KR900004436B1 - 항-이디오형 항체 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

항-이디오형 항체

제 1 도는 본 발명의 항-이디오형 항체(anti-idiotype antibody)AId-6A와 AId-6F가 항체 FH-6에 대하여 특이적인 활성을 갖는 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

제 2 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-6F가 항원 Le^x-i와 항체 FH-6사이의 결합을 투여량에 의존적으로 억제시키는 유형의 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

제 3 도, 제 4 도, 제 5 도 및 제 6 도는 특이적인 항체로서 본 발명의 항-이디오형 항체를 사용하여 항원 시알릴 Le^x-i를 인식하는 항체를 측정하는 시스템의 표준곡선들이다.

제 7 도, 제 8 도, 제 9 도 및 제 10 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-6F를 표준용액으로 사용하여 항원 시알릴 Le^x-i를 측정하는 시스템의 표준곡선들이다.

제 11 도는 50개의 사례의 정상인과 10개 사례의 폐암 환자의 혈청내 FH-6항체를 본 발명의 항-이디오형 항체를 사용하여 측정한 도표이다.

제 12 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-6F가 FH-6항체를 생산하는 세포에만 반응하는 것을 나타내는 그래프이다.

제 13 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-1(2), AId-2(5), AId-3(3), AId-4(4)와 AId-5(5)가 항체 FH-2에 특이적인 반응성을 갖고 있는 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

제 14 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-1(2)이 FH-2항체와 항원사이의 결합을 조금 억제하는 항-이디오형 항체이며, 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-2(5), AId-3(3), AId-4(4)와 AId-5(1)는 투여량에 의존적으로 FH-2항체와 항원사이의 결합을 억제시키는 유형의 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

제 15 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-1(2)이 본 발명의 다른 항-이디오형 항체인 AId-2(5), AId-3(3), AId-4(4), AId-5(1)와는 에피토프(epitope)가 다름을 나타내는 그래프이다.

제 16 도는 FH-2항체를¹²⁵I로 표시한 본 발명의 항-이디오형 항체와 반응시켜서 얻은 표준곡선이다.

제 17 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AIdㅡ6(1), AId-7(3), AId-8(2)이 AH-6항체에 특이적인 반응성을 갖고 있는 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

제 18 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-6(1)가 AH-6항체와 항원 사이의 결합을 조금 억제하는 항-이디오형 항체이며, 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-7(3)와 AId-8(2)이 투여량에 의존적으로 AH-6항체의 항원사이의 결합을 억제시키는 유형의 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

제 19 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-6(1)가 본 발명의 다른 항-이디오형 항체 AId-7(3)와 AId-8(2)과는 에피토프(epitope)가 다름을 나타내는 그래프이다.

제 20 도는 AH-6항체를¹²⁵I로 도시한 본 발명의 항-이디오형 항체와 반응시켜서 얻은 표준곡선이다.

제 21 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-9(1), AId-10(3), AId-11(2)이 CA 19-9항체에 대하여 특이적인 반응성을 갖고 있는 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

제 22 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-9(1)이 항체-항원 결합을 투여량에 의존적으로 억제시키는 유형의 항-이디오형 항체이며, 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-10(3)과 AId-11(2)은 항체-항원 결합을 억제시키지 않는 유형의 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

제 23 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-9(1)이 본 발명의 다른 항-이디오형 항체 AId-10(3)과 AId-11(2)과는 에피토프(epitope)가 다름을 나타내는 그래프이다.

제 24 도는 CA 19-9 항체를¹²⁵I로 표시한 본 발명의 항-이디오형 항체와 반응시켜서 얻은 표준곡선이다.

제 25 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-7A 1, AId-7A 2, AId-7A 3가 FH-7항체에 특이적인 반응성을 갖고 있는 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

제 26 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-7A 3가 FH-7항체와 항원사이의 결합을 억제하지 못하는 항-이디오형 항체이며, 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-7A 1과 AId-7A 2는 FH-7항체의 항원사이의 결합을 투여량에 의존적으로 억제시키는 유형의 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

제 27 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-9A 1이 FH-9항체에 특이적인 반응성을 갖고 있는 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

제 28 도는 본 발명의 항-이디오형 항체 AId-9A 1이 FH-9항체와 항원사이의 결합을 투여량에 의존적으로 억제시키는 유형의 항-이디오형 항체임을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 암의 식별 및 진단에 유용한 신규의 항-이디오형 항체들에 관한 것이다.

세포들이 암으로 변환됨에 따른 탄화수소 결합의 이상에 관하여 수행된 기본적인 연구결과에 따라 암의 표시자들로서 탄수화물성의 암 항원에 대하여 최근 수년간 관심이 집중되어 왔다.

다음식 (1)(2)(3)(4)(5)(6)으로 표시되는 구조를 갖는 탄화수소 결합들은 암 특이성이 대단히 높다.

이러한 탄화수소 결합을 갖는 항원들은 암 환자의 체액중의 현저히 나타나게되며, 또한 이 탄화수소 결합을 인식할 수 있는 특이적 항체들의 존재가 입증되었다.

NeuAcα2→3 Galβ1→4GlcAc(3←α1 Fuc)β1→3 Galβ1→4 GlcNAc(3←α1 Fue)β1→3 ;

Galβ1→4 Glc- ----------------------------- (1)

Galβ1→4 GlcNAc(3α1 Fuc)β1→3 Galβ1→ ------------ (2)

Fucα1→2 Galβ1→4 GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3 Galβ1→ ----- (3)

NeuAcα2→3 Galβ1→3 GlcNAc(4←α1 Fuc)β1→3 Galβ1→ --- (4)

NeuAcα2→3 Galβ1→3 GlcNAc(4←α1 Fuc)(6←α2 NeuAc)β1→3 Galβ1→ -------------------------------------- (5)

NeuAcα2→3 Galβ1→3 GlcNAc(6←α2 NeuAc)β1→3 Galβ1→ (6)

따라서 혈액, 소변등의 생물학적 액체중에서 이들 탄화수소 결합들을 검출하는 것은 암의 식별 및 진단에 매우 유용할 것으로 기대된다[Cancer Res, 46, 2619-2626(1986); Biochem. Biophys. Res/Commum, 100, 1578-1586(1981); J. Biol. Chem., 259, 4672-4680(1984); J. Biol. Chem., 258, 11793-l1797(1983); Cancer Res., 43, 5489-5492(1983); etc.].

전술한 바와갈이 식(1)의 탄화수소 결합(이하 "시알릴 Le^x-i(Sialyl Le^x-i)"라 칭한다)과 식(2)의 탄화수소 결합(이하 "Le^x"라 칭한다); 식(3)의 탄화수소 결합(이하 "푸코실 Le^x(Fucosyl Le^x)"라 칭한다; 식(4)의 탄화수소 결합(이하 "시알릴 Le^a(Sialyl Le^a)"라 칭한다; 식(6)의 탄화수소 결합(이하 "디시알릴형-1(Disialyl type-1)"이라 칭한다)에 특이적인 항체들이 이미 확인되어 있다. 그렇지만, 항체를 사용하여 탄화수소 결합을 측정하기 위한 표식되거나 불용성으로 만든 항원이나 표준항원으로서 사용할 수 있는 정제된 항원을 실제적으로는 입수할 수 없는 문제점이 있었다.

비록 상기의 보고서들에서 언급된 글라이코리피드들이 시알릴 Le^x-i, Le^x, 푸코실 Le^x, 시알릴 Le^a, 디시알릴 Le^a또는 디시알릴 형-1을 갖는 정제된 항원으로서 알려져 있기는 하지만, 이들 글라이코리피드들의 정제과정이 대단히 번거롭고 복잡하며, 단지 그 구조의 측정에 유용한 정도의 낮은 수율로 얻을 수 있을 뿐이었다.

따라서 이 생성물들은 탄화수소 결합들에 대한 측정을 위하여는 결국 사용할 수 없었다.

따라서 시알릴 Le^x-l, Le^x, 푸코실 Le^x, 시알릴 Le^a, 디시알릴 Le^a또는 디시알릴 형-1로 표시되는 암 항원에 대한 종양표시자를 측정하기 위한 기술에는 큰 제약이 있었으며, 상기한 측정기술은 그 감도와 장확성을 크게 향상시키는 일이 여전히 과제로 남아 있었다.

본 발명의 목적은 암 항원의 측정에 유용한 신규의 항-이디오형 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 높은 감도와 정밀성을 갖는 면역검정법으로 암 항원을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 다음의 설명으로부터 명확하게 될 것이다.

본 발명은 시알릴 Le^x-i, Le^x, 푸코실 Le^x, 시알릴 Le^a, 디시알릴 Le^a와 디시알릴 형-1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 탄화수소 결합을 인식하는 특이적인 항체에 반응하는 신규의 항-이디오형 항체를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 높은 감도와 정밀성을 가지고 상기의 암 항원들을 측정하기 위한 집중적인 연구를 수행한바, 다음과 같은 사실을 발견하였다.

(1) 항원으로서 위에서 상세히 열거한 탄화수소 결합들을 인식하는 특이적인 항체에 반응하는 본 발명의 항-이디오형 항체는 탄수화물성 항원의 자가항체에 대하여 매우 특이적이며, 따라서 자가항체를 측정하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

(2) 탄수화물성 항원과 그 항체사이의 반응을 투여량에 의존적으로 억제시키는 형인 본 발명의 항-이디오형 항체를 사용하게 되면, 이 항-이디오형 항체는 정제된 항원으로서 유용하게 사용될 수 있으므로 항원과 항체를 매우 용이하게 높은 감도로 정확하게 측정할 수 있다.

(3) 탄수화물성 항원과 그 항체사이의 반응을 억제시키지 않는 형인 본 발명의 항-이디오형 항체는 항체를 사용하여 탄수화물성 항원을 측정하는데 이차적인 항체로 사용될 수 있다.

(4) 따라서 탄수화물성 항원과 그 자가항체 또는 이 항체를 사용하는 세포들은 본 발명의 항-이디오형 항체를 사용하여 높은 감도로 정확하게 측정될 수 있다. 결과적으로 암을 매우 용이하게 식별, 진단할 수 있게 된다.

(5) 더우기 본 발명의 항-이디오형 항체를 사용하여 상기한 탄화수소 결합을 인식하는 항체를 그 결합 특이성에 근거하여 용이하고도 효과적으로 정제할 수 있다.

본 발명자들은 이러한 발견에 기초하여 연구를 계속한바, 본 발명의 항-이디오형 항체를 확증하는데 성공하였다.

이 항체는 그 반응 특이성(인식되는 항원의 결합부위)이 독특하다. 이러한 독특한 항원 결합부위의 3차구조는 면역글로뷸린 분자내의 고도로 변하기 쉬운 영역내에 형성되어 있다.

이러한 고도로 변하기 쉬운 영역의 구조에 의해서 측정되는 항체에 독특한 항원성(항원의 구조)이 알려져있다.(이디오형 ; idiotype)항-이디오형 항체는 이러한 이디오형과 반응하는 항체로서 알려져 있다[Oudin, J. et al, Acad. Sci. (Paris), 257, 805(1963); Jerne, N.K., An. Immunol., 125C 373(1974) ; Brown, C.A. et al., J. Immunol., 123, 2l02(l979) ; Jaffers, G. J. et al., Transplant Proc., 15, 146 (1983) ; Levy, R. et al., Fed. Proc. Fed. Am, Soc. Exp. Biol., 42, 2650(1983) ; Koprowski, H. et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 81, 216(1984) ; etc.]

본 발명의 항-이디오형 항체는 항체에 반응하거나 감응하기 쉽고, 특수한 탄수화물성 항원을 인식하는데 특이적이며, 본 항-이디오형 항체에 대한 항원으로서 작용하는 항체로서 특이화 되어 있다(시일릴 Le^x-i를 인식하는 항체를 "Abl-(1)" Le^x, 를 인식하는 항체를 "Abl-(2)", 푸코실 Le^x를 인식하는 항체를 "Abl-(3)" 시알릴 Le^a를 인식하는 항체를 "Abl-(4)", 디시알릴 Le^a를 인식하는 항체를 "Abl-(5)", 디시알릴 형-1을 인식하는 항체를 "Abl-(6)"로 지금부터 각각 칭한다).

따라서 본 발명의 항-이디오형 항체들 각각은 항체 Abl-(1), Abl-(2), Abl-(3), Abl-(4), Abl-(5)와 Abl-(6)의 단지 어느 하나와 특이적인 반응성을 갖고 있다.

본 발명의 항-이디오형 항체는 항체 Abl-(1), Abl-(2), Abl-(3), Abl-(4), Abl-(5) 또는 Abl-(6)의 항원 결합 부위로부터 떨어져 있는 어떤 부위를 인식하는 부위를 갖고 있으며(α-형), 따라서 항원(시알릴 Le^x-i, Le^x, 푸코실 Le^x, 시알릴 Le^a, 디시알릴 Le^a또는 디시알릴 형-1)과 항체 Abl-(1), Abl-(2), Abl-(3), Abl-(4), Abl-(5) 또는 Abl-(6)사이의 반응을 억제하지 않는다. 더우기 본 발명의 항-이디오형 항체들은 Abl-(1), Abl-(2), Abl-(3), Ab1-(4), Abl-(5) 또는 Abl-(6)의 항원 결합부위나 이 부위에 인접한 어떤 부위를 인식하는 부위를 갖고 있거나(γ-형), 또는 항원결합 부위에 상보적이며 시알릴 Le^x-i, Le^x, 푸코실 Le^x, 시알릴 Le^a, 디시알릴 Le^a또는 디시알릴 형-1과 똑같은 구조를 갖는 부위를 갖고 있으며(β-형), 이 결과 항-이디오형 항체는 항체 Abl-(1), Ab1-(2), Abl-(3), Abl-(4), Abl-(5) 또는 Abl-(6)와 각종의 글라이코리피드 사이의 반응을 투여량에 의존적으로 억제하게 된다.

탄수화물들, 지질들, 그리고 이것들의 연결식등을 지금부터 다음에 표시한 바와같이, IUPAC-IUB와 이 기술분야에서 통상적이고 일반적으로 사용되는 용어를 표현한다.

NeuAc ; N-아세틸뉴라민산

Gal ; 갈락토오스

Glc ; 글루코오스

GIcNAC ; N-아세틸글루코사민

FUC ; 푸코오스

본 발명의 항-이디오형 항체의 제조방법을 지금부터 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 항-이디오형 항체는 면역시키는 항원으로서 Abl-(1), Abl-(2), Abl-(3), Abl-(4), Abl-(5) 또는 Abl-(6)를 사용한 항체를 생산하는 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 면역시키는 항원으로서 사용되는 항체 Abl-(1), Abl-(2), Abl-(3), Abl-(4), Abl-(5) 또는 Abl-(6)는 이 항체가 시알린 Le^x-i, Le^x, 푸코실 Le^x, 시알린 Le^a, 디시알린 Le^a또는 디시알린 형-1에 상응하는 구조를 인식하는 한, 특별한 제한은 없다. 즉 이 항체가 탄화수소 결합과 탄화수소 결합을 포함하고 있는 글라이코리피드 또는 글라이코프로테인과 결합할 수 있는 한 특별한 제한은 없다. 그러나 항체의 특이성의 견지에서 모노클로날 항체가 바람직하다. 이러한 항체들은 문헌상에 나타나 있다. 예를들면, 시알린Le^x-i를 인식하는 항체 Abl-(1)은 J. Biol, Chem., 259, 10511-10517(1984)에서 발표된 항체 "FH-6"로 알려져 있다. Le^x를 인식하는 항체 Abl-(2)는 J. Biol, Chem. , 259, 4681-4785(1984)에서 항체 "FH-2"로 알려져 있다. 푸코실 Le^x를 인식하는 항체 Abl-(3)는 J. Biol, Chem., 258, 11793-11797(1983)에서 발표된 항체 ''AH-6"로 알려져 있다. 시알린 Le^a를 인식하는 항체 Abl-(4)는 cancer Res, , 43, 5489-5492(1983)에서 발표된 항체 "CA 19-9"로 알려져 있다.

다시알린 Le^a를 인식하는 항체는 J. Biol. Chem., 261, 5487-5495(1986)에서 발표된 항체 "FH-7"으로 알려져 있다. 디시알릴 형-1을 인식하는 항체는 Biochemistry, 25, 2859-2866 (1986)에서 발표된 항체 "FH-9"으로 알려져 있다. 이들 항체들은 이들 연구 보고서에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 항체는 탄화수소결합을 특이적으로 인식하는 FH-6, FH-2, AH-6, CA19-9, FH-7 또는 FH-9와 같은 특이적인 항체로 포유동물을 면역시키고, 하이브리도마 세포를 얻기 위하여 포유동물의 형질 세포종 세포와 면역 세포를 융합시켜서 세포를 클론으로 만들고, 상기의 항체 FH-6, FH-2, AH-6, CA 19-9, FH-7, FH-9을 인식하는 원하는 항-이디오형 항체를 생산하는 클론을 선발하여 이 클론으로부터 원하는 항-이디오형 모노클로날 항체를 얻는 방법으로 바람직하게 제조할 수 있다.

상기의 과정에서 항체 FH-6, FH-2, AH-6, CA 19-9, FH-7 또는 FH-9와같은 항원으로 면역시키는 포유동물에는 특정한 제한은 없다. 그러나 사용되는 형질세포종 세포와 포유동물의 세포와의 융합에 대한 아미아빌리티(ameability)를 고려하여 적당한 동물을 선택하는 것이 바람직하다.

일반적으로 새앙쥐 속의 쥐와 무스속의 쥐가 유용하게 사용된다. FH-6등의 항체를 포유동물의 정맥내나 피하내 또는 복강내로 투여하는 통상적인 방법으로 포유동물을 면역시킬 수 있으며, 더욱 바람직한 것은 적당한 농도가 되도록 PBS 등으로 FH-6등의 항체를 희석시키고 송아지 혈청 알부민(BSA)등의 일반적인 담체와 이 항체를 결합시킨 후 총 투여량이 약 l-100㎍/동물의 양으로 매 2-14일마다 수차례, 또는 필요한 때에 동물에게 이 항체를 투여하는 것이다.

또한 통상적인 보조제도 투약시에 사용될 수 있다. 면역시키는 세포들로서 사용될 수 있는 항원을 최종 투여한 후 3일후에 비장세포들을 제거하는 것이 바람직하다. 면역 세포들과 융합시키는 다른 숙주 세포들인 포유동물의 형질 세포종으로서는 P³(P³/X63-Ag8)[Nature, 256, 495-497 (1975)], P3-U1[Current Topics in Microbiologh and Immunology, 81, 1-7 (1978)], NS-1(Eur, J. Immunol, 6, 511-519(1976), MPC-11[Cell, 8, 405-415 (1976)], SP2/0[Nature, 276, 269-270 (1978)], Fo[J. Immuno1, Meth , 35-1-21 (1980)]X68. 5. 3. [J. Immuno1, 123, 1548-1550 (1979)], S194[J. Exp. Med., 148, 313-323 (1978)]etc., R210[Nature, 277, 131-133 (1979)]과 같은 골수종 세포들을 포함하여 다양한 공지의 쌜라인들이 있다. 형질구 세포들과 면역세포들 사이의 융합은 밀스테인(Milstein)등의 방법(메쏘드 인 엔자몰로지, 73권, P3 (1981))과 같은 공지의 방법들에 의해서 기본적으로 수행된다. 더욱 상세히는 융합촉진제의 존재하의 통상적인 영양배지중에서 융합반응을 수행된다.

유용한 융합촉진제의 예로서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 일본의 혈구 응집성 바이러스(HVJ)등과 같은것이 통상적으로 사용된다. 융합 효율을 향상시키기 위하여, 다이메틸 술폭사이드와 같은 보조제들도 필요하다면 배지에 가하여 사용될 수 있다.

면역세포들과 형질 세포종 세포들은 통상적인 비율로 사용된다. 예를들면 면역 세포들은 형질세포종 세포들에 대하여 1-10배의 양으로 사용된다. 융합에 유용한 배지의 예로서는 형질세포종 세포들은 증식시키는데 사용되는 PRMI-1640 배지와 MEM 배지를 들 수 있으며, 또한 이러한 종류의 세포들을 배양시키는데 사용되는 각종의 배지들도 사용될 수 있다.

일반적으로 태아 송아지 혈청(FCS)과 같은 혈청 보충제를 첨가한 배지를 사용하는 것이 바람직하며, 이 성분은 후에 제거되게 된다. 융합을 일으키게 하기 위하여는 사전에 결정된 양으로 면역시키는 세포들과 형질세포종 세포들을 배지중 철저히 혼합시키고, 사전에 약 37℃로 가열한 평균 분자량이 약 1000-6000인 PEG의 용액을 통상적으로 약 30-60W/V%의 농도가 되도록 배지에 가한다. 이어서 원심분리하고 상등액을 제거할 때마다 적당한 배지를 배양물에 수시로 가한다.

이러한 절차를 반복하여 원하는 하이브리도마를 얻는다. 이렇게하여 얻어진 원하는 하이브리도마를 HAT 배지(하이포싼씬, 아미노프테린, 티미딘을 함유)와 같은 통상적인 선발배지중에서 배양하여 더욱 분리한다. HAT 배지중에서의 배양은 원하는 하이브리도마 세포들 이외의 세포들(즉 융합되지 않는 세포들)이 사멸하기에 충분한 소정기간동안 행하여 지게되며, 이 기간은 통상적으로 수일에서 수주까지이다. 이렇게하여 얻어진 하이브리도마 세포들을 통상적인 제한 희석 방법을 사용하여 원하는 항-이디오형 항체를 생산하는 클론을 회수하는 것에 의해서 모노클로날 항체를 생산할 수 있게 된다. 항체를 생산하는 클론은, ELISA 방법(Engval1, E., Meth. Enzymol, 70, 419-439(1980), 플래그(plague)방법, 스포트(Spot)방법, 응집반응방법, 오그터로니(Ouchterlony)방법, 방사선 면역검정법(RIA)등과 같은 항체를 검출하기 위하여 일반적으로 사용되는 각종의 방법들을 사용하여 회수될 수 있다. 원하는 항-이디오형 항체는 항체 FH-6, FH-2, AH-6, CA 19-9, FH-7 또는 FH-9와 특이적인 반응성을 나타내는 동시에 같은 종류의 다른 어떤 항체와도 반응성을 나타내지 않는 항체를 사용하여 확인될 수 있다. 원하는 항체의 검출을 위하여는 정제된 FH-6, FH-2, AH-6, CA 19-9, FH-7 또는 FH-9항체를 사용하는 것이 유리하다.

본 발명자들에 의하여 이미 확립된 본 발명의 항-이디오형 항체를 사용할 경우에는 정제된 항체 FH-6 등은 면역침전법, 친화토그로마트로라피등의 방법에 의하여 용이하게 얻어질 수 있다. 또한, 정제된 FH-6, FH-2, AH-6, CA 19-9, FH-7 또는 FH-9항체와 같은 면역시키는 항원을 사용하는 것이 유리하다. 이와 같은 방법으로 시알릴 Le^x-i와 FH-6와의 반응, Le^x와 FH-2와의 반응, 푸코실 Le^x와 AH-6와의 반응, 시알린 Le^a와 CA 19-9와의 반응, 디시알릴 Le^a와 FH-7과의 반응 또는 디시알릴 형-1과 FH-9과의 반응을 억제시키는 활성에 근거하여, 원하는 항-이디오형 항체를 생산하는 특정한 형의 하이브리도마를 선발하는 것으로, 본 발명의 항-이디오형 항체를 생산하는 원하는 하이브리도마를 얻을 수 있다. 이들 하이브리도마들은 통상적인 배지중에서 예비 배양될 수도 있으며, 기간을 연장시키기 위하여 액체질소를 사용하는 것으로 용이하게 보존할 수도 있다.

본 발명의 원하는 항-이디오형 항체는 통상적인 방법으로 항체를 생성하는 하이브리도마를 배양하여 배양상등액으로부터 얻을 수 있으며, 또는 하이브리도마를 증식시킬 수 있는 포유동물에 이 하이브리도마를 투여하여 포유동물에 복수증을 일으킨 다음 이 복수로부터 얻을 수도 있다. 전자는 고도로 정제된 형태의 항체를 제조하는데 적합하며, 후자는 항체의 대량생산에 적합하다.

원한다면, 본 발명의 항-이디오형 항체는 염석, 흡착법, 젤여과, 친화크로마토그라피등과 같은 통상적인 방법으로 용이하게 정제될 수 있다.

본 발명의 항-이디오형 항체를 사용하게 되면, 특히 체액중에 존재하는 탄수화물성 항원(즉 시알린 Le^x-i, Le^x, 푸코실 Le^x, 시알린 Le^a, 디시알린 Le^x또는 디시알릴 형-1)과 이것들에 대한 특이적 항체를 매우 높은 감도로 정확하게 측정할 수 있다.

따라서 본 발명에 의하여 제공되는 항-이디오형 항체는 암이 초기 단계라 할지라도 암의 정확한 식별 및 진단을 위하여 유용하게 사용될 수 있다. 탄수화물성 항원과 항체들은 본 발명의 항-이디오형 항체와 체액등과 같은 시료를 접촉시켜 그 반응성을 측정하는 등의 통상적인 면역학적 측정 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 방법들로서는 예를들면 RIA, 효소면역검정법(FIA), 응집반응방법, 유동혈구계산법(FCM)등을 들 수 있다. 이러한 방법들은 경쟁법, 샌드위치법, 유동혈구계산기등의 일반적으로 사용되는 방법이나 장치등을 사용하여 수행될 수 있다.

측정용 시료로서 유용한 체액의 예로서는 혈액, 세포액, 림프, 흉막액, 복막액, 양수액, 위액, 소변, 췌장액, 척수액, 타액등이 있다. 이들중에서도 혈액, 특히 혈청이나 혈장이 바람직하다. 상기의 면역학적 측정방법에 있어서 이 측정시스템 중의 항원이나 항체는 통상적인 방법으로 불용성인 담체와 화학적 또는 물리적으로 반응시켜서 불용성화 시킨다. 유용하게 사용될 수 있는 불용성 담체의 예로서는, 셀룰로오스 분말, 세파댁스, 세파로스, 폴리스틸렌, 여과지, 카복시메틸셀룰로오스, 이온교환수지, 텍스트란, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브나일론, 유리구슬, 명주, 폴리아민-메틸 비닐에테르-말레인산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레인산 공중합체 등이 있다.

불용성화는 공유결합법인 디아조방법, 펩타이드방법 (아미노산 유도체, 카복시클로라이드수지, 카보다이이미드수지, 말레익 안하이드라이드 유도체, 아이소시아네 이트 유도체, 시안 브로마이드-활성화 다당류, 셀룰로오스 카보네이트유도체, 축합제등을사용), 알킬레이션방법, 가료제를 사용하는 담체결합방법(가교제로서 글루타랄데하이드, 헥사메틸렌 아이소시 아네이트등을 사용), Ug1반응에 의한 담체결합 방법등의 화학적 방법 ; 이온교환 수지와 같은 담체를 사용하는 이온결합방법 ; 담체로서, 유리구슬이나 공극성 유리등을 사용하는 물리적 흡착방법 등에 의하여 달성될 수 있다.

응집반응 방법이 사용될 경우에 본 발명의 항체는 응집반응 시험에 통상적으로 사용되는 적혈구나 라택스입자등의 입자(감작화시킨; sensitized with)에 흡착시킨 것을 사용한다.

상기의 측정방법에 있어서 항원이나 항체의 표시를 위해서는 방사성물질 효소적 표시물질과 형광물질등의 각종의 통상적인 표시제들이 사용된다. 유용한 표시제의 예로서는¹²⁵I나 이와유사한 방사성 I와 같은 방사성 물질과 플루오레신 아이소티오시 아테이트(FITC), 테트라메틸로 다민 아이소티오시아네이트(TRITC), 로다민이 치환된 아이소티오 시아네이트(XRITC), 로타민 B 아이소티오시아테이트, 다이클로로트리아진플루오레신(DTAF)등의 형광물질, 퍼록시다제(POX), 미옐로퍼록시다제, 키모트립시노젠, 프로카복시펩티다제, 글리세로알데하이드-3-포스페이트 대하이드로게나제, 알밀라제, 포스포릴라제, 데옥시리보뉴클레아제(DNA 아제), 리보뉴클레아제(DNA 아제), 알칼리 포스파라제, β-갈락토시다제 등과 같은 효소적 표시물질을 들 수 있다. 이러한 표시제들은 통상적인 방법으로 사용된다. [J. Biol. Chem., 254, 9349-9351(1979); Nature, 194, 495 (1962); Acta. Endocrinol Suppi , 168, 206 (1972); Proc. Nat. Acad. Sci USA, 57, 713 (1967); 등을 참조]

측정방법에 있어서의 반응은 이러한 종류의 통상적인 면역반응을 사용하여 수행된다. 이 측정 시스템에서 사용되는 용매는 반응에 불리한 영향을 주지않는 통상적인 것을 사용한다.

바람직한 용매의 예로서는 시트레이트 완충용액, 인산완충용액, 트리스-HC1 완충용액, 초산완충용액등을 들 수 있다. 면역검정 시스템의 조건을 특별한 제한은 없으나, 본 발명과 같은 유형의 측정방법에 통상적으로 사용되는 조건들을 사용한다. 더욱 상세히는 이 면역 반응은 통상적으로 45℃ 이하의 온도에서 수행되며, 바람직하게는 4-40℃ 의 온도로 1-40시간 동안 반응시킨다. 반응후 결합되어 있는 생성물을 공지의 방법을 사용하여 유리된 물질(B-F)로부터 분리시킨다.

불용성화 방법을 사용할 경우, 고체상은 원심분리, 여과, 수세 또는 가만히 따라내는 방법들을 사용하여 액체상으로부터 분리될 수 있다. 다른 경우에 있어서는 텍스트란으로 코팅한 목탄법, 더블항체법 등과 같은 통상적인 방법이 사용된다.

본 발명의 측정방법에 었어서, 다음과 같은 특성을 갖는 항-이디오형 항체를 사용하였다.

(1) 본 발명의 항-이디오형 항체는 항체 FH-6만을 인식하는 항-이디오형 항체와 항체 FH-2만을 인식하는 항-이디오형 항체, 항체 AH-9만을 인식하는 항-이디오형 항체, 항체 CA 19-9만을 인식하는 항-이디오형 항체, 항체 FH-7만을 인식하는 항-이디오형 항체, 항체 FH-9만을 인식하는 항-이디오형 항체의 6가지 종류로 되어 있다. 따라서 체액중에 존재하는 탄수화물성 항원(즉 시알릴 Le^x-i, Le^x, 푸코실 Le^x, 시일릴 Le^a, 디시알릴 Le^a또는 디시알릴 형-1)에 대한 자가항체를 측정하는 시스템에 사용하는데에 있어서 본 발명의 항-이디오형 항체는 상기와 같은 항원에 특이적인 항체로서 매우 유용하게 사용될 수 있다. 항-인간 IgG 항체나 단백질 A를 사용하는 통상적인 자가항체 측정 시스템은 항상 많은 비특이적인 결함 반응을 일으키므로 강도가 낮은 결점이 있으며, 따라서 측정하는데 다량의 시료가 필요하다. 반면에 어떠한 비특이적인 반응도 일으키지 않는 본 발명의 항-이디오형 항체를 사용하게 되면, 편리한 응집반응 방법과 같은 직접적인 방법으로 간단하고도 유리하게 측정할 수 있다. 더우기 본 발명의 항체를 형광제로 표시하게 되면, 유동혈구 계수법으로 측정할 수 있게되며, 또한 자가항체를 생산하는 세포들에 대하여 분액법을 사용할 수 있게 된다.

(2) 시알릴 Le^x-i와 항체 FH-6, Le^x와 항체 FH-2, 푸코실 Le^x와 항체 AH-6, 시알릴 Le^a와 항체 CA 19-9, 디시알릴 Le^a와 항체 FH-7, 디시알릴 형-1과 항체 FH-9사이의 반응을 투여량에 의존적으로 억제하는 유형의 본 발명의 항체들은 암 항원들이나 항체들을 측정하는 시스템에서 정제된 항원들로서 제공되는 표준항원 또는 원하는 표시되거나 불용성화시킨 항원으로서 만족스럽게 사용될 수 있다.

이러한 검정 시스템에서 사용하기 위하여 제공된 정제된 항원들은 그 감도와 정확성을 크게 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 종래에는 통상적으로 실행될 수 없는 방법인 표시된 항원을 사용한 경쟁 검정법의 사용을 가능하게 할 수 있다.

(3) 시알릴 Le^x-i와 항체 FH-6, Le^x와 항체 FH-2, 푸코실 Le^x와 항체 AH-6, 시알릴 Le^a와 항체 CA 19-9, 디시알릴 Le^a와 항체 FH-7, 디시알릴 형-1과 항체 FH-9사이의 반응에 어떠한 억제효과도 나타내지 않는 유형의 본 발명의 항-이디오형 항체는 이 시스템 중에서 유용하게 사용될 수 있으며, 여기서 항체들은 암 항원의 측정과 항체에 특이적인 이차 항체와 같은 항체들의 증식에 사용되며, 측정에 있어서 매우 향상된 감도를 나타낼 수 있게 된다.

본 발명의 항-이디오형 항체에 대한 전술한 특성에 근거하여 적절한 측정 시스템이 제공될 수 있으며, 예를들면, 다음과 같은 방법들을 들 수 있다.

탄화수소 결합을 포함하고 있는 암 항원을 측정하는 시스템의 예들을 다음에 나타냈다.

(1) 표시된 항-이디오형 항체와 시료 또는 표준물질 그리고 항원으로서 제공된 항체를 반응시킨 다음 항-쥐 항체를 사용하는 더블 항체법으로 처리하는 검정시스템.

고체상의 형태로 만든 항-이디오형 항체와 시료 또는 표준물질 그리고 임뮤노겐(특이적항체)으로서 제공된 표시된 항체를 반응시킨 다음 고체상 경쟁법으로 처리하는 검정시스템.

(3) 항원으로 코팅한 구슬과 시료 또는 표준물질 그리고 임뮤노겐으로서 제공된 표시된 항체를 반응시킨다음 고체상 경쟁법으로 처리한 후, 항원-항체 반응을 억제시키지 않는 유형의 표시된 항-이디오형 항체를 사용하여 증식시키는 검정시스템.

탄화수소 결합을 포함하는 암 항원에 대한 자가항체를 측정하는데 유용한 시스템의 예들을 다음에 나타냈다.

(1) 고체상의 형태로 만든 항-이디오형 항체와 시료 또는 표준물질을 반응시킨 다음 표시된 항-이디오형 항체와 생성물이 더욱 반응하도록 샌드위치 검정법으로 처리하는 검정시스템.

(2) 고체상의 형태로 만든 항-이디오형 항체와 시료를 반응시킨 다음, 표시된 항-인간 IgG와 생성물이 더욱 반응하도록 샌드위치 검정법으로 처리하는 검정시스템.

(3) 표시된 항체(임뮤노겐)과 항-이디오형 항체 그리고 시료 또는 표준항체를 반응시킨 다음, B/F분리를 위하여 항-쥐 IgG를 사용하는 더블항체법에 따른 액상경쟁법으로 처리하는 검정시스템.

(4) 고정화 항체(임뮤노겐)와 표시된 항-이디오형 항체 그리고 시험시료나 표준시료를 반응시키는 경쟁법으로 처리하는 검정시스템.

이들 측정밥법들은 본 발명의 항-이디오형 항체를 병합시킨 검정키트(Kit)를 사용하여 매우 편리하게 수행될 수 있다. 암은 본 발명의 항-이디오형 항체를 포함하고 있는 전달자로 구성되어 있는 이러한 키트를 사용하여 용이하게 식별, 진단될 수 있다. 이러한 키트의 항체 제제는 글리세롤이나 송아지 혈청 단백질과 같은 안정제나 보존제가 첨가될 수도 있다. 바람직하게는 항체 제제가 친액성인 것이 좋다. 이 키트는 물에 섞이거나 용해될 수 있는 용매가 포함될 수도 있다. 재구성 또는 보존제, 안정제를 첨가한후 시료를 보호하기 위하여, 사용전에 미리 결정된 PH로 이 제제 시스템을 유지하기 위한 완충용액을 이 항체 제제에 첨가할 수도 있다.

비록 완충용액은 이 키트 제제의 필수적인 성분으로 간주되지는 않지만 본 방법을 실행할 때 이 시스템에 PH가 약 4-8이 되도록 완충액을 가하는 것이 바람직하다. 이렇게 재구성된 제제는 물을 포함하는 것이 바람직하기는 하지만 물과 섞일 수 있는 용매로 된것도 사용될 수 있다. 물과 섞일 수 있는 용매들은 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구나 잘 알고 있다.

유용한 용매의 예로서는 알콜, 글리콜, 글리콜 에테르등을 들 수 있다.

본 발명을 다음의 실시예, 참고예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명하기로 한다.

[실시예 1]

항-이디오형 항체의 제조.

(1) 항-이디오형 항체에 대한 항원으로서 제공된 100㎍의 항체 FH-6(Fukushl, Y., Nudelman, E., Levery, B. S. and Hakomori, s., J. Biol. Chem., 259, 10511-10517(1984))를 포함하는 인산완층 Nac1 용액(500㎍. pH 7.4)을 현탁액을 제조하기 위하여 동량의 푸레운드의 완전보조제(Freund's complete adjuvant) (DIFCO 라보러터리, 디트로이트, 미시간, 미국)와 혼합한다.

20㎍의 FH-6에 상응하는 양의 현탁액을 위스터 쥐의 피하내로 투여한다. 20㎍의 FH-6에 상응하는 양의 현탁액을 위로부터 2주일 후에 쥐에 투여한다. 이로부터 2주일 후에 200㎍의 FH-6가 포함된 생리식염수를 피하내로 투여한다. 최종투여한지 3일후에 비장을 제거하고, 이 비장세포들을 RPMI-01640 배지로 세차례 씻어낸다.

쥐의 골수종 세포수 p3U1(커렌트 토픽스인 마이크로 바이올러지 앤드 임뮤놀러지, 81, 57, 1978)을 같은 방법으로 씻는다. 상기와 같이 하여 얻은 수세한 세포들을 예를들면, 4×10'7 세포와 2×10⁸비장세포들로 하여 50m1의 원심분리관에 넣고 섞은 다음 200G로 5분간 원심분리한다. 상등액을 파스퇴르 피펫으로 제거한다. 37℃로 유지한 50W/V%의 폴리에틸렌글리콜 1500(베링거만하임 야마노우찌 사)이 함유된 2㎖의 RPMI-1640액을 1분간 상기에서의 침전물에 점적한다. 이어서, 37℃로 유지한 FCS가 함유되어 있지 않는 1㎖ 의 RPMI-1640액을 혼합물에 가하여 1분간 방치한 다음, 같은 용액 2㎖을 가한후, 2분간 더 방치한다. 같은 용액 4㎖을 가한후, 4분간 방치한다. 그 다음, 이 혼합물에 15% FCS, 0.05g효력(potency)1의 황산스트렙토마이신, 60000단위/1의 페니실린 G 포타슘, 54㎎/1의 젠타마이신과 1mM 피루베이트가 함유된 8㎖의 RPMI-1640(이하 ''완전 RPMI''라 칭한다)을 가하고, 이 혼합물을 200G로 5분간 원심분리한다.

상등액으로부터 분리한 침전물을 37℃로 유지한 완전 RPMI에 2×10⁶비장세포/㎖의 농도로 현탁시킨다. 이 현탁액을 24-웰 마이크로 플레이트(코스타 사)의 각 웰에 0.1㎖씩 넣고, 37℃의 배양기내에서 5% CO₂하에 배양시킨다.

이로부터 24시간후, 1.0×10⁴M하이포싼씬, 4.0×10⁷M 아미노프테린과 1.6×10⁵M 타미단을 함유하고 있는 0.1m1의 완전 RPMI 배지(이하 "HAT 배지"라 칭한다)를 각 웰속에 가한다.

이 상등액의

씩을 3, 5, 7일째에 신선한 HAT 배지로 교체한다. 9일째되는 날에, 이 상등액의

을 1.0×10⁴M 하이포싼신과 1.6×10⁵M 타미단을 함유하는 완전 RPMI 배지(이하 "HT 배지"라 칭한다)로 교체한다. 이와 유사하게, 상등액의

씩을 12, 15, 18, 21째 되는 날에 HT 배지로 교체하고, 24일째되는 날에 완전 RPMI 배지로 교체한다. 이 배양물은 그후, 완전 RPMI 배지를 사용하여 중식을 시키게 된다.

이렇게 하여 얻어진 하이브리도마를 제한 희석법으로 클로닝시킨다. 2.5×10 하이브리도마/㎖과 4×10⁸세포/㎖의 Balb/C 혈통인 쥐의 흉선을 완전 RPMI 배지에 현탁시킨 다음, 이 현탁액을 5 하이브리도마/웰의 양으로 96-웰 플레이트에 넣고 배양시킨다. 생육된 하이브리도마를 0.5 하이브리도마/웰의 농도로 유사하게 클로닝 시킨다. 원하는 항-이디오형 항체를 생산하는 클론을 다음방법에 따라 회수한다. FH-6와 항체AH-6(Abe, K., Mckibbin, J. M. and Hakomori, S., J. Biol., Chem, 258 11793-1l797(1983))와 송아지 혈청알부민(BSA)을 불용화 시키면서 96-웰 플레이트에 넣는다. 각 웰속에서 클로닝시키는 동안 50㎍의 배양상등액을 가하고, 50㎍의 인산 완충용액을 가한 다음, 실온에서 1시간 동안 진탕하여 반응시킨다.

그후, 이 반응혼합물을 증류수로 씻어서 반응되지 않은 물질들을 제거한다. 각 웰속에 100㎕의 6000배로 희석하여 퍼록시다제로 표시된 항-쥐 IgG(카펠사)를 넣고, 실온에서 30분간 진탕하여 반응시킨다. 증류수로 반응되지 않은 물질들을 씻어낸 후, 2.5㎎/㎖의 0-페닐렌다이아민이 함유된 0.01%의 H₂O₂100㎕을 각 웰속에 가하고, 실온에서 15분간 플레이트를 정지시킨 상태에서 반응시킨다. 발색된 마이크로플레이트를 마이크로리더("Titertek Multiskan R MCC", Flow Laooratories Inc., U.S.A )를 사용하여 492nm에서 측정하였다 FH-6에만 양성반응(결합특성)을 나타내는 본 발명의 항체를 생산하는 클론을 선발한 다음, 다음의 억제시스템 선별법을 수행하였다. 각 클론의 상등액(50㎕)을¹²⁵I로 표시된 FH-6의 200㎕(C.a.50000Cpm)과 1시간 동안 실온에서 진탕하여 반응시킨 다음, 항원으로서 제공된 PC-9추출물로 코팅한 한개의 구슬과 실온에서 1시간 동안 진탕시켜 배양시킨후, 이 구슬의 방사능을 측정하여, FH-6와 항원사이의 결합을 억제시키는 클론의 활성을 검사한다. 기준으로서 배양상등액으로부터 유리된 시스템의 억제활성과 비교하여 클론을 선발한다.

이 두가지 선별시스템과 제한 희석법을 사용하여, FH-6와 항원(시알릴 Le^x-i)사이의 반응을 억제시키기 않는 본 발명의 항체를 생산하는 원하는 하이브리도마세포들인 두개의 클론(클론번호; OAL-AId-6A와 OAL-AId-6C) 과 세 개의 클론(클론번호; OAL-AId-6D, OAL-AId-6E와 OAL-AId-6F) 을 얻는다. 대표적인 예로서, 하이브리도마 OAL-AId-6F를 ATCC에 기탁하였다(ATCC기호; HB9207). 두 가지 유형의 대표로서, OAL-AId-6A와 OAL-AId-6F를 다음에서 설명하기로 한다. 억제 시스템 선별법에서 항원으로 사용되는 PC-9추출물을 코팅한 구슬은 시알릴 Le^x-i를 발현하는 것을 알려진 암세포주 PC-9(Cancer Res., 42, 601-608(1982))의 배양상등액을 퍼클로린산(PCA)로 추출하고, 이 추출물은 세파로스 CL-6B로 처리한 다음, 결과된 글라이코프로테인이 구슬에 흡착(불용성화)시켜서 제조된다.

(2) 상기의 절차(1)에서 얻어진 클론번호 OAL-AId-6A 또는 OAL-AId-6F를 5%이내의 CO₂로 완전 RPMI 배지중에서 37℃로 48시간 동안 배양한다 배양액을 원심분리(3000rpm, 10분간)시킨다.

이와같이 하여, 이 배양상등액은 원하는 모노클로날항체(이하 OAL-AId-6A와 -6F를 각기 "AId-6A''와 ''AId-6F''로 칭한다)를 포함하게 된다. 이 항체들은 쥐의 모노클로날 타이핑키트(Miles Scientlfic 사제품)에 의하여 인식되므로 IgG₂a류에 속하는 것을 판단되었다.

(3) 절차(1)에 의하여 얻어진 클론번호 AId-6A 또는 AId-6F(1×10⁷세포)를 0.5㎖의 RPMI-1640 배지에 현탁시키고, 이 현탁액을 털을 깎은 쥐의 복막내로 투여한다. 2-3주일후에, AId-6A나 AId-6F가 함유된 복수를 모은다. 항체의 농도는 약 0.2-5㎎/㎖이었다.

상기의 절차(2)에서 얻은 배양상등액이나 위에서 얻은 복수를 2배로 희석시킨 다음, 항체 FH-6의 고체상을 품고 있는 세파로스(파마시아 제품인 BrCN-활성화 세파로스 CL-4B를 사용하여 제조)를 사용하여 친화 크로마토그라피로 처리한다. 이와같이 하여, 정제된 AId-6A와 AId-6F를 얻는다.

[실시예 2]

항-이디오형 항체의 제조.

(1) 항-이디오형 항체에 대한 항원으로서 제공된 100㎍의 항체 FH-2(Biochem. Biophys. Res. Commun., 100, 1578-1586(1981); J. Biol. Chem., 259, 4672-4680(1984) ) 를 포함하는 인산완충 NaCl용액(500㎕, pH7.5)을 현탁액을 제조하기 위하여 동량의 푸레운드의 완전보조제(Freund's complete adjuvant) (DIFCO 라보러터리, 디트로이트, 미시간, 미국)와 혼합한다.

20㎍와 FH-2에 상응하는 양의 현탁액을 위스터 쥐의 피하내로 투여한다. 실시예 1의 절차(1)에서와 같은 방법으로 이 쥐를 더욱 면역시키고, 하이브리도마를 얻기 위하여 세포융합을 시킨다음, 제한 희석법을 사용하여 클로닝시킨다.

원하는 항-이디오형 항체를 생산하는 클론을 다음 방법에 따라 회수한다. 정제된 FH-2와 정제된 쥐의 IgM을 불용화시키면서 96-웰 플레이트에 넣는다.

각 웰속에서 클로닝시키는 동안 50㎕의 배양상등액을 가하고, 50㎕의 인산완충용액을 가한다음, 실온에서 1시간 동안 진탕하여 반응시킨다.

FH-2에만 양성반응(결합특성)을 나타내는 본 발명의 항체를 생산하는 클론을 실시예 1의 절차(1)과 같은 방법으로 선발한 다음, 다음의 억제시스템 선별법을 수행하였다. 각 클론의 상등액(5O㎕)을¹²⁵I로 표시된 FH-2의 200㎕(C, a, 50000cpm)과 실온에서 한시간 동안 진탕시켜 반응시켰다. 이 반응혼합물 200㎕을 항원으로서 제공된 PC-7세포들이 고정된 마이크로플레이트에 넣고 실온에서 20분간 진탕하여 반응시켰다.

FH-2와 항원사이의 결합을 억제시키는 활성을 세포들이 고정된 마이크로플레이트의 방사능을 측정하여 검사한다. 기준으르서 배양상등액으로부터 유리된 시스템의 억제활성과 비교하여 클론을 선발한다. 이 두가지 선별시스템과 제한 희석법을 사용하여, FH-2와 항원 Le^x사이의 반응을 억제시키는 활성이 낮은 본 발명의 항-이디오형 항체를 생산하는 원하는 하이브리도마 세포인 한개의 클론 (클론번호; OAL-AId-2×16, OAL-AId-2×24, OAL-AId-2×26과 OAL-AId-2×42)과 상기의 활성이 높은 본 발명의 항-이디오형 항체를 생산하는 네개의 클론(클론번호; OAL-AId-2×50)을 얻는다. 대표적인 예로서, 하이브리도마 OAL-AId-2×26을 ATCC에 기탁하였다(기탁 기호 ; HB9447). 억제시스템 선별법에서 항원으로 사용되는 PC-7이 고정된 마이크로플레이트는 폴리 L-라이신과 글루타랄데하이드를 사용한 플레이트상에서 탄화수소 결합구조 L^x(Yoshihiro Hayata et al., Igakuno Ayumi(Progres of Medicine), 90, 36, 1974; and Takayoshi Ohtani et al, Haigan(Lung Cancer), 16, 67, 1976)를 발현시키는 것으로 알려진 암의 썰라인PC-7의 세포들을 불용성화시키는 것으로 얻어진다.

(2) 상기의 절차(1)에서 얻어진 각 클론들, 즉 클론번호 OAL-AId-2×42, OAL-AId-2×16, OAL-AId-2×24, OAL-AId-2×26 또는 OAL-AId-2×50을 5%이내의 CO₂로 완전 RPMI배지중에서 37℃로 48시간 동안 배양한다. 이 배양액을 원심분리(3000rpm, 10분간)시킨다. 이와같이 하여 이 배양상등액은 각각 원하는 모노클로날항체(이하 "AId-1", "AId-2", "AId-3"M "AId-4"와 "AId-5"라 칭한다)를 포함하게 된다. 쥐의 모토클로날 타이핑키트(Miles Scientific사 제품)에 의하여 인식되는 것을 판단하여, OAL-AId-2×16, OAL-AId-2×24와 OAL-AId-2×26은 IgG₁류에 속하는 것으로 판명되었으며, OAL-AId-2×42의 OAL-AId-2×50은 IgG₂류에 속하는 것으로 판명되었다.

(3) 절차(1)에 의하여 얻어진 클론번호 OAL-AId-2×42, OAL-AId-2×16, OAL-AId-2×24, OAL-AId-2×26 또는 OAL-AId-2×50(1×10⁷세포)을 0.5㎖의 RPMI-1640배지에 현탁시키고, 이 현탁액을 털을 깎은 쥐의 복막내로 투여한다. 2-3주일후에, AId-1, AId-2, AId-3, AId-4 또는 AId-5를 포함하는 복수를 모은다. 항체 농도는 약 0.2-5㎎/㎖이었다.

상기의 절차(2)에서 얻은 배양상등액이나 위에서 얻은 복수를 2배로 희석시킨 다음, 항체 FH-2의 고체상을 품고 있는 세파로스(파마시아 제품인 BrCN-활성화 세파로스 CL-4B를 사용하여 제조)를 사용하여 친화크로마토그라피로 처리한다. 이와같이 하여, 정제된 AId-1, AId-2, AId-3, AId-4와 AId-5를 얻는다.

[실시예 3]

(1)항-이디오형 항체에 대한 항원으로서 제공된 100㎍의 항체 AH-6(J. Biol. Chem., 258, 11793-11797, 1983)를 포함하는 인산완충 NaCl용액(500㎕, pH7.4)을 현탁액을 제소하기 위하여 동량의 푸레운드의 완전보조제 (Frenud's complete adjuvant) (DIFCO 라보러터리, 디트로이트, 미시간, 미국)와 혼합한다. 20㎍의 AH-6에 상응하는 양의 현탁액을 위스터 쥐의 피하내로 투여한다. 실시예 1의 절차(1)에서와 같은 방법으로 이 쥐를 더욱 면역시키고, 하이브리도마를 얻기 위하여 세포융합을 시킨다음, 제한 희석법을 사용하여 클로닝시킨다.원하는 항-이디오형 항체를 생산하는 클론을 다음 방법에 따라 회수한다. 정제된 AH-6와 정제된 쥐의IgM을 불용화시키면서 96-웰 플레이트에 넣는다. 각 웰속에서 클로닝시키는 동안 50㎕의 배양상등액을 가하고, 50㎕의 인산 완충용액을 가한다음, 실온에서 1시간동안 진탕하여 반응시킨다. AH-6에만 양성반응(결합특성)을 나타내는 본 발명의 항체를 생산하는 클론을 실시예 1의 절차(1)과 같은 방법으로 선발한 다음, 다음의 억제시스템선별법을 수행하였다. 각 클론의 상등액(50㎕)을¹²⁵I로 표시된 AH-6의 200㎕(C, a, 5000cpm)과 실온에서 한시간 동안 진탕시켜 반응시켰다. 이 반응혼합물을 항원으로서 제공된 간암조직의 추출물로 코팅한 한개의 구슬을 반응혼합물에 가하고 실온에서 1시간동안 진탕하여 반응시켰다. AH-6와 항원사이의 결합을 억제시키는 활성을 구슬의 방사능을 측정하여 검사한다. 기준으로서 배양상등액으로부터유리된 시스템의 억제 활성과 비교하여 클론을 선발한다. 이 두가지 선별시스템과 제한희석법을 사용하여, AH-6와 항원 푸코실 Le^x사이의 반응을 억제시키는 활성이 낮은 본 발명의 항-이디오형 항체를 생산하는 원하는 하이브리도마세포인 한개의 클론(클론번호; OAL-AId-4Y40)과 상기의 활성이 높은 본 발명의 항-이디오형 항체를 생산하는 2개의 클론(클론번호; OAL-AId-4Y12, OAL-AId-4Y26)을 얻는다. 대표적인 예로서, 하이브리도마 OAL-AId-4Y12를 ATCC에 기탁하였다(기탁기호; HB9450) 억제시스템선별법에서 사용되는 동시에 항원으로서 사용되는 간암의 세포추출물로 코팅된 구슬은 AH-6항체와의 반응에서 양성인 결장암에서 전이된 간세포를 사용하여, 이 조직을 퍼클로린산으로 추출한다음, 결과된 글라이크프로테인을 흡착(불용성화)시킨 구슬로 제조된다.

(2) 상기의 절차(1)에서 얻어진 각 클론들, 즉 클론번호 OAL-AId-4Y40, OAL-AId-4Y12, 또는 OAL-AId-4Y26을 5%이내의 CO₂로 완전 RPMI배지중에서 37℃로 48시간 동안 배양한다. 이 배양액을 원심분리(3000rpm, 10분간)시킨다. 이와같이 하여, 이 배양상등액은 각각 원하는 모노클로날 항체(이하#AId-6", "AId-7"와 "AId-8"라 칭한다)를 포함하게 된다. 쥐의 모노클로날 타이핑키트(Miles Scientific사 제품)에 의하여 인식되는 것을 판단하여, OAL-AId-4Y40은 IgG₁류에 속하는 것으로 판명되었으며, OAL-AId-4Y26은 IgG₂류에 속하는 것으로 판명되었다.

(3) 절차(1)에 의하여 얻어진 클론번호 OAL-AId-4Y40, OAL-AId-4Y12 또는 OAL-AId-4Y26을 Ald-6, AId-7 또는 AId-8을 얻기 위하여 실시예 1의 절차(3)에서와 같은 방법으로 털을 깎은 쥐의 복막내로 투여한다. 이 액체를 항체 AH-6의 고체상을 품고 있는 세파로스를 사용한 친화 크로마토그라피로 처리한다. 이와같이 하여, 정제된 AId-6, AId-7과 AId-8을 얻는다.

[실시예 4]

(1) 항-이디오형 항체에 대한 항원으로서 제공된 l00㎍의 항체 CA19-9(Cancer Res, 43, 5489-5492, 1983)을 포함하는 인산완충 NaC1용액(500㎕, pH734)을 현탁액을 제조하기 위하여 동량의 푸레운드의 완전보조제(Freund's complete adjuvant)(DIFCO 라보러터리, 디트로이트, 미시간, 미국)와 혼합한다. 20㎍의 (A19 -9)에 상응하는 양의 현탁액을 위스터 쥐의 피하내로 투여한다. 실시예 l의 절차(1)에서와 같은 방법으로 이 쥐를 더욱 면역시키고, 하이브리도마를 얻기 위하여 세포융합을 시킨다음, 제한희석법을 사용하여 클로닝시킨다.

원하는 항-이디오형 항체를 생산하는 클론을 다음 방법에 따라 회수한다 CA19-9(J. B. C., 257, 14365-14369, 1982 Cancer Research, 43, 5489-5492, 1983)과 정제된 쥐 의 IgM을 96-웰 플레이트상에서 불용성화시킨다. 각 웰속에서 클로닝시키는 동안 50㎕의 배양상등액을 가하고, 50㎕의 인산완충용액을 가한 다음, 실온에서 1시간동안 진탕하여 반응시킨다. CA19-9에만 양성반응을 나타내는 본 발명의 항체를 생산하는 클론을 실시예 1의 절차(1)과 같은 방법으로 선발한 다음, 다음의 억제 시스템선별법을 수행하였다. 각 클론의 상등액(50㎕)을¹²⁵I로 표시된 FH-2의 200㎕ (C. a, 50000cpm)과 실온에서 한시간 동안 진탕시켜 반응시켰다.

항원으로서 제공된 KATO-III 세포추출물로 코팅된 한개의 구슬을 반응혼합물에 가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕하여 반응시켰다. 이 구슬의 방사능을 측정하여, CA19-9와 항원사이의 결합을 억제시키는 클론의 활성을 검사하였다. 기준으로서 배양상등액으로부터 유리된 시스템의 억제활성과 비교하여 클론을 선발하였다. 이 두가지 선별시스템과 제한희석법을 사용하여 CA19-9와 항원(시알릴 Le^a) 사이의 반응을 억제시키는 유형의 본 발명인 항-이디오형 항체를 생산하는 원하는 하이브리도마 세포인 한개의 클론(클론번호; OAL-AId-19A4)과 반응을 억제시키는 본 발명의 항-이디오형 항체를 생산하는 2개의 클론(클론번호; OAL-AId-19A7과 OAL-AId-19A10)을 얻는다. 대표적인 예로서, 하이브리도마 OAL-AId-19A4와 OAL-AId-19Al0을 ATCC에 기탁하였다(기탁번호; HB9461과 HB9448) 억제시스템 선별법에서 항원으로 사용되는 KATO-III는 시알릴 Le^a(Morimasa Sekiguchi et al, Soshiki Baiyo(Tissue Culture), 9(6), 201-207, 1983)를 발현시키는 것으로 알려진 암의 쎌라인 KATO-III의 배양된 세포들로부터 제조되며, 이 절차는 PBS로 추출시키고, PNA-세파로스(CL-6B로 처리하여 결과된 글라이코프로테인을 구슬에 흡착(불용성화)시켜 제조된다.

(2) 상기의 절차(1)에서 얻어진 클론번호 OAL-AId--19A4, OAL-AId-19A7 또는 OAL-AId-19Al0을 5%이내의 CO₂로 완전 RPMI배지중에서 37℃로 48시간 동안 배양한다. 이 배양액을 원심분리(3000rpm, 10분간)시킨다. 이와같이 하여, 이 배양상등액은 각각 원하는 모노클로날 항체(이하 "AId-9""AId-10""AId-11"이라 칭한다)를 포함하게 된다. 쥐의 모노클로날타이핑키트에 의하여 인식되는 것을 판단하여, OAL-AId-19A4와 OAL-AId-19A7은 IgG₂류에 속하는 것으로 판명되었으며, OAL-AId-1gAl0은 IgG₁류에 속하는 것으로 판명되었다.

(3) 절차(1)에 의하여 얻어진 클론번호 OAL-AId-19A4, OAL-AId-19A7 또는 OAL-AId-19Al0(1×10⁷세포)을 0.5㎖의 RPMI-1640배지에 현탁시키고, 이 현탁액을 털을 깍은 쥐의 복막내로 투여한다. 2-3주일에, AId-9, AId-10, 또는 AId-11을 포함하는 복수를 모은다.

이 액체를 항체 CA19-9의 고체상을 품고 있는 세파로스를 사용하여 친화크로마토그라피로 처리한다. 이와같이 하여, 정제된 AId-9, AId-10과 AId-11을 얻는다.

[실시예 5]

(1) 항-이디오형 항체에 대한 항원으로서 제공된 100㎍의 항체 FH-7(J. Biol. Chem, 261, 5487-5495, 1986)을 포함하는 인산완충 NaC1용액(500㎕, pH7.4을 현탁액을 제조하기 위하여 동량의 푸레운드의 완전보조제(Freund's compl-ete adjuvant)(DIFCO 라보러터리, 디트로이트, 미시간, 미국)와 혼합한다.

20㎍의 FH-7에 상응하는 양의 현탁액을 위스터 쥐의 피하내로 투여한다. 실시예 1의 절차(1)에서와 같은 방법으로 이 쥐를 더욱 면역시키고, 하이브리도마를 얻기 위하여 세포융합을 시킨다음, 제한희석법을 사용하여 클로닝시킨다.

원하는 항-이디오형 항체를 생산하는 클론을 다음 방법에 따라 회수한다. 정제된 FH-7과 정제된 쥐의IgM을 불용화시키면서 96-웰 플레이트에 넣는다.

각 웰속에서 클로닝시키는 동안 50㎕의 배양상등액을 가하고, 50㎕의 인산완충용액을 가한다음, 실온에서 1시간 동안 진탕하여 반응시킨다. FH-7에만 양성반응을 나타내는 본 발명의 항체를 생산하는 클론을 실시예 1의 절차(1)과 같은 방법으로 선발한 다음, 다음의 억제시스템선별법을 수행하였다. 각 클론의 상등액(50㎕)을¹²⁵I로 표시된 FH-7의 200㎕(C, a, 100000cpm)과 실온에서 한시간 동안 진탕시켜 반응시켰다. 항원으로서 제공된 태변추출물로 코팅된 한개의 구슬을 반응혼합물에 가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕하여 반응시켰다. 이 구슬의 방사능을 측정하여, FH-7과 항원사이의 결합을 억제시키는 클론의 활성을 측정하였다.

기준으로서 배양상등액으로부터 유리된 시스템의 억제 활성과 비교하여 클론을 선발한다. 이 두가지 선별시스템과 제한희석법을 사용하여, FH-7과 항원(시알릴 Le^a) 사이의 반응을 억제시키는 유형의 본 발명의 항-이디오형 항체를 생산하는 원하는 하이브리도마세포인 한개의 클론(클론번호; OAL-AId-7A1과 OAL-AId-7A2)과 반응을 억제시키지 않는 본 발명의 항-비디오형 항체를 생산하는 한개의 클론(클론번호 ; OAL-AId-7A3)을 얻는다. 대표적인 예로서, 하이브리도마 OAL-AId-7A1을 일본의 퍼멘테이션리서취 인스티튜트에 기탁번호 FERM BP-1522로 기탁하였다.

억제시스템선별법에서 항원으로서 사용되고, 태변추출물로 코팅된 구슬은 FH-7과의 반응에서 양성을 나타나는 1g의 태변에 5g의 0.6M피클로린산을 가하고, 워닝혼합기로 혼합물을 동질화시킨 다음, 이 혼합물을 150000×g로 30분 동안 원심분리시키고 결과된 상등액을 중성화시킨 후, 투석시킨 다음, 동결건조시켜서 제조한다. 이 생성물을 세파로스 CL-6B를 사용하여 젤여과시켜서 포획되지 않고 빠져나오는 분액을모은다. 이렇게하여, 글라이코프로테인을 흡착시킬 수 있는 구슬을 얻는다.

(2) 위에서 얻은 클론번호 OAL-AId-7Al, OAL-AId-7A2 또는 OAL-AId-7A3을 5%이내의 CO₂로 완전 RPMI배지중에서 37℃로 48시간 동안 배양한다. 이 배양액을 원심분리(3000rpm, 10분간)시킨다. 이와같이하여, 이 배양상등액은 각각 원하는 모노클로날항체(이하 "AId-7Al", "AId-7A2"와 "AId-7A3"라 칭한다)를 포함하게 된다. 쥐의 모노클로날타이핑키트(㎖les Scientific사 제품)에 의하여 인식되는것을 판단하여 IgG₂류에 속하는 것으로 판명되었다.

(3) 실시예 5-(1)에 의하여 얻어진 클론번호 OAL-AId-7Al, OAL-AId--7A2 또는 0AL-AId-7A3(1×10⁷세포)를 0.5m1의 RP㎖-1640배지에 현탁시키고, 이 현탁액을 털을 깍은 쥐의 복막내로 투여한다.

2-3주일후에, AId-7Al, AId-7A2 또는 AId-7A3를 포함하는 복수를 모은다. 항체 농도는 약 0.2-5㎎/㎖이었다.

상기의 절차(2)에서 얻은 배양상등액이나 위에서 얻은 복수를 2배로 희석시킨 다음, 항체 FH-6의 고체상을 품고있는 세파로스(파마시아 제품인 BrCN-활성화세파르스 CL-4B를 사용하여 제조)를 사용하여 친화크로마토그라피로 처리한다. 이와같이 하여, 정제된 AId-7A1, AId-7A2와 AId-7A3을 얻는다

[실시예 6]

항-이디오형 항체의 제조

(1) 항-이디오형 항체에 대한 항원으로서 제공된 100㎍의 항체 FH-9(Biochemistry, 25, 2859-2866, 1986)을 포함하는 인산완충 NaCl용액(500㎕, pH7.4)을 현탁액을 제조하기 위하여 동량의 푸레운드의 완전보조제(Freund's complete adjuvant) (DIFCO 라보러터리, 디트로이트, 미시간, 미국)와 혼합한다.

20㎍의 FH-2에 상응하는 양의 현탁액을 위스터 쥐의 피하내로 투여한다. 실시예 1의 절차(1)에서와 같은 방법으로 이 쥐를 더욱 면역시키고, 하이브리도마를 얻기 위하여, 세포융합을 시킨다음 사용하여 클로닝시킨다.

원하는 항-이디오형 항체를 생산하는 클론을 다음 방법에 따라 회수한다. 정제된 FH-9과 정제된 쥐의 IgG₁을 불용화시키면서 96-웰 플레이트에 넣는다.

각 웰속에서 클로닝시키는 동안 50㎕의 배양상등액을 가하고, 50㎕의 인산완충용액을 가한다음, 실온에서 1시간 동안 진탕하여 반응시킨다. FH-9에만 양성반응을 나타내는 본 발명의 항체를 생산하는 클론을 실시예 1의 절차(1)과 같은 방법으로 선발한 다음, 다음의 억제시스템선별법으로 수행하였다. 각 클론의 상등액(50㎕)을¹²⁵I로 표시된 FH-9의 200㎕(C, a, 50000cpm)과 실온에서 한시간 동안 진탕시켜 반응시켰다. 이 반응혼합물을 항원으로서 제공된 PC-7세포들이 고정된 마이크로플레이트에 넣고 실온에서 1시간 동안 진탕하여 반응시켰다. FH-9과 항원사이의 결합을 억제시키는 활성을 세포들이 고정된 마이크로플레이트의 방사능을 측정하여 검사한다. 기준으로서 배양상등액으로부터 유리된 시스템의 억제활성과 비교하여 클론을 선발한다. 이 두가지 선별시스템과 제한희석법을 사용하여, FH-9과 항원 디시알릴 형-1사이의 반응을 억제시키는 유형인 본 발명의 항-이디오형 항체를 생산하는 원하는 하이브리도마세포인 한개의 클론(클론번호; OAL-AId-9Al)을 얻는다. 하이브리도마 OAL-AId-9A1을 일본의 퍼멘테이션리서취 인스티튜트에 기탁번호 FERMBP-1523으로 기탁하였다. 억제시스템 선별법에서 항원으로서 사용되는 PC-7은 폐암 쎌라인 PC-7을 10⁵세포/웰의 양으로 폴리라이신의 고체상을 지닌 마이크로플레이트에 이 세포들을 넣고, 글루타랄데하이드로 이 세포들을 고정시켜 배양하는 것으로 제조되었다.

(2) 상기의 절차(1)에서 얻어진 클론번호 OAL-AId-9A1을 5%이내의 CO₂로 완전 RPMI배지중에서 37℃로 48시간 동안 배양한다. 이 배양액을 원심분리(3000rpm, 10분간)시킨다.

이와같이 하여, 이 배양상등액은 각각 원하는 모노클로날 항체("AId-9A1"이라 칭한다)를 얻는다.

쥐의 모노클로날 타이핑키트에 의하여 인식되는 것을 판단하여, OAL-AId-9A1은 IgG₂a류에 속하는 것으로 판명되었다.

(3) 절차(1)에 의하여 얻어진 클론번호 OAL-AId-9A1을 실시예 1-(3)과 같은 방법으로 털을 깍은 쥐의 복막내로 투여하였다. 2-3일후에, AId-9A1이 포함된 복수를 모았다. 항체 농도는 약 0.2-5㎎/㎖이었다.

상기의 절차(2)에서 얻은 배양상등액이나 위에서 얻은 복수를 2배로 희석시킨 다음 항체 FH-2의 고체상을 품고 있는 세파로스(파마시아 제품인 BrCN-활성화 세파로스 CL-4B를 사용하여 제조)를 사용하여 친화 크로마토그라피로 처리하여, 정제된 AId-9A1을 얻었다.

[참고예 1]

(1) 불용성화된 항체의 제조

실시예 1에서 얻은 정제된 항체 AId-6A 또는 AId-6F를 0.15M NaCl과 0 .05% NaN₃가 함유된 50mM PBS(PH 7.4)로 5㎍/단백질/㎖의 농도로 조절했다.

일만개의 폴리스티렌구슬(직경 4mm, Sekisui Chemical사 제품)을 30% 에타놀이 함유된 1/1000N NaOH용액으로 철저히 씻어낸 후, 증류수로 씻는다. 그 다음 이 구슬을 1/1000N NaC1용액으로 철저히 씻어낸 후 증류수로 씻는다.

800개의 구슬을 100㎖의 항체 용액에 가한 후, 이 혼합액을 2시간동안 교반한 다음 4℃에서 하룻밤 동안 방치한다. 이 구슬들을 여과시킨후, 생리식염수로 씻어내고 0.5%의 결정(Sekiagaku Kogyo사)를 함유하는 50mM BSA(PH 7.4)안에 넣는다. 이 혼합액을 2시간동안 교반한후, 4℃로 하룻밤 동안 방치한다. 이 구슬들을 여과하고, 불용성화된 항 예들을 얻기위하여 철저히 씻어낸다.

(2)¹²⁵I로 표시된 항체의 제조

¹mCi의¹²⁵I(MEN사)를 정제된 항원 AId-6A 또는 AId-6F가 포함된 100㎍의 0.lM코레이트 완충용액(PH 8.2)에 가하였다. 1㎖/㎖의 이오도겐(Pierce사)가 함유된 다이클로로메탄용액(40㎕)을 유리제 시험관에 넣고, 질소개스를 불어넣어 용매를 제거하여 건조시킨다. 이 항체 용액을 유리제 시험관에 넣고, 5분간 냉각시키면서 반응시킨다. 이 반응 생성물을 반응을 종결시킨 후 다른 시험관에 넣고, 젤 여과(세자로스CL-6B, 용출액; 0.15M NaCl, 0 1% BSA와 0.02% NaN₃가 함유된 50mM인산 완충용액)시켜서,¹²⁵I로 표시된 항체를 얻기 위하여 방사능 피크에 일치되는 IgG분액을 모으고, 항체 FH-6를 사용하여 반응성을 시험한다.

¹²⁵I로 표시된 항체들의 만족스러운 시료들은 클로라민 T법(Nature, 194, 496, 1962)과 볼톤-헌터법(Biochem ; J, 89, 114, 1963)에 의해서도 제조될 수 있다.

(3) 효소로 표시된 항체의 제조

정제된 항체 AId-6A 또는 AId-6F(10㎎)을 1㎖의 1M인산 완충용액(PH 6.8)에 녹이고, 이 용액을10㎎/㎖의 퍼록시다제가 함유된 상기와 같은 완충용액을 가하고 부드럽게 교반한다. 이 혼합물에 50㎕의 1% 글루타랄데하이드 용액을 점적하여 가한 후, 이 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양한다.

이 혼합물로부터 퍼록시다제로 표시된 항체를 얻기 위하여 4℃에서 하루동안 식염수로 투석시킨다. 퍼록시다제로 표시된 항체의 만족스러운 시료들은 또한 페리오딕산 가교법(J.Histochem. Cytochem., 22, 1084-1091, 1974), 말레이미드 가교법(J.Histochem. Cytochem., 78, 235-237, 1975), 아이소시아네이트 가교법(J.Histochem.Cytochem., 21, 233-240, 1973)과 벤조퀴논 가교법(Ann.Immunol, 127C, 197-208, 1976)에 의해서도 제조될 수 있다.

또한 B.G 갈락토시다제, 알칼리 포스파타제, 말레이트 테하이드로게나제, 글루코오스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코오스 옥시다제, 아세틸콜린 에스터 라제, 글루코아밀라제, 라이소자임 등과 같은 다른 효소도 표시를 위하여 사용될 수 있다.

(4) 형광 물질로 표시된 항체의 제조

실시예 1-(2)에서 제조된 100㎎의 정제된 항-이디오형 항체 AId-6F를 1㎖의 0.05M카보네이트 완충용액(PH 9.5)에 용해시킨다. 10㎍/m1의 농도로 카보네이트 완충용액 FITC(플루오레신 아이소시아네이트)를 용해시켜 제조한 용액을 상기의 용액에 점적하여 가한후, 이 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반한다.

그다음 이 혼합물을 0.005M 인산 완충용액을 사용하여 하루동안 투석시키고, FITC로 표시된 항-이디오형 항체를 얻기 위하여 DEAE-세파로스를 사용하여 이온교환시켜서 정제한다. 이 항체는 또한 상기와 같은 방법을 사용하여 RITC(테트라메틸로다민 아이소시아네이트)로 만족스럽게 표시할 수도 있다.

[참고예 2]

(1) 불용성화된 항체의 제조

실시예 2-(3)에서 제조된 정제된 항-이디오형 항체 AId-1, AId-2, AId-3, AId-4 또는 AId-5를 0.15M NaC1과 0.05% NaN3가 함유된 50mM PBS(PH 7.4)로 5㎍/단백질/㎖의 농도로 조절하였다. 참고예 1-(1)에서와 같은 방법으로 하여 불용성화된 항체를 얻었다.

(2)¹²⁵I로 표시된 항체의 제조

실시예 2-(3)에서 얻은 정제된 항체 AId-1, AId-2, AId-3, AId-4 또는 AId-5(100㎍)을 0.l㎖의 0.1M보레이트 완충용액(PH 8.2)에 용해시켰다.

¹mCi의 Na¹²⁵I(MEN사)를 이 용액에 가하였다.

참고예 l-(2)에서와 같은 방법을 사용하여¹²⁵I로 표시된 항체를 제조하였다

(3) 효소로 표시된 항체의 제조

실시예 2-(3)에서 얻은 10㎖의 정제된 항-이디오형 항체 AId-1, AId-2, AId-3, AId-4 또는 AId-5를 1㎖의 0.1M인산 완충용액(PH 6.8)에 용해시키고, 10㎎/mI의 퍼록시다제가 함유된 상기와 같은 용액을 위의 용액에 가한다.

참고예 1-(3)에서와 같은 방법을 사용하여 퍼록시다제로 표시된 항체를 얻는다.

(4) 형광 물질로 표시된 항체의 제조

실시예 2-(3)에서 얻은 10㎎의 정제된 항-이디오형 항체 AId-1, AId-2, AId-3, AId-4 또는 AId-5를 1㎖의 0.05M카보네이트 완충용액(PH 9.5)에 용해시킨다.

100㎍/㎖의 농도로 위에서와 같은 용액에 FITC(플루오레신 아이소시아네이트)를 용해시켜서 제조한 용액을 위의 용액에 점적하여 가하고, 이 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반한다. 참고예 1-(4)에서와 같은방법을 사용하여 FITC로 표시된 항-이디오형 항체를 얻는다.

[참고예 3]

(1) 불용성화된 항체의 제조

실시예 3-(3)에서 얻은 항체 AId-6, AId-7 또는 AId-8을 불용성화된 항체로 제조하는 참고예 1-(1)에서와 같은 방법으로 처리한다.

(2)¹²⁵I로 표시된 항체의 제조

실시예 3-(3)에서 얻은 항체 AId-6, AId-7 또는 AId-8을¹²⁵I로 표시된 항체를 제조하는 참고예 1-(2)에서와 같은 방법으로 처리한다.

(3) 효소로 표시된 항체의 제조

실시예 3-(3)에서 얻은 정제된 항-이디오형 항체 AId-6, AId-7 또는 AId-8을 퍼록시다제로 표시된 항체를 제조하는 실시예 1-(3)과 같은 방법으로 처리한다.

(4) 형광 물질로 표시된 항체의 제조

실시예 3-(3)에서 얻어전 정제된 항-이디오형 항체 AId-6, AId-7 또는 AId-8을 FITC로 표시된 만족스러운 항-이디오형 항체를 제조하는 참고예 1-(4)와 같은 방법으로 처리한다.

[참고예 4]

(1) 불용성화된 항체의 제조

실시예 4-(3)에서 얻은 항체 AId-9, AId-10 또는 AId-11을 불용성화된 항체로 제조하는 참고예 1-(1)에서와 같은 방법으로 처리한다.

(2)¹²⁵I로 표시된 항체의 제조

실시예 4-(3)에서 얻은 항체 AId-9, AId-10 또는 AId-11을¹²⁵I로 표시된 항체를 제조하는 참고예1-(2)에서와 같은 방법으로 처리한다.

(3) 효소로 표시된 항체의 제조

실시예 4-(3)에서 얻은 정제된 항-이디오형 항체 AId-9, AId-10 또는 AId-11을 퍼록시다제로 표시된 항체를 제조하는 실시예 1-(3)과 같은 방법으로 처리한다.

(4) 형광 물질로 표시된 항체의 제조

실시예 4-(3)에서 얻어진 정제된 항-이디오형 항체 AId-9, AId-10 또는 AId-11을 FITC로 표시된 만족스러운 항-이디오형 항체를 제조하는 참고예 1-(4)와 같은 방법으로 처리한다.

[참고예 5]

(1) 불용성화된 항체의 제조

실시예 5-(3)에서 얻은 항체 AId-7A1, AId-7A2 또는 AId-7A3를 불용성화된 항체로 제조하는 참고예 1-(1)에서와 같은 방법으로 처리한다.

(2)¹²⁵I로 표시된 항체의 제조

실시예 5-(3)에서 얻은 항체 AId-7A1, AId-7A2 또는 AId-7A3를¹²⁵I로 표시된 항체를 제조하는 참고예 1-(2)에서와 같은 방법으로 처리한다.

(3) 효소로 표시된 항체의 제조

실시예 5-(3)에서 얻은 정제된 항-이디오형 항체 AId-7A1, AId-7A2 또는 AId-7A3를 퍼록시다제로 표시된 항체를 제조하는 실시예 1-(3)과 같은 방법으로 처리한다.

(4) 형광 물질로 표시된 항체의 제조

실시예 5-(3)에서 얻어진 정제된 항-이디오형 항체 AId-7A1, AId-7A2 또는 AId-7A3를 FlTC로 표시된 만족스러운 항-이디오형 항체를 제조하는 참고예 1-(4)와 같은 방법으로 처리한다.

[참고예 6]

(1) 불용성화된 항체의 제조

실시예 6-(3)에서 얻은 항체 AId-9A1을 불용성화된 항체로 제조하는 참고예 1-(1)에서와 같은 방법으로 처리한다.

(2)¹²⁵I로 표시된 항체의 제조

실시예 6-(3)에서 얻은 항체 AId-9A1을¹²⁵I로 표시된 항체를 제조하는 참고예 1-(2)에서와 같은 방법으로 처리한다.

(3) 효소로 표시된 항체의 제조

실시예 6-(3)에서 얻은 정제된 항-이디오형 항체 AId-9A1을 퍼록시다제로 표시된 항체를 제조하는실시예 1-(3)과 같은 방법으로 처리한다.

(4) 형광 물질로 표시된 항체의 제조

실시예 6-(3)에서 얻어진 정제된 항-이디오형 항체 AId-9A1을 FITC로 표시된 만족스러운 항-이디오형 항체를 제조하는 참고예 1-(4)와 같은 방법으로로 처리한다.

[실험예 1]

AId-6A 또는 AId-6F배양상등액의 희석액(×100, ×300, ×900, ×270, ×8100과×24300)을 완전 RPMI배지를 사용하여 제조하였다.

각 희석액 50㎕과 인산 완충용액(PH 7.4) 200㎕을 포함하는 시험관들을 준비한다.

FH-6 항체(J.B.C., 258, 11793, 1983), FH-2 항체(B.B.R.C, 109, 36, 1982), FH-4 항체(J.B.C., 259, 4681, 1984), 1A-4 항체(Science, 220, 509, 1983), CA19-9 항체(J.B.C., 257, 14865, 1982), CA125항체(Cancer Res, 44, 2813, 1984), Ca15-3항체(Prot. Biol. Fluids, 13, 1013, 1984), BALB/C 쥐의 IgM항체와 BSA의 고정화된 구슬들을 각각의 시험관에 넣는다. 이렇게 준비된 각각의 시험관을 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시킨다.

이어서 시험관의 내용물을 3㎖의 증류수로 2차례 씻어서 반응되지 않고 남아있는 AId-6A 또는 AId-6F를 제거하고, 20㎕의 퍼록시다제로 표시된 항-쥐 IgG(Cappel사 제품, ×18000희석)를 각 시험관에 넣은 다음 실온에서 1시간동안 진탕하여 반응시킨다. 반응되지 않은 퍼록시다제로 표시된 항-쥐 IgG를 3㎖의 증류수로 2차례 씻어내어 제거한다. 그 다음 고정화된 구슬을 다른 시험관에 넣는다.

2.5㎎/㎖의 농도로 0.01% H₂O₂용액에 0-페닐렌다이아민을 용해시켜 제조한 용액(500㎕)을 각 시험관에 넣는다. 이 혼합물을 실온에서 30분간 방치한후, 반응을 종결시키기 위하여 2.0㎖의 1.3N H₂SO₄를 각 시험관에 가한다. 이 반응 혼합물을 흡광도 492nm에서 검사한다.

결과적으로 제 1 도에 나타나 있는 바와같이 AId-6A와 AId-6F는 단지 FH-6항체의 고정화된 구슬에만 반응하며, 다른 항체와 BSA의 구슬에는 반응하지 않는다.

이것은 AId-6A와 AId-6F가 FH-6에 대하여 특이적인 반응성을 갖는 항-이디오형 항체임을 시사하고 있다.

[실험예 2]

FH-6(하이브리도마 배양상등액을 10배 희석)와 OAL-AId-6A 또는 OAL-AId-6F(각기 ×2, ×6, ×18, ×58, ×162, ×486, ×1458희석)를 같은 양으로 혼합하여 실온으로 15분간 반응시킨다.

시알릴 Le^x-i를 갖고 있는 5ng의 정제된 글라이코리피드(6B 갱글리오사이드)와 15ng의 콜레스테롤 그리고 25ng의 포스파티딜콜린을 지지하고 있는 고정화된 구슬을 이 반응 혼합물에 가한다. 구슬을 씻어낸후 반응하여 구슬에 남아있는 FH-6를 FITC로 표시된 쥐의 IgG+M과 판텍스 장치(Pandex device)를 사용하여 정량한다. 제 2 도는 AId-6F가 시알릴 Le^x-i와 FH-6사이의 결합을 투여량에 의존적으로 억제시키는 유형의 항체임을 시사하고 있다.

상기의 시험결과는 AId-6A는 상기의 결합을 전혀 억제하지 못한다는 사실을 보여주고 있다.

[실험예 3]

(1) 특이적 항체로서 본 발명의 항체를 사용하여 시알릴 Le^x-i를 인식하는 항체를 측정하는 시스템.

(a) 염소 혈청에 FH-6의 표준용액을 각각 50㎖씩 다양한 농도로 넣고, 0.1% BSA와 0.05% NaN₃를 함유하는 50mM PBS완충용액(PH 7.4)중의 고정화된 구슬과 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시킨다.

반응되지 않은 물질들을 씻어내어 제거한후, 상기에서 얻은¹²⁵I로 표시된 항체(AId-6F)가 함유된 상기와 같은 완충용액(약 100, 000cpm)200㎕을 실온에서 2시간동안 진탕하여 구슬과 반응시킨다. 반응되지 않은 물질들을 씻어서 제거한후 이 구슬의 방사능을 감마 계수기로 측정한다.

제 3 도는 얻어진 결과들로부터 작성한 표준극선을 나타낸다.

(b) (a)에서와 같은 방법으로 작성한 표준 FH-6항체 50㎕을¹²⁵I로 표시된 AId-6F가 함유된 (a)에서와 같은 완충용액(약 20000cmP)200㎕에 가하고, 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시킨다. FH-6의 고정화된 구슬을 이 반응 화합물에 넣고, 상기에서와 같은 방법으로 1시간 동안 반응시킨다. 이 구슬을 씻어낸후 감마 계수기로 방사능을 측정한다. 제 4 도는 이 결과로부터 작성한 표준곡선을 나타낸다.

도표에서 Bo는 0μ/㎖표준용액을 나타내며, 블랭크 용액이 사용될 때의 바인딩 cpm을 의미한다. Bo와 비교하여 B는 표준용액의 경쟁을 위하여 사용될때의 바인딩 cpm을 나타낸다. 따라서 B/Bo(%)의 값이 작아지면 작아질수록 더욱 경쟁적이 된다. 이 수치는 표준용액의 양이 증가함에 따라 감소된다.

(c) (a)에서와 같은 방법으로 제조한 FH-6항체 표준용액(50㎕)(a)에서 사용된 같은 완충용액 200㎕과 AId-6F의 고정화된 구슬을 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시켰다.

¹²⁵I로 표시된 FH-6의((a)에서와 같은 완충용액으로 제조, 약 20000cpm)용액을 100㎕가하고, 이 혼합물을 1시간동안 반응시켰다. 그 다음 이 구슬을 씻어냈다. 제 5 도는 얻어진 표준곡선을 나타낸다.

(d) (a)에서와 같은 방법으로 제조한 FH-6항체 표준용액 100㎕¹²⁵I로 표시된 FH-6가 50mM PBS완충용액(PH7.4, 0.15M NaC1, 0 l% BAS와 0.05% NaN₃)에 함유된 용액(약 20000cpm)100㎕상기와 같은 완충용액에 AId-6를 1㎍/㎖의 농도로 희석한 용액 100㎕ 상기의 완충용액 100㎕의 혼합액을 제조한다. 이 혼합액을 4℃로 하룻밤동안 방치한다.

이 혼합액에 상기의 완충용액으로 400배 희석한 정상적인 쥐의 혈장 100㎕, 상기의 완충용액으로 40배 희석한 항-쥐 IgG 항체 100㎕과 10%의 폴리에틸렌 글리콜 수용액 200㎕을 가한다. 결과된 혼합액을 원심분리(3000rpm, 30분간)시킨다. 상등액을 B/F분리를 위해 가만히 따른다. 제 6 도는 침전물을 측정하여 얻은 표준곡선을 나탄낸다.

(2) 시알릴 Le^x-i항원(표준용액으로 AId-6F를 사용)을 측정하는 시스템

(a) 시알릴 Le^x-i항원 대신에 염소혈청에 AId-6F를 용해시켜 각종 농도의 용액을 제조한다.

각각의 용액(50㎕)과 FH-6항체의 고정화된 구슬을 0.1% BSA와 0.05% NaN₃가 함유된 50mM사이트 레이트 완충용액(PH 4.5)과 실온에서 2시간 동안 진탕시켜 반응시킨다. 반응되지 않고 남아있는 물질을 씻어낸후,¹²⁵I로 표시된 FH-6항체를 상기에서와 같은 완충용액에 용해시킨 용액(약 7000cpm)200㎕을 이 반응 혼합물에 가한다.

이 혼합물을 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시킨다. 반응되지 않은 물질들을 씻어낸후, 감마계수기를 사용하여 이 구슬의 방사능을 측정한다. 제 7 도는 위의 결과들로부터 작성한 표준곡선이다.

(b) (a)에서와 같은 방법으로 AId-6F표준용액 50㎕을¹²⁵I로 표시된 FH-6가 용해된 사이트레이트 완충용액(약 20000cmp)200㎕과 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시킨다. 고정화된 AId-6F구슬을 가하고, 이 혼합물을 1시간동안 경쟁반응 시킨다. 씻어낸후 감마계수기를 사용하여 이 구슬의 방사능을 측정한다. 제 8 도는 이렇게하여 얻어진 표준곡선을 나타낸다.

(c) (a)에서와 같은 방법으로 AId-6F표준용액 50㎕을¹²⁵I로 표시된 AId-6F(30000cpm)를 함유하는 상기와 같은 사이트레이트 완충용액 200㎕에 들어있는 FH-6의 고정화된 구슬과 실온에서 2시간 동안 교반하여 경쟁 반응시킨다. 반응되지 않은 물질을 제거한후 감마계수기를 사용하여 이 구슬의 방사능을 측정한다.

(d) (a)에서와 같은 방법으로 AId-6F표준용액 50㎕을¹²⁵I로 표시된 FH-6(20000cpm)를 함유하는 상기와 같은 사이트레이트 완충용액 200㎕과 실온에서 2시간동안 진탕하여 경쟁반응 시킨다. PC-9 추출물로 코팅한 한 개의 구슬을 가하고, 이 혼합물을 1시간동안 더 반응시킨다. 씻어낸후, 감마계수기를 사용하여 이구슬의 방사능을 측정한다. 제 10 도는 이와같이 하여 얻은 표준곡선을 나타낸다.

[실험예 4]

(1) 혈청내의 FH-6항체의 측정

인간의 혈청(50㎕)에 0.1% BSA와 0.05% NaN₃가 함유된 50mM PBS(PH 7 .4)200㎕을 가한다. 정상인과 암 환자 각각으로부터 4개의 시료를 준비한다. 고정화된 AId-6F항체 구슬을 2개의 시료에 넣고, PC-9추출물의 고정화된 구슬을 다른 시료에 넣는다. 각각의 시료를 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시킨다.

반응이 종료된후 반응되지 않은 물질들을 증류수로 3차례 씻어서 제거한다.¹²⁵I로 표시된 AId-6F항체(200㎕, 100, 000cpm)를 한 종류의 구슬에 가하고, 200㎕의¹²⁵I로 표시된 항-인간 IgG(50000cpm)을 다른종류의 구슬에 가한다. 각 혼합물을 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시킨다.

이어서 반응되지 않은 혼합물을 증류수로 세차례 씻어내어 제거한다. 감마계수기를 사용하여 이 구슬의 방사능을 측정한다. 제 11 도는 50개 사례의 정상인과 10개 사례의 폐암 환자 사이의 중요한 차이점을 나타내는 결과를 보여준다.

(2) FH-6항체를 생산하는 세포의 검출

최종 농도가 10⁷세포/㎖인 GH-6하이브리도마(기준; AH-6하이브리도마)용액은 냉각된 PBS로 FH-6하이브리도마를 3차례 씻어낸후 제조한다. FH-6와 AH-6하이브리도마 용액(각기 50㎕과 50㎕의 형광물질로 표시된 AId-6F(100, 33.3, 11.1 또는 3.7㎍/㎖)을 30분간 얼음으로 냉각시키면서 반응시킨다.

이 반응 혼합물을 냉각된 PBS로 한차례 씻어내고, 1㎖로 희석시킨 다음 488nm의 들뜬상태에서 그리고 530nm의 방출 상태에서 혈구계수기(스펙트란 III, Ortho Diagnostic사 제품)를 사용하여 유동혈구 계수법을 수행한다.

형광물질로 표시한 형체 AId-6F와 반응한 FH-6의 비를 AH-6의 비와 비교하였다. 제 12 도는 항-이디오형 항체 AId-6F가 오로지 FH-6항체를 생산하는 세포와만 반응하는 결과를 나타내고 있다.

[실험예 5]

(l) 클론번호 OAL-AId-3×42, OAL-AId-2×16, OAL-AId-2×24, OAL-AId-2×26 또는 OAL-AId-2×50의 배양상등액을 완전 RPMI-1640배지로 희석(×10, ×30, ×90, ×270, ×810 또는 ×2430)하였다. 각 희석액 50㎕과 인산 완충용액(PH 7.4)200㎕을 각각 담고 있는 시험관을 준비하였다.

각종 항체의 고정화된 구슬과 BALB/C혈통인 쥐의 IgG₁, IgG₂a, IgG₂b, IgM항체와 BSA를 실험예 1에서와 같은 방법으로 각각의 시험관에 넣었다. 각각의 혼합물을 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시켰다. 그후 이 반응혼합물을 실험예 1에서와 같은 방법으로 처리하여 반응을 종결시키고, 492nm에서 흡광도를 측정하였다.

제 13 도는 AId-1(2), AId-2(5), AId-3(3), AId-4(4)와 AId-5(1)이 AFH-2의 구슬에만 반응하며, 다른 어떠한 항체의 구슬이나 BSA와는 반응하지 않는다는 결과를 나타내고 있다. 이것은 이들 항체가 FH-2에 특이적인 반응성을 갖고 있는 항-이디오형 항체임을 시사하고 있다.

OAL-AId-2×42, OAL-AId-2×16, OAL-AId-2×24, OAL-AId-2×26 또는 OAL-AId-2×50의 배양 상등액(50㎕)을 200㎕ (50000cpm)의¹²⁵I로 표시된 FH-2와 실온에서 하룻밤동안 진탕하여 반응시킨다. 이 반응혼합물(200㎕) 항원으로서 PC-7세포가 고정되어 있는 마이크로플레이트에 옮기고, 실온에서 90분간 진탕하여 반응시킨다. 이어서 플레이트를 증류수로 3차례 씻어내고, 항원-항체 반응이 종결되도록 200㎕의 2N NaOH를 플레이트에 가한다. 상등액에 남아있는¹²⁵I로 표시된 FH-2의 방사능을 측정한다. 이와같이 하여 항-이디오형 항체가 항체-항원 결합을 억제하는지 조사하였다.

제 14 도는 AId-1(2)가 FH-2항체와 항원 사이의 결합을 조금 억제하며, AId-2(5), AId-3(3), AId-4(4) 또는 AId-5(1)이 투여량에 의존적으로 결합을 억제시키는 유형인 항-이디오형 항체임을 시사하고있다.

(3) 항-이디오형 항체(AId-1, AId-2, AId-3, AId-4 또는 AId-5)의 배양 상등액의 희석액(×1, ×3, ×9, ×27, ×81과 ×243)을 준비하였다. 각 희석액(50㎕)을 0.1% BSA와 0 05% NaN₃가 함유된 50mM PBS(PH 7.4)완충용액에¹²⁵I로 표시된 항-이디오형 항체(AId-4)를 용해시킨 용액(20000cpm)200㎕을 가하였다. FH-2항체의 고정화된 구슬을 혼합물속에 넣고, 실온에서 90분간 진탕하여 반응시켰다. 반응되지 않은 물질을 증류수로 3차례 씻어냈다. 감마 계수기를 사용하여 이 구슬의 방사능을 측정하였다.

제 15 도는 AId-1(2)가 다른 네개의 항-이디오형 항체((1)-(5))와는 에피토프(epltope)가 다르다는 사실을 나타낸다.

(4) FH-2항체를 각종의 농도로 염소 혈청에 용해시켜 표준용액을 얻는다. 각 표준용액(50㎕)과 위에서 얻은 항-이디오형 항체의 고정화된 구슬(불용성화된 AId-1, AId-2, AId-3, AId-4 또는 AId-5의 구슬)한개를 0.1% BSA와 0.05% NaN₃를 함유하는 200㎕의 50mM PBS(PH 7.4)완충용액에 가하였다. 이 혼합물을 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시켰다.

반응되지 않은 물질을 씻어내어 제거하고, 이 반응 혼합물을 상기에서와 같은 완충용액에 상기에서 얻은¹²⁵I로 표시된 항-이디오형 항체(AId-1, AId-2, AId-3, AId-4 또는 AId-5)의 용액(약 100000cpm)200㎕을 실온에서 2시간동안 진탕하여 더욱 반응시켰다. 반응되지 않은 혼합물을 제거한후, 감마계수기를 사용하여 이 구슬의 방사능을 측정하였다. 제 16 도는 이러한 결과로부터 얻은 표준곡선을 나타낸다.

[실험예 6]

(1) OAL-AId-4Y40, OAL-AId-4Y12 또는 OAL-AId-4Y25의 배양 상등액을 완전 RPMI-1640배지로 희석한 희석액(×10, ×30, ×90, ×270, ×810과 ×2430)을 준비하였다.

각 희석액(50㎕)을 실험예 1에서와 같은 방법으로 처리하여 각종의 항체들에 대한 상등액의 방사능을 측정하였다.

제 17 도는 AId-6(1), AId-7(3) 또는 AId-8(2)이 단지 항체 AH-6의 고정화된 구슬에만 반응하며, 다른 어떠한 항체의 고정화된 구슬이나 BSA와는 반응하지 않는다는 사실을 나타내고 있다. 이것은 이들 항체들이 AH-6항체에 특이적인 반응성을 갖는 항-이디오형 항체들임을 나타낸다.

(2) OAL-AId-4Y40, OAL-AId-4Y12 또는 OAL-AId-4Y26의 배양 상등액(50㎕)을¹²⁵I로 표시된 AH-6항체의 용액(50000cpm)200㎕과 실온에서 하룻밤동안 진탕하여 반응시킨다.

결장암으로부터 유도된 간암조작을 퍼쿨로린산으로 추출한 불용성화시킨 추출물을 품고 있는 폴리스티렌 구슬을 반응혼합물 내에 한원으로서 넣는다. 이 혼합물을 실온에서 90분간 진탕하여 반응시켰다. 그후 이 구슬을 증류수로 3차례 씻어냈다. 그 다음 이 구슬을 새로운 시험관에 넣고, 이 구슬에 남아있는¹²⁵I로 표시된 AH-6항체의 방사능을 측정하였다.

이와같이 하여 항-이디오형 항체가 항체-항원 반응을 억제하는지 조사하였다.

제 18 도는 AId-6(l)이 AH-6항체와 항원 사이의 결합을 조금 억제하는 반면에 AId-7(3)나 AId-8(2)는 투여량에 의존적으로 결합을 억제하는 유형인 항-이디오형 항체임을 나타내고 있다.

(3) 각종의 농도로 항-이디오형 항체(AId-6, AId-7 또는 AId-8)의 배양 상등액을 희석한 희석액(×1, ×3, ×9, ×27, ×81과 ×243)을 준비하였다. 각 희석액(50㎕)을 실험예 5-(3)에서 사용된것과 같은 완충용액에¹²⁵I로 표시한 항-이디오형 항체(AId-7)을 용해시킨 용액(20000cpm)200㎕을 가하였다.

FH-6항체의 고정화된 구슬을 혼합물에 넣고, 실온에서 90분간 진탕하여 반응시켰다. 반응되지 않은 물질을 증류수로 3차례 씻어내 제거하였다. 감마계수기를 사용하여 이 구슬의 방사능을 측정하였다.

제 19 도는 AId-6(1)이 AId-7(3)나 AId-8(2)와는 에피토프(epitope)가 다르다는 사실을 나타내고 있다.

(4) 실험예 5-(4)에서와 같은 방법으로 50㎕의 AH-6항체의 표준용액과 상기에서 얻은 항-이디오형 항체의 고정화된 구슬(불용성화시킨 AId-6, AId-7 또는 AId-8의 구슬)

그리고 상기의 완충용액 20㎕을 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시켰다. 반응되지 않은 물질을 씻어서 제거하고, 상기에서 사용된 것과 같은 완충용액에 상기에서 얻은¹²⁵I로 표시한 항-이디오형 항체(AId-6, AId-7 또는 AId-8)가 용해된 용액(약 100, 000cpm) 200㎕과 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시켰다. 반응되지 않은 물질을 제거한후 감마 계수기를 사용하여 이 구슬의 방사능을 측정하였다. 제 20 도는 이렇게 얻어진 결과로부터 작성한 표준곡선을 나타낸다.

[실험예 7]

(1) OAL-AID-19A4, OAL-AId-19A7 또는 OAL-AId-19Al0의 배양 상등액을 완전 RPMI-1640배지로 희석한 희석액(×10, ×30, ×90, ×270, ×810, ×2430)을 준비하였다. 각 희석액(50㎕)을 실험예1-(1)에서와 같은 방법으로 처리하여 각종의 항체들에 대한 상등액의 방사능을 측정하였다. 제 21 도는 AId-9(1), AId-10(3) 또는 AId-11(2)가 단지 항체 CA19-9의 고정화된 구슬에만 반응하며, 다른 어떠한 항체의 고정화된 구슬이나 BSA와는 반응하지 않는다는 사실을 나타내고 있다. 이것은 이들 항체들이CA19-9항체에 특이적인 반응성을 갖는 항-이디오형 항체들임을 나타낸다.

(2) OAL-AId-19A4, OAL-AId-19A7 또는 OAL-AId-19Al0의 배양 상등액(50㎕)을¹²⁵I로 표시된 AH-6항체의 용액(50000cpm) 200㎕과 실온에서 하룻밤 동안 진탕하여 반응시킨다. 불용성화시킨 글라이코프로테인을 품고있는 폴리스티렌 구슬을 항원으로서 혼합물에 넣었다. 이 글라이코프로테인은 KATO-Ⅲ 세포를 퍼클로린산으로 추출한 다음 RNA세파로스 CL-4B를 사용하여 친화크로마토그라피로 이 추출물을 정제하여 얻은 것이다. 이 혼합물을 실온에서 90분간 진탕하여 반응시켰다. 그 후 이 구슬을 증류수로 3차례 씻어냈다. 그 다음 이 구슬을 새로운 시험관에 넣고, 이 구슬에 남아있는¹²⁵I로 표시된 CA19-9항체의 방사능을 측정하였다. 이와 같이하여 항-이디오형 항체가 항체-항원 반응을 억제하는지 조사하였다.

제 22 도는 AId-9(1)이 항체-항원 결합을 투여량에 의존적으로 억제시키는 유형의 항-이디오형 항체이며, AId-10(3)와 AId-11(2)는 이 결합을 억제시키지 않는 항-이디오형 항체임을 나타내고 있다.

(3) 각종의 농도로 항-이디오형 항체(AId-9, AId-10 또는 AId-11)의 배양 상등액을 희석한 희석액(×1, ×3, ×9, ×27, ×81과 ×243)을 준비하였다. 각 희석액(50㎕)을 0.1% BSA와 0.05% NaNO₃가 함유된 50mM PBS(pH 7.4)완충용액에¹²⁵I로 표시한 항-이디오형 항체(AId-9)를 용해시킨 용액(20000cpm)200㎕을 가하였다. CA19-9항체의 고정화된 구슬을 혼합물에 넣고, 실온에서 90분간 진탕하여 반응시켰다. 반응되지 않은 물질을 증류수로 3차례 씻어내 제거하였다. 감마 계수기를 사용하여 이 구슬의 방사능을 측정하였다.

제 23 도는 AId-9(1)이 AId-10(3)나 AId-11(2)와는 에피토프(epitope)가 다르다는 사실을 나타내고 있다.

(4) 상기에서와 같은 방법으로, 50㎕의 CA19-9항체의 표준용액과 상기에서 얻은 항-이디오형 항체의 고정화된 구슬(불용성화 시킨 AId-9, AId-10 또는 AId-11의 구슬) 그리고 상기의 완충용액 200㎕을 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시켰다. 반응되지않은 물질을 씻어서 제거하고, 상기에서 사용된 것과 같은 완충 용액에 상기에서 얻은¹²⁵I로 표시한 항-이디오형 항체(AId-9, AId-10 또는 AId-11)가 용해된 용액(약 100, 000cpm) 200㎕과 실온에서 2시간동안 진탕하여 반응시켰다. 반응되지 않은 물질을 제거한후 감마 계수기를 사용하여 이 구슬의 방사능을 측정하였다. 제 24 도는 이렇게 얻어진 결과로부터 작성한 표준곡선을 나타낸다.

[실험예 8]

(1) OAL-AId-7Al, OAL-AId-7A2 또는 OAL-AId-7A3의 배양상등액을 완전 RPMI-1640배지로 희석한 희석액(×30, ×90, ×270. ×810과 ×2430)을 준비하였다. 각 희석액(200㎕)을 실험예 1에서와 같은 방법으로 처리하여, 각종의 항체들에 대한 상등액의 방사능을 측정하였다. 제 25 도는 AId-7A1, AId-7A2 또는 AId-7A3가 단지 항체 FH-7의 고정화된 구슬에만 반응하며, 다른 어떠한 항체의 고정화된 구슬이나 BSA와는 반응하지 않는다는 사실을 나타내고 있다. 이것은 이들 항체들이 FH-7항체에 특이적인 반응성을 갖는 항-이디오형 항체들임을 나타낸다.

(2) OAL-AId-7Al, OAL-AId-7A2 또는 OAL-AId-7A3의 배양 상등액(50㎕)을¹²⁵I로 표시된 FH-7항체의 용액(100, 000cpm) 200㎕과 실온에서 1시간동안 진탕하여 반응시킨다. 이어서 태변으로부터 추출하여 실시예 5-(1)에서와 같은 방법으로 정제하여 얻은 글라이코프로테인의 고정화된 구슬을 항원으로서 이 반응혼합물에 가한다. 이 혼합물을 실온에서 1시간동안 진탕하여 반응시켰다. 그후 이 구슬을 증류수로 3차례 씻어냈다. 그 다음 이 구슬을 새로운 시험관에 넣고, 이 구슬에 남아있는¹²⁵I로 표시된 FH-7항체의 방사능을 측정하였다. 이와 같이하여 항-이디오형 항체가 항체-항원 반응을 억제하는지 조사하였다. 제 26 도는 AId-7A3가 FH-7항체와 항원 사이의 결합을 억제하지 못하며, AId-7A1 또는 AId-7A2가 투여량에 의존적으로 이 결합을 억제시키는 유형의 항-이디오형 항체임을 나타내고 있다.

[실험예 9]

(l) OAL-AId-9A1의 배양 상등액을 완전 RPMI-1640배지로 희석한 희석액(×30, ×90, ×270, ×810과 ×2430)을 준비하였다.

각 희석액(200㎕)을 실험예 1에서와 같은 방법으로 처리하여 각종의 항체들에 대한 상등액의 방사능을 측정하였다. 제 27 도는 AId-9A1이 단지 항체 FH-9의 고정화된 구슬에만 반응하며, 다른 어떠한 항체의 고정화된 구슬이나 BSA와는 반응하지 않는다는 사실을 나타내고 있다 이것은 이 항체 FH-9항체에 특이적인 반응성을 갖는 항-이디오형 항체임을 나타낸다.

(2) OAL-AId-9A1의 배양상등액(50㎕)을¹²⁵I로 표시된 FH-9항체의 용액(100, 000cpm) 200㎕과 실온에서 하룻밤 동안 진탕하여 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 항원으로서 제공된 PC-7이 고정된 플레이트에 옮기고, 25℃로 1시간동안 진탕하여 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 증류수로 3차례 씻어냈다. 이어서 200㎕의 2N NaOH를 항원이 들어있는 플레이트에 가하고, 25℃로 30분간 진탕하였다.

결과된 혼합물을 새로운 시험관에 넣고, 항체-항원 결합을 억제시키는 항-이디오형 항체를 확인하기 위하여 포함되어 있는¹²⁵I로 표시된 FH-9항체의 방사능을 측정하였다. 제 28 도는 AId-9A1이 FH-9항체와 항원 사이의 결합을 투여량에 의존적으로 억제시키는 유형의 항-이디오형 항체임을 나타내고 있다.

Claims (27)

1. 식 NeuAcα2→3Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Galβ1→4GIcNAc(3←α1 Fuc)β1→3GaIβ1→4Glc-, 식 Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→, 식 Fucα1→2Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→, 식 NeuAcα2→3GaIβ1→3GlcNAc(4←α1 Fuc)β1→3Galβ1→, 식 NeuAcα2→3Ga1β1→3GlcNAc(4←α1 Fuc)(6←α2 NeuAc)β1→3Ga1β1→과 식 NeuAcα2→3Ga1β1→3GlcNAc(6←α2 NeuAc)β1→3Galβ1→으로 구성된 군으로부터 선택된 탄화수소 결합을 인식하는 특이적인 항에 대한 항-이디오형 항체.
2. 제 1 항에 있어서, 특이적인 항체가 FH-6, FH-2, AH-6, CA19-9, FH-7 또는 FH-9인 항-이디오형 항체.
3. 제 2 항에 있어서, 특이적인 항체가 FH-6인 항-이디오형 항체.
4. 제 2 항에 있어서, 특이적인 항체가 FH-2인 항-이디오형 항체.
5. 제 2 항에 있어서, 특이적인 항체가 AH-6인 항-이디오형 항체.
6. 제 2 항에 있어서, 특이적인 항체가 CA19-9인 항-이디오형 항체.
7. 제 2 항에 있어서, 특이적인 항체가 FH-7인 항-이디오형 항체.
8. 제 2 항에 있어서, 특이적인 항체가 FH-9인 항-이디오형 항체.
9. 제 1 항에 있어서, 탄화수소 결합과 특이적인 항체사이의 반응을 억제시키는 항-이디오형 항체.
10. 제 1 항에 있어서, 탄화수소 결합과 특이적인 항체사이의 반응을 억제시키지 않는 항-이디오형 항체.
11. 식 NeuAcα2→3Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→4GIcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→4Glc-, 식 Ga1βl→4GIcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Galβ1→, 식 Fucα1→2Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→, 식 NeuAcα2→3GaIβ1→3GlcNAc(4←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→, 식 NeuAcα2→3Galβ1→3GlcNAc(4←α1 Fuc)(6←α2 NeuAc)β1→3Ga1β1→ or 식 NeuAcα2→3Ga1β1→3GlcNAc(6←α2 NeuAc)β1→3Ga1β1→으로 표시된 탄화수소 결합을 인식하는 특이적인 항체를 면역시키는 항원으로서 사용하는 것을 특징으로 하는 항-이디오형 항체의 제조방법.
12. 제 11 항에 있어서, 하이브리도마 세포를 제조하기 위하여 포유동물의 형질세포종 세포와 특이적인 항체로 면역시킨 포유 동물의 형질세포를 융합시키고, 이렇게하여 얻은 하이브리도마 세포로부터 항체를 생산하는 클론을 선발한 다음 상기의 클론으로부터 원하는 항-이디오형 모노클로날 항체를 얻는 것을 특징으로 하는 항-이디오형 항체의 제조방법.
13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 특이적인 항체가 FH-6, FH-2, AH-6, CA19-9, FH-7 또는 FH-9인 항-이디오형 항체의 제조방법.
14. 제 12 항에 있어서, 하이브리도마 세포가 하이브리드 쎌라인 KCTC 8362 P(ATCC번호 HB 9207)인 항-이디오형 항체의 제조방법.
15. 제 12 항에 있어서, 하이브리도마 세포가 하이브리드 쎌라인 KCTC 8363 P(ATCC번호 HB 9447)인 항-이디오형 항체의 제조방법.
16. 제 12 항에 있어서, 하이브리도마 세포가 하이브리드 쎌라인 KCTC 8364 P(ATCC번호 HB 9450)인 항-이디오형 항체의 제조방법.
17. 제 12 항에 있어서, 하이브리도마 세포가 하이브리드 쎌라인 KCTC 8365 P(ATCC번호 HB 9461)인 항-이디오형 항체의 제조방법.
18. 제 12 항에 있어서, 하이브리도마 세포가 하이브리드 쎌라인 KCTC 8366 P(ATCC번호 HB 9448)인 항-이디오형 항체의 제조방법.
19. 제 12 항에 있어서, 하이브리도마 세포가 하이브리드 쎌라인 KCTC 8367 P(FERM BP-1522)인 항-이디오형 항체의 제조방법.
20. 제 12 항에 있어서, 하이브리도마 세포가 하이브리드 쎌라인 KCTC 8368 P(FERM BP-1523)인 항-이디오형 항체의 제조방법.
21. 제 11 항에서 정의된 제조방법에 의하여 제조된 항-이디오형 항체.
22. 식 NeuAcα2→3Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Galβ1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Galβ1→4Glc-, 식 Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)βI→3Galβ1→, 식 Fucα1→2Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Galβ1→, 식 NeuAcα2→3Galβ1→3GlcNAc(4←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→, 식 NeuAcα2→3Ga1β1→3GlcNAc(4←α1 Fuc)(6←α2 NeuAc)β1→3Ga1β1→괴 식 NeuAcα2→3Galβ1→3GlcNAc(6←α2 NeuAc)β1→3Ga1β1→으로 구성되는 군으로부터 선택된 탄화수소 결합을 인식하는 특이적인 항체가 포함된 시료를 제 1 항에서의 항-이디오형 항체와 접촉시켜서 그 반응성을 검사하는 것으로 이루어지는 시료내에 존재하는 상기의 특이적인 항체의 측정방법.
23. 제 22 항에 있어서, 시료가 체액인 특이적인 항체의 측정방법.
24. 제 22 항에 있어서, 시료가 항체를 생산하는 세포인 특이적인 항체의 측정방법.
25. 제 1 항의 항-이디오형 항체로 이루어지는 암 진단용 키트(Kit).
26. 하기의 탄화수소 결합을 인식하는 특이적인 항체와의 선택적인 면역학적 반응에 근거하여 시료내에, 식 NeuAcα2→3Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→4GIcNAc(3←α1 Fuc)βl→3Ga1β1→4GIc-, 식 Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→, 식 Fucα1→2Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Ga1βl→, 식 NeuAcα2→3Ga1β1→3GlcNAc(4←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→, 식 NeuAcα2→3Galβ1→3GlcNAc(4←αl Fuc)(6←α2 NeuAc)β1→3Ga1β1→, 식 NeuAcα2→3GaIβ1→3GlcNAc(6←α2 NeuAc)β1→3Galβ1→으로 구성되는 군으로부터 선택된 탄화수소 결합을 갖는 암 항원을 검출하는 면역검정법에 있어서, 정제된 항원으로서 제 9 항의 항-이디오형 항체를 사용하는 그 이용방법.
27. 하기의 탄화수소 결합을 인식하는 특이적인 항체와의 선택적인 면역학적 반응에 근거하여, 시료내에 식 NeuAcα2→3Ga1β1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Galβ1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Galβ1→4Glc-, 식 Galβ1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→, 식 Fucα1→2Galβ1→4GlcNAc(3←α1 Fuc)β1→3Ga1β1→, 식 NeuAcα2→3Galβ1→3GlcNAc(4←α1 Fuc〉β1→3Ga1β1→, 식 NeuAcα2→3Galβ1→3GlcNAc(4←α1 Fuc) (6←α2 NeuAc) β1→3Ga1β1→ and 식 NeuAcα2→3Ga1β1→3GlcNAc(6←α2 NeuAc) β1-→3Ga1β1→으로 구성되는 군으로부터 선택된 탄화수소 결합을 갖는 암 항원을 검출하는 면역검정법에 있어서, 상기의 특이적인 항체에 대한 이차항체로서 제 10 항의 항-이디오형 항체를 사용하는 그 이용방법.

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