JPH0739388A - ヘパリン結合性増殖因子の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）等のヘパリン
結合性増殖因子をコードする遺伝子を導入して形質転換
された細胞株を硫酸化多糖類またはそのアゴニストの存
在下において培養し、その培養液からヘパリン結合性増
殖因子を採取する。 【効果】 本発明の方法によれば、ヘパリン結合性増殖
因子の生産及び回収量を従来法よりも数倍高めることが
可能となり、該因子の医療分野での広範な利用が期待で
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヘパリン結合性増殖因子
を生産する方法に関するものであり、詳しくは硫酸化多
糖類またはそのアゴニストの存在下においてヘパリン結
合性増殖因子を産生する形質転換細胞を培養することに
より、その培養上清から該増殖因子を高産生で効率よく
取得する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
種々の細胞増殖因子がクロ−ニングされているが、それ
らの中で、ヘパリンに強い親和性を有する一群の増殖因
子が見出されている。これをヘパリン結合性増殖因子と
総称するが、この中には線維芽細胞増殖因子（ＦＧ
Ｆ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、プレイオト
ロフィン、顆粒球／マクロファ−ジ・コロニ−形成刺激
因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インタ−ロイキン３及び７、血
管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等、種々の既知または
未同定の増殖因子が含まれる（実験医学，９（１４），
１７７２（１９９１））。これらの因子は、ヘパリンや
ヘパラン硫酸に代表されるグリコサミノグリカンと結合
することが知られており、中でもＦＧＦは、ヘパラン硫
酸プロテオグリカンとの結合により細胞表面や細胞外基
質に貯蔵されること、及びＦＧＦの有する生物学的活性
がヘパリンによって調節され得ることが確認された（Ｃ
ｅｌｌ，６４，８４１（１９９１））。最近、肝実質細
胞を生体内より取り出して生体外においてその増殖を促
進させうるヒト由来の蛋白性因子、即ちヒト肝細胞増殖
因子（以下「ｈＨＧＦ」と略す。）が劇症肝炎患者血漿
より見い出され（特開昭６３−２２５２６号公報）、さ
らにｈＨＧＦ蛋白質をコ−ドするアミノ酸配列及びこれ
をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の配列（特開平３−７
２８８３号公報）、さらにこのｃＤＮＡを用いたｈＨＧ
Ｆ蛋白質の生産方法及び形質転換体（特開平３−２８５
６９３号公報）が報告されている。かかる方法により生
産される組み換えｈＨＧＦ蛋白質は、生体外において肝
実質細胞の増殖を促進する働きがみとめられている。ま
た、ヒトに限らずＨＧＦ蛋白は、ヘパリンに強い親和性
を有する上記ヘパリン結合性増殖因子の一種であること
が判明している。本発明者らは、標的細胞におけるＨＧ
Ｆ結合・消費に硫酸化多糖類が及ぼす影響について調べ
たところ、ＨＧＦと種々の硫酸化多糖類とを混合するこ
とにより、ＨＧＦの標的細胞への結合および標的細胞に
よるｈＨＧＦの消費が強く抑制され、結果としてＨＧＦ
の作用が持続かつ安定化することを見出した（欧州公開
特許公報第５１７１８２号）。

【０００３】一方、一般に増殖因子の生産手段として、
大腸菌などの微生物や哺乳動物由来細胞に該増殖因子の
ｃＤＮＡを導入する方法が広く利用されている（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．，１
６．３−１７．４０，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８
９））。ｈＨＧＦに代表されるような、糖鎖を持ち且つ
分子内に多くのジスルフィド結合を有する複雑な構造の
蛋白質の場合、専ら動物細胞がその生産に利用される。
その中でも特に汎用されているのがチャイニ−ズ・ハム
スタ−卵巣由来の上皮系細胞株ＣＨＯである。

【０００４】他方、ヘパリン結合性増殖因子の標的細胞
上のレセプタ−分子も明らかになりつつあり、例えばＨ
ＧＦのレセプタ−分子は癌原遺伝子ｃ−ｍｅｔ産物（Ｃ
−Ｍｅｔ蛋白質）であることが判明しており（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２５１，８０２（１９９１））、また酸性型及
びアルカリ型ＦＧＦやＫＧＦのレセプターとして既に数
種類のＦＧＦレセプターファミリーが明らかにされてい
る（実験医学，１０，２５（１９９２））。さらにそれ
以外のレセプターとして、細胞表層のヘパラン硫酸プロ
テオグリカン（ＨＳＰＧ）も、分子内グリコサミノグリ
カンを介してヘパリン結合性増殖因子を捕捉することが
知られている（蛋白質・核酸・酵素，３４，８５３（１
９８９））。ＨＳＰＧは、極めて多くの細胞上に大量に
発現する。 さらに、一般に増殖因子が細胞上の特異的
レセプタ−に結合してその生理活性を惹起する際には、
増殖因子自身が速やかに細胞内に取り込まれ、消費され
ることが広く認められている。ＨＧＦにおいても、本発
明者らは、既に上皮系細胞株を用いた解析から、ｈＨＧ
Ｆがレセプタ−に結合後極めて速く細胞内に取り込まれ
（インタ−ナリゼ−ション）（ｔ_1/2 ：５−１０分）、
分解を受けて培養上清中に放出される（デグラデ−ショ
ン）（ｔ_1/2 ：３０−６０分）ことを明らかにしている
（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｓｕｐｐｌ ０（１
６ｐａｒｔＢ），１８４（１９９２））。

【０００５】従来の技術では、ヘパリン結合性増殖因子
のｃＤＮＡを有する発現ベクタ−を適当な宿主細胞に導
入して該増殖因子を生産した場合、発現した該増殖因子
の一部が産生細胞自身の増殖因子レセプタ−及びＨＳＰ
Ｇ分子を介して分解・消費されることを防げなかったた
め、産生細胞培養上清中から回収される該増殖因子の量
は比較的低値であった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、該増殖因
子産生細胞（形質転換体）の培養系に各種硫酸化多糖類
を添加し、該増殖因子産生量を比較検討した。例えば、
ｈＨＧＦｃＤＮＡを導入したＨＧＦ産生ＣＨＯ細胞（特
開平３−２８５６９３号公報）の培養液中に硫酸化多糖
類を１〜１０００μｇ／ｍｌの濃度で添加し、経時的に
培養上清を回収してＨＧＦ含量を定量した。その結果、
興味深いことに、硫酸化多糖類の添加によって約１．５
〜５倍のＨＧＦ産生増強が認められた。

【０００７】一方、本発明者らは、ＨＧＦ発現に用いた
宿主ＣＨＯ細胞のＨＧＦ応答性を検討したところ、該宿
主細胞がＣ−Ｍｅｔ蛋白質を持ち実際にＨＧＦ添加によ
ってＤＮＡ合成が促進されること、及び宿主細胞がＨＧ
Ｆを消費・分解することを見出した。さらに、本発明者
らは、宿主細胞のＨＧＦ結合・分解に及ぼす硫酸化多糖
類の影響について調べたところ、ＨＧＦと硫酸化多糖類
とを混合することにより、ＨＧＦの宿主細胞への結合お
よび宿主細胞によるＨＧＦの消費が強く抑制されること
を見出した。

【０００８】以上の結果から、ＨＧＦ産生細胞培養系に
おいて、硫酸化多糖類を培養系に添加することで産生細
胞自身によるＨＧＦ結合・消費・分解が回避され、培養
上清からのＨＧＦ回収量が大幅に増強することが判明
し、本発明を完成するに至った。 すなわち本発明の
要旨は、ヘパリン結合性増殖因子をコードする遺伝子を
導入して形質転換された細胞株を硫酸化多糖類またはそ
のアゴニストの存在下において培養し、その培養液から
ヘパリン結合性増殖因子を採取することを特徴とするヘ
パリン結合性増殖因子の生産方法、及びヘパリン結合性
増殖因子をコードする遺伝子を導入して形質転換された
細胞株の培養液中に硫酸化多糖類またはそのアゴニスト
を共存させることを特徴とするヘパリン結合性増殖因子
の分解抑制方法に存する。

【０００９】以下、本発明につき詳細に説明する。本発
明で定義されるヘパリン結合性増殖因子とは、硫酸化多
糖類に親和性を有する全てのヘパリン結合性増殖因子が
該当する。具体的には、全アミノ酸配列が明らかとなっ
ている酸性型ＦＧＦ、アルカリ型ＦＧＦ（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１４７，１２０（１９
８７））、ＫＧＦ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，７５２
（１９８９））、ＨＧＦ等の蛋白性因子等が挙げられ
る。

【００１０】本発明で使用する該増殖因子産生細胞は、
その表層にＨＳＰＧに代表される硫酸化多糖構造を有す
る細胞で、かつ組換え法により上記のような増殖因子ｃ
ＤＮＡを導入されたものである。具体的には、特開平３
−２８５６９３号公報に記載された方法に従いｈＨＧＦ
をコ−ドするｃＤＮＡを含む発現ベクタ−を構築し、そ
の発現ベクタ−をＣＨＯ細胞等の宿主に導入した産生株
などが挙げられる。かかるＨＧＦ産生細胞系では、硫酸
化多糖類添加によって約１．５〜５倍以上のＨＧＦ回収
増大が認められる。かかる細胞株の培養は、常法により
浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地とし
ては、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等が使用され、５−
１０％血清の存在下、もしくは適当量のインスリン、デ
キサメサゾン、トランスフェリン等の存在下において培
養する。

【００１１】本発明において、上記ヘパリン結合性増殖
因子を産生する形質転換細胞培養系に添加する硫酸化多
糖類としては、天然グリコサミノグリカンを含むプロテ
オグリカン、グリコサミノグリカン、グルカン、それら
の誘導体が挙げられる。硫酸化多糖類は、糖がグリコシ
ド結合によって脱水縮合して生じる炭水化物、すなわち
グリカンに硫酸基が付加したものであり、かかる多糖類
とは、グリコサミノグリカンのごとく二糖類単位が繰り
返してできた構造を有し、その二糖類の１つがグルコサ
ミンまたはガラクトサミンから成るもの（生命の科学，
３９（４），３０６（１９８８））や、グルカンのよう
に多糖類が硫酸エステル化されたもの、さらにはこれら
の誘導体が含まれる。具体的には、例えばコンドロイチ
ン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫
酸、ヘパリン、デキストラン硫酸等が挙げられる。また
これら硫酸化多糖類のアゴニストも、本発明の培養系に
添加することができる。

【００１２】上記硫酸化多糖類またはそのアゴニスト
は、ヘパリン結合性増殖因子を産生する細胞培養液中に
少なくとも１種類添加される。添加量としては、産生細
胞の増殖に強い影響を与えない範囲であるならば特に制
限はされないが、通常１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好
ましくは１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲で好適に利用さ
れる。また添加する時期は、通常培養の当初から加え、
培地を交換する毎に新たに添加する方法が採用される
が、培養の途中で加えても差し支えない。

【００１３】かかる培養により、ヘパリン結合性増殖因
子はその形質転換細胞培養系の培養上清中に産生され、
従ってこの培養上清から目的とするヘパリン結合性増殖
因子を常法に従って分離・精製することができる。具体
的には、培養上清を各種のクロマトグラフィー、例えば
Ｓ−セファロース、硫酸化セルロファイン等の使用によ
り容易に単離・精製することができる。

【００１４】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に
限定されるものではない。 実施例１ ＣＨＯ細胞上のＨＧＦレセプタ−の検出 精製された組換えｈＨＧＦ標品（特開平３−７２８８３
号公報に記載の方法に従って調製）を、クロラミンＴ法
（Ｎａｔｕｒｅ，１９４，４９５（１９６２））にてヨ
−ド標識した。すなわち、１００μｌの０．５Ｍ 塩化
ナトリウム、０．５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に
溶解したｈＨＧＦ ２０μｇに１ｍｇ／ｍｌ クロラミ
ンＴ １００μｌを添加して反応を進行させ、次いで
２．５ｍｇ／ｍｌ ピロ亜硫酸ナトリウム １００μｌ
を加えて反応を停止した。反応液を０．２５％ ゼラチ
ン、５ｍＭ ヨウ化カリウム含有ＰＢＳ（−）にて平衡
化したセファデックスＧ−２５（ファルマシア社）カラ
ムに添加し、標識されなかったヨ−ドを除いた。 ¹²⁵Ｉ
標識ｈＨＧＦ（以下、「標識ｈＨＧＦ」と略す）は、
０．２μｍフィルタ−を通過させて無菌化し、分注して
使用時まで−２０℃にて保存した。

【００１５】底面積７８．５ｃｍ² のプラスチックディ
ッシュ（コ−ニング社）にＣＨＯ細胞を培養し、ほぼ飽
和密度に達した（セミコンフレント）ものを実験に使用
した。細胞をディッシュに付着させた状態で、０．２５
％ ゼラチン、２５ｍＭ ヘペス含有ＤＭＥＭ培地（ギ
ブコ社）ｐＨ７．４（以下、「結合培地」と略す）にて
３回洗浄し、次いで０−２００ｐＭ標識ｈＨＧＦを含む
結合培地１０ｍｌと共に４℃にて４時間ゆるやかに振と
う培養した。対照として、２００ｐＭ標識ｈＨＧＦにさ
らに２ｎＭ非標識ｈＨＧＦを加えたディッシュも用意し
た。上清を除去し、氷冷結合培地、次いで氷冷ＰＢＳ
（−）にて各４回洗浄後、５ｍｌの架橋緩衝液（１００
μｇ／ｍｌ ビススベレ−ト含有１４０ｍＭ 塩化ナト
リウム、１ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭリン酸ナ
トリウム（ｐＨ８．３））中で４℃にて３０分間反応さ
せて、標識ｈＨＧＦと細胞表面のｈＨＧＦ結合蛋白とを
化学架橋した。５ｍｌの２５ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ
ＥＤＴＡを添加して反応を停止させた後、細胞をスクレ
−パ−にて剥離し、４００μｌの可溶化液（５０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ 塩化ナトリ
ウム、１％ ノニデットＰ−４０、１ｍＭＥＤＴＡ、２
ｍＭ フェニルメチルスルフォン酸フルオライド）を加
え、氷上で１時間反応させて細胞を可溶化した。細胞可
溶化液から、１２０００×ｇ，４℃、３０分間の遠心分
離にて上清を得て、その一部を免疫沈降法、電気泳動及
びオ−トラジオグラフィーに供した。

【００１６】上記細胞可溶化画分から、ＨＧＦの機能的
レセプタ−分子の一つとして知られるｃ−Ｍｅｔ蛋白質
を分離する目的で、免疫沈降を行った。すなわち、細胞
可溶化液に５μｌの抗マウスｃ−Ｍｅｔ抗血清（Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０４，８５７（１９９
２））と２０μｌのプロテイン−Ａ セファロ−ス（フ
ァルマシア社）を加えて、ｃ−Ｍｅｔ蛋白質／ＨＧＦ複
合体を免疫沈降させた。沈降物は、ＳＤＳ−サンプル緩
衝液（０．１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ６．８）、１０％
グリセロ−ル、１％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ））中で煮沸後、６％ ポリアクリルアミド濃度の非
還元条件でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供
し、ゲルを固定・乾燥後、オ−トラジオグラフィにて標
識ｈＨＧＦの結合する蛋白質を検出した。

【００１７】図１に結果を示す。図１においてレ−ン
１、２、３、４はそれぞれ標識ｈＨＧＦ添加量５０ｐ
Ｍ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、２００ｐＭ＋非標識ｈＨ
ＧＦ２ｎＭのサンプルの結果を表す。左側の数字は、分
子量マ−カ−の移動度をキロダルトン（ｋＤａ）で示し
てある。非還元下では７０ｋＤａ付近に標識ｈＨＧＦ単
独のバンドを認め、さらに２５０ｋＤａ付近に特異的バ
ンドを検出した。このバンドは抗ｃ−Ｍｅｔ抗体で特異
的に沈降すること、ｈＨＧＦの分子量を差し引くと約１
８０ｋＤａの大きさであることから、ｈＨＧＦとｃ−Ｍ
ｅｔ蛋白質の複合体であると結論される。

【００１８】以上の結果から、ｈＨＧＦ産生細胞株の親
株であるＣＨＯ細胞上には、既にＨＧＦの機能的レセプ
タ−の構成分子として知られるＣ−Ｍｅｔ蛋白質が存在
し、実際にｈＨＧＦがＣＨＯ細胞表面のｃ−Ｍｅｔ蛋白
質に特異的に結合することが判明した。

【００１９】実施例２ ＣＨＯ細胞培養系における添加
ｈＨＧＦ分子の残存量の測定 次にＣＨＯ細胞におけるｈＨＧＦの分解速度を調べる目
的で、以下の実験を行った。すなわち、培養上清中に一
定量のｈＨＧＦを添加し、経時的に上清中の残存ＨＧＦ
量をエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法にて測
定し、硫酸化多糖類の有無によるＨＧＦ分解速度の違い
を比較検討した。

【００２０】ＣＨＯ細胞を０．０２％トリプシン−ＥＤ
ＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）含有の１０ｍＭ リン
酸緩衝液−生理食塩水 ｐＨ７．４（ＰＢＳ（−））に
て剥離し、低速遠心にて３回洗浄後、細胞濃度５×１０
⁵ 個／ｍｌとなるよう１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含
有ｅＲＤＦ培地（極東製薬社）にて懸濁した。この細胞
液を、１ｍｌずつ１２ウェルマイクロプレ−ト（コスタ
−社）に添加して、５％炭酸ガス含有空気気相下、３７
℃で１昼夜培養した。１６時間後、培養ウェルの培養液
を除き、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄後、２μｇ／ｍｌの
ヒトリコンビナントＨＧＦを含む新鮮な培地を１ｍｌず
つ添加した。この時、一部のウェルには最終濃度１００
μｇ／ｍｌとなるようヘパリン（分子量４０００−６０
００、シグマ社）を加えた。５％炭酸ガス含有空気気相
下、３７℃で培養を続け、１、２、５、２４、６８時間
後に５０μｌずつ上清を採取して、ＥＬＩＳＡ法にて上
清中の残存ＨＧＦ量を測定した。上清は、測定直前まで
−８０℃にて凍結保存した。 上記被検培養上清中の残
存ＨＧＦ量を、ｈＨＧＦ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ
法にて測定した。すなわち、被検上清を０．１％ ＣＨ
ＡＰＳ、０．４Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）（シグマ社、ＲＩＡグレ−ド）、
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有１０ｍＭ リン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）にて５０、１００、２００倍に希釈し
た。ＥＬＩＳＡ用プレ−トとして、９６ウェルマルチプ
レ−ト（ヌンク社、ＥＬＩＳＡ用）に予め抗ｈＨＧＦモ
ノクロ−ナル抗体を吸着させ（０．５μｇ／５０μｌ−
５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）／ウェル）、次い
で１％ ＢＳＡ、０．０５％ アジ化ナトリウム含有Ｐ
ＢＳ（−）を１昼夜以上反応させてウェル壁をブロッキ
ングしたものを用いた。

【００２１】被検希釈液をＥＬＩＳＡプレ−トウェルに
５０μｌずつ加え、４℃で１昼夜静置した。翌日、０．
０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（−）（ＰＢＳＴ）
にてウェルを４回洗浄後、二次抗体としてペルオキシダ
−ゼ共役化抗ｈＨＧＦポリクロ−ナル抗体を添加し、室
温にて２時間以上反応させた。二次抗体は、ヒトリコン
ビナントＨＧＦを免疫したウサギ血清よりプロテインＡ
カラムにてアフィニティ−精製し、過ヨウ素酸法にてペ
ルオキシダ−ゼを共役化して（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅ
ｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，２２，１０８４（１９７
４））作製した。

【００２２】インキュベ−ト後、ウェルをＰＢＳＴにて
６回洗浄し、発色液（０．０４％オルソフェニレンジア
ミン、０．０２％ 過酸化水素水含有リン酸クエン酸緩
衝液（ｐＨ５．０））を５０μｌ／ウェル添加して、室
温で数分−数十分放置した。適度な発色の得られた時点
で４．５Ｎ硫酸を加えて（５０μｌ／ウェル）反応を停
止し、イムノリ−ダ−（日本インタ−メッド社）にて４
９０ｎｍの吸光を測定した。検量線作成のために、予め
濃度を吸光係数から算出しておいたｈＨＧＦ標準品を０
−４０ｎｇ／ｍｌの範囲で段階希釈して使用した。な
お、ここで使用したＥＬＩＳＡ法がＨＧＦ分解産物を全
く検出しないことを、酵素消化後ｈＨＧＦの電気泳動の
バンドとの対応から確認した。

【００２３】図２に結果を示す。横軸は培養開始後の時
間を、縦軸は培養上清中のｈＨＧＦ（μｇ／ｍｌ）を表
している。培養上清中にヘパリン無添加群（●）では速
やかにｈＨＧＦ量が減少したのに対し、添加群（■）で
はｈＨＧＦの減少速度が極めて遅延することが確かめら
れた。グラフの傾きから、上清中ｈＨＧＦの減少速度ｔ
_1/2 は、ヘパリン無添加群で約１２時間、添加群で約１
３５時間と算出された。 以上の結果から、酸化多糖類
の一種であるヘパリンを培養液に添加することによっ
て、ｈＨＧＦのＣＨＯ細胞における分解が著しく抑制さ
れることが判明した。

【００２４】実施例３ ｈＨＧＦ産生ＣＨＯ細胞株のｈ
ＨＧＦ産生に及ぼすヘパリンの影響 実際のｈＨＧＦ産生株において培養液中に硫酸化多糖類
を加え、ｈＨＧＦの回収量を検討した。特開平３−２８
５６９３号公報に記載の方法に従って、ＣＨＯ細胞にｈ
ＨＧＦｃＤＮＡを含む発現ベクタ−を導入し、ｈＨＧＦ
を恒常的かつ安定して産生する形質転換ｈＨＧＦ生産株
ＫＢＥ、ＫＴ４−３およびＧＥ４３−１９を得た。ｈＨ
ＧＦ生産株を細胞濃度４×１０⁴ 個／ｍｌで５％ＦＢＳ
含有ｅＲＤＦ培地に懸濁し、１ｍｌずつ１２ウェルマイ
クロプレ−トに播種した。ここに最終濃度０−１０００
μｇ／ｍｌになるようヘパリン（シグマ社）を加えて培
養を開始し、一定時間後に上清の一部を採取してｈＨＧ
Ｆ特異的ＥＬＩＳＡ法（実施例２参照）にてｈＨＧＦ含
量を測定した。

【００２５】図３及び図４に結果を示す。図３は、ＫＢ
Ｅ細胞培養開始後２−３日毎に培地交換して上清を採取
し、培養１１日目まで経時的にｈＨＧＦ量を追跡したも
のである。横軸に培養日数を、縦軸に培養上清中のｈＨ
ＧＦ累積量をＥＬＩＳＡユニット（Ｕ；ＯＤ490 ×希釈
倍率）で示してある。本条件下では、培養４日目に細胞
はほぼ飽和密度に達し、以降徐々に細胞数を減じて培養
１３日目には細胞生存率は３０％以下であった。ヘパリ
ン添加群において１μｇ／ｍｌという低濃度の添加から
顕著なｈＨＧＦ量の上昇が認められ、１０−１００μｇ
／ｍｌヘパリン存在下でいずれの培養期間においても２
−３倍のＨＧＦ量の増加が明らかとなった。図４は、Ｋ
ＢＥ細胞が飽和密度に達した直後に培地交換をし、２日
後の上清を採取してｈＨＧＦ含量を測定したものであ
る。横軸はヘパリン濃度を、縦軸はｈＨＧＦ含量をヘパ
リン無添加群を１．０としたときの相対値で表す。ヘパ
リン添加群では、無添加群に比べて１０μｇ／ｍｌの添
加で既に２倍以上のｈＨＧＦ量の上昇が認められ、１０
００μｇ／ｍｌまでの添加において２−２．５倍のｈＨ
ＧＦ量上昇が示された。

【００２６】次に、３種類のｈＨＧＦ生産株において、
ヘパリン添加による上清中ｈＨＧＦ量の変化を測定した
結果を表１に示す。被検上清は、細胞飽和直後に培地交
換して２日後のものを測定した。ヘパリン無添加群のｈ
ＨＧＦ含量を１．００として、ヘパリン１０μｇ／ｍｌ
添加群のｈＨＧＦ含量を相対値として示した。いずれの
株においても、２−５倍のｈＨＧＦ回収量の増大が認め
られた。

【００２７】

【表１】

【００２８】以上の結果、ｈＨＧＦ産生細胞株の培養液
中にヘパリンを添加することにより、回収されるｈＨＧ
Ｆ量が数倍に増大することが判明した。

【００２９】実施例４ ｈＨＧＦ産生ＣＨＯ細胞株のｈ
ＨＧＦ産生に及ぼす各種硫酸化多糖類の影響 次に、ヘパリン以外の硫酸化多糖類についても同様の検
討を行った。ＫＢＥ株を４×１０⁵ 個／ｍｌ／ウェルで
１２ウェルマイクロプレ−トに播種し、培養５日後の上
清を採取して、上述のＥＬＩＳＡ法にて培養上清中のｈ
ＨＧＦ量を測定した。添加多糖類として、ヘパリン、ヘ
パラン硫酸、デキストラン（以上シグマ社）、デキスト
ラン硫酸及びコンドロイチン硫酸（以上生化学工業社）
を用いた。

【００３０】表２に結果を示す。ヘパリン、ヘパラン硫
酸、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のいずれに
おいてもｈＨＧＦ含量の増大が認められた。ヘパリン、
ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸では１０−１００μｇ
／ｍｌの添加範囲で最大効果が得られ、２倍ないしそれ
以上の上昇が示された。一方、コンドロイチン硫酸では
効果は認められるものの、その増大効果はやや低く、有
効必要用量も高用量側にシフトしていた。硫酸基を持た
ないデキストランでは、全く効果が認められなかった。

【００３１】

【表２】

【００３２】ＫＢＥ株は、マイクロキャリア−（ファル
マシア社）を用いた浮遊培養法によって数カ月以上ＨＧ
Ｆ産生を維持させることが可能であるが、その場合も、
硫酸化多糖類は同様の効果を数カ月間維持した。種々の
培養形態・培養スケ−ルの検討においても、硫酸化多糖
類の作用は付着培養（Ｔフラスコ、ディッシュ、ロ−ラ
−ボトルなど）・浮遊培養（マイクロキャリア−を用い
た、あるいは用いないスピナ−培養）に関わりなく、ま
た９６ウェルプレ−トのマイクロウェル培養から数リッ
トル以上の培養規模において、同様に認められた。

【００３３】以上の結果から、ＨＧＦ生産細胞の培養系
に種々の硫酸化多糖類を加えることにより、回収される
ＨＧＦ量が２倍ないし数倍に増大することが判明した。
この効果は低用量の硫酸化多糖類添加で生じ、培養の方
法や硫酸化多糖類の種類に関わりなく、培養数時間から
数カ月間の長期に渡って維持され、ＨＧＦ生産株で広く
認められた。この効果の原理は、硫酸化多糖類がその硫
酸基を介してＨＧＦを結合し、ＨＧＦ産生細胞上のレセ
プタ−（ｃ−Ｍｅｔ蛋白質及びヘパラン硫酸プロテオグ
リカンなど）へのＨＧＦ結合・消費・分解を著しく遅延
させるためと理解された。

【００３４】

【発明の効果】本発明の生産方法によれば、ヘパリン結
合性増殖因子の生産及び回収量を数倍に高めることが可
能であり、その結果、該増殖因子の生産におけるコスト
を著しく軽減できるようになった。本発明を基にヘパリ
ン結合性増殖因子を生産することにより、医療分野での
広範な利用が期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＨＯ細胞におけるｈＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ蛋白
質複合体の形成についてＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動の結果を示す、電子顕微鏡写真で表した図面であ
る。

【図２】ＣＨＯ細胞におけるｈＨＧＦの消費速度につい
て、ヘパリン存在下及び非存在下での比較を示した図面
である。

【図３】ｈＨＧＦ生産株における培養上清中のｈＨＧＦ
量について、ヘパリン存在下及び非存在下での比較を経
時的に示した図面である。

【図４】ｈＨＧＦ生産株における培養上清中のｈＨＧＦ
量について、ヘパリン添加用量の影響を示した図面であ
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘパリン結合性増殖因子をコードする遺
   伝子を導入して形質転換された細胞株を硫酸化多糖類ま
   たはそのアゴニストの存在下において培養し、その培養
   液からヘパリン結合性増殖因子を採取することを特徴と
   するヘパリン結合性増殖因子の生産方法。
2. 【請求項２】 硫酸化多糖類またはそのアゴニストが、
   硫酸基を含むプロテオグリカン、グリコサミノグリカ
   ン、グルカン、それらの誘導体またはそれらのアゴニス
   トから選ばれることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 ヘパリン結合性増殖因子をコードする遺
   伝子を導入して形質転換された細胞株の培養液中に硫酸
   化多糖類またはそのアゴニストを共存させることを特徴
   とするヘパリン結合性増殖因子の分解抑制方法。