JPH01146898A - 抗イデイオタイプ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、癌のスクリーニング及び診断用として有用な
新規な抗イデイオタイプ抗体に関する。

従来の技術 細胞の癌化に伴う糖鎖異常の基礎研究に基づき、糖鎖性
の癌抗原が腫瘍マーカーとして、近年脚光をあびている
。ことに下記式（１）、（２）、（３）、（４）、（５
）、（６） ＮｅｕＡｃ　α２−＋３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ（
３−ａＩＦｕｃ）β１→３Ｇａｌβ１→４ＧｌｅＮＡｃ
（３＝α１Ｆｕｃ）　　β１→３Ｇａｌβ１→４ＧＩＣ
−（１）Ｇａｌβ１−＋４ＧｌｃＮＡｃ（３←ａ　ＩＦ
ｕｃ）　　β１→３Ｇａｌβ１→、　　　　　　　　　
　　　　　　　　（２）Ｆｕｃαｌ−＊２Ｇａｌβ１−
＊４ＧｌｃＮＡｃ（３”αＩＦ　ｕｃ）　　β１−３Ｇ
ａｌβ１→　　　　　　　　　　（３）ＮｅｕＡｃ　ａ
　２−＋３．Ｇａｌβ１−＋３ＧｌｃＮＡｃ（４←αＩ
Ｆｕｃ）　β１→３Ｇａｌβ１→　　　　　　　　　（
４）ＮｅｕＡｃ　β２−＋３Ｇａｌβ１→３ＧＩｃＮＡ
ｃ（４←ａＩ　Ｆｕｃ）（６←ａ　２　ＮｅｕＡｃ）β
１→３Ｇａｌβ１−ＮｅｕＡｃ　β２→３Ｇａｌβ１−
＋３ＧｌｃＮＡｃ（６”α２ＮｅｕＡｃ）β１→３Ｇａ
ｌβ１−（６）で表わされる糖鎖構造は、極めて癌特異
性が高く、更に該糖鎖構造を有する抗原が癌患者の体液
中に極めて鋭敏に反映されており、又該糖鎖構造を認識
し得る特異抗体も確立されていることから、癌のスクリ
ーニング及び診断分野において、大きな期待カヨせられ
ている［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４６゜２６１９〜２
６２６、（１９８６）　　；　Ｂｌｏｃｈｅｍ。

Ｂｌｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍｍｕｎ、、　
　１００．　１５７８〜１５８６　　（１９８１）；　
Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２５９．４６７２〜４６８０　　（１９８４）；Ｊ。

Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５８．　１１７９３〜１１７
９７（１９８３）；　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４３．
５４８９〜５４９２　（１９８３）等〕。

しかしながら、上記式（１）で表わされる糖鎖構造（以
下「シアリルＬｅｘ−ｉＪという）、式（２）で表わさ
れる糖鎖構造（以下「Ｌｅｘ」という）、式（３）で表
わされる糖鎖構造（以下「フコシルＬｅｘ」という）、
式（４）でｉわされる糖鎖構造（以下［シアリルＬｅａ
Ｊという）、式（５）で表わされる糖鎖構造（以下［ジ
シアリルＬｅａＪという）又は式（６）で表わされる糖
鎖構造（以下「ジシアリルタイプ−１」という）に対す
る特異抗体は、上記報告のとおり、すでに確立されては
いるものの、該抗体を用いて癌抗原を測定する際に必要
な標識もしくは不溶化抗原または標準抗原（スタンダー
ド）として使用し得る所望の精製抗原が実際上ないこと
もあり、上記各式で表わされる癌抗原の測定は、その手
法上極めて制限されたものでしかなく、かつ感度及び精
度上に大きな問題を残している。即ち、シアリルＬｅｘ
−ｔ、Ｌｅｘ、フコシルＬｅｘ、シアリルＬｅａ、ジシ
アリルＬｅａ又はジシアリルタイプ−１を有する精製抗
原としては、上記報告の精製糖脂質が知られているが、
その精製工程は、極めて厖大かつ複雑であり、しかもそ
の結果として、わずかに構造決定に供し得る程度の収量
が得られているにすぎず、とうてい上記測定技術に供し
得ず、又糖脂質であるが為に、測定系の条件上、例えば
水溶性の面等からも、斯界の要求に添うものではない。

発明が解決しようとする問題点 かかる現状において、より高感度、高精度な、かつ操作
性に優れた１、シアリルＬｅｘ−ｉ。

Ｌｅｘ１フコシルＬｅｘ１シアリルＬｅａ１ジシアリル
Ｌｅ　　又はジシアリルタイプ−１に示される癌抗原の
免疫検定法による測定技術の開発が斯界で切望されてい
る。

更に、シアリルＬｅ　　−１、Ｌｅ　　、フコシルＬｅ
ｘ、シアリルＬｅ　　、ンンアリルＬｅ　　又はジシア
リルタイプ−１に加え、その自己抗体等の上記糖脂質に
関連する新しいタイプの腫瘍マーカーの開発、究明なら
びにその測定技術の確立、ひいてはより的確かつ早期の
癌のスクリーニング及び診断を可能とする技術の開発が
望まれている。

本発明は、斯かる技術的課題をよく解決するものであり
、上記所望の技術を達成する為の新規な抗イデイオタイ
プ抗体を提供することを目的とする。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、シアリルＬｅ　　−１ＳＬｅ　　。

フコシルＬｅｘ、シアリルＬｅａ、ジシアリルＬｅａ又
はジシアリルタイプ−１を認識する抗体を抗原とする新
規な抗イデイオタイプ抗体が提供される。

抗体は、その反応特異性（認識する抗原決定基）により
特定されるが、かかる特有の抗原結合部位の立体構造は
、その分子中の高度可変領域により形成される。

更に、上記特定の抗体に固有の抗原性（抗原構造）が知
られており（イディオタイプ）、上記高度可変領域から
なる構造がこれを決定している。

抗イデイオタイプ抗体は、かかるイディオタイプと反応
する抗体として知られている（Ｏｕｄｉｎ。

Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、Ａｃａｄ　、　　Ｓｃ１．　　（Ｐ
ａｒｉｓ）　、　２５７゜８０５　（１９６３）；板戸
信夫、臨床免疫、１７゜３５８〜３６５　（１９８５）
；　Ｊｅｒｎｅ、Ｎ、に、。

Ａｎｎ、Ｉ＋ｍｕｎｏ１．．１２５Ｃ，３７３（１９７
４）；　Ｂｒｏｗｎ、　Ｃ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ　、、Ｊ
、　　Ｉ＋ｍｕｎｏ１．　。

１２３．２１０２　　（１９７９）；　Ｊａｆｆｅｒｓ
、Ｇ。

Ｊ、　ｅｔ　ａｌ　、、Ｔｒａｎｓ’ｐｌａｎｔ　Ｐｒ
ｏｃ　、　、　　１５゜６４６　　（１９８３）　　；
　Ｌｅｖｙ　、　　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　　Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃ　、　　Ｆｅｄ、　　Ａｍ　、　　Ｓｏｃ、　
　Ｅｘｐ、　　Ｂｆｏｌ、、　　４２゜２６５０　　（
１９８３）　　；　Ｋｏｐｒｏｗｓｋｌ、　　Ｈ。

ａｔ　ａｌ　、　　、　　Ｐｒｏｃ　、　　Ｎａｔｌ　
、　　Ａｃａｄ　、　　５ｃＬＵＳＡ、８１．２１６　
（１９８４）等〕。

本発明の抗イデイオタイプ抗体は、特定癌抗原を認識す
ることで特定される抗体（以下、シアリルＬｅｘ−ｉの
構造を認識する抗体をＡｂｌ−（１）、ＬｅＸの構造を
認識する抗体をＡｂｌ−（２）、フコシルＬｅｘの構造
を認識する抗体をＡｂｌ−（３）　、シアリルＬｅａの
構造を認識する抗体をＡｂｌ−（４）、ジシアリルＬｅ
ａの構造を認識する抗体をＡｂｌ−（５）　、ジシアリ
ルタイプ−１を認識する抗体をＡｂｌ−（６）という）
を抗原とする抗イデイオタイプ抗体として特定され、従
って抗体Ａｂｌ−（１）　、Ａｂｌ−（２）　、Ａｂｌ
−（３）　、Ａｂｌ−（４）　、Ａｂｌ−（５）又はＡ
ｂｌ−（６）のいずれかの抗体とのみに特異反応性を有
する。

かかる本発明抗イデイオタイプ抗体には、抗体Ａｂｌ−
（１）、Ａｂｌ−（２）　、Ａｂｌ−（３）、Ａｂｌ−
（４）　、Ａｂｌ−（５）又はＡｂｌ−（６）の抗原結
合部位から離れた部位を認識しくα−タイプ）、従って
抗原（シアリルＬｅｘ−ｉ、Ｌｅｘ、フコシルＬｅｘ、
シアリルＬｅａ。

ジシアリルＬｅａ又はジシアリルタイプ−１）と抗体Ａ
ｂｌ−（１）　、Ａｂｌ−（２）　、Ａｂｌ−（３）　
、Ａｂｌ−（４）　、Ａｂｌ−（５）又はＡｂｌ−（６
）との反応を阻害しないタイプの抗イデイオタイプ抗体
が包含される。更に本発明抗イデイオタイプ抗体には、
Ａｂｌ−（１）　、Ａｂｌ−（２）　、Ａｂｌ−（３）
　、Ａｂｌ−（４）　、Ａｂｌ−（５）又はＡｂｌ−（
６）の抗原結合部位又はその近傍の部位を認識しくγ−
タイプ）、或いは抗原結合部位に相補的であって抗原（
シアリルＬｅｘ−ｉ、Ｌｅｘ、フコシルＬｅｘ、シアリ
ルＬｅａ、ジシアリルＬｅａ又はジシアリルタイプ−１
の糖鎖構造）と同一の構造を有しくβ−タイプ）、その
結果、抗原である各糖脂質と抗体Ａｂｌ−（１）　、Ａ
ｂｌ−（２）　、Ａｂｌ−（３）、Ａｂｌ−（４）　、
Ａｂｌ−（５）又はＡｂｌ−（６）との反応を濃度依存
的に阻害するタイプの抗イデイオタイプ抗体が包含され
る。

本明細書において糖、脂質及びそれらの結合様式等は、
ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ及びこの種の分野における通称名、
又は慣用に従い表示するものとし、その例を以下に挙げ
る。

ＮｅｕＡｃ；Ｎ−アセチルノイラミン酸Ｇａｌ；ガラク
トース Ｇｌｃ；グルコース ＧｌｃＮＡｃ　；Ｎ−アセチルグルコサミンＦ　ｕｃ　
；フコース 以下、本発明抗イデイオタイプ抗体の製造法ニつき詳述
する。

本発明抗イデイオタイプ抗体は、Ａｂｌ−（１）、Ａｂ
ｌ−（２）　、Ａｂｌ−（３）　、Ａｂｌ−（４）、Ａ
ｂｌ−（５）又はＡｂｌ−（６）を免疫抗原として使用
することにより、通常の抗体の製造方法に従って製造す
ることができる。免疫抗原として使用される抗体である
Ａｂｌ−（１）、Ａｂｌ−（２）　、Ａｂｌ−（３）、
Ａｂｌ−（４）、Ａｂｌ−（５）又はＡｂｌ−（６）は
、シアリルＬｅ　　−１、Ｌｅ　　、フコシルＬｅｘ、
シアリルＬｅ　　、ンンアリルＬｅ　　又はジシアリル
タイプ−１で示されるそれぞれの糖鎖構造を認識するも
の、即ちこれらの糖鎖構造乃至これを含む糖脂質等に特
異的に結合性を示すものである限り特に限定はないが、
その特異性の面からはモノクロナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ）抗体であるのが好ましい。かかる抗体は、例えば
シアリルＬｅｘ−ｉを認識する抗体Ａｂｌ−（１）、に
ついては文献Ｊ、Ｂ１ｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、２５９．１０５１１〜１０５１７（１９８
４）に記載の抗体ｒＦＨ−６Ｊとして公知であり、Ｌｅ
ｘを認識する抗体Ａｂｌ−（２）については、文献Ｊ、
　　Ｂｌｏｌ　、　　ＣｈｅＩｌ＋、、　２５９゜４６
８１〜４６８５　（１９８４）に記載の抗体ｒＦＨ−２
Ｊとして公知であり、フコシルＬｅｘを認識する抗体Ａ
ｂｌ−（３）については、文献Ｊ、Ｂ１ｏ１　、Ｃｈｅ
ｗ、、２５８．１１７９３〜１１７９７　（１９８３）
に記載の抗体ｒＡＨ−６Ｊとして公知であり、シアリル
Ｌｅａを認識する抗体Ａｂｌ−（４）については、文献
ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、、４３．５４８９〜５４９２　（
１９８３）に記載の抗体ｒｃＡ１９−９Ｊとして公知で
あり、ジシアリルＬｅａを認識する抗体としては文献Ｊ
。

Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｔｓ、、２６１．５４８７〜５４９５
（１９８６）に記載の抗体ｒＦＨ−７Ｊとして公知であ
り、さらにジシアリルタイプ−１を認識する抗体として
は文献Ｂ　１ｏｃｈｅｍ１ｓｔｒｙ、　２５　。

２８５９〜２８６６　（１９８６）に記載の抗体ｒＦＨ
−９Ｊとして公知である。又それら報告に準じて調製す
ることができる。

本発明抗体の好ましい製造法としては、本願特定の糖鎖
構造を認識する抗体、例えば上記抗体ＦＨ−６、ＰＨ−
２、ＡＨ−６、ＣＡ１９−９、ＦＨ−７又はＦＨ−９で
免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）を、哺乳動物
の形質細胞腫細胞と融合させハイブリドーマ（ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ）を作成し、これより上記抗体ＦＨ−６、Ｆ
Ｈ−２、ＡＨ−６、ＣＡ１９二９、ＰＨ−７又はＦＨ−
９を認識する所望の抗イデイオタイプ抗体を産生ずるク
ローンを選択し、該クローンより目的とする抗イデイオ
タイプモノクロナル抗体を得る方法を、例示できる。

上記方法において免疫抗原、すなわち抗体ＦＨ−６、Ｆ
Ｈ−２、ＡＨ−６、ＣＡ１９−９、ＦＨ−７又はＦＨ−
９で３疫される哺乳動物としては、特に限定されないが
、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮
して選択するのが好ましく、一般にはマウス、ラット等
が有利に使用される。

免疫は一般的方法により、例えば上記抗体ＦＨ−６、Ｐ
Ｈ−２、ＡＨ−６、ＣＡ１９−９、ＦＨ−７又はＦＨ−
９を哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内注射等により投
与することにより行なわれる。より具体的には、抗体Ｐ
Ｈ−６、ＦＨ−２、ＡＨ−６、ＣＡ１９−９、ＦＨ−７
又はＦＨ−９をＰＢＳ等で適当濃度に希釈し、これを必
要により牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等の通常の担体に
結合させた後、動物に２〜１４日毎に数回投与し、総投
与量が約１〜１００μｇ／動物程度になるように投与す
るのが好ましい。又、該投与に際しては、通常のアジュ
バントを併用することもできる。

免疫細胞としては、上記免疫原最終投与の約３日後に摘
出した牌細胞を使用するのが好ましい。

また上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺
乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々の細
胞株、例えばｐ　３　（ｐ　３／Ｘ６３−Ａｇ　８）［
Ｎａｔｕｒｅ、２５６，４９５〜４９７（１９７５）　
）　、Ｐ　３−Ｕ　１　（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｌｃｓ
ｌｎ　　ＭｌｅｒＯｂｌｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、８１．　１−７　（１９７８））　、Ｎ５
−１　（Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、６．５１１〜５１９　（１９７６）
）、ＭＰ　Ｃ−１１（Ｃｅ１１．８．４０５〜４１５（
１９７６）］　、５Ｐ２１０　［Ｎａｔｕｒｅ、２７６
゜２６９〜２７０　（１９７８））　、ＦＯ［Ｊ。

Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、、　３５．　１〜２１
　（１９８０）　）Ｘ６３．　６．　５．　３．　　（
Ｊ、　　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．．１２３゜１５４８〜１５
５０　（１９７９））　、５１９４（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅ
ｄ、、１４８．３１３〜３２３（１９７８））等や、ラ
ットにおけるＲ２１０（Ｎａｔｕｒｅ、２７７．１３１
〜１３３　（１９７９）ｉ等の骨髄腫細胞等が使用され
る。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、基本的
には、公知の方法例えばマイルスタイン（Ｍｌｌｓｔｅ
ｌｎ　）らの方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、Ｖｏｌ、　７３．　ｐｐ３　（１９８１）　３
等に準じて行ない得る。より具体的には上記融合反応は
、例えば融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で行な
われる。融合促進剤としては、通常用いられるもの、例
えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィ
ルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率
を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加
使用することもできる。免疫細胞と形質細胞腫細胞との
使用比は、通常の方法と変りがなく、例えば形質細胞腫
細胞に対し、免疫細胞を約１−１０倍程度用いればよい
。上記融合時の培地としては、例えば上記形質細胞腫細
胞株の増殖に使用されるようなＲＰＭＩ−１６４０培地
、ＭＥＭ培地、その他この種の細胞培養に使用される通
常の各種培地を利用でき、通常は牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ
）等の血清補液を抜いておくのがよい。融合は、上記免
疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を上記培地内でよく
混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば
平均分子量１０００〜６０００程度のものを、通常培地
に約３０〜６０Ｗ／Ｖ％の濃度で加えて混ぜ合せること
により行なわれる。以後、適当な培地を逐次添加して遠
心し、上清を除去する操作を繰返すことにより所望のハ
イブリドーマが形成される。

得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充
分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得
られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目
的とする抗イデイオタイプ抗体の産生株の検索及び単一
クローン化が行なわれる。

該産生株の検索は、例えばＥＬＩ　ＳＡ法（Ｅｎｇｖａ
ｌｌ、　Ｅ、、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、７０．４
１９〜４３９　（１９８０））　、プラーク法、スポッ
ト法、凝集反応法、オクテロニイ−（Ｏｕｃｈｔｅｒｌ
ｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）法等の
一般に抗体の検出に用いられている種々の方法〔［ハイ
ブリドーマ法とモノクロナール抗体」、■Ｒ＆Ｄプラン
ニング発行、Ｉ）Ｉ）３０〜５３．昭和５７年３月５日
〕に従って行なわれる。

上記目的の抗イデイオタイプ抗体の検出は、より具体的
には抗体ＦＨ−６、ＦＨ−２、ＡＨ−６、ＣＡ１９−９
、ＦＨ−７又はＦＨ−９と特異反応性を有し、他の同種
抗体には反応性を示さない抗体として確認され、かかる
検出に際しては、抗体ＦＨ−６、ＦＨ−２、ＡＨ−６、
ＣＡ１９−９、ＦＨ−７又はＦＨ−９は精製されたもの
を使用するのが有利である。

なお、本発明者によって既に確立された本発明の抗イデ
イオタイプ抗体を使用すれば、例えば免疫沈降法、アフ
ィニティークロマトグラフィー等により、より簡便に精
製された抗体ＦＨ−６、ＦＨ−２、ＡＨ−６、ＣＡ１９
−９、ＦＨ−７又はＰＨ−９を得ることができる。また
前記の免疫抗原としても上記精製された抗体ＦＨ−６、
ＦＨ−２、ＡＨ−６、ＣＡ１９−９、ＦＨ−７又はＰＨ
−９を使用するのが有利である。

かくして本発明抗イデイオタイプ抗体を産生ずる所望の
ハイブリドーマが得られ、又之等からは、更に必要によ
り、シアリルＬｅｘ−ＬとＦＨ−６、ＬｅＸとＦＨ−２
、フコシルＬｅｘとＡＨ−６、シアリルＬｅ　　とＣＡ
１９−９、ジシアリルＬｅａとＦＨ−７又はジシアリル
タイプ−１とＦＨ−９との反応に対する阻害活性に基づ
いた夫々のタイプの抗イデイ、オタイブ抗体を産生ずる
ハイブリドーマを選別することもできる。之等のハイブ
リドーマは、通常の培地で継代培養でき、また液体窒素
中で容易に長期間保存可能である。

上記で得られた本発明抗体を産生ずるハイブリドーマか
らの目的の本発明抗イデイオタイプ抗体の採取は、該ハ
イブリドーマを常法に従って培養し、その培養上清とし
て、或いはハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動
物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採
用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適し
ており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

また上記により得られる本発明抗イデイオタイプ抗体は
所望により、塩析、吸収法、ゲル沖過法、アフイニイテ
イクロマトグラフイー等の通常の精製手段により極めて
簡便に精製することができる。

かくして得られる本発明抗イデイオタイプ抗体の使用に
よれば、癌抗原たる前記シアリルしｅｘ−ｉ、ＬｅＸ、
フコシルＬｅｘ、シアリルＬｅａ。

ジシアリルＬｅ　　又はンンアリルタイブ−１、及びそ
の特異抗体、ことに体液中に存在するそれらを、極めて
高感度かつ高精度に測定することができる。従って本発
明抗イデイオタイプ抗体の提供によれば１、極めて早期
から的確な、癌のスクリーニング及び診断を行い得る。

本発明抗イデイオタイプ抗体を使用する上記スクリーニ
ング及び診断は、基本的には、通常の免疫検定法、例え
ばＥＴＡ法、酵素免疫測定法（ＥＴＡ）、凝集法、フロ
ーサイトメトリー法（ＦＣＭ）等に従うことができ、之
等各免疫検定法における具体的操作、手順等も一般に採
用されているそれらと特に異ならず、例えば公知の競合
法、サンドイツチ法、フローサイトメーターを用いる方
法等に準じることができる。

上記において検体として用いられる体液としては、例え
ば血液、細胞組織液、リンパ液、胸水、腹水、羊水、胃
液、尿、膵液、髄液、唾液等を例示できる。之等のうち
では、血液、特に血清又は血漿が好ましい。

また上記検定法において不溶化法を採用する場合は、常
法に従い測定系における抗原又は抗体は、不溶性担体に
化学的又は物理的に反応させることにより不溶化される
。ここで不溶性担体としては、例えばセルロース粉末、
セファデックス、セファロース、ポリスチレン、ｐ紙、
カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹脂、デキス
トラン、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ
、ナイロン、ガラスピーズ、絹、ポリアミン−メチルビ
ニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体
、エチレン−マレイン酸共重合体等を使用できる。不溶
化は、共有結合法としてのジアゾ法、ペプチド法（酸ア
ミノ誘導体法、カルボキシクロリド樹脂法、カルボジイ
ミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート
誘導体法、臭化シアン活性化多糖体性、セルロースカル
ボナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法等）、アル
キル化法、架橋試薬によ纂担体結合法（架橋試薬として
ゲルタールアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート
等を用いる）　、Ｕｇ１反応による担体結合法等の化学
的反応；或いはイオン交換樹脂のような担体を用いるイ
オン結合法；ガラスピーズ等の多孔性ガラスを担体とし
て用いる物理的吸着法によって行なわれる。尚、凝集法
を採用する場合は、本発明抗体を、赤血球もしくはラテ
ックス等の通常の凝集テストに使用される粒子に、上記
に従い吸着（感作）したものが使用される。

測定系における抗原又は抗体の標識体としては、それら
を、通常の放射性物質、酵素標識物質、螢光物質等の各
種標識剤で標識化したものが用いられる。該標識剤とし
ての放射性物質としては、？２５１等の放射性ヨード等
を、螢光物質としては、フルオレツセイン番イソチオシ
アナート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンΦイソ
チオシアナート（ＴＲＩＴＣ）　、置換ローダミン・イ
ソチオシアナート（ＸＲＩＴＣ）　、ローダミンＢ＠イ
ソチオシアナート、ジクロロトリアジンフルオレツセイ
ン（ＤＴＡＦ）等を、酵素標識物質としては、パーオキ
シダーゼ（ＰＯＸ）　、マイクロパーオキシダーゼ、キ
モトリプシノーゲン、プロカルボキシペプチダーゼ、グ
リセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、アミラーゼ
、ホスホリラーゼ、ＤＮＡアーゼ、ＲＮＡアーゼ、アル
カリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等をそれ
ぞれ挙げることができる。これらによる標識方法もまた
常法に従うことができる（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ　、　　Ｃ
ｈｅｍ、　。

２５４．９３４９〜９３５１　（１９７９）：Ｎａｔｕ
ｒｅ、１９４．４９５　（１９６２）；螢光抗体法、医
化学実験講座Ｎｏ、４，２６３〜２７０：Ａｃｔａ　、
　　Ｅｎｄｏｃｒｌｎｏｌ　、　５ｕｐｐ１．　、　１
６８゜２０６　（１９７２）　　：　Ｐｒｏｃ　、　Ｎ
ａｔ、　Ａｃａｄ　。

Ｓｃ１．、ＵＳＡ、−Σ７，７１３　（１９６７）等参
照〕。

上記測定系における反応も、通常のこの種の免疫反応と
同様に実施しうる。その際測定系に利用される溶媒とし
ては、反応に悪影響を与えない通常のもの、例えばクエ
ン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸
緩衝液等を好ましいものとして例示できる。また測定の
際の免疫反応条件は特に制限はなく、通常のこの種測定
法と同様のものとすることができる。即ち該免疫反応は
一般に４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃の温度条件
下、約１〜４０時間を要して行なわれる。免疫反応終了
後の結合体及び遊離体（Ｂ−Ｆ）の分離も公知の方法に
従い、例えば不溶化法を採用したときは、遠心分離、炉
別、洗浄、デカンテーション等の分離手段により固相一
液相を分離することができる。その他の場合には例えば
デキストラン−活性炭法、第２抗体法等の常法に従えば
よい。

本発明抗イデイオタイプ抗体の利用による、上記測定法
の特徴点をより具体的に説明する。

（１）本発明抗イデイオタイプ抗体には、抗体ＦＨ−６
のみを認識する抗イデイオタイプ抗体、抗体ＦＨ−２の
みを認識する抗イデイオタイプ抗体、抗体ＡＨ−６のみ
を認識する抗イデイオタイプ抗体、抗体ＣＡ１９−９の
みを認識する抗イデイオタイプ抗体、抗体ＦＨ−７のみ
を認識する抗イデイオタイプ抗体又は抗体ＰＨ−９のみ
を認識する抗イデイオタイプ抗体の６種の抗イデイオタ
イプ抗体が包含される。従って、体液中に存在する癌抗
原、即ち、前記シアリルＬｅ　　−１、Ｌｅ　　、フコ
シルＬｅ、ノアリルＬｅａ、ジシアリルＬｅａ又はジシ
アリルタイプ−１に対する自己抗体の測定系においてそ
の特異抗体として極めて有利に使用し得る。抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体又はプロティンＡを使用する一般の自己抗体測定
系においては、常に非特異的反応が多いので感度が低く
検体量が多量を要するという欠点がある。これに対して
本発明抗体の使用によれば、非特異的反応がないので有
利であり、もちろん直接法ことに簡便な凝集法による測
定をも可能とする。更に螢光標識された本発明抗体の使
用により、これを通常のフローサイトメトリーに適用す
ることによって、上記自己抗体産生細胞の測定ないしは
分画を行い得る。

（２）シアリルＬｅｘ−ｉとその抗体ＰＨ−６、Ｌｅｘ
とその抗体ＦＨ−２、フコシルＬｅｘとその抗体ＡＨ−
６、シアリルＬｅａとその抗体′　ＣＡ１９−９、ジシ
アリルＬｅａとその抗体ＦＨ−７又はジシアリルタイプ
−１とその抗体ＦＨ−９との反応を濃度依存的に阻害す
るタイプの本発明の各抗体は、癌抗原又はその抗体の測
定系において、精製抗原として使用でき、所望の不溶化
抗原、標識抗原ないしは、スタンダードとして、良好に
使用することができる。かかる測定系における精製抗原
の提供によって、その感度及び精度が著しく向上し、か
つ従来なし得なかった、標識抗原を使用する競合法によ
る測定をも可能とする。

（３）シアリルＬｅｘ−ｉとその抗体ＦＨ−６、Ｌｅｘ
とその抗体ＦＨ−２、フコシルＬｅｘとその抗体ＡＨ−
６、シアリルＬｅａとその抗体ＣＡ１９−９、ジシアリ
ルＬｅａとその抗体ＦＨ−７又はジシアリルタイプ−１
とその抗体ＦＨ−９との反応を阻害しないタイプの本発
明抗イデイオタイプ抗体は、抗体を用いる抗原の測定系
において、抗体の増幅即ち、抗体に特異的な第２抗体と
して使用でき、その感度を著しく向上させることができ
る。

上記に例示された本発明抗イデイオタイプ抗体の特徴点
に基づいた測定系は、適宜設定し得るが、例えば次の方
法によることができる。

即ち、糖鎖構造含有癌抗原の測定系としては、例えば■
標識抗イディオタイプ抗体、被検検体又は標準物質、及
び免疫原とした抗体を反応させた後、抗ラット抗体によ
る二抗体法に供する測定系、■固相化抗イディオタイプ
抗体、被検検体又は標準物質、及び標識された免疫原と
した抗体を反応させた後、固相化競合法に供する測定系
、■抗原ビーズ、被検検体又は標準物質、及び標識され
た免疫原とした抗体を反応させた後、固相化競合法に供
し、次いで免疫反応を阻害しないタイプの標識抗イデイ
オタイプ抗体を用いて増幅する測定系を採用することが
できる。

また、糖鎖構造含有癌抗原に対する自己抗体の測定系と
しては、例えば■固相化抗イディオタイプ抗体及び被検
検体又は標準抗体を反応させた後、更に標識化抗イデイ
オタイプ抗体を反応させるサンドイツチ法に供する測定
系、■固相化抗イディオタイプ抗体及び被検検体を反応
させた後、更に標識抗ヒトＩｇＧを、反応させるサンド
イツチ法に供する測定系、■標識抗体（免疫原）、抗イ
デイオタイプ抗体及び被検検体又は標準抗体を反応させ
た後、抗ラットＩｇＧによる２抗体法でＢ／Ｆ分離する
液相競合法に供する測定系、■固相化抗体（免疫原）、
標識抗イデイオタイプ抗体及び被検検体又は標準検体を
反応させる競合法に供する測定系を採用することができ
る。

上記測定法を実施するのに特に便利な方法は、本発明抗
イデイオタイプ抗体を必須成分として含有して調製され
た上記測定用のキットを使用する、方法である。このキ
ットによれば、癌のスクリーニング及び診断を、容易に
行なうことができる。

かかるキットにおいてその抗体試薬には、グリセロール
やウシ血清蛋白のような安定化剤及び／又は保存剤を添
加することができる。好ましくは、この抗体試薬は凍結
乾燥したものであり、キットには水溶性もしくは水と混
和しうる溶媒を含有させることかできる。更にこの抗体
試薬には、再構成された試薬系を一定のｐＨに保つため
の緩衝液及び／又は使用前に試料が悪化するのを防ぐた
めの保存剤及び／又は安定剤を添加することができる。

緩衝液はキット試薬の必須成分とは考えられないが、本
発明の測定法を実施する際に、ｐＨを４〜８程度とする
ものを添加するのが好ましい。

また再構成剤は好ましくは水を含んだものであるが、水
の一部又は全部を水と混和し得る溶媒で置き換えること
もできる。水と混和し得る溶媒としては当業者に周知で
あり、例えばグリセリン、アルコール類、グリコール類
、グリコールエーテル類等を使用できる。

発明の効果 （１）本発明によれば、癌診断分野において優れた特性
を有する癌抗原、即ち、シアリルＬｅｘ−ｉ、Ｌｅｘ、
フコシルＬｅｘ、シアリルＬｅａ、ジシアリルＬｅａ又
はジシアリルタイプー１を認識する抗体を抗原とする抗
イデイオタイプ抗体が提供される。

（２）本発明抗イデイオタイプ抗体を用いるときには、
該抗イデイオタイプ抗体の上記癌抗原の自己抗体に対す
る特異性が高いため、該自己抗体を極めて有利に測定で
きる。

（３）該癌抗原とその抗体との反応を濃度依存的に阻害
するタイプの本発明抗イデイオタイプ抗体は精製抗原と
して好適に使用できるので、該癌抗原又はその抗体の測
定系における感度、精度を著しく向上させることができ
る。

（４）該癌抗原とその抗体との反応を阻害しないタイプ
の本発明抗イデイオタイプ抗体は、抗体を用いる該癌抗
原の測定系において、抗体の増幅即ち抗体に特異的な第
二抗体として使用できるので、測定感度を著しく向上さ
せることができる。

（５）従って、かかる本発明抗イデイオタイプ抗体の利
用によれば、該癌抗原及びその自己抗体ないしは該抗体
産生細胞を高感度、高精度かつ簡便に測定することがで
き、癌のスクリーニング及び診断を極めて有利に行い得
る。

（６）更に、本発明抗イデイオタイプ抗体を利用すれば
、上記特定の糖鎖構造を認識する抗体を、その結合特異
性に基づき、簡便に且つ特異的に精製することができる
。

実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例、参考
例及び試験例を挙げる。

実施例１　抗イデイオタイプ抗体の製造■　抗イデイオ
タイプ抗体の免疫原として抗体ＦＨ−６（Ｆｕｋｕｓｈ
ｌ、　Ｙ、、Ｎｕｄｅｌｍａｎ　、　　Ｅ、。

Ｌｃｖｅｒｙ　、　　Ｂ、　　Ｓ、、ａｎｄ　Ｈａｋｏ
ｍｏｒｉ　、　　Ｓ、、Ｊ。

Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５９．１０５１１〜１０５１
７゜１９８４）の１００μｇを含有するリン酸緩衝食塩
水（ｐＨ７，４）５００μＱの溶液を等量のフロイント
　コムブリート　アジュバント（Ｆ　ｒｅｕｎｄ　ｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ、　Ｄ　Ｉ　Ｆ　Ｃ０
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｌｔ　Ｍｉｃｈ
ｌｇａｎ　ＵＳＡ）と混和し、懸濁させた。得られた懸
濁液を上記ＰＨ−６２０μｇ含有分だけ取り、ウィスタ
ー系ラットに皮下投与した。以後、２週間目に同波をＦ
Ｈ−６２０μｇ含有分投与し、更に２週間後、生理食塩
水に溶解したＦＨ−６２００μｇ含有分を皮下に投与し
た。最終投与の３日後に牌臓を摘出し、牌細胞をＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地で３回洗浄した。

マウス骨髄腫細胞株Ｐ　３　Ｕ　１　（Ｃｕｒｒｅｎｔ
’ｒｏｐｔｃｓ　ｉｎ　　Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ　
ａｎｄ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｔｏｇｙ　。

８１．１〜７．１９７８）を同様に洗浄後、その４Ｘ１
０７個と上記牌細胞２Ｘ１０Ｂ個とを５０ｍＱ遠心管に
入れ混合した。２００Ｇ、５分間遠心後、上清をパスツ
ールピペットで除去した。３７℃に保温したポリエチレ
ングリコール１５００（ベーリンガーマン／％イム山之
内）５０Ｗ／Ｖ％を含むＲＰＭＩ−１６４０溶液２ｍＱ
を１分間かけて滴下し、次いで、３７℃に保温したＰＣ
８を含まないＲＰＭＩ−１６４０溶液１　ｍＱを加え、
１分間放置後、さらに２ｍＱを加え、２分放置後４ｍＱ
を加える。４分放置後、３７℃に保温した１５％ＦＣ３
，０，０５ｇ力価／Ｑ−硫酸ストレプトマイシン、６０
０００　Ｕ／Ｑ−ペニシリンＧカリウム、５４ｍｇ／Ｑ
−ゲンタマイシン、及び１ｍＭピルベートを含有するＲ
ＰＭＩ−１６４０（以下これを［完全ＲＰＭＩＪという
）を８ｍＱ加え、２００Ｇで５分間遠心分離した。上清
を除去し、３７℃に保温した完全ＲＰＭＩに牌臓細胞２
Ｘ１０６個／ｍＱとなるように懸濁し、２４穴マイクロ
プレート（コースタ−社）に０．１ｍＱづつ接種し、３
７℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で培養した。

２４時間後、１．０Ｘ１０’Ｍヒボキサンチン、４．０
ＸＩＯ°７Ｍアミノプリテン、 １．６Ｘ１０’Ｍチミジンを含む完全ＲＰＭＩ培地（以
下ｒＨＡＴ培地」という）０．１ｍＱを各ウェルに添加
した。以後、上清の半分を第３、第５、第７日口にそれ
ぞれ新しいＨＡＴ培地に代え、第９日口に同様に上清の
半分を１．ＯＸｌｏ−４Ｍヒポキサンチン及び１．６Ｘ
１０’Ｍチミジンを含む完全ＲＰＭＩ培地（以下ｒＨＴ
培地」という）に代えた。同様に第１２．１５．１８．
２１日目に上清の半分をＨＴ培地に代え、２４日目に上
清の半分を完全ＲＰＭＩ培地に代えた。以後、この完全
ＲＰＭＩ培地で増殖維持した。

かくして得られるハイブリドーマを、限界希釈法により
クローニングした。即ちハイブリドーマ２．５Ｘ１０個
／　ｍＱ　ＳＢ　ａｌｂ　／　Ｃ系マウス胸線細胞４Ｘ
１０８個／　ｍＱとなるように完全ＲＰＭＩ培地に調製
し、これをハイブリビーフ５個／ウェルとなるように９
６ウエルのプレートに播き、培養した。増殖してくるハ
イブリドーマを更に同様にハイブリドーマ０．５個／ウ
ェルとしてクローニングした。

目的の抗イデイオタイプ抗体を産生ずるクローンの検索
は、ＰＨ−６、抗体ＡＭ−６（Ａｂｅ。

Ｋ　、、Ｍｃｋｌｂｂｉｎ、　Ｊ　、　Ｍ、、ａｎｄ　
Ｈａｋｏｍｏｒｌ、　Ｓ　、、　Ｊ　。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５８．　１１７９３〜１１７９
７゜１９８３）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をそれ
ぞれプレートに不溶化した９６穴プレートの各ウェルに
、クローニング中の培養上清を５０μＱと、リン酸緩衝
液５０μＱとを入れ、室温で振盪下で１時間反応させた
。反応後、蒸留水で未反応物を洗浄除去し、パーオキシ
ダーゼ標識抗ラットＩｇＧ（カッベル社）の６０００倍
希釈溶液を１００μＱづつ各ウェルに入れ、室温で振盪
下で３０分間反応させた。さらに、未反応物を蒸留水で
洗浄除去し、０．０１％Ｈ２Ｏ２溶液中に２、　５ｍｇ
／ｍＱで溶解した０−フェニレンジアミン溶液を１００
μＱづつ入れ、室温で１５分間静置反応した後、２Ｎ　
　Ｈ２８０＆を１００μＱ加え反応を停止させた。発色
したマイクロプレートをマイクロリーダーｒ　Ｔ　１ｔ
ｅｒｔｅｋ　ＭｕｌｔｉｓｋａｎＯＭ　ＣＣｌ　（Ｆｌ
ｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ　Ｉｎｃ、　（ＵＳＡ
）社製）を用いて４９２ｎＩ！ｌで測定した。

上記方法によって、ＦＨ−６のみに陽性反応（結合性）
を示す本発明抗体産生クローンを選別し、更に以下の阻
害系スクリーニングに付した。

すなわち当該クローンの培養上清５０μＱと１２５■標
識ＦＨ−６の２００．ｃｌ　　（５００００ｃｐｍ）と
を振盪下、室温で１時間反応させ、抗原としてのＰＣ−
９ビーズを１ヶ入れ、振盪下、室温で１時間反応させる
ことにより、ビーズの放射能カウントによってＰＨ−６
と抗原との結合阻害活性を試験した。培養上清を使用し
ない系をコントロールとして、その阻害活性により、ク
ローンを選別した。かかる両スクリーニング系及び上記
限界希釈法により、ＦＨ−６と抗原（シアリルＬｅｘ−
ｉ）との反応を阻害しないタイプの本発明抗体を産生ず
る２クローン（クローンＮα：　０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−６
Ａ及び０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−６０）及び上記阻害するタイ
プの本発明抗体を産生ずる３クローン（クローンＮｏ、
：　０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−６Ｄ、　　０ＡＬ−ＡＩ　ｄ
−６Ｅ及び０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−６Ｆ）の所望のハイブリ
ドーマを得た。尚代表例として、ハイブリドーマ０ＡＬ
−ＡＩ　ｄ−６Ｆをアメリカンタイプ　カルチャー　コ
レクションに寄託した（ＡＴＣＣ記号　ＨＢ　　９２０
７）。

以下側タイプを代表して、０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−６Ａ及び
０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−６Ｆにつき述べる。尚、上記阻害系
のスクリーニングにおいて抗原として使用したＰＣ−９
ビーズは、シアリルＬｅ　　−ｔを表現していることが
知られている癌細胞株ＰＣ−９（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ
、、４２．　６０１〜６０８（１９８２））の培養上清
を過塩素酸（ＰＣＡ）抽出後、セファロースＣＬ−６Ｂ
に付して得られた糖蛋白をビーズに、吸着（不溶化）さ
せて得た。

■　上記■で得たりｏ−ンＮａ０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−６
Ａ又は０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−６Ｆを、完全ＲＰＭＩ培地に
て５％炭酸ガスインキュベータ中で、３７９Ｃにて４８
時間培養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１
０分）して、目的のモノクロナル抗体（以下これを順次
ｒＡＩｄ−６ＡＪ及びｒＡＩｄ−６ＦＪという）を含む
培養上清を夫々得た。

尚、両抗体共にＩｇＧｚａクラスに属していた。

これは、ラット　モノクロナル　タイピングキラ）　（
Ｍｌｌｅｓ　　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により確認
された。

■　前記■で得たクローンＮｏ、ＡＩｄ−６ＡまたはＡ
ｌｄ−６ＦのＩ　Ｘ　１０７個をＲＰＭＩ−１６４０培
地０．５ｍＱに懸濁させ、ヌードマウス、又はヌードラ
ットに腹腔的投与した。２〜３週間後、蓄積した腹水を
採取し、Ａｌｄ−６ＡまたはＡＩｄ−６Ｆを含む腹水を
得た。この抗体濃度は約０．２〜５　ｍｇ　／　ｍｏで
あった。上記及び前記■で得た培養上清、又は腹水をＰ
ＢＳで２倍に希釈したものを抗体ＦＨ−６を固相化した
セファロース（Ｂ　ｒ　ＣＮ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　５
ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）を
使用して作成したもの）のアフイニイテイクロマトグラ
フイーに付すことにより夫々、精製ＡＩｄ−６Ａ及びＡ
ｌｄ−６Ｆを得た。

実施例２　抗イデイオタイプ抗体の製造■　抗イデイオ
タイプ抗体の免疫原として抗体ＦＨ−２（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

、１００．１５７８〜１５８６　（１９８１）；Ｊ。

Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｗ、、２５９．４６７２〜４６８０
（１９８４）の１００μｇを含有するリン酸緩衝液食塩
水（ｐＨ７，４）５００μＱの溶液を等量のフロイント
　コムブリート　アジュバント（Ｆ　ｒｅｕｎｄ　ｃｏ
ｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ、　Ｄ　Ｉ　Ｆ　Ｃ０
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ　Ｍｉｅｈ
ｉｇａｎ　ＵＳＡ）と混和し、懸濁させた。得られた懸
濁液を上記ＦＨ−２２０μｇ含有分だけ取り、ウィスタ
ー系ラットに皮下投与した。以後、前記実施例１の■と
同様に免疫し、更に細胞融合を行いハイブリドーマを得
、限界希釈法によりクローニングした。

目的の抗イデイオタイプ抗体を産生ずるクローンの検索
は、精製ＰＨ−２、精製マウスＩｇＭをそれぞれプレー
トに不溶化した９６穴プレートの各ウェルに、クローニ
ング中の培養上清を５０μＱと、リン酸緩衝液５０μＱ
とを入れ、室温で振盪下で１時間反応させた。以後、実
施例１の■と同様にして、ＦＨ−２のみに陽性反応（結
合性）を示す本発明抗イデイオタイプ抗体産生クローン
を選別し、更に以下の阻害系スクリーニングに付した。

すなわち当該クローンの培養上清５０μＱと１２５　ｌ
標識ＦＨ−２の２００μＱ　　（５００００ｃｐｍ）と
を振盪下、室温で１時間反応させ、うち２００μＱを抗
原としてのＰＣ−７細胞を固定したマイクロプレートに
入れ、振盪下、室温で２０分間反応させることにより、
細胞固定マイクロプレートに結合した放射能カウントの
測定によってＦＨ−２と抗原との結合阻害活性を試験し
た。培養上清を使用しない系をコントロールとして、そ
の阻害活性により、クローンを選別した二かかる両スク
リーニング系及び上記限界希釈法により、ＦＨ−２と抗
原（Ｌ　ｅ　Ｘ）との反応の阻害が弱いタイプの本発明
抗イデイオタイプ抗体を産生ずる１クローン（クローン
Ｎｏ、：　０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−２Ｘ４２）及び上記阻
害が強いタイプの本発明抗イデイオタイプ抗体を産生ず
る４クローン（クローンＮｏ、：０ＡＬ−Ａｌｄ−２Ｘ
１６，０ＡＬ−Ａｌｄ−２Ｘ２４，０ＡＬ−Ａｌｄ−２
Ｘ２６及び０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−２Ｘ５０）の所望のハ
イブリドーマを得た。尚代表例として、ハイブリドーマ
０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−２Ｘ２６をアメリカン　タイプ　カ
ルチャー　コレクショ、ンに寄託した（ＡＴＣＣ記号Ｈ
Ｂ　　９４４７）。また、上記阻害系のスクリーニング
において抗原として使用したＰＣ−７細胞固定マイクロ
プレートは、Ｌｅｘの糖鎖構造を表現していることが知
られている癌細胞株ＰＣ−７（早田義博他、医学のあゆ
み、９０．３６．１９７４、大谷高義他、肺癌、１６．
６７．１９７６）の細胞とポリＬ−リジンをグルタルア
ルデヒドによってプレートに不溶化させて得た。

■　上記■で得たクローンＮｏ、０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−
２Ｘ４２．０ＡＬ−Ａｌｄ−２Ｘ１６．０ＡＬ−ＡＩ　
ｄ−２Ｘ２４．０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−２Ｘ２６、又は０
ＡＬ−ＡＩ　ｄ−２Ｘ５０を、完全ＲＰＭＩ培地にて５
％炭酸ガスインキュベータ中で、３７℃にて４８時間培
養した。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）
して、目的のモノクローナル抗体（以下これを順次ｒＡ
Ｉｄ−ＩＪ、ｒＡＩｄ−２Ｊ、ｒＡＩｄ−３Ｊ、ｒＡＩ
ｄ−４Ｊ、及びｒＡＩｄ−５Ｊという）を含む培養上清
をそれぞれ得た。

尚、０ＡＬ−ＡＩｄ−２Ｘ１６．０ＡＬ−Ａｔｄ−２Ｘ
２４．０ＡＬ−ＡＩｄ−２Ｘ２６はＩｇ０１クラスに、
又０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−２Ｘ４２．０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−２
Ｘ５０はＩｇＧ２ａクラスに属していた。これは、ラッ
ト　モノクローナル　タイピングキット（Ｍｉｌｅｓ　
　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により確認された。

■　前記■で得たクローンＮｏ、０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−
２Ｘ４２．０ＡＬ−Ａｌ　ｄ−２Ｘ１６．０ＡＬ−ＡＩ
　ｄ−２Ｘ２４．０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−２Ｘ２６、又は
０ＡＬ−Ａｌ　ｄ−２Ｘ５０（７）ＩＸＩＯ７個をＲＰ
ＭＩ−１６４０培地０．５ｍＱに懸濁させ、ヌードマウ
ス、又はヌードラットに腹腔内投与した。

２〜３週間後、蓄積した腹水を採取し、ＡＩｄ−１、Ａ
ｌｄ−２、Ａｌｄ−３、Ａｌｄ−４又はＡＩ　ｄ−５を
含む腹水を得た。この抗体濃度は約０．２〜５　ｍｇ　
／　ｍＱで多った。上記及び前記■で得た培養上清、又
は腹水をＰＢＳで２倍に希釈したものを抗体ＦＨ−２を
固相化したセファロース（Ｂ　ｒ　ＣＮ−ａｃｔｉｖａ
ｔｅｄ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂ（ファルマシ
ア社製）を使用して作成したもの）のアフイニイテイク
ロマトグラフイーに付すことにより夫々、精製Ａｉｄ−
１、Ａｌｄ−２、Ａｌｄ−３、Ａｉｄ−４及びＡＩｄ−
５を得た。

実施例３　抗イデイオタイプ抗体の製造■　抗イデイオ
タイプ抗体の免疫原として抗体ＡＨ−６（Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ　、　Ｃｈｅｗ、、　２５８゜１１７９３〜１１７９
７．１９８３）の１００μｇを含有するリン酸緩衝食塩
水（ｐＨ７，４）５００μＱの溶液を等量のフロイント
コムブリート　アジュバントと混和し、懸濁させた。得
られた懸濁液を上記ＡＨ−６２０μｇ含有分だけ取り、
ウィスター系ラットに皮下投与した。以後前記実施例１
の■と同様に免疫し、さらに細胞融合を行いハイブリド
ーマを得、クローニングした。

目的の抗イデイオタイプ抗体を産生ずるクローンの検索
は、精製ＡＨ−６抗体、精製マウスＩｇＭをそれぞれプ
レートに不溶化した９６穴プレートの各ウェルに、クロ
ーニング中の培養上清を５０μｇと、リン酸緩衝液５０
μＱとを入れ、室温、浸盪下で１時間反応させた。以後
、実施例１の■と同様にＡＨ−６のみに陽性反応を示す
本発明抗イデイオタイプ抗体産生クローンを選別した。

更に阻害系のスクリーニングは、当該クローンの培養上
清５０μＱと１２５Ｉ標識ＡＨ−６の２００ｕＱ　　（
５００００ｃｐｍ）とを浸盪下、室温で１時間反応させ
、抗原としての肝癌組織抽出物をコートシたビーズを１
個入れ、浸盪下、室温で１時間反応させることにより、
ビーズの放射能カウントによってＡＨ−６と抗原との結
合阻害活性を試験した。培養上清を使用しない系をコン
トロールとして、その阻害活性により、クローンを選別
した。かかる両スクリごニング系及び上記限界希釈法に
より、ＡＨ−６と抗原（フコシルＬｅＸ）との反応の阻
害が弱いタイプの本発明抗イデイオタイプ抗体を産生ず
るクローン（クローンＮｏ、０ＡＬ−ＡＩｄ−４Ｙ４０
）及び上記阻害の強いタイプの本発明抗イデイオタイプ
抗体を産生ずる２クローン（クローンＮｏ、０ＡＬ−Ａ
　Ｉ　ｄ−４Ｙ１２、及び０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−４Ｙ２６
）の所望のハイブリドーマを得た。尚代表例として、ハ
イブリドーマ０ＡＬ−Ａｌｄ−４Ｙ１２をアメリカン　
タイプカルチャー　コレクションに寄託した（ＡＴＣＣ
記号　ＨＢ　　９４５０）。

尚、上記阻害系のスクリーニングにおいて抗原として使
用した肝癌組織抽出物をコートしたビーズは、ＡＨ−６
抗体反応陽性の大腸癌の肝移転した肝組織より、過塩素
酸抽出後、得られた糖蛋白をビーズに吸着（不溶化）さ
せて得た。

■　上記■で得たクローンＮα０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−４
Ｙ４０．０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−４Ｙ１２、又はｏＡＬ−Ａ
Ｉ　ｄ−４Ｙ２６を、完全ＲＰＭＩ培地にて５％炭酸ガ
スインキュベータ中で、３７℃にて４８時間培養した。

培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）して、目
的のモノクロナール抗体（以下これを順次ｒＡＩｄ−６
Ｊ、ｒＡＩｄ−７Ｊ、及びｒＡＩｄ−８Ｊという）を含
む培養上清をそれぞれ得た。

０ＡＬ−Ａｌ　ｄ−４Ｙ４０はＩｇＧ、クラスに、０Ａ
Ｌ−Ａｌ　ｄ−４Ｙ１２．０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−４Ｙ２６
はＩｇＧｚａクラスに属していた。これは、ラットモノ
クローナル　タイピングキットにより確認された。

■　前記■で得たクローンＮｏ、０ＡＬ−Ａｌｄ−４Ｙ
４０．０ＡＬ−Ａｌ　ｄ−４Ｙ１２、又は０ＡＬ−ＡＩ
　ｄ−４Ｙ２６を前記実施例１の■と同様に、ヌードマ
ウス、又はヌードラットに腹腔内投与し、ＡＩｄ−６、
Ａｉｄ−７、又はＡＩｄ−８を含む腹水を得た。次いで
、これを抗体ＡＨ−６を固相化したセファロースのアフ
イニテイクロマトグラフイーに付すことにより、それぞ
れ精製Ａｌｄ−６、Ａ　Ｉ　ｄ−７、及びＡｉｄ−８を
得た。

実施例４　抗イデイオタイプ抗体の製造■　抗イデイオ
タイプ抗体の免疫原として抗体ＣＡ１９−９　（Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４３．　５４８９〜５４９２．１９
８３）の１００μｇを含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ
７，４）５００μＱの溶液を等量のフロイント　コンプ
リート　アジュバントと混和し、懸濁させた。得られた
懸濁液を上記ＣＡ１９−９　２０μｇ含有分だけ取り、
ウィスター系ラットに皮下投与した。以後前記実施例１
の■と同様に免疫し、さらに細胞融合を行いハイブリド
ーマを得、クローニングした。

目的の抗イデイオタイプ抗体を産生ずるクローンの検索
は、ＣＡ１９−９　（Ｊ、Ｂ、Ｃ，。

２５７．１４３６５〜１４３６９．１９８２゜Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　　４３．　５４８９〜５
４９２゜１９８３）、精製マウスＩｇＧ、をそれぞれプ
レートに不溶化した９６穴プレートの各ウェルに、クロ
ーニング中の培養上清を５０μＱと、リン酸緩衝液５０
μＱとを入れ、室温、浸盪下で１時間反応させた。以後
、実施例１の■と同様にＣＡｌ９−９のみに陽性反応を
示す本発明抗イデイオタイプ抗体産生クローンを選別し
た。

さらに阻害系のスクリーニングは、当該クローンの培養
上清５０μＱと♀５■標識ＣＡ１９−９の２００μＱ　
（５００００ｃｐｍ）とを浸盪下、室温で１時間反応さ
せ、抗原としてのＫＡＴＯ−ｍ細胞抽出物をコートした
ビーズを１個入れ、浸盪下、室温で１時間反応させるこ
とにより、ビーズの放射能カウントによってＣＡ１９−
９と抗原との結合阻害活性を試験した。培養上清を使用
しない系をコントロールとして、その阻害活性により、
クローンを選別した。かかる両スクリーニング系及び上
記限界希釈味により、ＣＡ１９−９と抗原（シアリルＬ
ｅ　　）との反応を阻害するタイプの本発明抗イデイオ
タイプ抗体を産生ずるクローン（りＯ−：／ＮＯ，０Ａ
Ｌ−Ａ　Ｉ　ｄ−１９Ａ４）　、及び」１記阻害するタ
イプの本発明抗イデイオタイプ抗体を産生ずる２クロー
ン（クローンＮα０ＡＬ−ＡＩｄ−１９Ａ７及び０ＡＬ
−ＡＩｄ−１９Ａ１０）の所望のハイブリドーマを得た
。尚代表例として、ハイブリドーマ０ＡＬ−ＡＩｄ−１
９Ａ４及び０ＡＬ−Ａｌ　ｄ−１９Ａ１０をアメリカン
　タイプカルチャー　コレクションに寄託した（ＡＴＣ
Ｃ記号　ＨＢ　　９４６１及びＨＢ　　９４４８）。

上記阻害系のスクリーニングにおいて抗原として使用し
たＫＡＴＯ−ｍは、上記シアリルＬｅａを表現している
ことが知られている癌細胞法ＫＡＴｏ−ＩＩＩ　（関口
守正他、組織培養、９　（６）　。

２０１〜２０７．１９８３）の培養細胞をＰＢＳで抽出
後、ＰＮＡ−セファロースＣＬ−６Ｂに付して得られた
糖蛋白をビーズに吸着（不溶化）させて得た。

■　上記■で得たクローンＮａ０ＡＬ−ＡＩｄ−１９Ａ
４．０ＡＬ−ＡＩｄ−１９Ａ７、又はｏＡＬ−Ａｌｄ−
１９Ａ１０を完全ＲＰＭＩ培地にて５％炭酸ガスインキ
ュベータ中で、３７℃にて４８時間培養した。培養液を
遠心分離（３０００ｒｐｍ１１０分）して、目的のモノ
クローナル抗体（以下これを順次ｒＡＩｄ−９Ｊ、ｒＡ
Ｉｄ−１０」、及びｒＡＩｄ−１１Ｊという）を含む培
養上清をそれぞれ得た。

０ＡＬ−Ａｌｄ−１９Ａ４、及び０ＡＬ−ＡＩｄ−１９
Ａ７は１ｇ０２Ｂクラスに、０ＡＬ−ＡＩｄ−１９Ａ１
０はＩ　ｇＧ、クラスに属していた。

これは、ラットモノクローナルタイピングキットにより
確認された。

■　前記■で得たクローンＮｏ、０ＡＬ−Ａｌｄ−１９
Ａ４．０ＡＬ−Ａｌｄ−１９Ａ７、又は０ＡＬ−ＡＩｄ
−１９Ａ１．０を前記実施例１の■と同様に、ヌードマ
ウス、又はヌードラットに腹腔内投与し、Ａｌｄ−９、
Ａｌｄ−１０、又はＡＩｄ−１１を含む腹水を得た。次
いで、これを抗体ＣＡ１９−９を固相化したセファロー
スのアフイニテイクロマトグラフイーに付すことにより
、それぞれ精製Ａｌｄ−９、ＡＩｄ−１０、及びＡＩｄ
−１１を得た。

実施例５　抗イデイオタイプ抗体の製造■　抗イデイオ
タイプ抗体の免疫原として抗体ＦＨ−７０，Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、、　２６１．　５４８７〜５４９５．１９８
６）の１００μｇを含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７
，４）５００μＱの溶液を等量のフロイント　コンプリ
ート　アジュバントと混和し、懸濁させた。得られた懸
濁液を上記ＦＨ−７２０μｇ含有分だけ取り、ウィスタ
ー系ラットに皮下投与した。以後前記実施例１の■と同
様に免疫し、さらに細胞融合を行いハイブリドーマを得
、クローニングした。

目的の抗イデイオタイプ抗体を産生ずるり。−ンの検索
は、精製ＦＨ−７抗体、精製マウスＩｇＧをそれぞれプ
レートに不溶化した９６穴プレートの各ウェルに、クロ
ーニング中の培養上清を５０μＱと、リン酸緩衝液５０
μＱとを入れ、室温、浸盪下で１時間反応させた。以後
、実施例１の■と同様に、ＦＨ−７のみに陽性反応を示
す本発明抗イデイオタイプ抗体産生クローンを選別した
。更に阻害系のスクリーニングは、当該クローンの培養
上清５０μＱと１２５■標識ＦＨ−７の２００μＱ　（
１０００００ｃｐｍ）とを振盪下、室温で１時間反応さ
せ、抗原としての胎児側抽出物をコートしたビーズを１
個入れ、振盪下、室温で１時間反応させることにより、
ビーズの放射能カウントによってＦＨ−７と抗原との結
合阻害活性を試験した。培養上清を使用しない系をコン
トロールとして、その阻害活性により、クローンを選別
した。かかる両スクリーニング系及び上記限界希釈法に
より、ＦＨ−７と抗原（ジシアリルＬｅａ）との反応を
阻害するタイプの本発明抗イデイオタイプ抗体を産生ず
るクローン（クローンＮｏ、０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−７Ａ
１、及び０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−７Ａ２）及び上記阻害し
ないタイプの本発明抗イデイオタイプ抗体を産生ずるク
ローン（クローンＮｏ、０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−７Ａ３）
の所望のハイブリドーマを得た。尚代表例として、ハイ
ブリドーマ０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−７Ａ１を通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託した〔受託番号微工
研条寄第１５２２号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１５２２）〕
。

尚上記阻害系のスクリーニングにおいて抗原として使用
した胎児側抽出物をコートしたビーズは、ＦＨ−７抗体
反応陽性の胎児側１ｇに対し、０．６Ｍ過塩素酸５ｇを
加えて、ワーニングブレンダーでホモジナイズし、１５
００００ｘＧ。

３０分間遠心分離後、その上清を中和して透析後、凍結
乾燥した。これをセファロースＣＬ−６Ｂを用いてゲル
沖過を行い、ボイドフラクションを分取して、得られた
糖蛋白をビーズに吸着させて得た。

■　上記で得たクローン陽、０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−７Ａ１
．０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−７Ａ２又は０ＡＬ−ＡＩｄ−７Ａ
３を、完全ＲＰＭＩ培地にて５％炭−酸ガスインキュベ
ーター中で、３７℃にて４８時間培養した。培養液を遠
心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）して、目的のモノク
ローナル抗体（以下、これらを順次ｒＡＩｄ−７ＡＩＪ
、ｒＡＩｄ−７Ａ２」及びｒＡＩ　ｄ−７Ａ３Ｊという
）を含む培養上清をそれぞれ得た。

尚、各抗体共にＩ　ｇ　Ｇ　２．クラスに属していた。

これは、ラット　モノクローナル　タイピングキット（
Ｍｉｌｅｓ　　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により確認
された。

■　前記実施例５−■で得たクローンＮｏ、０ＡＬ−Ａ
ｌｄ−７Ａ１．０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−７Ａ２及び０ＡＬ−
ＡＴｄ−７Ａ３のＩ　Ｘ　１０７個をＲＰＭＩ−１６４
０培地０．５ｍＱに懸濁させ、ヌードマウス又はヌード
ラットに腹腔的投与した。２〜３週間後、蓄積した腹水
を採取し、ＡＩｄ−７Ａ１、Ａｌｄ−７Ａ２又はＡＩ　
ｄ−７Ａ３を含む腹水を得た。この抗体濃度は約０．２
〜５．　０ｍｇ／ｍＱであった。上記及び前記■で得た
培養上清、又は腹水をＰＢＳで２倍に希釈したものを抗
体ＦＨ−７を固相化したセファロース（ＢｒＣＮ−ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ　
（ファルマシア社製）を使用して作成したもの）のアフ
ィニティクロマトグラフィーに付すことにより夫々、精
製Ａｌｄ−７Ａ１、ＡＩ　ｄ−７Ａ２、及びＡＩｄ−７
Ａ３を得た。

実施例６　抗イデイオタイプ抗体の製造■　抗イデイオ
タイプ抗体の免疫原として抗体ＦＨ−９（Ｂｌｏｃｈｅ
ｍｌｓｔｒｙ、２５．２８５９〜２８６６．１９８６）
の１００μｇを含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，４
）５００μＱの溶液を等量のフロイント　コンプリート
　アジュバントと混和し、懸濁させた。得られた懸濁液
を上記ＰＨ−９２０Ｍｇ含有分だけ取り、ウィスター系
ラットに皮下投与した。その後、前記実施例１−■と同
様に免疫し、さらに細胞融合を行いハイブリドーマを得
、クローニングした。

目的の抗イデイオタイプ抗体を産生ずるクローンの検索
は、ＦＨ−９抗体、精製マウスＩｇＧ、　　’をそれぞ
れプレートに不溶化した９６穴プレートの各ウェルに、
クローニング中の培養上清を５０μＱと、リン酸緩衝液
５０μＱとを入れ、室温、振盪下で１時間反応させた。

以後、実施例１−■と同様に、ＦＨ−９のみに陽性反応
を示す本発明抗イデイオタイプ抗体産生クローンを選別
した。

さらに阻害系のスクリーニングは、当該クローンの培養
上清５０μ、Ｑと１２５Ｉ標識ＦＨ−９の２００μＱ　
　（５００００ｃｐｍ）とを振盪下、室温で１時間反応
させ、抗原とし′ての肺癌細胞をコートしたビーズを１
個入れ、振盪下、室温で１時間反応させることにより、
ビーズの放射能カウントによってＦＨ−９と抗原との結
合阻害活性を試験した。培養上清を使用しない系をコン
トロールとして、その阻害活性により、クローンを選別
した。かかる両スクリーニング系及び上記限界希釈法に
より、ＦＨ−９と抗原（ジシアリルタイプ−１）との反
応を阻害するタイプの本発明抗イデイオタイプ抗体を産
生ずるクローン（クローンＮｏ、０ＡＬ−Ａｌ　ｄ−９
Ａ１）の所望のハイブリドーマを得た。尚、このハイブ
リドーマ０ＡＬ−Ａｉｄ−９Ａ１を通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託した〔受託番号微工研条
寄第１５２３号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１５２３））。

上記阻害系のスクリーニングにおいて抗原として使用し
たＰＣ−７は、株化肺癌細胞ＰＣ−７の培養細胞をポリ
リジンを固相化したマイクロプレートに１０５個／ｗｅ
ｌｌ入れ、ゲルタールアルデハイドで固定化させて得た
。

■　上記■で得たクローンＮｏ、０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−
９Ａ１を完全ＲＰＭＩ培地にて５％炭酸ガスインキュベ
ーター中で、３７℃にて４８時間培養した。

培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）して、目
的のモノクローナル抗体（以下、これをｒＡＩｄ−９Ａ
ＩＪという）を含む培養上清を得た。

Ａ　Ｉ　ｄ−９Ａ１は■ｇＧ２．クラスに属していた。

これは、ラット　モノクローナル　タイピングキットに
より確認された。

■　前記■で得たクローンＮα０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−９Ａ
１を前記実施例１−■と同様に、ヌードマウス、又はヌ
ードラットに腹腔内投与した。２〜３週間後、蓄積した
腹水を採取し、Ａｉｄ−９Ａ１を含む腹水を得た。こρ
抗体濃度は約０．２〜５．　０ｍｇ／ｍＱであった。

上記及び前記■で得た培養上清、又は腹水をＰＢＳで２
倍に希釈したものを抗体ＰＨ−９を固相化したセファロ
ース（Ｂ　ｒ　ＣＮ　−ａｃｔｉｖａｔｅｄｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ　（ファルマシア社製）を使用
して作製したもの）のアフィニティクロマトグラフィー
に付すことにより、精製Ａｉｄ−９Ａ１を得た。

参考例１ ■　不溶化抗体の調製 前記実施例１で得た精製抗体Ａｉｄ−６Ａ又はＡＩ　ｄ
−６Ｆを、０．１５Ｍ−ＮａＣＱ及び０．０５％ＮａＮ
３を含む５０ｍＭ−ＰＢＳ（ｐＨ７，４）にて５μｇ蛋
白質／　ｍＱに調整した。

ポリスチレンビーズ（セキスイ化学工業■、φ４ｍｍ）
１万個を、３０％エタノールを含む１／１００ＯＮ　　
ＮａＯＨ溶液でよく洗浄し、更に蒸溜水で洗浄した。次
いでこれを１／１００ＯＮ　　ＮＣＱ溶液でよく洗浄し
、更に蒸溜水で十分に洗浄した。

上記抗体溶液１００ｍＱに、このビーズ８００個を加え
、２時間撹拌し、次いで４℃下で一晩放置した。ビーズ
を沖過し、生理食塩水で洗浄後、０．５％結晶ＢＳＡ　
（生化学工業社）を含む５０ｍＭＰＨ８（ｐＨ７，４）
中に２時間撹拌し、更に４℃下で一晩放置した。ビーズ
を戸数し、充分に洗浄して不溶化抗体を得た。

■　１２５Ｉ標識抗体の調製 精製抗体ＡＩｄ−６Ａ又はＡＩｄ−６Ｆの１００μｇを
０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）０．１ｍＱに溶か
した溶液に、Ｎａ”Ｉ　（ＮＥＮ社）の１ｍＣ１を加え
た。ヨードゲン（夏ｏｄｏｇｅｎ　；ｐ　１ｅｒｃｅ社
）１ｍＯ／ｍＱめジクロルメタン溶液４０μＱをガラス
試験管に入れ、窒素ガス気流下に溶媒をとばして乾燥し
、この試験管に、上記抗体溶液を加え、水冷下に、５分
間、静置して反応させた。

この反応物を別の試験管に移し、反応を停止させた後、
ゲルｐ過（セファロースＣＬ６Ｂ、溶出液＝０．１５Ｍ
　　ＮａＣＱ、０．１％ＢＳＡ及び０．０２％ＮａＮ３
を含む５０ｍＭリン酸緩衝液）により、放射活性のピー
クに一致するＩｇＧ分画を採取して、１２５Ｉ−標識抗
体を得た。該抗体の反応性は、抗体ＦＨ−６を用いて試
験された。

また上記の他に、クロラミンＴ法（Ｎ　ａｔｕｒｅ。

１９４．４９６．１９６２）及びポルトン−ハンター法
（Ｂｌｏｃｈｅｍ、Ｊ、、８９，１１４．１９６３）に
従っても、それぞれ良好なｔ２５！−標識抗体を得た。

■　酵素標識抗体の調製 精製抗体ＡＩｄ−６ＡまたはＡｌｄ−６Ｆの１０ｍｇを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）１ｍＱに溶解し、
１０ｍｇ／ｍＱパーオキシダーゼの同緩衝液を加えて、
ゆるやかに撹拌する。１％ゲルタールアルデヒド溶液５
０μＱを滴下し、室温で、２時間インキュベーションし
、反応混合物を生理食塩水に対して、４℃下に一昼夜透
析して、パーオキシダーゼ標識抗体を得た。

また、上記の他に過ヨウ素酸架橋法（Ｊ。

Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　２２．
　１０８４〜１０９１．１９７４）、マレイミド架橋法
（Ｊ。

Ｈｔｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　７８．
　２３５〜２３７゜１９７５）、イソシアネート架橋法
（Ｊ。

Ｈｌｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、　２１．
２３３〜２４０゜１９７３）、ベンゾキノン架橋法（Ａ
　ｎｎ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２７Ｃ，１９７〜２０８．１９７
６）に従っても、それぞれ良好なパーオキシダーゼ標識
抗体を得た。さらに、パーオキシダーゼの代わりにβ・
Ｇガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、マレー
トデヒドロゲナーゼ、グルコース・６・リン酸脱水素酵
素、グルコース酸化酵素、アセチルコリンエステラーゼ
、グルコアミラーゼ、リゾチーム等の酵素も標識できた
。

■　螢光標識抗体の調製 前記実施例１−■で得た精製抗イデイオタイプ抗体ＡＩ
ｄ−６Ｆの１０ｍｇを０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，
５）１ｍＱに溶解し、これに１００μｇ／ｒｎＱ　　Ｆ
　Ｉ　ＴＣ（フルオレツセイン・イソチオシアナート）
の濃度で同緩衝液に溶解した溶液を滴下し、室温で１時
間攪拌する。その後、０．００５Ｍのリン酸緩衝液で一
昼夜透析後、ＤＥＡＥ−セファロースを用いてイオン交
換により精製し、ＦＩＴＣ標識抗イディオタイプ抗体を
得た。

また、上記の他にＲＩＴＣ（テトラメチルローダミン・
イソチオシアネート）でも、同様の方法で、良好なＲＩ
ＴＣ標識抗イディオタイプ抗体を得た。

参考例２ ■　不溶化抗体の調製 前記実施例２−■で得た精製抗イデイオタイプ抗体Ａｌ
ｄ−１、ＡＩｄ−２、ＡＩｄ−３、ＡＩｄ−４又はＡｉ
ｄ−５を、０．１５Ｍ−ＮａＣＱ及び０．０５％ＮａＮ
３を含む５０ｍＭ−ＰＢＳ（ｐＨ７，４）にて５μｇ蛋
白質／　ｍＱに調製した。

以下参考例１−■と同様の操作により、夫々の不溶化抗
体を得た。

■　＋２５　（標識抗体の調製 前記実施例２−■の方法で得た精製抗体Ａｉｄ−１、Ａ
ｉｄ−２、Ａｌｄ−３、Ａｌｄ−４又はＡＩｄ−５の１
００μｇを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）０．１
ｍＱに溶かした溶液にＮａ！２Ｊ　（ＮＥＮ社）の１ｍ
Ｃ１を加え、前記参考例１−■と同様の操作により１２
５　Ｉ標識抗体を調製した。

■　酵素標識抗体の調製 前記実施例２−■で得た精製抗イデイオタイプ抗体ＡＩ
ｄ−１、ＡＩｄ−２、ＡＩｄ−３、ＡＩｄ−４又はＡｌ
ｄ−１５の１０ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，
８）１ｍＱに溶解し、１０ｍｇ／ｍＱパーオキシダーゼ
の同緩衝液を加えて、前記参考例１−■と同様の操作に
よりパーオキシダーゼ標識抗体を得た。

■　螢光標識抗体の調製 前記実施例２−■で得た精製抗イデイオタイプ抗体ＡＩ
ｄ−１、Ａ　Ｉ　ｄ−２、Ａ　Ｉ　ｄ−３、Ａｌｄ−４
又はＡｌｄ−５の１０＋ａｇを０．０５Ｍ炭酸緩衝液（
ｐＨ９，５）１ｍＯに溶解し、これに１００μｇ／ｍ９
　　ＦＩＴＣ（フルオレツセイン・イソチオシアナート
）の濃度で同緩衝液に溶解した溶液を滴下し、室温で１
時間攪拌した。その後、前記参考例１−■と同様の操作
により、ＦＩＴＣ標識抗イディオタイプ抗体を得た。

参考例３ ■　不溶化抗体の調製 前記実施例３−■で得た抗体ＡＩｄ−６、Ａｌｄ−７又
はＡＩｄ−８を、上記参考例１−■と同様の操作により
不溶化抗体を調製した。

■　＋２５１標識抗体の調製　　− 前記実施例３−■で得た抗体ＡＩｄ−６、Ａｌｄ−７又
はＡＩｄ−８を、上記参考例１−■と同様の操作により
１２５Ｉ標識抗体を調製した。

■　酵素標識抗体の調製 前記実施例３−■で得た精製抗イデイオタイプ抗体Ａｌ
ｄ−６、Ａｉｄ−７又はＡｉｄ−８を、上記参考例１−
■と同様の操作によりパーオキシダーゼ標識抗体を調製
した。

■　螢光標識抗体の調製 前記実施例３−■で得た精製抗イデイオタイプ抗体Ａｉ
ｄ−６、ＡＩｄ−７又はＡｌｄ−８についても、上記参
考例１−■と同様の方法で、良好なＦＩＴＣａ識抗イデ
ィオタイプ抗体を調製した。

参考例４ ■　不溶化抗体の調製 前記実施例４−■、で得た抗体Ａｌｄ−９、ＡＩｄ−１
０又はＡ　Ｉ　ｄ−１１を、上記参考例１−■と同様の
操作により不溶化抗体を調製した。

■　＋２５　Ｈ標識抗体の調製 前記実施例４−■で得た抗体Ａｉｄ−９、ＡＩｄ−１０
又はＡ　Ｉ　ｄ−１１を、上記参考例１−■と同様の操
作により１２５１標識抗体を調製した。

■　酵素標識抗体の調製 前記実施例４−■で得た精製抗イデイオタイプ抗体Ａｉ
ｄ−９、Ａｉｄ−１０又はＡｌｄ−１１を、上記参考例
１−■と同様の操作によりパーオキシダーゼ標識抗体を
調製した。

■　螢光標識抗体の調製 前記実施例４−■で得た精製抗イデイオタイプ抗体ＡＩ
ｄ−９、ＡＩｄ−１０又はＡｉｄ−１１についても、上
記参考例１−■と同様の方法で、良好なＦＩＴＣ標識抗
イディオタイプ抗体を調製した。

参考例５ ■　不溶化抗体の調製 前記実施例５−■で得た抗体ＡＩｄ−７Ａ１、Ａ　Ｉ　
ｄ−７Ａ２又はＡＩ　ｄ−７Ａ３を、上記参考例１−■
と同様の操作により不溶化抗体を調製した。

■　１２５■標識抗体の調製 前記実施例５−■で得た抗体Ａｌｄ−７Ａ１、ＡＩ　ｄ
−７Ａ２又はＡＩｄ−７Ａ３を、上記参考例１−■と同
様の操作により１２５　■標識抗体を調製した。

■　酵素標識抗体の調製 前記実施例５−■で得た精製抗イデイオタイプ抗体ＡＩ
ｄ−７Ａ１、ＡＩｄ−７Ａ２又はＡＩｄ−７八３を、上
記参考例１−■と同様の操作によりパーオキシダーゼ標
識抗体を調製した。

■　螢光標識抗体の調製 前記実施例５−■で得た抗体Ａｉｄ−７Ａ１、ＡＩ　ｄ
−７Ａ２又はＡｉｄ−７Ａ３を、上記参考例１−■と同
様の操作により、良好なＦＩＴＣ標識抗イディオタイプ
抗体を調製した。

参考例６ ■　不溶化抗体の調製 前記実施例６−■で得た抗体ＡＩｄ−９Ａ１を、上記参
考例１−■と同様の操作により不溶化抗体を調製した。

■　１２５１標識抗体の調製 前記実施例６−■で得た抗体ＡＩｄ−９Ａ１を、上記参
考例１−■と同様の操作により１２５　Ｉ標識抗体を調
製した。

■　酵素標識抗体の調製 前記実施例６−■で得た抗体ＡＩｄ−９Ａ１を、上記参
考例１−■と同様の操作によりパーオキシダーゼ標識抗
体を調製した。

■　螢光標識抗体の調製 前記実施例６−■で得た抗体ＡＩ　ｄ−９Ａ１を、上記
参考例１−■と同様の操作により、良好なＦＩＴＣ標識
抗イディオタイプ抗体を調製した。

試験例Ｉ ＡＩｄ−６Ａ又はＡｉｄ−６Ｆ培養上清を完全ＲＰＭＩ
−１６４０培地で希釈（Ｘ１００、Ｘ３００、Ｘ９００
、Ｘ２７００、Ｘ８１００、Ｘ２４３００）したものを
それぞれ５０μＱと、リン酸緩衝液ｐＨ７，４２００μ
Ｑとを入れたチューブを用意し、そこに ＦＨ−６抗体（Ｊ、Ｂ、Ｃ，，２５８，１１７９３゜１
９８３）、 ＦＨ−２抗体（Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，，１０９，３６゜１９
８２）、 ＦＨ−４抗体（Ｊ、Ｂ、Ｃ，，２５９，４６８１゜１９
８４）、 ＩＡ−４抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２２０．　５０９゜
１９８３）、 ＣＡ１９−９抗体（Ｊ、Ｂ、Ｃ，，２５７゜１４８６５
、　１９８２）、 ＣＡ１２５抗体（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４４．２８
１３゜１９８４）　　、 ＣＡ１５−３抗体（Ｐｒｏｔ、Ｂｌｏｌ、Ｆ　Ｉｕｌｄ
ｓ、　１３゜１０１３、　１９８４）　、 ＢＡＬＢ／ＣマウスＩｇＭ抗体、及びＢＳＡのそれぞれ
不溶化ビーズを入れ、振盪下、室温で２時間反応させた
。

次いで、蒸溜水３ｍＱで２回洗浄し、未反応のＡＩ　ｄ
−６Ａ又はＡｉｄ−６Ｆを除去した後、パーオキシダー
ゼ標識抗ラットＩｇＧ（カペル社製。

１８０００倍希釈）を２００μＱづつ加え、室温で１時
間振盪反応させた。

さらに、未反応のパーオキシダーゼ標識抗ラット■ｇＧ
を３ｍＱの蒸溜水で２回洗浄除去し、別のチューブに不
溶化ビーズを移した。ここに０．０１％Ｈ２Ｏ２溶液中
に２．　５ｍｇ／ｍＱとなるように０−フェニレンジア
ミンを溶解した溶液５００μＱを加え、３０分間室温に
放置後、１．３ＮＨ２ＳＯａ　　２．ＯｍＱで反応を停
止させた後、４９２ｎｍで吸光度を測定した。

その結果、第１図に示すようにＡＩｄ−６Ａ及びＡｌｄ
−６ＦはＰＨ−６抗体不溶化ビーズとのみ反応し、この
他のいずれの抗体不溶化ビーズ、及びＢＳＡ不溶化ビー
ズとも反応しなかったことより、ＰＨ−６抗体と特異的
に反応する抗イデイオタイプ抗体であることが判った。

試験例２ ＦＨ−６（ハイブリドーマ培養上清の１０倍希釈液）を
０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−６Ａ又は０ＡＬ−ＡＩｄ−６Ｆ培養
上清（Ｘ２．Ｘ６．Ｘ１８．Ｘ５４゜Ｘ１６２．ｘ４８
６．Ｘ１４５８）を１対１で混合し、室温で１５分間反
応させた。その後、シアリル５ＳＥＡ−１を有する精製
糖脂質（６Ｂｇａｇ１１ｏｓｉｄｅ）　５　ｎｇ、コレ
ステロール１５ｎｇ、ホスファチジルコリン２５１ｇを
担持させた不溶化ビーズを加え、洗浄後１、ビーズ上に
反応しているＦＨ−６をＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ＋
Ｍを用いてバンデツクス（Ｐａｎｄｅｘ）装置により定
量した。

ＡＩ　ｄ−６Ｆの結果を、第２図に示す。ＡＩｄ−６Ｆ
はシアリル５ＳＥＡ−１とＰＨ−６の結合を濃度依存的
に阻害するタイプの抗体であることが判る。一方Ａｉｄ
−６Ａは、上記試験において、該結合を全く阻害しなか
った。

試験例３ （１）本発明抗体を特異抗体として用いるシアリル５Ｓ
ＥＡ−１を認識する抗体の測定系■　ひつじ血清に種々
の濃度でＦＨ−６を溶解したスタンダード５０μＱと、
前記で得た不溶化抗体（Ａｌｄ−６Ｆ不溶化ビーズ）の
１ケとを０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含む
５０ｍＭ　　ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）緩衝液中で、振盪
下に２時間（室温）反応させ、未反応物を洗浄除去後、
更に、前記で得た１２５１標識抗体（ｔ２Ｊ標識Ａｉｄ
−６Ｆ）の上記緩衝液溶液２００μＱ（約１０万ｃｐｍ
）を反応させた（振盪下、室温、２時間）。未反応物を
洗浄除去後、ビーズの放射能をγ−カウンターにより測
定した。上記により作成した標準曲線を第３図に示す。

◎　上記■と同様に調製したＦＨ−６抗体スタンダード
５０μＱに１２５１標識ＡＩｄ−６Ｆの■と同じ緩衝液
の溶液２００μＱ　（約２００００ｃｐｍ）を加えて反
応させた（振盪下、室温２時間）。

更にＦＨ−６不溶化ビーズを１ヶ加えて１時間同様に反
応後、洗浄し、ビーズの放射能をγ−カウンターにより
測定した。

上記により作成した標準曲線を第４図に示す。

なお、図中ＢｏはスタンダードＯｕ　／　ｍＱ　ｓ即ち
ブランク溶液を入れた場合の結合ｃｐｍを意味し、これ
と比較して、スタンダードで競合させた場合の結合ｃｐ
ｍをＢとして表わす。よってＢ　／　Ｂ　。

（％）はＢをＢｏで割った％で表わされ、この値が小さ
い程、競合が強いということになり、スタンダードの量
を上げるにしたがって小さくなる。

Ｏ■と同様に調製したＦＨ−６抗体スタンダード５０μ
Ｑと■と同じ緩衝液２００μＱとＡｌｄ−６Ｆ不溶化ビ
ーズ１ケとを室温、振盪下、２時間反応させた。１２５
１標識ＦＨ−６の１００μＱ（■と同じ緩衝液使用、約
２００００ｃｐｍ）を加えて、さらに１時間反応後、洗
浄し、以下同様にして作成した標準曲線を第５図に示す
。

＠　■と同様に調製したＦＨ−６抗体スタンダード１０
０μＱに５０ｍＭ　　ＰＢＳ、ｐＨ７，４（０，１５Ｍ
　　ＮａＣＱ、０．１％ＢＡＳ。

０．０５％ＮａＮ３を含む）緩衝液で希釈したｔ２５夏
標識ＦＨ−６溶液１００μＱ　（約２００００ｃｐｍ）
と同じ緩衝液で希釈したＡＩｄ−６Ｆ（１μｒ／ｍＱ）
を１００μＱと、同じ緩衝液１００μＱを加えて混合し
、４℃で一夜静置した。

これに上記緩衝液で４００倍希釈した正常ラット血漿１
００μＱ１上記緩衝液で４０倍希釈した抗うットＩｇＧ
抗体１００μＱ１及び１０％ポリエチレングリコール水
溶液２００μＱを加えて、遠心分離（３０００ｒｐｍ、
３０分）した。上清をデカンテーションしてＢ／Ｆ分離
した。沈渣の放射能を測定して作成した標準曲線を第６
図に示す。

（２）シアリル５ＳＥＡ−１抗原測定系（Ａｉｄ−６Ｆ
をスタンダードとして用いた系）■　ＡＩｄ−６Ｆを種
々の濃度で羊血清に溶解したものをシアリル５ＳＥＡ−
１抗原の代わりに用い、これを５０μＱとＦＨ−６抗体
不溶化ビーズ１ヶとを０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｎａ
Ｎ３を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）中で
室温、振盪下２時間反応後、未反応物を洗浄除去後、さ
らにｔ２５１標識ＦＨ−６抗体を上記の緩衝液で調整し
た溶液２００μＱ （約７００００ｃｐｍ）を加え、振盪下、室温で２時間
反応させた。未反応物を洗浄除去後、ビーズの放射能を
γ−々ウンターにより測定した。上記により作成した標
準曲線を第７図に示す。

◎　上記■と同様、ＡＩ　ｄ−６Ｆスタンダード５０μ
Ｑを用い、セ５Ｉ−標識ＦＨ−６約２００００ｃｐｍ／
２００μ９のクエン酸緩衝液とを振盪下、室温で２時間
反応させ、更にＡｌｄ−６Ｆ不溶化ビーズを入れ、１時
間競合反応させる。洗浄除去後、ビーズの放射能をγ−
カウンターで測定する。この標準曲線を第８図に示す。

Ｏ■と同様にＡＩｄ−６Ｆスタンダード５０μＱを用い
、ＦＨ−６不溶化ビーズ１ケと、１２５　ｌ標識ＡＩ　
ｄ−６Ｆ３００００ｃｐｍ／２００．ｃｌの上記クエン
酸緩衝液中で、室温、振盪下で２時間競合反応を行ない
、未反応物を洗浄除去後、ビーズの放射能をγ−カウン
ターで測定した。この標準曲線を第９図に示す。

＠　■と同様にＡＩ　ｄ−６Ｆスタンダードを５０ｔｔ
Ｑ用い、１２５１標識ＦＨ−６２００００ｃｐｍ／２０
０μＱの上記クエン酸緩衝液中で、競合反応を室温、振
盪下で２時間反応させ、これにＰＣ−９ビーズ１ケを加
え、さらに１時間反応後、洗浄し、ビーズの放射能をγ
−カウンターで測定した。この標準曲線を第１０図に示
す。

試験例４ （１）血清中のＦＨ−６抗体の測定 ヒト血清（正常人、及び癌患者）５０μＱに、０．１％
ＢＳＡと０．０５％ＮａＮ３を含む５０ｍＭ−ＰＢＳ　
（ｐＨ７，４）緩衝液２００．ｃｌを加えたものを１検
体につき４組用意し、２組にはＡｌｄ−６Ｆ抗体不溶化
ビーズを入れ、残りの２組にはＰＣ−９抽出物の不溶化
ビーズ１ケを入れた後、室温、振盪下で２時間反応させ
た。反応後、未反応物を蒸留水で３回洗浄除去し、一方
には、１２５１標識ＡＩｄ−６Ｆ抗体（１０万ｃｐｍ）
２００μＱを加え、他方には、１２５■標識抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体（５万ｃｐｍ）２００μ９を加え、それぞれ室温
で振盪下２時間反応させた。その後、未反応物を蒸留水
で３回洗浄除去後、ビーズの放射能をγ−カウンターに
より測定した。

その結果、第１１図に・示すように正常人５０例と肺癌
患者１０例との間に有意差があった。

（２）ＰＨ−６抗体産生細胞の検出 ＦＨ−６ハイブリドーマ（コントロールとしてＡＨ−６
ハイブリドーマを使用）を冷ＰＢＳで３回洗浄後、終濃
度１０００万Ｃｅ１ｌ／ｍＱに調製した。

このＦＨ−６ハイブリドーマとＡＨ−６ハイブリドーマ
５０μＱと螢光標識Ａｌｄ−６Ｆ　（１００１１ｇ／ｍ
Ｑ、３３．３１１ｇ／ｍＱ、１１．１／ｊｆ／ｍＱ。

３、７μｇ／ｍＱ）の５０ｔｔＱを水冷下で３０分間反
応させた後、冷ＰＢＳで１回洗浄後１　ｍＧに希釈し、
エキサイチージョン４８８ｎｍ、エミッション５３０ｎ
ｍの条件でフローサイトメータースペクトランＩ　Ｉ　
Ｉ　（Ｓｐｅｃｔｒａｎ　Ｉ　Ｉ　Ｉ、　Ｏｒ　ｔｈ。

社製）にかけ、螢光標識抗体ＡＩｄ−６Ｆと反応するＰ
Ｈ−６の割合を、ＡＨ−６／％イブリドーマのその世と
比較した。

その結果、第１２図に示すように、抗イデイオタイプ抗
体Ａｉｄ−６ＦはＦＨ−６抗体産生細胞とのみ反応する
ことが判った。

試験・例５ ■クローンＮａ０ＡＬ−Ａｌ　ｄ−２Ｘ４２．０ＡＬ−
ＡＩｄ−２Ｘ１６．０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−２Ｘ２４．０
ＡＬ−ＡＩ　ｄ−２Ｘ２６、又は０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−
２Ｘ５０の培養上清を完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で希
釈（Ｘ１０、Ｘ３０、Ｘ９０、Ｘ２７０、Ｘ８１０、Ｘ
２４３０）したちのをそれぞれ５０μＱと、リン酸緩衝
液（ｐＨ７，４）２００μＱとを入れたチューブを用意
し、そこに試験例１と同様各種抗体、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　
／　ｃマウスＩｇＧ、、１ｇＧ　　ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＭ
抗体、及びＢＳＡのそ２ａゝ れぞれ不溶化ビーズを入れ、振盪下、室温で２時間反応
させた。

その後、試験例１と同様の操作を行ない、反応を停止さ
せた後、４９２ｎｍで吸光度を測定した。

その結果、第１３図に示すようにＡＩｄ−１〔曲線（２
））　、Ａｌ　ｄ−２（曲線（５）　）　、ＡＩｄ−３
［曲線（３））　、ＡＩ　ｄ−４（曲線（４）〕及びＡ
Ｉｄ−５（曲線（１）〕は〕ＦＨ−２抗体不溶化ビーと
のみ反応し、この他のいずれの抗体不溶化ビーズ、及び
ＢＳＡ不溶化ビーズとも反応しなかった〔曲線（６）〕
ことより、ＦＨ−２抗体と特異的に反応する抗イデイオ
タイプ抗体であることが判った。

■　０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−２Ｘ４２．０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ
−２Ｘ１６．０ＡＬ−ＡＩ・ｄ−２Ｘ２４．０ＡＬ−Ａ
Ｉ　ｄ−２Ｘ２６、又は０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−２Ｘ５０の
培養上清５０μＱと１２５■標識ＦＨ−２の２００μ９
　　（５００００ｃｐｍ）とを振盪下、室温で一晩反応
させた後、抗原としてＰＣ−７細胞を固定したマイクロ
プレートに２００μＱを移し、振盪下、室温で９０分間
反応させた。次いで蒸留水で３回洗浄後、２Ｎ　　Ｎａ
ＯＨ２００１Ｑを入れ、抗原抗体反応をはずし、その上
清に残存している１２５１標識ＰＨ−２抗体の放射能量
を測定することにより、抗体と抗原の結合を阻害する抗
イデイオタイプ抗体を調べた。

その結果、第１４図に示すようにＡｌｄ−１〔曲線（２
）〕は、ＦＨ−２抗体と抗原の結合を僅かに阻害するが
、Ａｌｄ−２［曲線（５）〕、Ａｉｄ−３（曲線（３）
）、ＡＩｄ−４（曲線（４））　、又はＡｌｄ−５［曲
線（１）］は濃度依存的に阻害するタイプの抗イデイオ
タイプ抗体であることが判らた。

■　１２５１標識抗イディオタイプ抗体（ＡＩｄ−４）
を０．１％ＢＳＡ、及び０．０５％ＮａＮ３を含む５０
ｍＭ−ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）緩衝液で希釈した溶液２
００μＱ　　（２００００ｃｐｍ）と種々の濃度に希釈
（Ｘｉ、Ｘ３．Ｘ９．Ｘ２７．Ｘ８１、Ｘ２４３）Ｌ、
た抗イデイオタイプ抗体培養上清（Ａｌｄ−１、Ａｌｄ
−２、Ａｌｄ−３、ＡＩｄ−４又はＡｉｄ−５）を５０
μＱ加えた溶液に、ＦＨ−２抗体の不溶化ビーズを１ヶ
入れ、振盪下に９０分間、室温で反応させた。次いで未
反応物を蒸留水で３回洗浄除去した後、ビーズの放射能
量をγ−カウンターにより測定した。

この結果、第１５図に示すように、ＡＩｄ−１〔曲線（
２）〕とその他４種類の抗イデイオタイプ抗体〔曲線（
１）、（３）、（４）及び（５）〕とはエピトープが′
異なることが判った。

■　ひつじ血清に種々の濃度でＦＨ−２抗体を溶解した
スタンダード５０μＱと前記で得た不溶化抗イデイオタ
イプ抗体ビーズ（Ａｌｄ−１、ＡＩｄ−２、Ａｉｄ−３
、ＡＩｄ−４、又はＡｌｄ−５不溶化ビーズ）の１ケと
を０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含む５０ｍ
Ｍ−ＰＢＳ（ｐ　Ｈ７，４）緩衝液２００゛μＱに加え
、振盪下に２時間、室温で反応させ、未反応物を洗浄除
去後、更に、前記で得た１２５１標識抗イディオタイプ
抗体（ＡＩｄ−１、Ａｉｄ−２、Ａｌｄ−３、ＡＩｄ−
４又はＡｌｄ−５）の上記緩衝溶液２００μＱ　（約１
０万ｃｐｍ）を反応させた（振盪下、室温、２時間）。

未反応物を洗浄除去後、ビーズの放射能をγ−カウンタ
ーにより測定した。上記により作成した標準曲線の一例
を第１６図にしめす。

試験例６ ■　０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−４Ｙ４０．０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ
−４Ｙ１２、又は０ＡＬ−ＡＩｄ−４Ｙ２６の培養上清
を完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈（Ｘ１０、Ｘ３０
、Ｘ９０、Ｘ２７０、Ｘ８１０、Ｘ２４３０）したちの
をそれぞれ５０μＱ取り、上記試験例１と同様に操作し
、種々の抗体に対する反応性を調べた。

その結果、第１７図に示すようにＡＩｄ−６〔曲線（１
）　）　、Ａ、Ｉ　ｄ−７（曲線（３））　、又はＡｉ
ｄ−８（曲線（２）〕は〕ＡＨ−６抗体不溶化ビーとの
み反応し、この他のいずれの抗体不溶化ビーズ、及びＢ
ＳＡ不溶化ビーズとも反応しなかった〔曲線（４）〕こ
とより、〕ＡＨ−６抗と特異的に反応する抗イデイオタ
イプ抗体であることが判った。

■　０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−４Ｙ４０．０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ
−４Ｙ１２、又は０ＡＬ−ＡＩｄ−４Ｙ２６の培養上清
５０μＱとｔ２５　ｌ標識ＡＨ−６抗体の２００ｔｔＱ
　　（５００００ｃｐｍ）とを振盪下、室温で一晩反応
させた後、抗原として大腸癌由来の肝癌組織の過塩素酸
抽出物を不溶化したポリスチレンビーズを入れて振盪下
、室温で、９０分間反応させた後、蒸留水で３回洗浄し
た。次いで、新しいチューブにビーズを移し、ビーズ上
に残存している１２５夏標識ＡＨ−６抗体の放射能量を
測定することにより、抗体と抗原の結合を阻害する抗イ
デイオタイプ抗体を調べた。

その結果、第１８図に示す如く、ＡＩｄ−５〔曲線（１
）〕は〕ＡＨ−６抗と抗原の結合を僅かに阻害するが、
ＡＩｄ−７（曲線（３））　、又はＡｌｄ−８［曲線（
２）］は濃度依存的に阻害するタイプの抗イデイオタイ
プ抗体であることが判った。

■　ｔ２５１Ｊａ識抗イテイオタイプ抗体（Ａｌｄ−７
）を上記試験例５−■に記載の緩衝液で希釈した溶液２
００μＱ　（２００００ｃｐｍ）と、種々の濃度に希釈
（ＸＩ、Ｘ３．Ｘ９．Ｘ２７．Ｘ８１゜Ｘ２４３）した
抗イデイオタイプ抗体培養上清（Ａｌｄ−６、Ａｉｄ−
７、又はＡＩｄ−８）を５０μＱ加えた溶液に、ＡＨ−
６抗体の不溶化ビーズを１ヶ入れ、振盪下に９０分間、
室温で反応させた。次いで未反応物を蒸留水で３回洗浄
除去した後、ビーズの放射能量をγ−カウンターにより
測定した。

この結果、第１９、図に示すように、Ａｌｄ−６〔曲線
−（１））とＡＩｄ−７（曲線（３）〕又はＡｉｄ−８
（曲線（２）〕とはエピトープが異なることが判った。

■　上記試験例５−■と同様にＡＨ−６抗体を溶解した
スタンダード５０μＱと、前記で得た不溶化抗イデイオ
タイプ抗体ビーズ（ＡＩｄ−６、ＡＩｄ−７、又はＡＩ
ｄ−８不溶化ビーズ）の１ケと上記緩衝液２００μＱを
加えて、振盪下に２時間、室温で反応させ、未反応物を
洗浄除去後、更に、前記で得た１２５１標識抗イデ、イ
オタイブ抗体（Ａｌｄ−６、ＡＩｄ−７、又はＡＩｄ−
８）の上記緩衝溶液２００μＱ　（約１０万ｃｐｍ）を
反応させた（振盪下、室温、２時間）。未反応物を洗浄
除去後、ビーズの放射能をγ−カウンターにより測定し
た。上記により作成した標準曲線の一例を第２０図に示
す。

試験例７ ■　０ＡＬ−Ａｉｄ−１９Ａ、４．０ＡＬ−Ａｉｄ−１
９Ａ７、又は０ＡＬ−ＡＩｄ−１９Ａ１０の培養上清を
完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈（Ｘ１０、Ｘ３０、
Ｘ９０、Ｘ２７０、Ｘ８１０、Ｘ２４３０）したものを
それぞれ５０μＱ取り、上記試験例１−■と同様の操作
により、種々の抗体に対する反応性を調べた。

その結果、第２１図に示すようにＡＩｄ−９〔曲線（１
））、Ａｌｄ−１０（曲線（３）〕、又はＡｌｄ−１１
（曲線（２）〕は〕ＣＡ１９−９抗体不溶化ビーとのみ
反応し、この他のいずれの抗体不溶化ビーズ、及びＢＳ
Ａ不溶化ビーズとも反応しなかった〔曲線（４）〕こと
により、ＣＡ１９−９抗体と特異的に反応する抗イデイ
オタイプ抗体であることが判った。

■　０ＡＬ−Ａｌ　ｄ−１９Ａ４．０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ
−１９Ａ７、又は０ＡＬ−ＡＩｄ−１９Ａ１０の培養上
清５０μＱとｔ２５１標識ＣＡ１９−９抗体の２００μ
９　　（５００００ｃｐｍ）とを振盪下、室温で一晩反
応させた。その後、抗原としてＫＡＴＯ−■細胞を過塩
素酸で抽出した後、ＰＮＡセファロースＣＬ−４Ｂでア
フィニティー精製した糖蛋白質を不溶化したポリスチレ
ンビーズを入れて振盪下、室温で９０分間反応させた。

次いで、蒸留水で３回洗浄し、新しいチューブにビーズ
を移し、ビーズ上に残存している１２５！標識ＣＡ１９
−９抗体の放射能ｍを測定することにより、抗体と抗原
の結合を阻害する抗イデイオタイプ抗体を調べた。

その結果、第２２図に示す如く、ＡＩｄ−９〔曲線（１
）〕は抗体と抗原の結合を濃度依存的に阻害するタイプ
の抗イデイオタイプ抗体であり、ＡＩｄ−１０（曲線（
３）〕及びＡｉｄ−１１〔曲線（２）〕は阻害しないタ
イプの抗イデイオタイプ抗体であることが判った。

■　１２５１標識抗イディオタイプ抗体（Ａｌｄ−９）
を０．１％ＢＳＡ、及び０．０５％ＮａＮ３を含む５０
ｍＭ−ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）緩衝液で希釈した溶液２
００μＱ　　（２００００ｃｐｍ）と種々ノ濃度ニ希釈
（Ｘｉ、Ｘ３．Ｘ９．Ｘ２７゜Ｘ８１．Ｘ２４３）した
抗イデイオタイプ抗体培養上清（Ａｌｄ−９、Ａｌｄ−
１０、又はＡｌｄ−１１）を５０μＱ加えた溶液に、Ｃ
Ａ１９−９抗体の不溶化ビーズを１ヶ入れ、振盪下に９
０分間、室温で反応させた。次いで未反応物を蒸留水で
３回洗浄除去した後、ビーズの放射能量をγ−カウンタ
ーにより測定した。

この結果、第２３図に示すように、ＡＩｄ−９〔曲線（
１）〕とＡＩｄ−１０（曲線（３）〕又はＡｌｄ−１１
［曲線（２）〕とはエピトープが異なることが判った。

■　上記試験例５−■と同様にＣＡ１９−９抗体を溶解
したスタンダード５０μＱと、前記で得た不溶化抗イデ
イオタイプ抗体ビーズ（ＡＩｄ−９、Ａｌｄ−１０、又
はＡＩｄ−１１不溶化ビーズ）の１ケと上記緩衝液２０
０μＱを加えて、振盪下に２時間、室温で反応させ、未
反応物を洗浄除去後、更に前記で得た１２５　ｌ標識抗
イデイオタイプ抗体（Ａｌｄ−９、Ａｉｄ−１０、又は
Ａｌｄ−１１）の上記緩衝溶液２００．ｃｌ　　（約１
０万ｃｐｍ）を反応させた（振盪下、室温、２時間）。

未反応物を洗浄除去後、ビーズの放射能をγ−カウンタ
ーにより測定した。

上記により作成した標準曲線の一例を第２４図に示す。

試験例８ ■　０ＡＬ−Ａ　Ｉ　ｄ−７Ａ１．０ＡＬ−ＡＩｄ−７
Ａ２又は０ＡＬ−Ａｌ　ｄ−７Ａ３の培養上清を完全Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地で希釈（Ｘ３０、Ｘ９０、Ｘ２７
０、Ｘ８１０、Ｘ２４３０、Ｘ７２９０）したちのをそ
れぞれ２００μＱ取り、上記試験例１と同様に操作し、
種々の抗体に対する反応性を調べた。

その結果、第２５図に示すようにＡＩｄ−７Ａ１、ＡＩ
ｄ−７Ａ２、及びＡＩｄ−７Ａ３はＦＨ−７抗体不溶化
ビーズとのみ反応し、この他のいずれの抗体不溶化ビー
ズ及びＢＳＡ不溶化ビーズとも反応しなかったことより
、ＦＨ−７抗体と特異的に反応する抗イデイオタイプ抗
体であることが判った。

■　０ＡＬ−Ａｌ　ｄ−７Ａ１．０ＡＬ−Ａｌｄ−７Ａ
２又は０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−７Ａ３の培養上清５０μＱと
１２５１標識ＦＨ−７の２００μＱ（１０００００ｃｐ
ｍ）とを振盪下、室温で１時間反応させた。その後、抗
原として実施例５−■に記載の方法によって抽出、精製
した胎児側の糖蛋白質の不溶化ビーズを入れて振盪下、
室温で１時間反応させた。次いで、蒸留水で３回洗浄し
、新しいチューブにビーズを移し、ビーズ上に残存して
いる２５　Ｉ標識ＦＨ−７抗体の放射能量を測定するこ
とにより、抗体と抗原の結合を阻害する抗イデイオタイ
プ抗体を調べた。

その結果、第２６図に示す如く、ＡＩｄ−７Ａ３はＦＨ
−７抗体と抗原の結合を阻害せず、Ａｌｄ−７Ａ１、又
はＡＩ　ｄ−７Ａ２は濃度依存的に阻害するタイプの抗
イデイオタイプ抗体であることが判った。

試験例９ ■　０ＡＬ−ＡＩｄ−９Ａ１の培養上清を完全Ｒｒ’Ｍ
Ｉ−１６４０培地で希釈（×３０、×９０、×２７０、
×８１０、Ｘ２４３０、ｘ７２９０）したものをそれぞ
れ２００μＱ取り、上記試験例１と同様に操作し、種々
の抗体に対する反応性を調べた。

その結果、第２７図に示すようにＡｉｄ−９Ａ１はＦＨ
−９抗体不溶化ビーズとのみ反応し、この他のいずれの
抗体不溶化ビーズ、及びＢＳＡ不溶化ビーズとも反応し
なかったことより、ＰＨ−９抗体と特異的に反応する抗
イデイオタイプ抗体であることが判った。

■　０ＡＬ−ＡＩ　ｄ−９Ａ１の培養上清５０μＱと１
２５工標識ＦＨ−９２００μＱ　（１０００００ｃｐｍ
）とを振盪下、室温で１晩反応させた後、抗原としてＰ
Ｃ−７を固定化したプレートに移し、振盪下、２５℃で
１時間反応させた後、蒸留水で３回洗浄した。次いで、
２Ｎ　　ＮａＯＨ２００μＱを加え、２５℃で３０分間
、振盪溶出した後、新しいチューブに移し、溶出された
１２５Ｉ標識ＦＨ−９抗体の放射能量を測定することに
より、抗体と抗原の結合を阻害する抗イデイオタイプ抗
体を調べた。

その結果、第２８図に示す如く、Ａ　Ｉ　ｄ−９Ａ１は
ＦＨ−９抗体と抗原の結合を濃度依存的に阻害するタイ
プの抗イデイオタイプ抗体であることが判った。

【図面の簡単な説明】

第１図は、試験例１の結果を示すグラフである。 第２図は、試験例２の結果を示すグラフである。 第３〜１０図は、試験例３により作成した各標準曲線を
示すグラフである。第１１〜１２図は試験例４の結果を
示すグラフである。 第１３〜１６図は、試験例５の結果を示すグラフである
。第１７〜２０図は、試験例６の結果を示すグラフであ
る。第２１〜２４図は、試験例７の結果を示すグラフで
ある。第２５〜２６図は、試験例８の結果を示すグラフ
である。第２７〜２８図は、試験例９の結果を示すグラ
フである。 （以　上） 第３図 第４図 ｙｒだシアリルＬｅｘ−ｉｔ停（Ｆ　Ｈ−６を俳）ｎｇ
／ｍｌ第５図 ｙｒたシアリルＬＣｘ−！を停（ＦＨ−６を停）ｎｇ／
ｍｌ第６図 ：ｆｒ７ＬシアリルＬｅｘ−ｉ　ｔｎ（ＦＨ−６３イキ
）ｎｇ／ｍｌ第７図 Ｆ）Ｉ−６に対゛ＩＳ’ｊＬＷ４オタイブ丁尤イ４（入
Ｉｄ−６Ｆ！４＄）ｎｇ／ｍｌ第８図 ＦＨ−６＋；対了引光イヂイオタイ６＊＜キ（ＡＩｄ−
６Ｆ）ｎｇ／ｍｌ第９図 ＦＨ−ｓｒ：１す３ｊＬイデイオタイラ’ｊＬイ本（Ａ
Ｉｄ−６Ｆ）ｎｇ／ｍｌ第１ｏ図 ＦＨ−６ｒｚ＃Ｔ６＆イディオタイプ、ｔ４（ＡＪｄ−
６Ｆｊｆｍｎｇ　／ｍｌ第１６図 ＦＨ−２抗体（ｎｇ／ｍυ 第２ｏ図 ＡＨ−６抗＃−（ｎｇ／ｍＪ） 第２４図 ＣＡ１９−９抗体　（ｎｇ／ｒｒ？り

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 【遺伝子配列があります】 式 【遺伝子配列があります】 式 【遺伝子配列があります】 式 【遺伝子配列があります】 式 【遺伝子配列があります】 又は式 【遺伝子配列があります】 で表わされる糖鎖構造を認識する抗体を抗原とする抗イ
   デイオタイプ抗体。