JPH09121895A - Ｈｄｌコレステロールの特異的測定用組成物及び測定方法 - Google Patents
Ｈｄｌコレステロールの特異的測定用組成物及び測定方法Info
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- JPH09121895A JPH09121895A JP24872296A JP24872296A JPH09121895A JP H09121895 A JPH09121895 A JP H09121895A JP 24872296 A JP24872296 A JP 24872296A JP 24872296 A JP24872296 A JP 24872296A JP H09121895 A JPH09121895 A JP H09121895A
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- density lipoprotein
- enzyme
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロ
ールの測定用組成物及び測定方法を提供する。 【解決手段】 組成物は、生体試料中のＨＤＬコレステ
ロールとコレステロールエステラーゼ及びオキシダーゼ
とを接触させ、酵素反応による消費又は生成化合物を測
定する試薬組成物において、カラギナン、アクリル酸／
メタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー、
又はオクチルチオグルコシドからなる群から選択される
化合物を含有する。方法は、分画操作を行っていない被
検試料と前記化合物を接触させる。 【効果】 試料（血清又は血漿）の遠心操作が不要であ
る。
ールの測定用組成物及び測定方法を提供する。 【解決手段】 組成物は、生体試料中のＨＤＬコレステ
ロールとコレステロールエステラーゼ及びオキシダーゼ
とを接触させ、酵素反応による消費又は生成化合物を測
定する試薬組成物において、カラギナン、アクリル酸／
メタクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー、
又はオクチルチオグルコシドからなる群から選択される
化合物を含有する。方法は、分画操作を行っていない被
検試料と前記化合物を接触させる。 【効果】 試料（血清又は血漿）の遠心操作が不要であ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、高密度リポタンパ
ク質（ＨＤＬ）コレステロールの特異的測定用組成物及
び測定方法に関する。
ク質（ＨＤＬ）コレステロールの特異的測定用組成物及
び測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血漿又は血清中の各リピドフラクション
中に含有されるコレステロールは、近年アテローム性動
脈硬化症や心筋梗塞の危険度を示す診断材料として重要
視されている。血清のリピドフラクションはそれぞれ脂
質複合体粒子としての大きさが異なり、比重の差を利用
した分離法である超遠心法に従って、カイロミクロン、
超低密度リポプロテイン（Very low density lipoprote
in；以下ＶＬＤＬともいう）、低密度リポプロテイン
（Low density lipoprotein ；以下ＬＤＬともいう）、
及び高密度リポプロテイン（High density lipoprotei
n；以下ＨＤＬともいう）の４種類に分別されている。
各リピドフラクションは、アポリポタンパク質と脂質に
大別され、脂質は更に遊離型コレステロール、エステル
型コレステロール、トリグリセリド及びリン脂質から構
成されている。このため、コレステロールの測定は遊離
型とエステル型の両者について行われている。
中に含有されるコレステロールは、近年アテローム性動
脈硬化症や心筋梗塞の危険度を示す診断材料として重要
視されている。血清のリピドフラクションはそれぞれ脂
質複合体粒子としての大きさが異なり、比重の差を利用
した分離法である超遠心法に従って、カイロミクロン、
超低密度リポプロテイン（Very low density lipoprote
in；以下ＶＬＤＬともいう）、低密度リポプロテイン
（Low density lipoprotein ；以下ＬＤＬともいう）、
及び高密度リポプロテイン（High density lipoprotei
n；以下ＨＤＬともいう）の４種類に分別されている。
各リピドフラクションは、アポリポタンパク質と脂質に
大別され、脂質は更に遊離型コレステロール、エステル
型コレステロール、トリグリセリド及びリン脂質から構
成されている。このため、コレステロールの測定は遊離
型とエステル型の両者について行われている。
【０００３】日常的な臨床検査では、自動分析装置を使
用して酵素法による総コレステロールの測定が広く行わ
れているが、リピドフラクションについては、試料の前
処理（分画・分離操作）を行うことが必要なため、酵素
法による自動分析測定（自動化）の普及が遅れていた。
この試料の前処理としては、種々の沈殿法が行われてお
り、例えばリンタングステン酸とマグネシウムイオン、
デキストランサルフェートとマグネシウムイオン、ヘパ
リンとカルシウムイオンあるいはマンガンイオン（M. B
urstein and H. R. Scholnick; Adv. Lipid Res., 11,
67, 1973, G. R. Warnick et al.; Clin. Chem., 25, 5
96, 1979）、又はポリエチレングリコールを添加してＬ
ＤＬ等を沈殿させて遠心操作によって上澄み液を被検試
料とする方法が繁用されている。詳細には、沈殿剤とし
てリンタングステン酸とマグネシウムイオンを使った場
合、これらを含む溶液に試料（血清や血漿）を加え、Ｈ
ＤＬ以外のリピドフラクションを不溶性の複合体とす
る。これを遠心分離することによって沈殿を除き、ＨＤ
Ｌを含む上清を回収する。分画されたＨＤＬは総コレス
テロール測定用の酵素試薬で自動分析システムによる測
定が可能となる。また、免疫法（C-C. Heuck, 31, 252,
1985)においても沈殿剤としてアポリポタンパク質Ｂ
（ＨＤＬには含まれない）に対する抗体を試料（血清や
血漿）に加え、ＨＤＬ以外のリピドフラクションを沈殿
させる。以下同様に分画した後、はじめて上清中のＨＤ
Ｌ含有コレステロールの測定を行うことができる。この
ように、従来の方法ではいずれも多くの工程と時間を要
するという欠点があった。
用して酵素法による総コレステロールの測定が広く行わ
れているが、リピドフラクションについては、試料の前
処理（分画・分離操作）を行うことが必要なため、酵素
法による自動分析測定（自動化）の普及が遅れていた。
この試料の前処理としては、種々の沈殿法が行われてお
り、例えばリンタングステン酸とマグネシウムイオン、
デキストランサルフェートとマグネシウムイオン、ヘパ
リンとカルシウムイオンあるいはマンガンイオン（M. B
urstein and H. R. Scholnick; Adv. Lipid Res., 11,
67, 1973, G. R. Warnick et al.; Clin. Chem., 25, 5
96, 1979）、又はポリエチレングリコールを添加してＬ
ＤＬ等を沈殿させて遠心操作によって上澄み液を被検試
料とする方法が繁用されている。詳細には、沈殿剤とし
てリンタングステン酸とマグネシウムイオンを使った場
合、これらを含む溶液に試料（血清や血漿）を加え、Ｈ
ＤＬ以外のリピドフラクションを不溶性の複合体とす
る。これを遠心分離することによって沈殿を除き、ＨＤ
Ｌを含む上清を回収する。分画されたＨＤＬは総コレス
テロール測定用の酵素試薬で自動分析システムによる測
定が可能となる。また、免疫法（C-C. Heuck, 31, 252,
1985)においても沈殿剤としてアポリポタンパク質Ｂ
（ＨＤＬには含まれない）に対する抗体を試料（血清や
血漿）に加え、ＨＤＬ以外のリピドフラクションを沈殿
させる。以下同様に分画した後、はじめて上清中のＨＤ
Ｌ含有コレステロールの測定を行うことができる。この
ように、従来の方法ではいずれも多くの工程と時間を要
するという欠点があった。
【０００４】最近、これら分画操作を必要としない測定
法について報告が出されている（例えば、特公平６−１
６７２０号、特公平７−３４７６０号、特開昭５８−１
６５８００号各公報）。すなわち、従来より用いられて
いる総コレステロール測定のための酵素法としては、コ
レステロールエステラーゼによりコレステロールエステ
ルを加水分解し、この酵素反応生成物であるコレステロ
ールをコレステロールオキシダーゼにより、溶存酸素を
使って酸化反応を行わせて生成される過酸化水素を、適
当な被酸化性発色剤の存在下でペルオキシダーゼ反応に
より発色させて比色定量したり、あるいは、前記のコレ
ステロールオキシダーゼによる酸化反応の際に消費され
る溶存酸素量を酸素電極で測定する方法が知られてい
た。
法について報告が出されている（例えば、特公平６−１
６７２０号、特公平７−３４７６０号、特開昭５８−１
６５８００号各公報）。すなわち、従来より用いられて
いる総コレステロール測定のための酵素法としては、コ
レステロールエステラーゼによりコレステロールエステ
ルを加水分解し、この酵素反応生成物であるコレステロ
ールをコレステロールオキシダーゼにより、溶存酸素を
使って酸化反応を行わせて生成される過酸化水素を、適
当な被酸化性発色剤の存在下でペルオキシダーゼ反応に
より発色させて比色定量したり、あるいは、前記のコレ
ステロールオキシダーゼによる酸化反応の際に消費され
る溶存酸素量を酸素電極で測定する方法が知られてい
た。
【０００５】例えば、前記の各特許公報の記載によれ
ば、前記の反応系において胆汁酸塩と共に非イオン系の
ポリエチレンオキシド基含有界面活性剤の存在はコレス
テロールエステラーゼの活性発現に重要であり、この界
面活性剤なしには活性を発現しないとされている。そし
て、特公平６−１６７２０号公報には、この胆汁酸塩に
は、脂質が豊富で比較的わずかなタンパク質を有するリ
ポタンパク質である乳び脂粒、ＶＬＤＬ及びＬＤＬのみ
を溶かし、その中に含有されるコレステロールを酵素反
応に関与させる効果があるため、ＨＤＬコレステロール
の測定にさきがけて、これを反応させ、次いで前記の界
面活性剤を添加し、ＨＤＬフラクション中に含有される
コレステロールと酵素とを反応させることによってＨＤ
Ｌコレステロールを特異的に分別測定する方法が記載さ
れている。また、特公平７−３４７６０号公報には、前
記と同様の系において、更に、使用する酵素を膵臓由来
のコレステロールエステラーゼとし、抗ＬＤＬ抗体を反
応系へ添加しておくことにより、ＬＤＬやＶＬＤＬの主
要構成タンパク質であるアポリポタンパク質Ｂと前記抗
体との間に抗原抗体反応による複合体を形成させ、当該
酵素との反応を阻害することで総合的にＨＤＬフラクシ
ョンに対する特異性を上げる工夫を行っている。しか
し、これらの方法は試薬へ新たに抗体を添加したり、反
応時間が２０分以上かかるなど、製造コストや測定操作
上、日常使われている自動分析機への対応が不十分なも
のであった。
ば、前記の反応系において胆汁酸塩と共に非イオン系の
ポリエチレンオキシド基含有界面活性剤の存在はコレス
テロールエステラーゼの活性発現に重要であり、この界
面活性剤なしには活性を発現しないとされている。そし
て、特公平６−１６７２０号公報には、この胆汁酸塩に
は、脂質が豊富で比較的わずかなタンパク質を有するリ
ポタンパク質である乳び脂粒、ＶＬＤＬ及びＬＤＬのみ
を溶かし、その中に含有されるコレステロールを酵素反
応に関与させる効果があるため、ＨＤＬコレステロール
の測定にさきがけて、これを反応させ、次いで前記の界
面活性剤を添加し、ＨＤＬフラクション中に含有される
コレステロールと酵素とを反応させることによってＨＤ
Ｌコレステロールを特異的に分別測定する方法が記載さ
れている。また、特公平７−３４７６０号公報には、前
記と同様の系において、更に、使用する酵素を膵臓由来
のコレステロールエステラーゼとし、抗ＬＤＬ抗体を反
応系へ添加しておくことにより、ＬＤＬやＶＬＤＬの主
要構成タンパク質であるアポリポタンパク質Ｂと前記抗
体との間に抗原抗体反応による複合体を形成させ、当該
酵素との反応を阻害することで総合的にＨＤＬフラクシ
ョンに対する特異性を上げる工夫を行っている。しか
し、これらの方法は試薬へ新たに抗体を添加したり、反
応時間が２０分以上かかるなど、製造コストや測定操作
上、日常使われている自動分析機への対応が不十分なも
のであった。
【０００６】他方、H. Sugiuchi ら（Clin. Chem., 41,
717, 1995）は自動分析機へ適応した新しい方法につい
て報告している。すなわち、使用する当該酵素（コレス
テロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダー
ゼ）にポリエチレングリコールを結合させ、化学修飾し
て高分子化した酵素を用いるものである。更に、前記の
高分子化酵素に加えて、種々のリピドフラクションと親
和性があるとされるシクロデキストリン誘導体（具体的
には、硫酸化α−シクロデキストリン）を共存させるこ
とでＨＤＬ以外のリピドフラクションに対して複合体を
形成させることができることが記載されている。この複
合体は、前記高分子化酵素による反応を受けにくいため
ＨＤＬフラクションを特異的に測定することができる。
しかし、このような手段を採用した場合、酵素の修飾は
新たな工程の増加と、酵素標品の精製度の管理や化学修
飾の程度差による酵素活性変動の抑制と管理、更には修
飾酵素の安定性の維持等、新たな問題点を付随すること
になる。
717, 1995）は自動分析機へ適応した新しい方法につい
て報告している。すなわち、使用する当該酵素（コレス
テロールエステラーゼ、及びコレステロールオキシダー
ゼ）にポリエチレングリコールを結合させ、化学修飾し
て高分子化した酵素を用いるものである。更に、前記の
高分子化酵素に加えて、種々のリピドフラクションと親
和性があるとされるシクロデキストリン誘導体（具体的
には、硫酸化α−シクロデキストリン）を共存させるこ
とでＨＤＬ以外のリピドフラクションに対して複合体を
形成させることができることが記載されている。この複
合体は、前記高分子化酵素による反応を受けにくいため
ＨＤＬフラクションを特異的に測定することができる。
しかし、このような手段を採用した場合、酵素の修飾は
新たな工程の増加と、酵素標品の精製度の管理や化学修
飾の程度差による酵素活性変動の抑制と管理、更には修
飾酵素の安定性の維持等、新たな問題点を付随すること
になる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、現在の
臨床検査試験では、迅速で簡便な手段である自動分析装
置による測定が主流である点を鑑み、ＨＤＬコレステロ
ールの測定方法において、試料（血清又は血漿）の遠心
操作を行うことなく簡便な操作で、且つ高精度の測定結
果が得られる方法の開発を目的として、鋭意研究を重ね
た結果、ＨＤＬコレステロールの測定方法において利用
する酵素（コレステロールエステラーゼ、及びコレステ
ロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレス
テロールとの反応に関して、ＨＤＬフラクションのコレ
ステロールとの反応には影響しないが、ＬＤＬ及びＶＬ
ＤＬフラクションのコレステロールとの反応を阻害する
化合物が存在することを見出し、これらの化合物を用い
ることにより、試料（血清又は血漿）の遠心操作を行う
ことなく簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールを高精度
に測定することができることを見出した。本発明は、こ
うした知見に基づくものである。
臨床検査試験では、迅速で簡便な手段である自動分析装
置による測定が主流である点を鑑み、ＨＤＬコレステロ
ールの測定方法において、試料（血清又は血漿）の遠心
操作を行うことなく簡便な操作で、且つ高精度の測定結
果が得られる方法の開発を目的として、鋭意研究を重ね
た結果、ＨＤＬコレステロールの測定方法において利用
する酵素（コレステロールエステラーゼ、及びコレステ
ロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コレス
テロールとの反応に関して、ＨＤＬフラクションのコレ
ステロールとの反応には影響しないが、ＬＤＬ及びＶＬ
ＤＬフラクションのコレステロールとの反応を阻害する
化合物が存在することを見出し、これらの化合物を用い
ることにより、試料（血清又は血漿）の遠心操作を行う
ことなく簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールを高精度
に測定することができることを見出した。本発明は、こ
うした知見に基づくものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、生体
試料中の高密度リポタンパク質コレステロールとコレス
テロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ
とを接触させ、前記コレステロールと前記各酵素との酵
素反応により消費される化合物又は生成される化合物を
測定して、高密度リポタンパク質コレステロールを特異
的に定量するための試薬組成物において、（１）カラギ
ナン、（２）アクリル酸又はメタクリル酸とラウリルア
クリレートとのコポリマー、及び（３）オクチルチオグ
ルコシドからなる群から選択される化合物少なくとも１
種を含有することを特徴とする、高密度リポタンパク質
コレステロールの特異的測定用組成物に関する。また、
本発明は、生体試料中の高密度リポタンパク質コレステ
ロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステロー
ルオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロールと前
記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成
される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コレス
テロールを特異的に定量する方法において、（１）カラ
ギナン、（２）アクリル酸又はメタクリル酸とラウリル
アクリレートとのコポリマー、及び（３）オクチルチオ
グルコシドからなる群から選択される化合物少なくとも
１種を、分画操作を行っていない被検試料と接触させ、
高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロール
エステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとの酵素
反応により消費される化合物又は生成される化合物を測
定することを特徴とする、高密度リポタンパク質コレス
テロールの特異的測定方法にも関する。
試料中の高密度リポタンパク質コレステロールとコレス
テロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ
とを接触させ、前記コレステロールと前記各酵素との酵
素反応により消費される化合物又は生成される化合物を
測定して、高密度リポタンパク質コレステロールを特異
的に定量するための試薬組成物において、（１）カラギ
ナン、（２）アクリル酸又はメタクリル酸とラウリルア
クリレートとのコポリマー、及び（３）オクチルチオグ
ルコシドからなる群から選択される化合物少なくとも１
種を含有することを特徴とする、高密度リポタンパク質
コレステロールの特異的測定用組成物に関する。また、
本発明は、生体試料中の高密度リポタンパク質コレステ
ロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステロー
ルオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロールと前
記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は生成
される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コレス
テロールを特異的に定量する方法において、（１）カラ
ギナン、（２）アクリル酸又はメタクリル酸とラウリル
アクリレートとのコポリマー、及び（３）オクチルチオ
グルコシドからなる群から選択される化合物少なくとも
１種を、分画操作を行っていない被検試料と接触させ、
高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロール
エステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとの酵素
反応により消費される化合物又は生成される化合物を測
定することを特徴とする、高密度リポタンパク質コレス
テロールの特異的測定方法にも関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明においては、生体試料とし
て、特に哺乳動物（特にヒト）の血清又は血漿をそのま
ま用いることができる。すなわち、血清又は血漿を分画
処理したり、抗体で処理する必要がない。また、本発明
においては、前記の生体試料をコレステロールエステラ
ーゼ及びコレステロールオキシダーゼと接触させる際
に、それらの酵素とＨＤＬコレステロールとの反応には
影響しないが、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレ
ステロールとの反応を阻害する化合物（以下、ブロッカ
ーと称することがある）として、（１）カラギナン、
（２）アクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマ
ー（ＣＬＡ）、若しくはメタクリル酸とラウリルアクリ
レートとのコポリマー（ＭＡＬＡ）、又は（３）オクチ
ルチオグルコシドの少なくとも１種を共存させる。
て、特に哺乳動物（特にヒト）の血清又は血漿をそのま
ま用いることができる。すなわち、血清又は血漿を分画
処理したり、抗体で処理する必要がない。また、本発明
においては、前記の生体試料をコレステロールエステラ
ーゼ及びコレステロールオキシダーゼと接触させる際
に、それらの酵素とＨＤＬコレステロールとの反応には
影響しないが、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレ
ステロールとの反応を阻害する化合物（以下、ブロッカ
ーと称することがある）として、（１）カラギナン、
（２）アクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリマ
ー（ＣＬＡ）、若しくはメタクリル酸とラウリルアクリ
レートとのコポリマー（ＭＡＬＡ）、又は（３）オクチ
ルチオグルコシドの少なくとも１種を共存させる。
【００１０】カラギナンは、硫酸基を結合したガラクト
ース及び３，６−アンヒドロガラクトースからなるアニ
オン性天然多糖類であり、水溶性やゲル化性などの物理
的性質が異なるι型、λ型及びκ型が存在する。本発明
では、こられのι型、λ型及びκ型のいずれも用いるこ
とができるが、ι型及びλ型が好ましい。
ース及び３，６−アンヒドロガラクトースからなるアニ
オン性天然多糖類であり、水溶性やゲル化性などの物理
的性質が異なるι型、λ型及びκ型が存在する。本発明
では、こられのι型、λ型及びκ型のいずれも用いるこ
とができるが、ι型及びλ型が好ましい。
【００１１】アニオン性合成高分子化合物であるアクリ
ル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー（ＣＬ
Ａ）、若しくはメタクリル酸とラウリルアクリレートと
のコポリマー（ＭＡＬＡ）としては、好ましくは、一般
式（Ｉ）： 〔但し、Ｒ1 は水素原子又はメチル基であり、Ｒ2 は−
（ＣＨ2 ）11−ＣＨ3 基であり、ｘは、Ｒ1 が水素原子
である場合には、６５〜８９、好ましくは７０〜８０で
あり、Ｒ1 がメチル基である場合には、７８〜９３であ
り、好ましくは８３〜９３である〕で表される化合物又
はその塩を用いることができる。なお、一般式（Ｉ）に
おいて、アクリル酸繰り返し単位とメタクリル酸繰り返
し単位は、それぞれアトランダムにコポリマー内に含ま
れている。前記一般式（Ｉ）で表されるコポリマーの塩
は、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、又は
カリウム）の塩を挙げることができる。
ル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー（ＣＬ
Ａ）、若しくはメタクリル酸とラウリルアクリレートと
のコポリマー（ＭＡＬＡ）としては、好ましくは、一般
式（Ｉ）： 〔但し、Ｒ1 は水素原子又はメチル基であり、Ｒ2 は−
（ＣＨ2 ）11−ＣＨ3 基であり、ｘは、Ｒ1 が水素原子
である場合には、６５〜８９、好ましくは７０〜８０で
あり、Ｒ1 がメチル基である場合には、７８〜９３であ
り、好ましくは８３〜９３である〕で表される化合物又
はその塩を用いることができる。なお、一般式（Ｉ）に
おいて、アクリル酸繰り返し単位とメタクリル酸繰り返
し単位は、それぞれアトランダムにコポリマー内に含ま
れている。前記一般式（Ｉ）で表されるコポリマーの塩
は、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、又は
カリウム）の塩を挙げることができる。
【００１２】オクチルチオグルコシドは、ｎ−オクチル
−β−Ｄ−チオグルコピラノシドである。本発明におい
ては、前記のカラギナン、ＣＬＡ、ＭＡＬＡ、又はオク
チルチオグルコシドを単独で又は２種以上を任意に組み
合わせて用いることができる。
−β−Ｄ−チオグルコピラノシドである。本発明におい
ては、前記のカラギナン、ＣＬＡ、ＭＡＬＡ、又はオク
チルチオグルコシドを単独で又は２種以上を任意に組み
合わせて用いることができる。
【００１３】なお、本発明において、カラギナン以外の
アニオン性多糖類、例えば、ヒアルロン酸及びその誘導
体、アルギン酸及びその誘導体、コンドロイチン硫酸、
ヘパラン硫酸及びその誘導体、カラギナンの誘導体、カ
ルボキシメチルセルロース、リン酸化セルロース、硫酸
化セルロース、カルボキシメチルキチン、硫酸化キチ
ン、デキストラン硫酸などは、ブロッカーとしての作用
を示さない。また、前記のＣＬＡ又はＭＡＬＡ以外のア
ニオン性ポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタ
クリル酸、アクリル酸とオクチルアクリレイトとのコポ
リマー、ポリスチレンスルホン酸、スチレンスルホン酸
と２−エチルヘキシルアクリレートとのコポリマー、ス
チレンスルホン酸とラウリルアクリレートとのコポリマ
ーなども、ブロッカーとしての作用を示さない。
アニオン性多糖類、例えば、ヒアルロン酸及びその誘導
体、アルギン酸及びその誘導体、コンドロイチン硫酸、
ヘパラン硫酸及びその誘導体、カラギナンの誘導体、カ
ルボキシメチルセルロース、リン酸化セルロース、硫酸
化セルロース、カルボキシメチルキチン、硫酸化キチ
ン、デキストラン硫酸などは、ブロッカーとしての作用
を示さない。また、前記のＣＬＡ又はＭＡＬＡ以外のア
ニオン性ポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタ
クリル酸、アクリル酸とオクチルアクリレイトとのコポ
リマー、ポリスチレンスルホン酸、スチレンスルホン酸
と２−エチルヘキシルアクリレートとのコポリマー、ス
チレンスルホン酸とラウリルアクリレートとのコポリマ
ーなども、ブロッカーとしての作用を示さない。
【００１４】更に、オクチルチオグルコシド以外のアル
キル基含有糖類、例えば、オクチルグルコシド、ヘプチ
ルチオグルコシド、ドデシルマルトシド、シュークロー
スモノカプレイトなども、ブロッカーとしての作用を示
さない。更にまた、カチオン性ポリマー、例えば、ポリ
〔（ジメチルイミニオ）ヘキサメチレン（ジメチルイミ
ニオ）メチレン−１、４−フェニレンメチレンジクロラ
イド〕、ポリ〔（ジメチルイミニオ）エチレン（ジメチ
ルイミニオ）メチレン−１、４−フェニレンメチレンジ
チロライド〕、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモ
ニウムクロライド）、ポリ（トリメチルアリルアンモニ
ウムクロライド）など；カチオン性多糖類、例えば、キ
トサン、脱アセチル化キトサン；中性多糖類、例えば、
デキストラン、セルロース、マンナン、アガロース等、
他にこれらの中性多糖類のジエチルアミノエチル誘導
体；及びヘパリンなども、ブロッカーとしての作用を示
さない。
キル基含有糖類、例えば、オクチルグルコシド、ヘプチ
ルチオグルコシド、ドデシルマルトシド、シュークロー
スモノカプレイトなども、ブロッカーとしての作用を示
さない。更にまた、カチオン性ポリマー、例えば、ポリ
〔（ジメチルイミニオ）ヘキサメチレン（ジメチルイミ
ニオ）メチレン−１、４−フェニレンメチレンジクロラ
イド〕、ポリ〔（ジメチルイミニオ）エチレン（ジメチ
ルイミニオ）メチレン−１、４−フェニレンメチレンジ
チロライド〕、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモ
ニウムクロライド）、ポリ（トリメチルアリルアンモニ
ウムクロライド）など；カチオン性多糖類、例えば、キ
トサン、脱アセチル化キトサン；中性多糖類、例えば、
デキストラン、セルロース、マンナン、アガロース等、
他にこれらの中性多糖類のジエチルアミノエチル誘導
体；及びヘパリンなども、ブロッカーとしての作用を示
さない。
【００１５】本発明において、ブロッカーは、水溶液と
して用いるのが好ましい。水溶液中のブロッカー濃度
は、好ましくは０．０００２重量％〜１．０重量％、よ
り好ましくは０．０００５重量％〜０．５重量％、最も
好ましくは０．００１重量％〜０．２重量％である。ブ
ロッカーの濃度が０．０００２重量％より少ないと、Ｌ
ＤＬ及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールとの酵
素反応に対する阻害効果が見られず、正確な測定を行う
ことができない。逆に１．０重量％を越える濃度では、
フラクションのコレステロールとの酵素反応に対する特
異性が全く見られなくなり、またブロッカーの溶解度が
悪化する。
して用いるのが好ましい。水溶液中のブロッカー濃度
は、好ましくは０．０００２重量％〜１．０重量％、よ
り好ましくは０．０００５重量％〜０．５重量％、最も
好ましくは０．００１重量％〜０．２重量％である。ブ
ロッカーの濃度が０．０００２重量％より少ないと、Ｌ
ＤＬ及びＶＬＤＬフラクションのコレステロールとの酵
素反応に対する阻害効果が見られず、正確な測定を行う
ことができない。逆に１．０重量％を越える濃度では、
フラクションのコレステロールとの酵素反応に対する特
異性が全く見られなくなり、またブロッカーの溶解度が
悪化する。
【００１６】コレステロールエステラーゼ及びコレステ
ロールオキシダーゼとしては、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）等を結合させて化学修飾した酵素、又は化学
修飾していない酵素のいずれも用いることができる。酵
素の由来も限定されず、コレステロールエステラーゼと
しては、例えば、シュードモナス属の微生物や、牛又は
豚の膵臓由来のコレステロールエステラーゼを用いるこ
とができる。コレステロールエステラーゼとして微生物
由来のコレステロールエステラーゼを使用した場合に、
前記のブロッカーは特に有効である。また、コレステロ
ールオキシダーゼとしては、例えば、ストレプトマイセ
ス属又はノカルディヤ属の微生物由来のコレステロール
オキシダーゼを用いることができる。それらの酵素の添
加量も特に限定されないが、例えば、好ましくは０．１
ｕ／ｍｌ〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．２ｕ／ｍ
ｌ〜２０ｕ／ｍｌである。
ロールオキシダーゼとしては、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）等を結合させて化学修飾した酵素、又は化学
修飾していない酵素のいずれも用いることができる。酵
素の由来も限定されず、コレステロールエステラーゼと
しては、例えば、シュードモナス属の微生物や、牛又は
豚の膵臓由来のコレステロールエステラーゼを用いるこ
とができる。コレステロールエステラーゼとして微生物
由来のコレステロールエステラーゼを使用した場合に、
前記のブロッカーは特に有効である。また、コレステロ
ールオキシダーゼとしては、例えば、ストレプトマイセ
ス属又はノカルディヤ属の微生物由来のコレステロール
オキシダーゼを用いることができる。それらの酵素の添
加量も特に限定されないが、例えば、好ましくは０．１
ｕ／ｍｌ〜９０ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．２ｕ／ｍ
ｌ〜２０ｕ／ｍｌである。
【００１７】本発明において、前記のブロッカーに加え
て、アルカリ土類金属イオンを更に存在させると、リピ
ドフラクションのコレステロールに対する前記酵素の特
異性が向上するので好ましい。アルカリ土類金属は、特
に限定されないが、マグネシウム、カルシウム、ストロ
ンチウム、又はバリウムを用いることができ、マグネシ
ウムが好ましい。アルカリ土類金属イオンは、水溶性無
機塩、例えば、ハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化
物、又はヨウ化物）又は硫酸化物、あるいは、水溶性有
機塩、例えば、酢酸塩又はクエン酸塩として用いること
ができる。アルカリ土類金属イオンは、好ましくは５〜
３００ｍＭ、より好ましくは１０〜１５０ｍＭの量で用
いることができる。
て、アルカリ土類金属イオンを更に存在させると、リピ
ドフラクションのコレステロールに対する前記酵素の特
異性が向上するので好ましい。アルカリ土類金属は、特
に限定されないが、マグネシウム、カルシウム、ストロ
ンチウム、又はバリウムを用いることができ、マグネシ
ウムが好ましい。アルカリ土類金属イオンは、水溶性無
機塩、例えば、ハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化
物、又はヨウ化物）又は硫酸化物、あるいは、水溶性有
機塩、例えば、酢酸塩又はクエン酸塩として用いること
ができる。アルカリ土類金属イオンは、好ましくは５〜
３００ｍＭ、より好ましくは１０〜１５０ｍＭの量で用
いることができる。
【００１８】本発明によれば、被検試料（血清又は血
漿）について遠心分離等の操作を行わずに、前記のブロ
ッカーを、場合によりアルカリ土類金属の存在下に、被
検試料（血清又は血漿）と接触（共存）させ、被検試料
中のＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロール
と酵素との反応を阻害するとともに、ＨＤＬコレステロ
ールと酵素との反応は阻害せずに進行させ、コレステロ
ールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物
（例えば、酸素）又は生成される化合物（例えば、過酸
化水素）を、公知の手段により検出し、ＨＤＬコレステ
ロールを定量することができる。例えば、過酸化水素を
検出する場合には、適当な被酸化性発色剤とペルオキシ
ダーゼの存在下に生成するＨ2 Ｏ2 を発色させて、分光
学的に比色測定する。
漿）について遠心分離等の操作を行わずに、前記のブロ
ッカーを、場合によりアルカリ土類金属の存在下に、被
検試料（血清又は血漿）と接触（共存）させ、被検試料
中のＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロール
と酵素との反応を阻害するとともに、ＨＤＬコレステロ
ールと酵素との反応は阻害せずに進行させ、コレステロ
ールと前記各酵素との酵素反応により消費される化合物
（例えば、酸素）又は生成される化合物（例えば、過酸
化水素）を、公知の手段により検出し、ＨＤＬコレステ
ロールを定量することができる。例えば、過酸化水素を
検出する場合には、適当な被酸化性発色剤とペルオキシ
ダーゼの存在下に生成するＨ2 Ｏ2 を発色させて、分光
学的に比色測定する。
【００１９】Ｈ2 Ｏ2 は、公知の方法で、例えば、適当
な被酸化性発色剤の存在下にペルオキシダーゼの反応に
より発色させることができる。被酸化性発色剤として
は、３−ハイドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾ
イックアシド（ＨＴＩＢＡ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）と４−アミノア
ンチピリン（４−ＡＰ）が好適であり、ＨＴＩＢＡやＥ
ＳＰＴは０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして４−
ＡＰは０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有させ
ることができる。自動分析装置による測定では、波長５
１０ｎｍ（ＨＴＩＢＡを使用する場合）、又は５４６ｎ
ｍ（ＥＳＰＴを使用する場合）における吸光度を測定す
ればよい。
な被酸化性発色剤の存在下にペルオキシダーゼの反応に
より発色させることができる。被酸化性発色剤として
は、３−ハイドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾ
イックアシド（ＨＴＩＢＡ）やＮ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−ｍ−トルイジン（ＥＳＰＴ）と４−アミノア
ンチピリン（４−ＡＰ）が好適であり、ＨＴＩＢＡやＥ
ＳＰＴは０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲で、そして４−
ＡＰは０．０５ｍＭ〜２ｍＭの濃度範囲で適宜含有させ
ることができる。自動分析装置による測定では、波長５
１０ｎｍ（ＨＴＩＢＡを使用する場合）、又は５４６ｎ
ｍ（ＥＳＰＴを使用する場合）における吸光度を測定す
ればよい。
【００２０】本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬
を、現在汎用されている自動分析装置に合わせて、２試
薬系にすることができる。この場合、第一試薬にブロッ
カー及び場合によりアルカリ土類金属を含有させ、第二
試薬にコレステロールエステラーゼ及びコレステロール
オキシダーゼを含有させることができる。第一試薬及び
第二試薬の緩衝剤としては、リン酸緩衝液、ＢＥＳ，Ｈ
ＥＰＥＳ，ＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液、トリス緩衝
液、イミダゾール緩衝液等を使用することができる。緩
衝液の濃度としては、好ましくは１０〜１０００ｍＭ、
より好ましくは２０〜５００ｍＭ、最も好ましくは２０
〜２００ｍＭである。また、それらの緩衝液のｐＨは、
好ましくは６．０〜８．０、より好ましくはＬＤＬのコ
レステロール及びＶＬＤＬのコレステロールと酵素との
阻害が良好なｐＨ６．５−８．０の範囲内で適宜選択す
ることができる。アルキル土類金属イオンは、第一試薬
及び／又は第二試薬に含有させることができるが、第一
試薬に含有させることが好ましい。
を、現在汎用されている自動分析装置に合わせて、２試
薬系にすることができる。この場合、第一試薬にブロッ
カー及び場合によりアルカリ土類金属を含有させ、第二
試薬にコレステロールエステラーゼ及びコレステロール
オキシダーゼを含有させることができる。第一試薬及び
第二試薬の緩衝剤としては、リン酸緩衝液、ＢＥＳ，Ｈ
ＥＰＥＳ，ＰＩＰＥＳなどのグッド緩衝液、トリス緩衝
液、イミダゾール緩衝液等を使用することができる。緩
衝液の濃度としては、好ましくは１０〜１０００ｍＭ、
より好ましくは２０〜５００ｍＭ、最も好ましくは２０
〜２００ｍＭである。また、それらの緩衝液のｐＨは、
好ましくは６．０〜８．０、より好ましくはＬＤＬのコ
レステロール及びＶＬＤＬのコレステロールと酵素との
阻害が良好なｐＨ６．５−８．０の範囲内で適宜選択す
ることができる。アルキル土類金属イオンは、第一試薬
及び／又は第二試薬に含有させることができるが、第一
試薬に含有させることが好ましい。
【００２１】２試薬系の本発明試薬を用いて、ＨＤＬコ
レステロールを測定する場合の反応系を模式的に示せば
以下のとおりである。 第一試薬（ブロッカー含有）＋被検試料（血清／血漿） ↓ＬＤＬ，ＶＬＤＬのブロック化 第二試薬（酵素及び発色系構成成分含有） （コレステロールエステラーゼ反応） コレステロールエステル＋Ｈ2 Ｏ→コレステロール＋脂肪酸 （１） （コレステロールオキシダーゼ反応） コレステロール＋Ｏ2 →Δ４−コレステン−３−オン＋Ｈ2 Ｏ2 （２） （ペルオキシダーゼ反応） Ｈ2 Ｏ2 ＋被酸化性発色剤→酸化縮合物 （３） ↓ 吸光度測定
レステロールを測定する場合の反応系を模式的に示せば
以下のとおりである。 第一試薬（ブロッカー含有）＋被検試料（血清／血漿） ↓ＬＤＬ，ＶＬＤＬのブロック化 第二試薬（酵素及び発色系構成成分含有） （コレステロールエステラーゼ反応） コレステロールエステル＋Ｈ2 Ｏ→コレステロール＋脂肪酸 （１） （コレステロールオキシダーゼ反応） コレステロール＋Ｏ2 →Δ４−コレステン−３−オン＋Ｈ2 Ｏ2 （２） （ペルオキシダーゼ反応） Ｈ2 Ｏ2 ＋被酸化性発色剤→酸化縮合物 （３） ↓ 吸光度測定
【００２２】自動分析装置による測定では、主に前記反
応式（２）で生成するＨ2 Ｏ2 を比色法によって測定す
るが、これら溶液中での反応だけでなく、例えば、濾紙
試験片などによる乾式測定系（ドライケミストリー）で
も同様に用いることができる。また、このＨ2 Ｏ2 は、
フェロシアン化カリウムなどの適当なメディエーターと
ペルオキシダーゼの存在下に反応させることにより、生
成する酸化電位差を電気化学的に測定することもでき
る。他方、酵素反応により消費される化合物、例えば、
前記反応式（２）で消費される酸素（溶存酸素）を、従
来公知の方法、例えば、酸素電極で測定することもでき
る。また、酵素反応により生成される化合物としては、
前記の過酸化水素以外にも、例えば、前記反応式（１）
の生成物である脂肪酸、あるいは前記反応式（２）の生
成物であるΔ４−コレステン−３−オンを適当な方法で
測定してもよい。
応式（２）で生成するＨ2 Ｏ2 を比色法によって測定す
るが、これら溶液中での反応だけでなく、例えば、濾紙
試験片などによる乾式測定系（ドライケミストリー）で
も同様に用いることができる。また、このＨ2 Ｏ2 は、
フェロシアン化カリウムなどの適当なメディエーターと
ペルオキシダーゼの存在下に反応させることにより、生
成する酸化電位差を電気化学的に測定することもでき
る。他方、酵素反応により消費される化合物、例えば、
前記反応式（２）で消費される酸素（溶存酸素）を、従
来公知の方法、例えば、酸素電極で測定することもでき
る。また、酵素反応により生成される化合物としては、
前記の過酸化水素以外にも、例えば、前記反応式（１）
の生成物である脂肪酸、あるいは前記反応式（２）の生
成物であるΔ４−コレステン−３−オンを適当な方法で
測定してもよい。
【００２３】
【作用】以下の説明に限定されるものではないが、本発
明においては、ＨＤＬコレステロールの測定方法におい
て利用する酵素（コレステロールエステラーゼ及びコレ
ステロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コ
レステロールとの反応に際して、前記のブロッカーとし
て用いる化合物が、直接にリピドフラクションのアポリ
ポタンパク質に親和性を示すか、あるいは間接的にリピ
ドフラクションのコレステロールと酵素との反応時に酵
素と相互作用するものと考えられる。すなわち、各リピ
ドフラクションは、脂質とアポリポタンパク質とからな
る脂質複合体となっているが、その脂質構成比の違いと
アポリポタンパク質のタイプ（Ａ−１，Ａ−１，Ｂ−１
００，Ｂ−４８，Ｃ，Ｅなど）の差による物理化学的性
質及び量的（被検試料中に含まれる量）な違いによって
識別される。ＨＤＬフラクションとＬＤＬ及びＶＬＤＬ
フラクションとの間で最も大きく異なるアポリポタンパ
ク質のタイプ（前者がＡ−１，Ａ−２、後者がＢ−１０
０，Ｃ，Ｅ）の違いが明らかなため、従来、アポリポタ
ンパク質に対する抗体を用いる方法も開発されてきた。
この従来法はアポリポタンパク質Ｂ及びＣに対する抗体
を試料に混和し、免疫複合体を形成させることが特徴で
ある。この免疫複合体は酵素反応阻害を惹起するため、
次に酵素を加えるとＨＤＬコレステロールのみが酵素と
反応するので、ＨＤＬコレステロールのみを測定するこ
とができる。しかし、免疫複合体を形成することができ
る抗体の反応性を一定に維持することは難しく、また免
疫複合体自体の濁りが著しいため、コレステロール測定
のための比色定量に際して誤差が大きくなるという欠点
があった。これに対し、本発明では、前記のブロッカー
がアポリポタンパク質を中心とする脂質複合体と相互に
作用し、コレステロールエステラーゼ及びコレステロー
ルオキシダーゼによる、各リピドフラクションのコレス
テロールに対する反応性を特異的に変化させることがで
き、しかも、前記のブロッカーは、抗体とは異なり、安
定な化合物である。
明においては、ＨＤＬコレステロールの測定方法におい
て利用する酵素（コレステロールエステラーゼ及びコレ
ステロールオキシダーゼ）とリピドフラクション含有コ
レステロールとの反応に際して、前記のブロッカーとし
て用いる化合物が、直接にリピドフラクションのアポリ
ポタンパク質に親和性を示すか、あるいは間接的にリピ
ドフラクションのコレステロールと酵素との反応時に酵
素と相互作用するものと考えられる。すなわち、各リピ
ドフラクションは、脂質とアポリポタンパク質とからな
る脂質複合体となっているが、その脂質構成比の違いと
アポリポタンパク質のタイプ（Ａ−１，Ａ−１，Ｂ−１
００，Ｂ−４８，Ｃ，Ｅなど）の差による物理化学的性
質及び量的（被検試料中に含まれる量）な違いによって
識別される。ＨＤＬフラクションとＬＤＬ及びＶＬＤＬ
フラクションとの間で最も大きく異なるアポリポタンパ
ク質のタイプ（前者がＡ−１，Ａ−２、後者がＢ−１０
０，Ｃ，Ｅ）の違いが明らかなため、従来、アポリポタ
ンパク質に対する抗体を用いる方法も開発されてきた。
この従来法はアポリポタンパク質Ｂ及びＣに対する抗体
を試料に混和し、免疫複合体を形成させることが特徴で
ある。この免疫複合体は酵素反応阻害を惹起するため、
次に酵素を加えるとＨＤＬコレステロールのみが酵素と
反応するので、ＨＤＬコレステロールのみを測定するこ
とができる。しかし、免疫複合体を形成することができ
る抗体の反応性を一定に維持することは難しく、また免
疫複合体自体の濁りが著しいため、コレステロール測定
のための比色定量に際して誤差が大きくなるという欠点
があった。これに対し、本発明では、前記のブロッカー
がアポリポタンパク質を中心とする脂質複合体と相互に
作用し、コレステロールエステラーゼ及びコレステロー
ルオキシダーゼによる、各リピドフラクションのコレス
テロールに対する反応性を特異的に変化させることがで
き、しかも、前記のブロッカーは、抗体とは異なり、安
定な化合物である。
【００２４】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：超遠心法によるリピドフラクションの分画 超遠心法による脂質フラクションの分画は、工藤明生等
（動脈硬化、6, 39, 1978)の方法に準じて行った。具体
的には、プール血清１６ｍｌへ、ＥＤＴＡナトリウム塩
１６ｍｇ、ショ糖４ｇ、臭化カリウム３．２ｇ、及び塩
化ナトリウム０．８ｇを加え溶解した。これとは別に３
種類の比重液を作成した。すなわち、比重１．２１の比
重液は、ショ糖２０ｇ、臭化カリウム１５ｇ、及び塩化
ナトリウム５ｇを精製水１００ｍｌに溶解して調製し
た。比重１．０６３の比重液は、比重１．２１の前記比
重液３０ｍｌと精製水７０ｍｌを混和して調製した。ま
た比重１．００６の比重液は、ショ糖２．５ｇを精製水
９７．５ｍｌに溶解して調製した。１０ｍｌ容量の遠心
管に上記の血清１．９ｍｌを入れ、この上層に比重１．
２１の比重液０．８ｍｌを注射器で静かに重層し、遠心
管を１０℃で５００００ｒｐｍ２０時間遠心した。遠心
処理終了後、最上層部には比重１．２１以下の全てのリ
ピドフラクションが集まるが、この最上層部の上に更に
比重１．０６３の比重液１．６ｍｌと比重１．００６の
比重液２ｍｌとを重層した。この遠心管を５００００ｒ
ｐｍで４時間更に遠心し、各リピドフラクションを回収
した。各画分は生理的食塩水に一夜透析後（冷蔵下）、
冷蔵保存した。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：超遠心法によるリピドフラクションの分画 超遠心法による脂質フラクションの分画は、工藤明生等
（動脈硬化、6, 39, 1978)の方法に準じて行った。具体
的には、プール血清１６ｍｌへ、ＥＤＴＡナトリウム塩
１６ｍｇ、ショ糖４ｇ、臭化カリウム３．２ｇ、及び塩
化ナトリウム０．８ｇを加え溶解した。これとは別に３
種類の比重液を作成した。すなわち、比重１．２１の比
重液は、ショ糖２０ｇ、臭化カリウム１５ｇ、及び塩化
ナトリウム５ｇを精製水１００ｍｌに溶解して調製し
た。比重１．０６３の比重液は、比重１．２１の前記比
重液３０ｍｌと精製水７０ｍｌを混和して調製した。ま
た比重１．００６の比重液は、ショ糖２．５ｇを精製水
９７．５ｍｌに溶解して調製した。１０ｍｌ容量の遠心
管に上記の血清１．９ｍｌを入れ、この上層に比重１．
２１の比重液０．８ｍｌを注射器で静かに重層し、遠心
管を１０℃で５００００ｒｐｍ２０時間遠心した。遠心
処理終了後、最上層部には比重１．２１以下の全てのリ
ピドフラクションが集まるが、この最上層部の上に更に
比重１．０６３の比重液１．６ｍｌと比重１．００６の
比重液２ｍｌとを重層した。この遠心管を５００００ｒ
ｐｍで４時間更に遠心し、各リピドフラクションを回収
した。各画分は生理的食塩水に一夜透析後（冷蔵下）、
冷蔵保存した。
【００２５】実施例２：ブロッカーの検索例 実施例１で得られたリピドフラクションのうち、ＬＤＬ
の１０μｌ、及びＨＤＬの２０μｌに、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍｌ、５０ｍＭ−３−ハイ
ドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイックアシド
（ＨＴＩＢＡ）溶液０．０２ｍｌ、及び被検物質（ブロ
ッカーなど）水溶液０．４３ｍｌを添加し、３７℃で５
分間加温した。続いて、予め混和しておいた０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍｌ、１０ｍＭ−４−
ＡＰの０．０５ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ濃度のペルオキシダ
ーゼ溶液５μｌ、コレステロールエステラーゼ（シュー
ドモナス属の微生物由来）及びコレステロールオキシダ
ーゼ（ノカルディヤ属の微生物由来）各１０ｕ／ｍｌ
（終濃度；但し、以下の表３のｎ−ＯＴＧ、ｎ−ＨＴＧ
及びＳＭＬでは０．４ｕ／ｍｌを使用した）を加えた。
３７℃で５分間放置した後、波長５１０ｎｍにおける吸
光度を測定した。また被検物質（ブロッカーなど）を添
加しないことを除いて前記と同様の操作によって吸光度
測定を行い、この対照試験の値を１００％として各脂質
フラクションに対する反応阻害率を調べた。なお、表１
〜表３中の（）内の値は、カラギナンでは終濃度０．１
Ｍ塩化マグネシウム、他は全て終濃度１３ｍＭ塩化マグ
ネシウム共存下の反応阻害率を示す。なお、表１〜表３
（及び以下の実施例）において、被検物質の略号は以下
の意味である。 ＣＬＡ：アクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリ
マーであり、ＣＬＡの後に記載する数字は、前記一般式
（Ｉ）におけるｘの数値を意味する。 ＭＡＬＡ：メタクリル酸とラウリルアクリレートとのコ
ポリマーであり、ＭＡＬＡの後に記載する数字は、前記
一般式（Ｉ）におけるｘの数値を意味する。 ＳＯＡ：スチレンスルホン酸とオクチルアクリレートと
のコポリマーであり、ＳＯＡの後に記載する数字は、単
位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。 ＣＳＡ：アクリル酸とスチリルアクリレートとのコポリ
マーであり、ＳＯＡの後に記載する数字は、単位分子当
りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。 ＣＯＡ：アクリル酸とオクチルアクリレートとのコポリ
マーであり、ＳＯＡの後に記載する数字は、単位分子当
りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。 ＳＬＡ：スチレンスルホン酸とラウリルアクリレートと
のコポリマーであり、ＳＯＡの後に記載する数字は、単
位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。 ｎ−ＯＴＧ：ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノ
シドである。 ｎ−ＨＴＧ：ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノ
シドである。 ＳＭＬ：シュクロースモノラウレートである。
の１０μｌ、及びＨＤＬの２０μｌに、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍｌ、５０ｍＭ−３−ハイ
ドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイックアシド
（ＨＴＩＢＡ）溶液０．０２ｍｌ、及び被検物質（ブロ
ッカーなど）水溶液０．４３ｍｌを添加し、３７℃で５
分間加温した。続いて、予め混和しておいた０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍｌ、１０ｍＭ−４−
ＡＰの０．０５ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ濃度のペルオキシダ
ーゼ溶液５μｌ、コレステロールエステラーゼ（シュー
ドモナス属の微生物由来）及びコレステロールオキシダ
ーゼ（ノカルディヤ属の微生物由来）各１０ｕ／ｍｌ
（終濃度；但し、以下の表３のｎ−ＯＴＧ、ｎ−ＨＴＧ
及びＳＭＬでは０．４ｕ／ｍｌを使用した）を加えた。
３７℃で５分間放置した後、波長５１０ｎｍにおける吸
光度を測定した。また被検物質（ブロッカーなど）を添
加しないことを除いて前記と同様の操作によって吸光度
測定を行い、この対照試験の値を１００％として各脂質
フラクションに対する反応阻害率を調べた。なお、表１
〜表３中の（）内の値は、カラギナンでは終濃度０．１
Ｍ塩化マグネシウム、他は全て終濃度１３ｍＭ塩化マグ
ネシウム共存下の反応阻害率を示す。なお、表１〜表３
（及び以下の実施例）において、被検物質の略号は以下
の意味である。 ＣＬＡ：アクリル酸とラウリルアクリレートとのコポリ
マーであり、ＣＬＡの後に記載する数字は、前記一般式
（Ｉ）におけるｘの数値を意味する。 ＭＡＬＡ：メタクリル酸とラウリルアクリレートとのコ
ポリマーであり、ＭＡＬＡの後に記載する数字は、前記
一般式（Ｉ）におけるｘの数値を意味する。 ＳＯＡ：スチレンスルホン酸とオクチルアクリレートと
のコポリマーであり、ＳＯＡの後に記載する数字は、単
位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。 ＣＳＡ：アクリル酸とスチリルアクリレートとのコポリ
マーであり、ＳＯＡの後に記載する数字は、単位分子当
りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。 ＣＯＡ：アクリル酸とオクチルアクリレートとのコポリ
マーであり、ＳＯＡの後に記載する数字は、単位分子当
りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。 ＳＬＡ：スチレンスルホン酸とラウリルアクリレートと
のコポリマーであり、ＳＯＡの後に記載する数字は、単
位分子当りのカルボン酸含有百分率の数値を意味する。 ｎ−ＯＴＧ：ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノ
シドである。 ｎ−ＨＴＧ：ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノ
シドである。 ＳＭＬ：シュクロースモノラウレートである。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】表１〜表３の結果から、カラギナン、ＣＬ
Ａ、及びＭＡＬＡは、ＨＤＬフラクションのコレステロ
ールと酵素との反応には影響しないが、ＬＤＬフラクシ
ョンのコレステロールとの反応を阻害することがわか
る。特に好ましい化合物は、水溶解性が良好なι型カラ
ギナン及びλ型カラギナン、前記一般式（Ｉ）でｘが７
０〜８０のＣＬＡ、又は同じくｘが８３−９３のＭＡＬ
Ａである。これらは、いずれもＨＤＬフラクションのコ
レステロールと酵素との反応においては２０％未満の阻
害率を示すのに対し、ＬＤＬフラクションでは７０％以
上の阻害率を示した。また、塩化マグネシウムの存在下
では、ＨＤＬフラクションのコレステロールと酵素との
反応においては１０％未満の阻害率であるのに対し、Ｌ
ＤＬフラクションでは９０％以上の阻害率を示し、以下
のように実用的なものであった。
Ａ、及びＭＡＬＡは、ＨＤＬフラクションのコレステロ
ールと酵素との反応には影響しないが、ＬＤＬフラクシ
ョンのコレステロールとの反応を阻害することがわか
る。特に好ましい化合物は、水溶解性が良好なι型カラ
ギナン及びλ型カラギナン、前記一般式（Ｉ）でｘが７
０〜８０のＣＬＡ、又は同じくｘが８３−９３のＭＡＬ
Ａである。これらは、いずれもＨＤＬフラクションのコ
レステロールと酵素との反応においては２０％未満の阻
害率を示すのに対し、ＬＤＬフラクションでは７０％以
上の阻害率を示した。また、塩化マグネシウムの存在下
では、ＨＤＬフラクションのコレステロールと酵素との
反応においては１０％未満の阻害率であるのに対し、Ｌ
ＤＬフラクションでは９０％以上の阻害率を示し、以下
のように実用的なものであった。
【００３０】実施例３：反応経時変化 ０．００２％−ＭＡＬＡ８９、２０ｍＭ塩化マグネシウ
ム、及び１ｍＭ−ＨＴＩＢＡを含む４０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）０．７５ｍｌに、試料として、実施例
１の方法で得られたリピドフラクションＨＤＬの２０μ
ｌ、ＬＤＬの１０μｌ、ＶＬＤＬの１０μｌ、及び正常
プール血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。
これに０．５ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌのペルオ
キシダーゼ、終濃度各１０ｕ／ｍｌのコレステロールエ
ステラーゼ（シュードモナス属の微生物由来）及びコレ
ステロールオキシダーゼ（ノカルディヤ属の微生物由
来）を含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２
５ｍｌを添加し、波長５１０ｎｍでの吸光度変化を記録
した。結果を図１に示す。ＨＤＬフラクションに比べＬ
ＤＬフラクション及びＶＬＤＬフラクションのコレステ
ロールに対する反応阻害が明らかであった。
ム、及び１ｍＭ−ＨＴＩＢＡを含む４０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）０．７５ｍｌに、試料として、実施例
１の方法で得られたリピドフラクションＨＤＬの２０μ
ｌ、ＬＤＬの１０μｌ、ＶＬＤＬの１０μｌ、及び正常
プール血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加温した。
これに０．５ｍＭ−４−ＡＰ、２０μｇ／ｍｌのペルオ
キシダーゼ、終濃度各１０ｕ／ｍｌのコレステロールエ
ステラーゼ（シュードモナス属の微生物由来）及びコレ
ステロールオキシダーゼ（ノカルディヤ属の微生物由
来）を含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．２
５ｍｌを添加し、波長５１０ｎｍでの吸光度変化を記録
した。結果を図１に示す。ＨＤＬフラクションに比べＬ
ＤＬフラクション及びＶＬＤＬフラクションのコレステ
ロールに対する反応阻害が明らかであった。
【００３１】実施例４：実検体の測定 ＣＬＡ８０をブロッカーに用いる場合、０．００２％−
ＣＬＡ８０、２０ｍＭ塩化マグネシウム、及び１ｍＭ−
ＥＳＰＴを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．７５ｍｌに血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加
温した。これに０．５ｍＭ−４−ＡＰ、０．４％ｎ−Ｏ
ＴＧ、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ、４ｕ／ｍｌ
のコレステロールエステラーゼ（シュードモナス属の微
生物由来）、及び４ｕ／ｍｌのコレステロールオキシダ
ーゼ（ノカルディヤ属の微生物由来）を含む５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．２５ｍｌを添加し、波長
５４６ｎｍの吸光度を測定した。また、ブロッカーにカ
ラギナンλを用いる場合には、０．００２％−ＣＬＡ８
０及び２０ｍＭ塩化マグネシウムの代わりに、０．０５
％カラギナンλ及び１００ｍＭ塩化マグネシウムを用い
ることを除いて、前記のＣＬＡ８０を用いた場合と同様
の操作によって吸光度測定を行った。他方、同じ検体に
ついてゲルロ過カラムによる反応液体クロマトグラフィ
ー法（ＨＰＬＣ法、W, Marz 等，Clin. Chem., 39, 227
6, 1993)での測定を実施し、その測定値と比較対照し
た。また、各測定法での標準物質としては、予め超遠心
法で分画したＨＤＬフラクションの総コレステロール値
を酵素法で測定したものを用いた。血清９例の測定値を
表４に示す。
ＣＬＡ８０、２０ｍＭ塩化マグネシウム、及び１ｍＭ−
ＥＳＰＴを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．７５ｍｌに血清１０μｌを加え、３７℃で５分間加
温した。これに０．５ｍＭ−４−ＡＰ、０．４％ｎ−Ｏ
ＴＧ、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ、４ｕ／ｍｌ
のコレステロールエステラーゼ（シュードモナス属の微
生物由来）、及び４ｕ／ｍｌのコレステロールオキシダ
ーゼ（ノカルディヤ属の微生物由来）を含む５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．２５ｍｌを添加し、波長
５４６ｎｍの吸光度を測定した。また、ブロッカーにカ
ラギナンλを用いる場合には、０．００２％−ＣＬＡ８
０及び２０ｍＭ塩化マグネシウムの代わりに、０．０５
％カラギナンλ及び１００ｍＭ塩化マグネシウムを用い
ることを除いて、前記のＣＬＡ８０を用いた場合と同様
の操作によって吸光度測定を行った。他方、同じ検体に
ついてゲルロ過カラムによる反応液体クロマトグラフィ
ー法（ＨＰＬＣ法、W, Marz 等，Clin. Chem., 39, 227
6, 1993)での測定を実施し、その測定値と比較対照し
た。また、各測定法での標準物質としては、予め超遠心
法で分画したＨＤＬフラクションの総コレステロール値
を酵素法で測定したものを用いた。血清９例の測定値を
表４に示す。
【００３２】
【表４】 検体 ＣＬＡ８０使用 カラギナンλ使用 ＨＰＬＣ法 血清１ ２０．７ ２１．９ ２２．１ 血清２ ３６．６ ３５．４ ３６．２ 血清３ ２９．２ ２８．３ ２８．５ 血清４ ４６．１ ４０．７ ４４．７ 血清５ ４１．３ ３８．６ ４０．３ 血清６ ３６．２ ３５．６ ３６．２ 血清７ ６７．９ ６５．６ ７０．９ 血清８ ３３．５ ３５．１ ３２．４ 血清９ ２７．８ ２６．４ ２６．５ 単位：ｍｇ／ｄｌ
【００３３】
【発明の効果】試料（血清又は血漿）の遠心操作を行う
ことなく、簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールの高精
度の測定を行うことができる。
ことなく、簡便な操作で、ＨＤＬコレステロールの高精
度の測定を行うことができる。
【図１】本発明によるブロッカーの存在下における、Ｈ
ＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及び正常プール血清の吸光度
の経時変化を示すグラフである。
ＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、及び正常プール血清の吸光度
の経時変化を示すグラフである。
Claims (6)
- 【請求項１】 生体試料中の高密度リポタンパク質コレ
ステロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステ
ロールオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロール
と前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は
生成される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コ
レステロールを特異的に定量するための試薬組成物にお
いて、（１）カラギナン、（２）アクリル酸又はメタク
リル酸とラウリルアクリレートとのコポリマー、及び
（３）オクチルチオグルコシドからなる群から選択され
る化合物少なくとも１種を含有することを特徴とする、
高密度リポタンパク質コレステロールの特異的測定用組
成物。 - 【請求項２】 アクリル酸又はメタクリル酸とラウリル
アクリレートとのコポリマーが、一般式（Ｉ）： 〔但し、Ｒ1 は水素原子又はメチル基であり、Ｒ2 は−
（ＣＨ2 ）11−ＣＨ3 基であり、ｘは、Ｒ1 が水素原子
である場合には、６５〜８９であり、Ｒ1 がメチル基で
ある場合には、７８〜９３である〕で表される化合物又
はその塩である請求項１に記載の組成物。 - 【請求項３】 更に、アルカリ土類金属イオンを含有す
る請求項１に記載の組成物。 - 【請求項４】 酵素反応生成物が過酸化水素であり、こ
の過酸化水素から色素を形成させて検出する検出試薬と
して、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、及
びＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン又
は３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸を
含有する請求項１に記載の組成物。 - 【請求項５】 生体試料中の高密度リポタンパク質コレ
ステロールとコレステロールエステラーゼ及びコレステ
ロールオキシダーゼとを接触させ、前記コレステロール
と前記各酵素との酵素反応により消費される化合物又は
生成される化合物を測定して、高密度リポタンパク質コ
レステロールを特異的に定量する方法において、（１）
カラギナン、（２）アクリル酸又はメタクリル酸とラウ
リルアクリレートとのコポリマー、及び（３）オクチル
チオグルコシドからなる群から選択される化合物少なく
とも１種を、分画操作を行っていない被検試料と接触さ
せ、高密度リポタンパク質コレステロールとコレステロ
ールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼとの
酵素反応により消費される化合物又は生成される化合物
を測定することを特徴とする、高密度リポタンパク質コ
レステロールの特異的測定方法。 - 【請求項６】 更に、アルカリ土類金属イオンを共存さ
せる請求項５に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24872296A JP3694121B2 (ja) | 1995-08-31 | 1996-08-30 | Ｈｄｌコレステロールの特異的測定用組成物及び測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-246583 | 1995-08-31 | ||
| JP24658395 | 1995-08-31 | ||
| JP24872296A JP3694121B2 (ja) | 1995-08-31 | 1996-08-30 | Ｈｄｌコレステロールの特異的測定用組成物及び測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09121895A true JPH09121895A (ja) | 1997-05-13 |
| JP3694121B2 JP3694121B2 (ja) | 2005-09-14 |
Family
ID=26537804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24872296A Expired - Lifetime JP3694121B2 (ja) | 1995-08-31 | 1996-08-30 | Ｈｄｌコレステロールの特異的測定用組成物及び測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3694121B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000043537A1 (fr) * | 1999-01-20 | 2000-07-27 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Methode pour mesurer un triglyceride dans une lipoproteine |
| WO2000057191A1 (fr) * | 1999-03-24 | 2000-09-28 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Procede de quantification du cholesterol |
| US6979552B2 (en) | 2000-11-14 | 2005-12-27 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of lipid assay and reagent for use therein |
| WO2007007443A1 (ja) * | 2005-07-11 | 2007-01-18 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法 |
| JPWO2007007443A1 (ja) * | 2005-07-11 | 2009-01-29 | 和光純薬工業株式会社 | 新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104048955A (zh) * | 2013-03-11 | 2014-09-17 | 南京澳林生物科技有限公司 | 高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 |
-
1996
- 1996-08-30 JP JP24872296A patent/JP3694121B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000043537A1 (fr) * | 1999-01-20 | 2000-07-27 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Methode pour mesurer un triglyceride dans une lipoproteine |
| US6811994B1 (en) | 1999-01-20 | 2004-11-02 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for quantitating triglycerides in lipoproteins |
| WO2000057191A1 (fr) * | 1999-03-24 | 2000-09-28 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Procede de quantification du cholesterol |
| US6979552B2 (en) | 2000-11-14 | 2005-12-27 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of lipid assay and reagent for use therein |
| WO2007007443A1 (ja) * | 2005-07-11 | 2007-01-18 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法 |
| WO2007007392A1 (ja) * | 2005-07-11 | 2007-01-18 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法 |
| EP1903069A1 (en) * | 2005-07-11 | 2008-03-26 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Novel polymer and method of measuring cholesterol therewith |
| JPWO2007007443A1 (ja) * | 2005-07-11 | 2009-01-29 | 和光純薬工業株式会社 | 新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法 |
| EP1903069A4 (en) * | 2005-07-11 | 2009-06-03 | Wako Pure Chem Ind Ltd | NEW POLYMER AND METHOD FOR MEASURING CHOLESTERINE THEREWITH |
| JP5029354B2 (ja) * | 2005-07-11 | 2012-09-19 | 和光純薬工業株式会社 | 新規ポリマー及びこれを用いたコレステロール測定法 |
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|---|---|
| JP3694121B2 (ja) | 2005-09-14 |
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