した。比重１．０６３の比重液は、比重１．２１の前記比重液３０ｍｌと精製水７０ｍｌを混和して調製した。また比重１．００６の比重液は、ショ糖２．５ｇを精製水９７．５ｍｌに溶解して調製した。
１０ｍｌ容量の遠心管に上記の血清１．９ｍｌを入れ、この上層に比重１．２１の比重液０．８ｍｌを注射器で静かに重層し、遠心管を１０℃で５００００ｒｐｍ２０時間遠心した。遠心処理終了後、最上層部には比重１．２１以下の全てのリピドフラクションが集まるが、この最上層部の上に更に比重１．０６３の比重液１．６ｍｌと比重１．００６の比重液２ｍｌとを重層した。
この遠心管を５００００ｒｐｍで４時間更に遠心し、各リピドフラクションを回収した。
各画分は生理的食塩水に一夜透析後（冷蔵下）、冷蔵保存した。
【００２５】
実施例２：ブロッカーの検索例
実施例１で得られたリピドフラクションのうち、ＬＤＬの１０μｌ、及びＨＤＬの２０μｌに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍｌ、５０ｍＭ−３−ハイドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイックアシド（ＨＴＩＢＡ）溶液０．０２ｍｌ、及び被検物質（ブロッカーなど）水溶液０．４３ｍｌを添加し、３７℃で５分間加温した。続いて、予め混和しておいた０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍｌ、１０ｍＭ−４−ＡＰの０．０５ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ濃度のペルオキシダーゼ溶液５μｌ、コレステロールエステラーゼ（シュードモナス属の微生物由来）及びコレステロールオキシダーゼ（ノカルディヤ属の微生物由来）各１０ｕ／ｍｌ（終濃度；但し、以下の表３のｎ−ＯＴＧ、ｎ−ＨＴＧ及びＳＭＬでは０．４ｕ／ｍｌを使用した）を加えた。３７℃で５分間放置した後、波長５１０ｎｍにおける吸光度を測定した。
また被検物質（ブロッカーなど）を添加しないことを除いて前記と同様の操作によって吸光度測定を行い、この対照試験の値を１００％として各脂質フラクションに対する反応阻害率を調べた。なお、表１〜表３中の（）内の値は、カラギナンでは終濃度０．１Ｍ塩化マグネシウム、他は全て終濃度１３ｍＭ塩化マグネシウム共存下の反応阻害率を示す。
なお、表１〜表３（及び以下の実施例）において、被検物質の略号は以下の意味である。
ＣＬＡ：アクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマーであり、ＣＬＡの後に記載する数字は、前記一般式（Ｉ）におけるｘの数値を意味する。
ＭＡＬＡ：メタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマーであり、ＭＡＬＡの後に記載する数字は、前記一般式（Ｉ）におけるｘの数値を意味する。
ＳＯＡ：スチレンスルホン酸とオクチルアクリレートとのコポリマーであり、ＳＯＡの後に記載する数字は、単位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。
ＣＳＡ：アクリル酸とスチリルアクリレートとのコポリマーであり、ＣＳＡの後に記載する数字は、単位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。
ＣＯＡ：アクリル酸とオクチルアクリレートとのコポリマーであり、ＣＯＡの後に記載する数字は、単位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。
ＳＬＡ：スチレンスルホン酸とラウリルアクリレートとのコポリマーであり、ＳＬＡの後に記載する数字は、単位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。
ｎ−ＯＴＧ：ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドである。
ｎ−ＨＴＧ：ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドである。
ＳＭＬ：シュクロースモノラウレートである。
【００２６】
【表１】
【表２】
【表３】
表１〜表３の結果から、カラギナン、ＣＬＡ、及びＭＡＬＡは、ＨＤＬフラクションのコレステロールと酵素との反応には影響しないが、ＬＤＬフラクションのコレステロールとの反応を阻害することがわかる。特に好ましい化合物は、水溶解性が良好なι型カラギナン及びλ型カラギナン、前記一般式（Ｉ）でｘが７０〜８０のＣＬＡ、又は同じくｘが８３−９３のＭＡＬＡである。これらは、いずれもＨＤＬフラクションのコレステロールと酵素との反応においては２０％未満の阻害率を示すのに対し、ＬＤＬフラクションでは７０％以上の阻害率を示した。また、塩化マグネシウムの存在下では、ＨＤＬフラクションのコレステロールと酵素との反応においては１０％未満の阻害率であるのに対し、ＬＤＬフラクションでは９０％以上の阻害率を示し、以下のように実用的なものであった。
【００３０】
実施例３：反応経時変化
０．００２％−ＭＡＬＡ８９、２０ｍＭ塩化マグネシウム、及び１ｍＭ−ＨＴＩＢＡを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．７５ｍｌに、試料として、実施例１の方法で得られたリピドフラクションＨＤＬの２０μｌ、ＬＤＬの１０μｌ、ＶＬＤＬの１０μｌ、及び正常プール血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。これに０．５ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ、終濃度各１０ｕ／ｍｌのコレステロールエステラーゼ（シュードモナス属の微生物由来）及びコレステロールオキシダーゼ（ノカルディヤ属の微生物由来）を含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２５ｍｌを添加し、波長５１０ｎｍでの吸光度変化を記録した。結果を図１に示す。ＨＤＬフラクションに比べＬＤＬフラクション及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールに対する反応阻害が明らかであった。
【００３１】
実施例４：実検体の測定
ＣＬＡ８０をブロッカーに用いる場合、０．００２％−ＣＬＡ８０、２０ｍＭ塩化マグネシウム、及び１ｍＭ−ＥＳＰＴを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．７５ｍｌに血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。これに０．５ｍＭ−４−ＡＰ、０．４％ｎ−ＯＴＧ、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ、４ｕ／ｍｌのコレステロールエステラーゼ（シュードモナス属の微生物由来）、及び４ｕ／ｍｌのコレステロールオキシダーゼ（ノカルディヤ属の微生物由来）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．２５ｍｌを添加し、波長５４６ｎｍの吸光度を測定した。また、ブロッカーにカラギナンλを用いる場合には、０．００２％−ＣＬＡ８０及び２０ｍＭ塩化マグネシウムの代わりに、０．０５％カラギナンλ及び１００ｍＭ塩化マグネシウムを用いることを除いて、前記のＣＬＡ８０を用いた場合と同様の操作によって吸光度測定を行った。他方、同じ検体についてゲルロ過カラムによる反応液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法、W, Marz 等，Clin. Chem., 39, 2276, 1993)での測定を実施し、その測定値と比較対照した。また、各測定法での標準物質としては、予め超遠心法で分画したＨＤＬフラクションの総コレステロール値を酵素法で測定したものを用いた。
血清９例の測定値を表４に示す。
【００３２】
【表４】
【発明の効果】
試料（血清又は血漿）の遠心操作を行うことなく、簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールの高精度の測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるブロッカーの存在下における、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及び正常プール血清の吸光度の経時変化を示すグラフである。
Claims (8)
- 生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コレステロールを特異的に定量するための試薬組成物において、オクチルチオグルコシドを含有することを特徴とする、高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定用組成物。
- 更に、アクリル酸若しくはメタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー、又はカラギナンを含有する請求項１に記載の組成物。
- アクリル酸又はメタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマーが、一般式（Ｉ）：
で表される化合物又はその塩である請求項２に記載の組成物。 - 更に、アルカリ土類金属イオンを含有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
- 酵素反応生成物が過酸化水素であり、この過酸化水素から色素を形成させて検出する検出試薬として、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、及びＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン又は３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸を含有する請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
- 生体試料中の高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コレステロールを特異的に定量する方法において、オクチルチオグルコシドを、分画操作を行っていない被検試料と接触させ、高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとの酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物を測定することを特徴とする、高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定方法。
- 更に、アクリル酸若しくはメタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー、又はカラギナンを共存させる請求項６に記載の方法。
- 更に、アルカリ土類金属イオンを共存させる請求項６又は７に記載の方法。
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