PT749435E

PT749435E - Agente anti-interferencias para utilizacao em testes imunologicos

Info

Publication number: PT749435E
Application number: PT95912194T
Authority: PT
Inventors: Rosemarie Kientsch-Engel; Frederic Donie; Michael Wiedmann
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1994-03-05
Filing date: 1995-03-03
Publication date: 2001-03-30
Also published as: ES2152392T3; EP0749435B1; EP0697021A1; JP2750003B2; EP0749435A1; DE59508529D1; US5952185A; CN1143368A; WO1995023800A1; DK0749435T3; KR100252688B1; JPH08508301A; CN1102594C; ATE196906T1; DE4407423A1; ATE194349T1; EP0697021B1; DE59508786D1

Description

DESCRIÇÃO "AGENTE ΑΝΤΙ-INTERFERÊNCIAS PARA UTILIZAÇÃO EM TESTES IMUNOLÓGICOS" A invenção refere-se a avidina ou estreptavidina ou a um derivado destes como agente anti-interferências em testes imunológicos, bem como a um processo para a identificação de um analito utilizando estes agentes anti-interferências.

Os métodos de identificação imunológica atingiram nos últimos anos um grande significado. Por seu intermédio pode identificar-se a existência de medicamentos, hormonas, proteínas, organismos infecciosos e, em especial, anticorpos específicos em amostras biológicas, de forma rápida e precisa. Em todos os métodos de identificação imunológica ocorre uma reacção de ligação específica entre um primeiro parceiro de ligação específico, a substância a identificar ("analito"), e um segundo parceiro de ligação específico, que reage especificamente com o analito ou a ele se liga. 0 analito e os parceiros de ligação específica ao analito, os chamados parceiros de um par de ligação específica, formam assim um par de ligação específica, em geral um complexo entre um antigene e um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo. Nesse caso, podem mais do que um analito ou mais do que um parceiro de ligação reagir entre si em cada reacção. Estas reacções de ligação específicas detectam-se de variadas maneiras. Em geral, um dos participantes na reacção de ligação específica encontra-se marcado. Métodos de marcação usuais são radioisótopos, agentes cromogénicos, fluorogénicos, marcadores enzimáticos ou substâncias que mais uma vez podem formar um par de ligação específico (por exemplo biotina / estreptavidina). No caso de testes imunológicos heterogéneos um dos parceiros de ligação encontra-se imobilizado sobre uma fase sólida. 1

Um problema grave em testes imunológicos é que podem ocorrer efeitos de troca indesejáveis e reacções de ligação não especificas entre os parceiros de ligação especifica do teste imunológico e a amostra, os restantes componentes contidos na amostra e, conforme o caso, a fase sólida. Tais efeitos de troca provocam em geral um aumento do sinal de base e também uma forte dispersão dos sinais, e com isso uma menor sensibilidade e especificidade do teste em causa. Tanto devido a efeito de troca não especifico com o parceiro de ligação marcado como também devido a ligação especifica de componentes do teste por componentes da amostra, podem resultar também medições positivas erradas, isto é, devido ao sinal medido erradamente elevado, pode concluir-se a presença de um analito mesmo na sua ausência.

Efectuaram-se várias tentativas para reduzir estes efeitos de troca não específicos em testes imunológicos. Sabe-se desde há muito que vários componentes de hidratos de carbono e várias proteínas, misturas de proteínas ou fracções de proteínas, bem como os respectivos hidrolisados podem reduzir efeitos de troca não específicos entre os componentes do teste e o analito em testes imunológicos (por exemplo Robertson et al., Journal of Immun. Meth. 26, 1985, 195; EP-A-260903; US-A-1,931,385). A utilização de fracções brutas de proteína e de hidrolisados brutos tem a desvantagem de, através dos componentes neles contidos, se poderem desencadear de novo outras perturbações no teste. Os hidrolisados produzidos enzimaticamente podem além disso estar contaminados com as proteases utilizadas na preparação e não apresentam em geral uma qualidade unitária, uma vez que a cisão é difícil de controlar. As contaminações por proteases podem atacar os componentes do teste e, mesmo em pequenas quantidades, conduzir a uma limitação das funções do teste e da estabilidade durante o armazenamento.

Para diminuir efeitos de troca não específicos em testes imunológicos foi também descrita a utilização de proteínas quimicamente modificadas, em especial de proteínas succiniladas ou acetiladas (US-A-5,051,356; EP-A-0 525 916). Com estas 2 7

substâncias não se podem evitar contudo resultados positivos errados em testes de anticorpos do soro.

As EP-A-0 331 068 e WO 91/06559 descrevem o emprego de imunoglobulinas polimerizadas, em especial IgG, para a redução de factores de perturbação não específicos como por exemplo factores reumáticos. Não se conseguem contudo com elas excluir satisfatoriamente todos os efeitos de troca perturbadores. Além disso, a adição de imunoglobulina humana não específica (anticorpos monoméricos ou poliméricos ou seus fragmentos) em testes de anticorpos humanos pode levar a um aumento do valor do ensaio em branco. Mais ainda, a obtenção de IgG humana ou animal é trabalhosa e dispendiosa. O objectivo da invenção foi por isso disponibilizar novas substâncias anti-interferências ou novos agentes anti-interferências que provocassem um melhor desimpedimento de efeitos de troca não específicos em testes imunológicos do que os conhecidos do estado da técnica. Por efeitos de troca não específicos entendem-se todos os efeitos de troca entre componentes do processo, que podem levar a erros dos resultados medidos. Estas substâncias anti-interferências destinam-se a evitar resultados de análise falsamente positivos, em especial na análise de anticorpos. Em particular, consegue evitar-se uma perturbação com a utilização de avidina ou estreptavidina como um dos parceiros de ligação num teste imunológico.

Atinge-se este objectivo através da avidina ou estreptavidina ou seus derivados como agente anti-interferências. Com a utilização destas substâncias conseguiu obter-se surpreendentemente um desimpedimento em testes, em especial em testes em que se utiliza avidina ou estreptavidina como um dos parceiros de ligação. 0 objectivo da invenção são por isso agentes anti-interferências para evitar efeitos de troca não específicos em testes que contêm avidina ou estreptavidina ou seus derivados e a 3

utilização destes agentes anti-interferências em testes. A avidina ou a estreptavidina ou seus derivados empregam-se de acordo com a invenção na forma solúvel. Não se encontram ligados ou acoplados a uma fase sólida ou a um grupo de marcação, por exemplo a um enzima. 0 agente anti-interferências de acordo com a invenção utiliza-se sempre adicionalmente aos restantes reagentes necessários para o teste e não se torna um componente do complexo formado no decurso da reacção de identificação a partir do analito a identificar e dos parceiros de ligação específicos. De preferência, emprega-se o agente anti-interferências de acordo com a invenção em testes imunológicos ("Immunoassays"). Contudo, pode empregar-se também em testes que tenham como base outros efeitos de troca, por exemplo testes de ácidos nucleicos. De preferência, o agente anti-interferências de acordo com a invenção emprega-se em testes nos quais um componente do teste se encontra ligado a avidina ou estreptavidina, por exemplo uma fase sólida revestida com avidina ou estreptavidina em testes imunológicos .ou de ácidos nucleicos. Por avidina ou estreptavidina entendem-se as proteínas purificadas naturalmente ocorrentes ou avidina ou estreptavidina recombinantes. Por derivados de avidina ou estreptavidina entendem-se moléculas de avidina ou estreptavidina modificadas. A modificação pode efectuar-se primeiro por ligação cruzada de moléculas de avidina ou de estreptavidina, de modo a obter-se o chamado poli-SA ou SA ramificado homogeneamente. Por SA entende-se sempre, no que se segue, avidina ou estreptavidina. Os métodos para ramificação ou polimerização de SA são em si conhecidos do especialista. É particularmente adequada uma ramificação por tratamento térmico ou por compostos bi- ou polifuncionais. Por compostos bi- ou polifuncionais entendem-se moléculas que possuem pelo menos dois grupos funcionais, que podem ser iguais ou diferentes, e que podem reagir através destes grupos funcionais com grupos funcionais de SA, por exemplo determinados grupos aminoácido ou hidrato de carbono. Exemplos típicos de lincantes adequados no âmbito da invenção apresentam-se na Tabela 1 seguinte. 4

Tabela 1

Abreviatura Composição quimica SPDP 3-(2-piridiltio)-propionato de N-succinimidilo EADP 4-azido-hexil-l,4-ditiobutirimidato de etilo . HC1 FNPA 4-fluoro-3-nitrofenilazida HSAB 4-azidobenzoato de N-hidroxissuccinimidilo ΜΑΒΙ 4-azidobenzoimidato de metilo . HCl MBS N-hidroxissuccinimidoéster de m-maleimidobenzoilo NHS-ASA ácido N-hidroxissuccinimidilo-4-azidossalicilico MHS N-hidroxissuccinimidoéster de maleimido-hexanoilo PNP-DTP 2-diazo-3,3,3-trifluoropropionato de p-nitrofenilo SADP 1,3'-ditiopropionato de N-succinimidil(4-azidofenilo) SAND 1,3'-ditiopropionato de sulfossuccinimidil-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)etilo SAN P AH hexanoato de N-succinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenil-amino) SASD 1,3'-ditiopropionato de silfossuccinimidil-2-(p-azidossalicilamido)etilo SIAB aminobenzoato de N-succinimidil(4-iodoacetilo) SMCC 1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleinimidoetil)-ciclo-hexano SMPB butirato de succinimidil-4-(p-maleinimidofenilo) DSS suberato de dissuccinimidilo DMS suberimidato de dimetilo Reagente de Traut 2-iminotiolano-2,4,6-tricloro-s-triazina SAMBA anidrido do ácido S'-acetil-mercaptossuccinico SATP tiopropionato de N-succinimidil-S-acetilo SATA tioacetato de N-succinimidil-S-acetilo

Em segundo lugar, a modificação pode consistir num acoplamento a outras moléculas de alto peso molecular, em especial proteínas como albumina de soro de vaca (RSA) ou imunoglobulina, que se empregam elas próprias frequentemente para supressão de 5

interferências em testes imunológicos. Através da formação destas ligações cruzadas forma-se a chamada SA. Neste complexo a SA e/ou a proteína podem mais uma vez encontrar-se polimerizadas. Os métodos para o acoplamento de SA a estas moléculas são conhecidos do especialista. Revelou-se particularmente adequado um acoplamento com DSS, SAMBA, SATP, MHS, SATA. Um complexo de RSA e SA ou poli-SA é particularmente adequado como agente anti-interferências. Obtêm-se resultados ainda melhores quando RSA polimerizada é acoplada a SA ou poli-SA. A polimerização ou ramificação de RSA pode efectuar-se pelos métodos acima mencionados para ramificação de SA. Como método mais adequado encontra-se descrita na EP-A 0331 127 uma polimerização por tratamento térmico.

Em terceiro lugar a modificação de SA pode consistir numa inactivação dos centros activos, isto é das posições de ligação para a biotina. Resulta daqui a chamada SA inactivada. A inactivação pode efectuar-se por simples saturação das posições de ligação com biotina ou com um derivado da biotina, que se encontra ligado a avidina ou estreptavidina. Devido à elevadíssima afinidade da SA para a biotina durante a utilização no teste imunológico quase não se liberta biotina, o que pode eventualmente levar a perturbações. É preferível modificar o centro activo de modo covalente. Para tal podem derivatizar-se uma ou mais unidades de aminoácido no centro activo da SA, de modo que a ligação à biotina seja fortemente diminuída ou totalmente impedida'. Os métodos para a inactivação das posições de biotina na SA são conhecidos do trabalho de Gitlin et al., Biochem. J. 269 (1990) 527-530. De preferência, modificam-se unidades de tirosina no centro activo da SA com fluoreto de p-nitrobenzenossulfonilo. Uma outra possibilidade para a inactivação das posições de biotina na SA consiste em acoplar biotina à posição de ligação de modo covalente. Os métodos para o acoplamento de biotina ao centro activo da SA são conhecidos do especialista. Como particularmente preferencial revelou-se um novo método para o acoplamento de biotina a SA por meio de um novo derivado da biotina fotoactivável. Os derivados da biotina 6

fotoactiváveis são conhecidos. Nas EP-A-0 155 854 e EP-A-0 187 323 descrevem-se fenilos/nitrofenilos substituídos por azida, que se encontram acoplados à biotina por um lincante contendo amina. Como derivado da biotina utiliza-se de preferência Biotina-DADOO-AB (biotina-[8-(4-azidobenzoil)amino-3, 6- dioxaoctil]amida). Outros derivados da biotina encontra-se descritos no Boehringer Mannheim Biochemica Katalog, Ident. N° 1292633 ou 1292641. Após a saturação das posições de biotina da SA com os derivados da biotina inicia-se a foto-reação e fixa-se assim de forma covalente a biotina ao centro activo. Nesta SA inactivada a biotina encontra-se ligada ao centro activo e adicionalmente através de uma ligação covalente para além do centro activo. 0 produto SA-biotina assim obtido é também um objectivo da presente invenção.

Uma outra possibilidade para a inactivação do centro activo da SA consiste em alterar as posições de ligação por tecnologia genética. 0 centro activo da SA pode ser modificado ou inactivado por substituição, eliminação ou inserção de unidades individuais de aminoácidos ou de curtos fragmentos de aminoácidos. De preferência, podem trocar-se aminoácidos individuais, por exemplo unidades de tirosina, no centro activo por outros aminoácidos. Pode contudo preparar-se SA na qual a posição de ligação falta parcial ou totalmente. Os métodos para a modificação e preparação da SA por tecnologia genética são conhecidos do especialista. Por exemplo, a preparação de estreptavidina recombinante encontra-se descrita na EP-A-0 198 015.

Em quarto lugar, pode conseguir-se a modificação por uma fragmentação da SA. Os fragmentos de SA podem produzir-se por cisão química ou enzimática ou por preparação recombinante. Neste caso, em particular, pode faltar a posição de ligação à biotina, como descrito acima. A vantagem da fragmentação é uma melhor solubilidade do produto. De preferência, empregam-se em mistura todos os fragmentos de avidina ou de estreptavidina 7 obtidos por cisão química ou enzimática, de modo que todas ou quase todas as partes da SA estejam contidas. A SA inactivada ou fragmentada deste modo pode empregar-se no primeiro ou no segundo métodos acima descritos para a modificação da SA, isto é, a SA inactivada pode ser de novo polimerizada ou ramificada com outras moléculas como RSA ou poli-SA. Estes agentes anti-interferências, nos quais se efectuou uma combinação de pelo menos dois dos métodos referidos para a modificação da SA, revelaram-se particularmente vantajosos.

Depois de efectuada a modificação da SA por um dos métodos referidos podé remover-se a eventual actívidade de ligação residual à biotina, biotina ligada de modo covalente à superfície, que não se encontra ligada no centro activo da avidina ou da estreptavidina, ou biotina livre, por meio de uma purificação adequada dos derivados de avidina ou de estreptavidina. Tal pode efectuar-se por exemplo através de uma adsorpção da biotina e/ou SA ligadas a uma fase sólida.

Objectivo da invenção são também por isso derivados de avidina ou de estreptavidina, obtidos por um dos processos acima descritos para a modificação, seguido de purificação para remoção da actívidade residual de ligação à biotina, biotina ligada de modo covalente à superfície, que não se encontra ligada no centro activo da avidina ou da estreptavidina, ou biotina livre, de preferência por uma adsorpção da biotina e/ou SA ligadas a uma fase sólida.

Objectivo da invenção é ainda um processo para a preparação dos agentes anti-interferências de acordo com a invenção, em que se modifica a SA segundo pelo menos um dos três métodos acima referidos e, conforme o caso, se purifica em seguida para a remoção da capacidade residual de ligação à biotina, biotina ligada de modo covalente à superfície ou biotina livre, como acima descrito.

A avidina ou a estreptavidina ou os seus derivados podem empregar-se para evitar interferências em todos os testes imunológicos ou de ácidos nucleicos correntes. São particularmente adequados para evitar interferências em testes imunológicos ou de ácidos nucleicos em que se utiliza avidina ou estreptavidina como um dos componentes de ligação. Tais testes imunológicos são conhecidos por exemplo dos trabalhos de Guesdon et al., J. Histochem. Cytochem. 27 (1979) 1131-1139 e de Bayer e Wilchek, Analytical Biochemistry 171 (1988) 1-32. As perturbações podem ser causadas por exemplo por anticorpos contra avidina ou estreptavidina, que ocorrem parcialmente no soro humano. Contudo, em testes imunológicos em que não se utiliza avidina ou estreptavidina, o agente anti-interferências de acordo com a invenção apresenta também um efeito vantajoso. Nestes testes imunológicos a utilização de SA ligada a uma outra molécula, como por exemplo RSA ou poli-SA, de acordo com o segundo método acima descrito para a modificação, revelou-se particularmente vantajosa. 0 agente anti-interferências de acordo com a invenção utiliza-se sempre adicionalmente em relação aos restantes reagentes necessários para o teste. Não é idêntico aos componentes avidina ou estreptavidina possivelmente ocorrentes no teste, por exemplo uma fase sólida revestida com SA ou um conjugado enzima-SA. 0 reagente anti-interferências de acordo com a invenção, ao contrário do que acontece com estes reagentes SA, não se incorpora no complexo de analito e agentes de ligação específicos a identificar.

Um outro objectivo da invenção é um processo para a determinação de um analito numa amostra por (1) contacto da amostra com (a) avidina ou estreptavidina ou um seu derivado, (b) um ou mais parceiros de ligação específicos do analito e (2) determinação do complexo formado entre o analito e o parceiro de ligação específico, como uma medida da presença do analito. 9 Γ\ r

......

Como analito podem servir todos os substratos que reajam especificamente com pelo menos um parceiro de ligação especifico para formar um complexo, como por exemplo haptenos, antigenes anticorpos ou ácidos nucleicos. Na identificação de anticorpos, em especial de auto-anticorpos, o processo de acordo com a invenção é particularmente adequado.

Como amostras servem em geral fluidos corporais como sangue, plasma, soro, saliva ou urina.

Como parceiro de ligação especifico pode servir qualquer parceiro de ligação biológico ou químico, que consiga ligar-se especificamente ao analito e que possa formar com este um complexo. Em tal situação encontram-se anticorpos, fragmentos de anticorpos, antigenes, haptenos, hormonas, avidina, biotina, ácidos nucleicos, oligonucleótidos ou derivados destes. De preferência, empregam-se na presente invenção como parceiros de ligação do analito anticorpos ou antigenes ou seus fragmentos.

Para a identificação do complexo entre o analito e o parceiro de ligação específico podem empregar-se todos os métodos ao alcance do especialista. Podem utilizar-se processos homogéneos, nos quais todos os parceiros de ligação participantes no processo se encontram em forma solúvel, por exemplo processos de precipitação com determinação turbidimétrica ou nefelométrica do complexo formado, ou testes imunológicos segundo o princípio CEDIA, EMIT ou FPIA. São também adequados processos heterogéneos em que pelo menos um reagente se encontra ligado a uma fase sólida. Exemplos destes são testes de aglutinação, em que um parceiro de um par de ligação se encontra ligado por exemplo a látex, testes "sanduíche", ELISA para a identificação de anticorpos como por exemplo contra HIV, HCV, rubéola, toxoplasma gondii, glutamato-desarboxilase ou tireoglobulina, RIA ou testes imunométricos. Além disso, no processo de precipitação, em todos estes processos, pelo menos um dos parceiros de ligação específica se encontra marcado. A marcação pode originar directamente um sinal mensurável, por exemplo um radioisótopo, 10

um marcador de quimiluminescência, fluorescência ou electroquimiluminescência, ou uma partícula corada, por exemplo uma partícula de sol metálico ou látex corado ou não corado. A marcação pode também originar um sinal indirecto, por exemplo uma marcação enzimática como peroxidase, glucose-oxidase, β-galactosidase ou fosfatase alcalina.

Os testes imunológicos podem também efectuar-se com tiras teste ou biossensores, em especial quando um dos parceiros de ligação se encontra acoplado à fase sólida através da SA. Também se podem evitar interferências, de acordo com a invenção, em testes imunológicos segundo o princípio da ressonância plasmónica.

Frequentemente, acopla-se à fase sólida um reagente do processo para a identificação do analito através de um par de ligação específico, por exemplo avidina ou estreptavidina / biotina. A vantagem neste caso é que a fase sólida pode ser utilizada universalmente em vários processos de identificação. É também possível ligar a marcação através de um par de ligação específico a um componente do teste. Por exemplo, um enzima pode estar acoplado a avidina ou estreptavidina e um parceiro de ligação, por exemplo um anticorpo, pode estar biotinilado. Exemplos destes tipos de processos de identificação são conhecidos do especialista. 0 derivado de avidina ou de estreptavidina de acordo com a invenção é particularmente adequado para evitar interferências nestes processos de identificação que utilizam uma ligação indirecta de um componente da reacção através de avidina/biotina ou estreptavidina/biotina. A execução do processo para a identificação do analito pode efectuar-se em um ou mais passos, isto é, a incubação do analito com cada um dos componentes do teste pode efectuar-se simultânea ou sucessivamente. Se se utilizar avidina ou estreptavidina ou um seu derivado, no qual as posições de ligação à biotina não foram inactivadas é necessário, em processos em que um componente de ligação está acoplado através de avidina/biotina 11 ou estreptavidina/bíotina, ter-se em atenção que a ligação do componente de ligação através de avidina/biotina ou estreptavidina/biotina já está excluída, antes de se adicionar avidina ou estreptavidina ou um seu derivado, uma vez que por outro lado as posições de ligação à biotina não inactivadas se ligam ao componente de ligação não biotinilado e provocam perturbações. Por exemplo, na utilização de uma fase sólida de avidina ou de estreptavidina, deve adicionar-se em primeiro lugar o parceiro de ligação específico biotinilado do analito, antes de se misturar a amostra com avidina ou estreptavidina ou um seu derivado. Caso se utilize um derivado de avidina ou de estreptavidina de acordo com a invenção, no qual as posições de ligação à biotina tenham sido inactivadas, podem incubar-se simultaneamente todos os reagentes do teste, uma vez que os reagentes biotinilados não se ligam ao derivado de avidina ou de estreptavidina. Este derivado de avidina ou de estreptavidina inactivado pode assim utilizar-se universalmente em todas as variantes possíveis do teste, sendo por isso preferencial. A concentração do agente anti-interferências de acordo com a invenção na mistura teste, situa-se entre 0,0001 e 1% (m/v), de preferência entre 0,01 e 1% (m/v).

Os componentes reaccionais individuais do processo para a identificação do analito são disponibilizados convenientemente na forma de uma combinação teste ou de um "kit" de teste. Um outro objectivo da invenção é por isso uma combinação teste para um processo para a identificação de um analito numa amostra contendo avidina ou estreptavidina ou um seu derivado e pelo menos um parceiro de ligação específico do analito. Além disso, pode conter também todos os restantes reagentes necessários para a execução do processo de identificação, como tampões, detergentes, marcadores, aditivos para a identificação da marcação como substratos enzimáticos, fases sólidas, etc. De preferência, o agente anti-interferências de acordo com a invenção e o parceiro ou os parceiros de ligação do analito são embalados em recipientes separados. Caso se utilize um agente 12

Ο1 anti-interferências de acordo com a invenção em que a posição de ligação à biotina tenha sido inactivada, pode também misturar-se directamente o agente anti-interferências com os parceiros de ligação do analito. A invenção é ilustrada pelos exemplos que se seguem:

Exemplo 1

Preparação de estreptavidina polimérica A preparação de estreptavidina polimerizada efectuou-se de acordo com a EP-A-0 331 127.

Activação de estreptavidina com éster de maleimido-hexanoil-N-hidroxissuccinimida

Dissolvem-se 30 mg de estreptavidina em 3 ml de fosfato de potássio 30 mM / cloreto de sódio 100 mM (pH 7,1) e temperam-se a 25°C. Sob agitação, adiciona-se gota a gota 0,15 ml de éster de maleimido-hexanoil-N-hidroxissuccinimida (MHS) (Boehringer Mannheim GmbH) em DMSO (10 mg/ml). Após um tempo de reacção de 1 hora a 25°C arrefece-se a solução num banho de gelo. Em seguida, dializa-se a MHS-estreptavidina formada, a 4°C, duas vezes contra 1 litro de fosfato de potássio 50 mM / cloreto de sódio 100 mM (pH 5,0).

Activação de estreptavidina com anidrido do ácido S- acetilmercaptos succini co

Dissolvem-se 30 mg de estreptavidina em 3 ml de fosfato de potássio 100 mM (pH 7,8) e temperam-se a 25°C. Sob agitação, adiciona-se gota a gota 0,175 ml de anidrido do ácido S-acetilmercaptossuccínico (SAMBA) em DMSO (10 mg/ml) . Após um tempo de reacção de 3 horas a 25°C dializa-se a SAMBA-estreptavidina formada, a 4°C, duas vezes contra 1 litro de fosfato de potássio 50 mM / EDTA 2 mM (pH 6,5). 13

Ramificação homogénea de estreptavidina

Temperam-se 3 ml de uma solução de SAMBA-estreptavidina activada (10 mg/ml) a 25°C e misturam-se com 50 μΐ de hidroxilamina (pH 6,5). Após 30 minutos a 25°C dilui-se por adição de 15 ml de fosfato de potássio 50 mM / cloreto de sódio 100 mM / EDTA 1 mM (pH 6,5). Inicia-se a ramificação homogénea da estreptavidina por adição de 3 ml de MHS-estreptavidina activada (10 mg/ml). Após um tempo de reacção de 2 horas a 25 °C sob agitação cuidadosa termina-se a reacção por adição de 0,2 ml de cisteina / HC1 100 mM. Após um tempo de incubação de 30 minutos a 25°C ajusta-se o valor de pH da solução a 7,5 por adição de hidrogenofosf ato dipotássico 1 M. Após adição de 0,2 ml de iodoacetamida 500 mM incuba-se durante mais uma hora a 25°C. Em seguida, dializa-se duas vezes a 4°C contra 3 litros de fosfato de potássio 50 mM / cloreto de sódio 100 mM (pH 3,5). Após a diálise concentra-se o conjugado numa célula de ultrafiltração e liofiliza-se após adição de sacarose (8%). 14

Exemplo 2

Preparação de Termo-RSA-SA A preparação de Termo-RSA-estreptavidina (Termo-RSA-SA) efectuou-se de acordo com a EP-A-0 331 127.

Ramificação de RSA a Termo-RSA

Dissolve-se 1,0 g de RSA em 100 ml de tampão de fosfato de potássio 20 mM, pH 7,0, e mantém-se durante 5 horas a uma temperatura de 70°C. Em seguida, arrefece-se a 20°C e dializa-se contra tampão de fosfato de potássio 100 mM a pH 7,8.

Activação de Termo-RSA com SAMBA

Dissolvem-se 68 mg de Termo-RSA em 2 ml de tampão de fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,8, e mistura-se lentamente com 0,38 ml de SAMBA (10 mg/ml em DMSO) . Após um tempo de reacção de 3,5 horas a 25°C, dializa-se a 4°C contra 1 litro de tampão de fosfato de potássio 50 mM a pH 6,5.

Preparação do conjugado de Termo-RSA-estreptavidina A ramificação heterogénea de estreptavidina com Termo-RSA efectua-se em condições análogas às da ramificação homogénea descritas no exemplo 1. Para tal fazem-se reagir 60 mg de MHS-estreptavidina activada (preparação de acordo com o exemplo 1) com 68 mg de SAMBA-Termo-RSA. O produto da reacção purifica-se por meio de filtração de gel (Superose, grau preparativo) e concentra-se numa célula de ultrafiltração. Por fim, liofiliza-se o produto obtido. 15

Exemplo 3

Activação de Termo-RSA-SA com biotina livre

Misturam-se 60 mg de Termo-RSA-SA, dissolvida em 6,0 ml de tampão de fosfato de potássio 100 mM, pH 7,0, com 2 mg de D-biotina, dissolvida em 0,5 ml de tampão de fosfato de potássio 10 mM, pH 7,8, e agita-se durante 1 hora. A biotina livre separa-se por filtração de gel (Superose 6®) . A fracção de proteína de alto peso molecular dializa-se contra tampão de fosfato de potássio 10 mM, pH 7,0, e liofiliza-se após adição de 8% de sacarose.

Exemplo 4

Preparação de estreptavidina modificada de modo covalente

Derivatizam-se unidades de tirosina no centro activo de estreptavidina / avidina com fluoreto de p-nitrobenzenossulfonílo, segundo G. Gitlin, E.A. Bayer, M. Wilchek: Studies on the biotin-binding sites of Avidin and Streptavidin; Biochem. J. (1990), 269, 527-530. A 1 g de estreptavidina, a uma concentração de proteína de 10 mg/ml em tampão Tris/HCl 0,1 M, pH 7,9, adiciona-se um excesso molar de 200 vezes de fluoreto de p-nitrobenzenossulfonilo (Sigma N-2262) em relação à subunidade de estreptavidina. Após a adição, agita-se durante 18-20 horas a 25°C. 0 produto, para separação do reagente de derivatização não transformado, dializa-se então contra um volume >500 vezes de tampão PBS a pH 7,5 (16-18 horas a 4°C). 16

Exemplo 5

Preparação de biotina fotoactivável Síntese de biotina-[8-(4-azidobenzoil)amino-3,6-dioxaoctil]amida (Biotina-ADOO-AB)

Dissolvem-se 1,50 g (4 mmol) de biotinil-1,8-diamino-3, 6-dioxaoctano (Biotina-DADOO, Boehringer Mannheim GmbH) sob agitação em 50 ml de DMF recentemente destilada. À solução adicionam-se sucessivamente 1,04 g (4 mmol) de 4-azidobenzoato de N-hidroxissuccinimidilo (HSAB, Boehringer Mannheim GmbH) e 0,55 ml (4 mmol) de trietilamina e deixa-se sob agitação durante 2 horas a 20°C. Em seguida, remove-se o solvente no evaporador rotativo sob vácuo de uma bomba de óleo e purifica-se o produto bruto resultante por cromatograf ia em sílica gel. Para tal, dissolve-se o resíduo numa quantidade tão pequena quanto possível de clorofórmio/metanol 2/1 (v/v) sob ligeiro aquecimento a cerca de 40°C e aplica-se sobre uma coluna (4x60 cm) de sílica gel 60 (Firma Merck, R. F. Alemã) . Elui-se com clorofórmio/metanol 2/1 (v/v) e recolhe-se em fracções de 50 ml. As fracções que contêm o produto puro identificam-se e purificam-se por CCF (sistema como descrito acima). Remove-se o solvente no evaporador rotativo e digere-se o resíduo semi-sólido com cerca de 50 ml de éter diisopropílico. O produto incolor, finamente cristalino, filtra-se e seca-se durante a noite numa estufa de vácuo (0,1-0,15 bar / 40°C).

Rendimento: 1,24 g (60% do teórico). CCF: Sílica gel 60 (Merck) F254, clorofórmio/metanol 2/1 (v/v); Rf = 0,71. iH-RMN (100 MHz / d6-DMS0): δ (ppm) = 1,20-1, 65 (m, 6H) ; 2,07 (tr, 2H) ; 2,60-3,65 (m, 15H); 4,05-4,20 (m, 2H); 6,38 (d, largo, 2H); 7,20 (d, 2H); 7,62 (tr, largo, 1H); 7,91 (d, 2H); 8,35 (tr, largo, 1H). 17

UV (CH3OH) : X(max) = 267 nm. IV (KBr): v = 2125 cm"1. O esquema de síntese da Biotina-DADOO-AB está representado na Figura 1.

Exemplo 6

Preparação de Biotina(fotoactivada)-Estreptavidina

Faz-se reagir estreptavidina com um derivado de biotina fotoactivável (por exemplo Biotina-DADOO-AB) e dializa-se para separação da biotina livre não ligada. Por irradiação com uma lâmpada de vapor de mercúrio (350-700 nm) inicia-se a reacção fotoquímica e fixa-se de modo covalente a biotina no centro de ligação da estreptavidina. A 1 g de estreptavidina, a uma concentração de proteína de 20 mg/ml em tampão PBS, pH 7,5, adiciona-se um excesso molar de 10 vezes de reagente de Biotina-DADOO-AB (3,5 ml de uma solução padrão de Biotina-DADOO-AB 25 mg/ml em DMSO). Após a adição agita-se durante 2 horas a 25°C ao abrigo da luz.

Separa-se completamente (até não ser possível detectar) o derivado de biotina livre não ligado por diálise (20 horas, 4°C) contra um volume >500 vezes de tampão PBS a pH 7,5. A mistura reaccional, a uma espessura de solução < 5 cm, irradia-se então com uma lâmpada de vapor de mercúrio (350-700 nm) , sob agitação, durante 20 minutos, e finalmente dializa-se mais uma vez contra um volume >500 vezes de tampão PBS a pH 7,5 (16-18 horas, 4°C). 18

Exemplo 7

Purificação de estreptavidina inactivada ou Termo-RSA-SA ou respectivos derivados e fragmentos

Preparação de adsorvente RSA-biotina A 1 g de RSA, a uma concentração de proteína de 10 mg/ml em tampão PBS, pH 8,5, adiciona-se um excesso molar de 10 vezes de N-hidroxissuccinimido éster do ácido D-biotinil-e-aminocapróico (Boehringer Mannheim GmbH).

Após a adição agita-se durante 2 horas a 25°C e termina-se a reacção por adição de lisina até uma concentração final de 10 mM. Separa-se completamente (até não ser possível detectar) o derivado de biotina livre não ligado por diálise (16-18 horas, 4°C) contra um volume >500 vezes de tampão PBS a pH 7,5. A 40 g de Amino-Spherosil® (Boehringer Mannheim GmbH) adicionam-se 300 ml de diglutaraldeído (a 10%) e agita-se a mistura sob rotação durante 2 horas a pH 3,7 e à temperatura de 55°C. Lava-se a suspensão com um volume >7 vezes que o de Spherosil® de água bidestilada e 5 vezes o de Spherosil® de tampão PBS a pH 8,0. Finalmente, o Spherosil® activado faz-se reagir com RSA-Bi durante 20 horas à temperatura ambiente sob agitação, a uma oferta de proteína de 5-10 mg/ml de Spherosil. A solução de proteína não consumida separa-se por meio de um filtro de vidro sinterisado e lava-se o material adsorvente com 10 volumes de Spherosil® de uma solução a 0,9% de NaCl e incuba-se com 5 volumes de Spherosil® de uma solução de etanolamina durante 1 hora. 0 material adsorvente lava-se então com um volume de 5 vezes o de Spherosil® de uma solução de NaCl a 0,9%, 3 vezes o volume de Spherosil® de ácido propiónico 1M e com uma quantidade suficiente de uma solução de NaCl 30 mM até se atingir o valor 19

de pH de 6,5. 0 adsorvente equilibra-se com uma quantidade suficiente de tampão PBS a pH 7,5.

Preparação de adsorvente estreptavidina-Spherosil A 40 g de Amino-Spherosil (Boehringer Mannheim GmbH) adicionam-se 300 ml de diglutaraldeído (a 10%) e agita-se a mistura sob rotação durante 2 horas a pH 3,7 e 55°C. Lava-se a suspensão com um volume >7 vezes que o de Spherosil de água bidestilada e 5 vezes o de Spherosil de tampão PBS a pH 8,0. O Spherosil activado faz-se reagir então durante 20 horas à temperatura ambiente a uma oferta de proteína de 5-10 mg/ml de Spherosil, com estreptavidina (Boehringer Mannheim GmbH) sob agitação. A solução de proteína não consumida separa-se por meio de um filtro de vidro sinterisado e lava-se o material adsorvente com 10 volumes de Spherosil de uma solução de NaCl a 0,9% e incuba-se com 5 volumes de uma solução de etanolamina durante 1 hora. O material adsorvente lava-se então com um volume de 5 vezes o de Spherosil de uma solução de NaCl a 0,9%, 3 vezes o volume de

Spherosil de ácido propiónico 1M e com uma quantidade suficiente de uma solução de NaCl 30 mM até se atingir o valor de pH de 6,5. Equilibra-se o adsorvente numa quantidade suficiente de tampão PBS a pH 7,5.

Por cromatografia em albumina de soro de vaca - biotina e/ou estreptavidina - adsorvente sobre uma base de Spherosil, purifica-se a estreptavidina inactivada de acordo com os exemplos 3, 4 ou 6, libertando-a da estreptavidina com actividade residual (ligação a biotina), da biotina livre residual ou da estreptavidina com biotina ligada de modo covalente à superfície (em oposição à biotina fixa na posição de ligação) .

Na mistura reaccional, adiciona-se por 10 mg de proteína 1 ml de estreptavidina-adsorvente, equilibrado em tampão PBS a pH 7,5, e agita-se durante 2 horas a 25°C. 20

A suspensão transfere-se então para uma coluna e lava-se o material da coluna com tampão PBS a pH 7,5. Durante a eluição da coluna controla-se o teor em proteína por espectroscopia de UV a 280 nm. Elui-se até não se observar a presença de proteína. Os eluídos contendo proteína reúnem-se numa única fracção.

No eluído de estreptavidina-adsorvente contendo proteína adiciona-se então por 10 mg de proteína 1 ml de albumina de soro de vaca - biotina (RSA-Bi)-Spherosil-adsorvente, equilibrado em tampão PBS a pH 7,5, e agita-se durante 2 horas à temperatura ambiente. A suspensão transfere-se para uma coluna e lava-se com tampão PBS a pH 7,5. Durante a eluição da coluna controla-se o teor em proteína por espectroscopia de UV a 280 nm. Os eluídos contendo proteína contêm o produto e reúnem-se numa única fracção. 0 produto ((poli-)estreptavidina inactivada ou Termo-RSA-SA ou derivados e fragmentos) concentra-se até uma concentração de proteína de 20 mg/ml e liofilíza-se após enchimento.

Exemplo 8

Execução de um teste GAD-anticorpo com execução sequencial em relação ao antigene e amostra biotinilados

Em cada cavidade de uma placa de microtitulação revestida com Termo-RSA-estreptavidina pipetam-se 100 μΐ de glutamato descarboxilase (GAD) biotinilada, isolado de cérebro de porco, numa concentração óptima para a carga em causa (1-3 μg/ml em tampão de incubação do Enzymun-Test® anti-HIV 1+2 da Boehringer Mannheim) e incubam-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lava-se a placa três vezes com 350 μΐ de cada vez de fosfato de potássio 50 mmol/1, a pH 7,0 com adição de 0,1% (v/v) de CHAPSO (2-hidroxi-l-propanossulfonato de 3—[(3— colamidopropil)dimetilamónio]). Dilui-se soro humano 1+25 em tampão de incubação do Enzymun-Test anti-HIV 1+2, ao qual se 21

adicionou uma quantidade determinada de Termo-RSA-estreptavidina (não tratada ou inactivada) ou de estreptavidina-monómero ou estreptavidina-polimero (não tratado ou inactivado). Estas amostras assim diluídas incubam-se num volume de 100 μΐ/cavidade à temperatura ambiente, sob agitação da placa de microtitulação, durante 1 hora. Em seguida aspiram-se as amostras e lavam-se as placas 3 vezes como acima descrito. Dilui-se o anticorpo a identificar acoplado a POD, de carneiro, com especificidade de ligação para IgG humano, em tampão de conjugação do Enzymun-Test anti-HIV 1+2, até uma concentração de 75 mU/ml e incuba-se em cada cavidade 100 μΐ desta solução diluída, durante 1 hora à temperatura ambiente sob agitação. Aspira-se o líquido e lava-se novamente a placa 3 vezes com acima descrito. O corante ABTS® dissolve-se numa concentração del mg/ml em tampão de substrato do Enzymun-Test® e incubam-se 100 μΐ/cavidade à temperatura ambiente sem agitação. Após cera de 30 minutos mede-se a extinção num fotómetro de placas de microtitulação. O comprimento de onda de leitura é 405 nm e o comprimento de onda de referência 492 nm. Os ensaios em branco efectuam-se em duas cavidades não tratadas que contêm apenas substrato / solução de corante. Subtrai-se o valor médio da extinção das duas cavidades do ensaio em branco de todas as outras extinções determinadas.

Nas Tabelas 2, 3 e 4 indicam-se sempre os valores médios de duas cavidades de uma amostra duplamente determinada em extinções. 22

Tabela 2

Desimpedimento por adição de quantidades variáveis de Termo-RSA-estreptavidina _ __

Amostra Extinção sem adição de tampão Altura do sinal em %gem do sinal inicial para quantidade de Termo-RSA-SA (%, p/v) cada 0 0,01 0,025 0,05 0,1 0,25 0, 5 1 Tampão 0, 016 * •k ★ ★ * + * ★ Soro normal 0,182 100 95 68 71 74 70 70 60 Controle positivo (MICA) 1,906 100 72 74 73,5 73 65 62 44 Soro positivo 2,065 100 63 61 62 60 50 48 37 Soro contam. 1 2,325 100 16 14 15 16 15 14 11 Soro contam. 2 1,234 100 9 8,5 8 5 4 4 2 Soro contam. 3 0,707 100 24 16 13 13 10 10 8 * Não existem dados, uma vez que não são significativos devido ao fraco sinal medido

MICA: anticorpo monoclonal contra GAD 23

I

Tabela 3

Desimpedimento por adição de estreptavidina monomérica ou polimérica

Amostra sem aditivo 1* (p/v) de SA 1% (p/v) de poli-SA Tampão 0, 008 0, 006 0, 009 Soro normal 0,106 0,144 0,108 Soro contam. 1, 390 0,108 0,087 Controle positivo 0, 950 1,588 1,033 (MICA) Soro positivo 0, 940 1,416 0, 950

Tabela 4

Desimpedimento por adição de Termo-RSA-estreptavidina ou Termo-RSA- estreptavidina modificada de modo covalente (de acordo com o exemplo 4)_

Amostra sem aditivo 0,025% (p/v) de Termo-RSA-SA 0,025% (p/v) de Termo-RSA-SA (inactivada) Tampão 0, 009 0, 011 0, 011 Soro normal 0,226 0, 191 0, 206 Soro contam. 1,500 0,117 0,332 Controle positivo 1,745 1,528 1,579 (MICA) Soro positivo 1,963 1, 457 0,797

Exemplo 9

Desimpedimento de um teste anti-HCV com biotina(fotoactivada)-SA

Princípio do teste:

Teste "sanduíche" em 2 passos com fase sólida de estreptavidina (execução do teste e reagentes como no Enzymun-Test® anti-HIV 1+2 da Boehringer Mannheim) 24 1 2 0 passo: péptido biotinilado mais amostra 0 passo: reacção dos anticorpos ligados à parede com um conjugado anti-IgG-humano-POD 3o passo: reacção de indicador com ABTS como substrato

Tampão: a) Tampão de incubação do Enzymun-Test® anti-HIV 1+2 Péptido-HCV da região "core" NS4 e NS5 ± estreptavidina inactivada preparada de acordo com os exemplos6 e 7 b) Tampão de conjugado do Enzymun-Test® anti-HIV 1+2

Tempos de incubação:

Io passo: 1 hora (amostra + tampão de incubação) 2° passo: 1 hora (+ tampão de conjugado) 3o passo: 1 hora (reacção de substrato com ABTS)

Amostras: 3 amostras negativas de soro (referência 1) 6 amostras negativas anti-HCV falsamente positivas 3 amostras positivas anti-HCV (referência 2)

Volumes: amostra: 20 μΐ todos os outros reagentes: 500 μΐ cada Execução do teste: em ES 600, a 25°C, segundo as instruções do Enzymun-Test® anti-HIV 1+2 25

Quantificação dos substratos:

Medição da solução de substrato a 422nm em ES 600 (Boehringer Mannheim GmbH). As extinções encontram-se apresentadas na Tabela 5.

Tabela 5

Amostras sem SA inact. no tampão de incub. 20 μ9/ιη1 de SA inact. no tampão de incubação I diminuição de sinal após adição de SA inactivada soro negativo 1 0, 036 0,027 * soro negativo 2 0,042 0, 035 ★ soro negativo 3 0,078 0,076 * soro neg.-HCV 1 0, 528 0,125 76% soro neg.-HCV 2 0,467 0,106 77% soro neg.-HCV 3 0, 979 0,161 84% soro neg.-HCV 4 0,499 0, 094 81% soro neg.-HCV 5 2,049 0,471 77% soro neg.-HCV 6 0,427 0,065 85% soro positivo HCV 1 1,747 1,645 6% soro positivo HCV 2 1,161 1,076 7% soro positivo HCV 3 1,104 1,026 7% * Não existem dados uma vez que não são significativos devido ao fraco sinal medido

Lisboa, 7 de Dezembro de 2000

ΙΕΝΤΠ OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL 26

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas como agente anti-interferências para evitar efeitos de troca não específicos em testes imunológicos ou testes de ácidos nucleicos.
2. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por se utilizarem como derivados de avidina ou de estreptavidina moléculas de avidina ou de estreptavidina ramificadas homogeneamente.
3. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por se utilizarem como derivados de avidina ou de estreptavidina moléculas de avidina ou de estreptavidina ramificadas por compostos bi- ou poli-funcionais.
4. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por se utilizarem como derivados de avidina ou de estreptavidina moléculas de avidina ou de estreptavidina ramificadas heterogeneamente.
5. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por se utilizarem moléculas de avidina ou de estreptavidina ramificadas com proteínas.
6. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por se utilizarem moléculas de avidina ou de estreptavidina ramificadas com proteínas polimerizadas. 1
7. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracterizada por se utilizarem como moléculas de avidina ou de estreptavidina moléculas de avidina ou de estreptavidina ramificadas homogeneamente.
8. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por se utilizarem como derivado de avidina ou de estreptavidina fragmentos que estejam em condições de manter o efeito anti- interferências de toda a molécula, ou uma mistura destes fragmentos de avidina ou de estreptavidina.
9. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizada por se utilizar como derivado de avidina ou de estreptavidina avidina ou estreptavidina inactivadas.
10. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a inactivação da avidina ou da estreptavidina se efectuar por saturação com biotina ou com um derivado de biotina.
11. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a inactivação se efectuar por modificação covalente do centro activo da avidina ou da estreptavidina.
12. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por se efectuar, para a modificação covalente, uma derivatização de pelo menos um dos aminoácidos do centro activo, ou um acoplamento covalente de biotina ao centro activo.
13. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o acoplamento covalente de biotina ao centro activo se 2 I A

JLuã a -

/ efectuar por meio de biotina fotoactivável, por exemplo Biotina-DADOO-AB.
14. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a desactivação do centro activo se efectuar por métodos de tecnologia genética, como substituição, eliminação ou inserção de uma ou mais unidades de aminoácido.
15. Utilização de avidina ou estreptavidina ou de um derivado destas de acordo com as reivindicações 9 a 14, caracterizada por a avidina ou estreptavidina inactivadas se purificarem adicionalmente por meio de biotina e/ou avidina ou estreptavidina ligadas a uma fase sólida.
16. Utilização de um agente anti-interferências de acordo com uma das reivindicações 1 a 15, num teste imunológico ou num teste de ácidos nucleicos, no qual se emprega como um dos componentes de ligação avidina ou estreptavidina.
17. Processo para a determinação de um analito numa amostra, caracterizado por abranger os passos: (1) contacto da amostra com (a) um agente anti-interferências de acordo com a uma das reivindicações 1 a 15 (b) um ou mais parceiros de ligação específicos do analito e (2) determinação do complexo formado a partir do analito e do parceiro de ligação específico como uma medida da presença do analito.
18. Processo para a determinação de um analito numa amostra, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por se acoplar pelo menos um componente de ligação do processo através de avidina/biotina ou estreptavidina/biotina e se efectuar o 3
19.

acoplamento destes componentes de ligação antes da introdução do agente anti-interferências. Processo para a determinação de um analito numa amostra, caracterizado por abranger os passos: (1) contacto da amostra com (a) um agente anti-interferências de acordo com a uma das reivindicações 1 a 15 (b) um ou mais parceiros de ligação específicos do analito e (2) determinação do complexo formado a partir do analito e do parceiro de ligação específico como uma medida da presença do analito, efectuando-se o contacto da amostra com (a) e (b) simultaneamente.
20. Combinação teste para um processo para a determinação de um analito numa amostra contendo (1) um derivado de avidina ou de estreptavidina que não se encontra incorporado no complexo de analito e parceiro de ligação ao analito, de acordo com uma das reivindicações 1 a 15 e (2) pelo menos um parceiro de ligação específico do analito.
21. Combinação teste de acordo com a reivindicação 20, contendo adicionalmente todos os outros reagentes necessários ao processo de determinação.
22. Processo para a preparação de um agente anti-interferências de acordo com uma das reivindicações 9 a 15, caracterizado por se modificar avidina ou estreptavidina e, conforme o caso, se purificar por meio de biotina e/ou avidina ou estreptavidina ligadas a uma fase sólida.
23. Avidina ou estreptavidina inactivadas, preparadas por saturação dos centros activos por biotina ou um derivado de biotina, ou por modificação covalente do centro activo e 4 â purificação por meio de biotina e/ou avidina ou estreptavidina ligadas a uma fase sólida.
24. Avidina ou estreptavidina inactivadas, nas quais se encontra ligada biotina ao centro activo e além disso, através de uma ligação covalente, no exterior do centro activo, preparadas por saturação dos centros activos da avidina ou estreptavidina com um derivado de biotina fotoactivável, seguida de acoplamento covalente do derivado de biotina por iniciação da reacção fotoquimica.
25. Avidina ou estreptavidina inactivadas, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadas por se utilizar como derivado de biotina Biotina-DADOO-AB. Lisboa, 7 de Dezembro de 2000 Ψ AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL /'

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