PT89385B - Processo para a preparacao de novos anticorpos - Google Patents

Description

os anticorpos e processos para a preparação das referidas linhas celulares.

Os anticorpos monoclonais do invento e os seus derivados são úteis para o diagnóstico e terapia do cancro e para a monitorização seriada dos doentes com can cro, relativamente a doenças recurrentes ou resposta à terapia. Constituem também objecto deste invento os equipamentos (kits) de teste e as composições :farmacêuticas que con têm os referidos anticorpos anti-CEA monoclonais.

processo de preparação dos referidos anticorpos consiste em se multiplicarem as células de hibridoma que segregam o anticorpo, in vitro ou in vivo, e, se de sejado, se converterem os anticorpos resultantes, nos seus derivados.

3Novos anticorpos

invento refere-se a novos anticorpos afinidade em relaç ão ao vados , seus derivados, os anticorpos, nhagens celulares , e dos monoclonais com elevadas especificidade e antigénio carcinoembriónico humano processos para a preparação destes linhagens celulares do hibridoma que segregam preparação das referidas lianticorpos anti-CEA estojos contendo os anticorpos monoclonais, e preparações farmacêuticas contendo os referidos anticorpos.

processos para a a utilização destes o diagnóstico e terapêutica do cancro, monoclonais, para

Fundamentos do invento desenvolvimento da bridoma tornou possível toras de anticorpos monoclonais (MAbs) com dese jada e caracterizar moléculas biologicamente importantes.

produzir linhagens tecnologia do hicelulares produa especificidade os quais podem ser usados para identificar, isolar

Os MAbs de que trata o presente invencarcinoembriónico (CEA).

CEA é um complexo de glicoproteinas imunoreactivas com peso molecular de 180 epitélios do aparelho da endoderme .

to são dirigidas contra o antigénio um .000 encontrado em adenocarcinomas dos digestivo e do colon fetal derivados nitários com CEA para dos doentes pelos ensaios imu papel desempenhado o diagnóstico e monitorização seriada com cancro em relação posta à terapêutica (Mach et al. ,

Berche et al. , Br. Med. J. 285 , 1447, 1982) utilização em modelos experimentais de dores de xenoimplantds de carcinoma de colon a doença recorrente ou res

Imun. Today 2, 239, assim como

1981 ;

a sua ratos rapados portahumano (Hedin

et al . , Int. J. Câncer 30 , 547, 1982; Buchegger et al . , Int.

J. Câncer 3 3, 643, 1984 ) foram amplamente avaliados e documentados .

Um dos principais inconvenientes da utilização dos anticorpos anti-CEA com finalidades clinicas tem sido a reactividade-cruzada destes anticorpos com alguns tecidos adultos aparentemente normais.

Estudos prévios revelaram que a maior parte dos antisoros hiperimunes convencionais produzidos cora tra diferentes formas imunogénicas de CEA apresentam reacção cruzada com muitos tipos diferentes de carcinomas assim como com antigénios relacionados com CEA encontrados na mucosa normal do colon, no baço, fígado, pulmão, glândulas sudoríperas , leucócitos polimorfonucleares e monocitos de indivíduos aparentemente normais.

A primeira das séries de antigénios identificadas com reacção cruzada com CEA foi chamada glicoproteina normal (NGP) ou antigénio de reacção cruzada não-especifico (NCA) por Mach and Pusztaszeri (Immunochemistry 9_, 1031, 1972) e por von Kleist et al . (Proc. Natl . Acad . Sei. 6 9 , 2492, 1972 ), respectivamente. Aqui será mencionado como NCA55, devido ao facto de ter sido verificado por ambos os grupos de pesquisa, possuir um peso molecular de cerca de 55KD.

Este antigénio também foi descrito por vários outros grupos de pesquisa cluindo CCEA-2 (Tuberville et al

1973), CCA-III

TEX (Kessler et com nomes diferentes, in. , Immunochemistry . Immunol. 118, 55 , 841, , 1977) e _38, 1041, 1978).

1984) identificou

643 ,

KD (NCA_g).

Buchegger um anti-a -

Um outro antigénio relacionado muito intimamente com CEA em termos de reactividade cruzada e de peso molecular (160 KD ) foi descrito por Burtin et al. , (in: Fishman & Sell, Onco-developmental expressão genética do de senvolvimento oncológico, N.Y. 1976, pp. 609-611) e foi designado como NCA-II. lhante ao antigénio-2 Matsuoka et al. (Int .

Este antigénio parece ser muito semefecal normal (NFA-2) descrito por

J. Câncer 21, 604, 1978).

O mesmo grupo identificou em fezes de adulto normal uma glicoproteina relacionada com CEA de 20-30 KD chamada NFA-1 (Kuroki et al. , Mol. Immunol . 19 , 399, 1982). Finalmente, a glicoproteina-1 biliar (BGP-1) é um antigénio com reacção cruzada com CEA presente na bilis normal descrito por Svenberg (Int. J. Câncer 17, 558, 1976).

Estes resultados como um todo demonstram que os antisoros reconhecem epítopos específicos para o CEA isolados assim como epítopos presentes em ambos os antigénios CEA e afins do CEA; sugerem ainda genes intimamente relacionados entre os antigénios CEA e afins do CEA assim como relações do produto percursor entre alguns deles. De acordo com Hammarstrõm et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 72, 1528, 1975) e Hedin et al. (Mol. Immunol. 23, 1053, 1986) os epítopos encontram-se predominantemente localizados nas metades peptídicas de CEA e parecem ser fortemente dependentes da conformação.

A produção de anticorpos anti-CEA mono clonais é apresentada por vários grupos de pesquisa. Accolla et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 77 , 563, 1980) anticorpos obtidos a partir de dois clones de giam fortemente com CEA mas também fracamente referiram que hibridoma reac o m N G P .

As reacções destes dois anticorpos com CEA não foram inibidas competitivamente um pelo outro indicando que reagiam com determinantes antigénicos diferentes na molécula de CEA. Os anticorpos descritos por Kupchik et al. , (Câncer Res. 41, 3306, 1981) e Primus et al . (Câncer Res. 43, 686, 693, 1983) revelaram ter pelo menos um certo grau de reactividade com leucócitos polimorfonucleares (PMNs).

Kuroki et al. (J. Immunol. 30, 2090,

1984) descreveram dois MABs contra CEA os quais, contudo, não i reagiram com preparações de CEA purificadas diferentes das usadas para imunização. Estes MABs ainda não foram caracterizados quanto ao grau de reactividade em relação ao tumor versus tecidos normais.

Objectivo do invento

O objectivo do invento é constituído por MABs anti-CEA que possuem uma elevada afinidade em relação a CEA, que revelam uma elevada percentagem de ligação às células de carcinoma transportando CEA, tanto in vitro como in vivo, e que possuem elevadas taxas de ligação entre o tecido tumoral e o tecido normal (T/N).

Descrição do invento

O invento refere-se a um anticorpo mono-clonal especifico em relação ao antigénio carcinoembríóni co (CEA) humano, e seus derivados, caracterizado pelo facto de reconhecer epítopos de CEA não presentes ou antigénio NCAgg ou NCAgg de reacção cruzada não específicos, na glicoproteina biliar, ou nos granulocitos, e que se liga ao CEA humano com uma afinidade de pelo menos (1,6 + 0,3) χ ΙΟ^θ litros/mol.

Em particular, o invento refere-se ao anticorpo monoclonal com a designação MAb CE25, e seus derivados .

Os derivados de um anticorpo monoclonal de acordo com o invento, especialmente de MAb CE25, são, por exemplo, fragmentos, tais como os fragmentos univalentes, Fab ou Fab' e os fragmentos divalentes F(ab')2 (Fab = ligação ao fragmento antigénio), que retem a sua especificidade em relação aos determinantes antigénicos de CEA, conjugados do anticorpo com enzimas, marcadores fluorescentes, quelatas de metal, substâncias citotóxicas ou citostáticas , avidin, biotin, etc., e anticorpos marcados radioactivamente.

Os enzimas usados para anticorpos conjugados do invento são, por exemplo, peroxidase de rábano bravo, fosfatase alcalina, (¾ -D-galactosidase, glucose oxida se, glucoamilase , carboanidr ase , acetilcolinosterose , lisoz^L ma, malato deshidrogenase ou glucose-6-fosfato deshidrogenase . Os marcadores fluorescentes conjugados com MAb são fluoresceina, fluorocromo, rodamina, etc.

Nesses conjugados o anticorpo está ligado aos enzimas ou marcadores fluorescentes directamente ou por meio de um grupo de espaçamento ou ligação. Exemplos para quelatores de metal são ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentaacético (DPTA), 1,4,8,11-tetraazatetradecano, ácido 1,4,8,11-tetraazatetradecano-1, 4,8,11-tetraacético, ácido 1-oxa-4,7,12,15-tetraazaheptadeca no-4,7,12,15-tetraacético, etc.

Os citostáticos, aplicáveis em ligação com os anticorpos do invento, são, inter alia, substâncias de alquilação, tais como meclorotamina, trietilenofosfaramida, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucil, busulfan, melfalan ou triaziquone, também composto nitrosoureia, tais como carmustine, lomustine, ou semustine. São também usadas antimetabolitos, tais como metotrexato, mercaptopurina, citarabina , fluorouracilo, floxuridina, ou ftorafur.

Um outro grupo de citostáticos inclui vinblastina e vincristina, assim como certos tais como actinomicina-D, daunorubicina xorubicina, mitramicina, estreptonigrina micina. Outros citostáticos apropriados carbacina, hidroxiureia, L-asparaginase, estramustina, ou podofilotoxina.

antibióticos, (= daunomicina), domitomicina e bleosão , inter dacarbazina, alia, pro mitotaOutros agentes citostáticos são e antagonistas das hormonas, tais como corticosteroides, exemplo prednisona, progestinas, por exemplo, hidroxipr gesterona ou medroprogesterona, estrogénios, por exemplo di tilestilbestrol, antiestrogénios, por exemplo tamoxifen, drogénios , por exemplo testosterona , e inibidores da aromata. por exemplo aminoglutetimida.

hormonas por o| <1) | auDerivados de um anticorpo monoclonal do invento conjugado com uma substância citostática contem ou a toxina intacta ou o seu derivado de cadeia-A. Toxinas apro priadas para ligação com anticorpo são, entre outras, várias lectinas , tais como ricina ou abrina, ou toxina A da difteria

Os anticorpos monoclonais marcados ra - 12 3 ~ dioactivamente contem por exemplo, iodo radioactivo ( I, 125 131 . , . ,9θν> 4-· _f99m .

I, I), yttrium ( Y), tecnetium ( Tc), etc.

Urn anticorpo monoclonal e os seus derivados de acordo com o invento são preparados por processos que são conhecidos per se, caracterizados pelo facto das células do hibridoma tal como são definidas a seguir segregando o anticorpo monoclonal sereno multiplicadas de acordo com métodos conhecidos in vitro ou in vivo. Se desejado, os anticorpos monoclonais resultantes são convertidos nos seus derivados.

A multiplicação in vitro é num meio de cultura apropriado, que são os meios padrão habituais, por exemplo Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) ou meio RPMI 1640, de mamífero, por exemplo vestigiais e suplementos pio células toneal do realizada de cultura cheio facultativamente por um soro de vitelo fetal , ou elementos sustentando o crescimento, por exem alimentadoras tais como células do exsudado peo ratinho normal, células do baço, dula óssea, etc.

soro macrófagos da me A produção in vitro rações de anticorpo relativamente puras e proporcional para dar origem a grandes quantidades dos antiTécnicas para o cultivo de hibridoma em em condições de cultura de tecido são conhecidas incluem cultura em suspensão homogénea, reactor de elevação proporciona prepa permite um aumento corpos desejados, larga escala na técnica e num por exemplo, agitação continua, ou cultura de nhadas em armadilha, por exemplo las , em micro pérolas de agarose de ar ou num reactor com células imobilizadas ou apa microcápsuem fibras ocas, ou em cargas de cerâmica.

Para isolamento dos anticorpos monoclo nais, as imunoglobulinas nas porções flutuantes das culturas são primeiramente concentradas por exemplo por precipitação com sulfato de amónio, diálise contra material higroscópico tal como PEG, filtração através de membranas selectivas , etc.

Se necessário e/ou desejado, os anticor pos concentrados são purificados pelos métodos crornatográfi cos habituais, por exemplo filtração por gel, cromatografia de permuta iónica, cromatograf ia sobre celulose-DEAE , Protei.

na A ou cromatografia de imuno-afinidade .

Grandes quantidades dos anticorpos monoclonais desejados podem também ser obtidos multiplicando as células do hibridoma in vivo. Os clones celulares são in_ jectados a mamíferos que sejam histocompatíveis com as células afins, por exemplo, ratinhos sinjeneicos, para causar crescimento dos tumores produtores de anticorpos.

Facultativamente, os animais são prepa rados com um hidrocarbonato, especialmente óleos minerais tais como pristano (tetrametilpentadecano), antes da injecção. Após uma a três semanas, os anticorpos monoclonais desejados são recuperados dos fluidos do corpo do referido mamífero.

Como um exemplo, as células de híbrido ma derivados dos ratinhos Balb/c são injectadas intraperitonealmente a ratinhos Balb/c pré-tratados facultativamente com um hidrocarboneto tal como pristano, e após uma a duas semanas são recolhidos os fluidos ascíticos destes ratinhos. Os anticorpos monoclonais desejados são isolados a partir dos fluidos corporais por métodos convencionais tal como foram atrás descritos.

Fragmentos de anticorpos monoclonais, por exemplo fragmentos Fab, Fab' ou F(ab')2, que retêm a sua especificidade em relação ao CEA humano, podem ser obtidos a partir de compostos preparados tal como foi atrás descrito por métodos conhecidos per se, por exemplo, por digestão com enzimas tais como a pepsina ou a papaina e/ou clivagem das ligações di-sulfureto por redução química.

Os conjugados de anticorpos monoclonais do invento são preparados por métodos conhecidos nesta técnica, por exemplo, por reacção de um anticorpo monoclonal preparado tal como foi aqui anteriormente descrito com o enzima na presença de um agente de ligação, por exemplo glutaraldeido, periodato, N,N'-o-fenilenodimaleimida, N-(m-maleimidobenzoloxi)-succinimida, N-(3-/~2'-piridilditio 7-propionoxi )-succinimida, N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida , etc .

Os conjugados com avidina são preparados de um modo semelhante. Os conjugados com biotina são preparados por exemplo por reacção de anticorpos monoclonais com um éster activado da biotina tal como o N-hidroxisuccini_ mida éster de biotina. Os conjugados com marcadores fluores centes são preparados na presença de um agente de ligação, por exemplo os indicados atrás, ou por reacção com um isotio cianato, de preferência fluoresceina-isotiocianato. Os conjugados de anticorpo com quelatos de metal são preparados de um modo análogo.

Os anticorpos monoclonais marcados radioactivamente com iodo ( I, I, I) sao obtidos a par tir de anticorpos monoclonais de acordo com o invento por io dinação conhecida per se, por exemplo com iodeto de sódio ou de potássio radioactivo e um agente químico de oxidação, tal como hipoclorito de sódio, cloramina T, etc, ou um agente de oxidação enzimático, tal como lactoperoxidase, glucose oxida se e glucose.

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento são ligados a yttrium (90 Y) por exemplo por quelação com ácido dietileno-triaminopentaacético (DPTA).

I

Os anticorpos marcados com Technetium-99 m são preparados por processo de permuta de ligandos, por exemplo reduzindo pertechnate (TcO^ ) com solução de estanho, fazendo a quelação do technetium reduzido numa coluna Sephadex e aplicando o anticorpo a esta coluna, ou por meio de técnicas de marcação directas , por exemplo incubando pertechnate, um agente de redução tal como SnCl₂, uma solução tampão tal como uma solução de ftalato de sódio-potássio, e o anticorpo.

invento também se refere à linhagem de células de hibridoma que segregam um anticorpo monoclonal anti-CEA de acordo com o invento, de preferência a linhagem celular do hibridoma com a designação CE 25, a qual foi depositada na Collection Nationale de Cultures de Microorganis mes (Colecção Nacional de Culturas de Microorganismos ) do Instituto Pasteur, Paris, em 15 de Dezembro, 1987, sob o numero de acesso 1-719.

As linhagens de células do hibridoma do invento são geneticamente estáveis, segregam anticorpos monoclonais do invento com especificidade constante e podem ser reactivados a partir de culturas congeladas a temperatu ras baixas por descongelação e reclonagem.

invento também se refere a um proces so para a preparação dessa linhagem celular de hibridoma, ca racterizado pelo facto de ratinhos Balb/c serem imunizados com CEA humano purificado ou com um veiculo antigénico contendo CEA humano purificado, sendo as células produtoras de anticorpo dos ratinhos Balb/c imunizados fundidos com células do mieloma P3-NS2/lAg4, e sendo as células híbridas obti das na fusão clonadas, e sendo seleccionadas as células clones segregando os anticorpos desejados.

A imunização com CEA de elevada pureza, preparado pelos métodos que se seguem é preferida. O CEA é extraído das células que transportam CEA, por exemplo metastases de adenocarcinoma colorectal, ou do pulmão, ou adenocarcinoma primário do pulmão, por precipitação com ácido perclórico, ou por extração salina.

O últi mo método é vantajoso visto que o CEA resultante ser menos desnaturado. Para o processo de extracção salina, o tecido que transporta CEA é homogenizado em tampão com um pH variando entre 7,0-7,6 tal como tampão fosfato, tampão Tris, tampão TAPSO (ácido Γ3- ΓN-tris(hidroximetil)metilamino_7-2-hidroxipropanosulfónico ) , tampão POPSO (ácido piperazina-N,N¹-bis- /”2-hidroxi-propanossulfónico 7) , tampão EPPS (ácido N- /~2-hidroxietil 7-piperazina-N¹-3-propanossulfónico),etc.

conhecidos per se, vos mecânicos, por turrax , sio-activos tais como Tween

A homogenização é alcançada por exemplo pela utilização de exemplo um batedor, misturador por ondas de ultra-som, pela adição de compostos tenTriton ou Tergitol, etc.

por métodos dispositiou ultraO CEA extraído é purificado por meio de métodos de cromatografia convencionais tais como cromatograf ia de permuta iónica, filtração por gel, cromatografia de afinidade, etc, e/ou por aplicação a um imunoadsorvente consistindo numa combinação de anticorpos anti-CEA conhecidos conjugados com uma matriz tal como sefarose ou agarose, facultativamente activados, por exemplo com brometo de cianogénio, cloroformato de nitrofenilo, hidrazida poliacrilamida ou outros.

Especialmente preferido é um processo para a preparação das linhagens celulares de hibridoma do i_n vento e seus derivados, caracterizado pelo facto de ratinhos Balb/c serem imunizados injectando intraperitonea1mente 15 pg de CEA purificado extraído por solução salina, sendo administrada intraperitonealmente após 4 meses uma série de in jecções intensificadoras (de reforço) com 15, 50 e 150 pg de CEA purificado extraído com solução salina, sendo células de baço retiradas de animais imunizados 3 dias após a última infecção e fundidas com células de mieloma P3-NS2/lAg4 na presença de um promotor de fusão.

Os promotores de fusão considerados são por exemplo virus Sendai ou outros paramixovirus , facultativamente sob a forma inactivada-UV, iões de cálcio, lipidos tensio-activos tais como lisolecitina , ou polietileno glicol.

A fusão celular é realizada de acordo com métodos descritos préviamente (Kõhler & Milstein,

Nature

256, 495, 1975 ) .

De preferência, as células de mieloma são fundidas com um excesso de três a vinte vezes superior de células do baço retiradas de mamíferos imunizados numa solução contendo cerca de 30% a cerca de 60% de polietileno glicol, com um peso molecular variando entre 1.000 e 4.000.

Após a fusão, as células são suspensas de novo e expandidas, num meio de cultura apropriado tal como foi aqui anteriormente descrito, suplementada com um meio selectivo , por exemplo meio HAT, com intervalo de tempo regu lares a fim de evitar que as células de mieloma normais ultrapassem em número as células do hibridoma.

Os produtos flutuantes da cultura de células de hibridoma são testadas em relação ao anticorpo mo noclonal contra CEA com um imunoensaio, de preferência com um imunoensaio enzimático ou um imunoensaio com rádio. As linhagens de células de hibridoma que segregam MAbs anti-CEA monoclonais tal como foi anteriormente descrito, por exemplo a linhagem de células CE25 que segregam MAb CE25, são clonadas, por exemplo limitando a diluição em agar mole, de preferência duas vezes ou mais.

Facultativamente, as células de hibridoma são feitas passar através de animais, por exemplo ratinhos, por injecção intraperitoneal e colheita da ascite, o que estabiliza as hibridomas e melhora as características de crescimento. As linhagens de células clonadas podem ser con geladas de um modo convencional.

Os anticorpos monoclonais e os seus de_ rivados de acordo com o invento são úteis no diagnóstico do cancro.

Um exemplo de utilização diagnóstica é constituído pela determinação qualitativa e quantitativa do antigénio carcinoembriónico humano, especialmente em flu dos biológicos. O anticorpo monoclonal do invento e seus d rivados podem ser usados em qualquer um dos imunoensaios conhecidos per se que utilizam as interacções de ligação entre o antigénio e o anticorpo monoclonal, tais como os radioimunoensaios (RIA), imunoensaios ligados ao enzima, testes de imunofluorescência , aglutinação do latex ou hemaglutinação.

|(D | H-16-

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal ou sob a forma de de rivados marcados radioactivamente num radioimunoensaio (RIA). Pode ser usada qualquer uma das modificações conhecidas de RIA em fase homogénea, RIA de fase sólida ou RIA heterogénia, RIA simples ou RIA duplo (sandwich) com determinação directa ou indirecta (competitiva) de CEA.

um RIA em sandwich em

E preferido um veiculo apropriado, por exemplo placa de microtitulação ou de um tubo de ensaio, por de poliestireno, vidro ou pérolas de plástico, papel folhas de acetato de celulose ou de a superfície plástica que de uma pl o exem cloreto de polipropileno ou de ριΐινιηι de filtro, ou dextra no , é revestido com um anticorpo monoclonal nitrocelulose , etc , o CEA por sim pies adsorção ou facultativamente após activação do veiculo, por exemplo com glutaraldeido ou brometo de cianogénio, e incubado com a solução do teste e uma solução de marcado radioactivamente com I, contra um anticorpo monoclonal monoclonal dissolvido reconhecendo um com para lo , e ao veicuanticorpo outro epítopo de CEA além diferente do anticorpo monoclonal ligado a quantidade de CEA é determinada medindo a radioactividade ligada ao veiculo.

RIA em sandwich é um anticorpo anti-CEA monoclonal do invenUm dos anticorpos utilizados no to .

Particularmente preferido é um radioimunoensaio em sandwich tal como foi agui anteriormente desem gue um anticorpo monoclonal do invento é por exemplo uma pérola de polistireno, incubada numa solução do teste e é finalmente desenvolvido com corpo monoclonal marcado com rádio que reconhece um epítopo diferente.

cri to, uma pérola, ta pérola revestida nizada contendo CEA ligado a sendo esou padroum anti-17Os anticorpos com o invento podem ser usados como rivados formados por conjugados com enzima. Esses imunoensaios com em que monoclonais de acordo tal ou sob a forma de de enzima num imunoensaio incluem processos de teste são usados os derivados de anticorpos monoclonais ma cados com enzima de acordo com invento ou anticorpos marc dos com enzima com um epítopo conhecidas per se dos anticorpos do que reconhecem e se ligam invento.

imunoabsor vente ligado a enzima) como foi descrito anticorpo monoclonal de acordo com o invento, incubado com uma solução do teste contendo CEA e depois com ção ao CEA, por exemplo soro de um soro policlonal em relacarneiro, e, finalmente, os anticorpos ligados do soro policlonal marcados com enzima são desenvolvidos por anticorpos ligam com que os reconhecem e que se é determieles , e a quantidade da proteina ligada nada por uma reacção do substrato enzimático. Esse anticorpo marcado com enzima e, por exemplo, uma imunoglobulina de cabra contra carneiro marcada com fosfatase.

Também se prefere um ELISA em que um veiculo revestido com o invento ção de um um anticorpo monoclonal de acordo é incubado com uma solução do teste e com uma anticorpo monoclonal que é conjugado com um anticorpo monoclonal dissolvido reconhecendo com soluenzi ma , epítopo diferente de CEA em relação ao que é reconhecido pelo anticorpo monoclonal ligado ao veiculo.

com o um

-18Por meio de uma reacção do substrato enzimático que resulta, por exemplo, numa alteração da cor que pode ser observada a olho nú ou por meio de dispositivos de medição õptica, é medida a quantidade de enzima ligado, a qual é proporcional à quantidade de CEA na solução do teste.

Também se prefere um ELISA em usado um anticorpo monoclonal marcado com enzima do e o veiculo é revestido com um anticorpo monoclonal que é invento anti-CEA que reconhece um epitopo diferente daquele que o anticorpo monoclonal reconhece de acordo com o invento.

Particularmente preferido é um imunoen saio enzimático chamado análise immunodot, em que as soluções do teste ou padrão contendo CEA são localizadas num veiculo microporoso com uma elevada afinidade intrínseca em relação aos polipeptideos, por exemplo em nitrocelulose, sendo o vei culo que tem uma ou várias partes com as referidas amostras incubado numa solução de um anticorpo monoclonal do invento, em seguida numa solução de um segundo anticorpo marcado com enzima que reconhece e se liga com o anticorpo monoclonal do invento e finalmente uma solução de um substrato enzimático que leva a um sinal detectável, por exmplo uma substância corada.

Esse segundo anticorpo marcado com enzima é por exemplo imunoglobulina de coelho anti-ratinho conjugada com peroxidase de rábano bravo que pode ser desenvolvido com substractos enzimáticos apropriados tais como

4-cloro-1-naftol, etc.

Os anticorpos monoclonais de acordo com o invento podem ser usados como tal sob a forma de derivados de acordo com o invento conjugados com marcadores fluorescentes em testes de imunofluorescência.

-19Esses testes de imunofluorescência incluem processos em que são usados os derivados do anticorpo monoclonal de acordo com o invento, por exemplo derivados conjugados com fluoresceina, ou anticorpos marcados com mar-

cadores fluorescentes conhecidos per se que reconhecem e se ligam com um epítopo do anticorpo monoclonal do invento.

E preferido um teste de imunofluorescência em que um veiculo tal como foi atrás descrito para RIA é revestido de acordo com métodos padrão (normalizado) com células a serem testadas quanto à presença de CEA , sendo as células fixadas e permeabilizadas para permitir a interacção do material proteináceo no interior da célula com soluções aplicadas, sendo incubado com uma solução de um derivado de anticorpo monoclonal conjugado com um marcador fluorescente ou incubado com uma solução de um anticorpo monoclonal do in vento seguindo-se uma solução de um segundo anticorpo marcado com um marcador fluorescente que reconhece e se liga ao anticorpo monoclonal do invento, por exemplo uma imunoglobulina de coelho anti ratinhos marcada com fluoresceina. A presença de CEA é então detectada e localizada por microscopia de fluorescência padrão ou por citometria de fluxo.

A utilização de acordo com o invento de anticorpos monoclonais e seus derivados tal como foi aqui anteriormente descrito para a determinação qualitativa e quantitativa do CEA humano inclui também outros imunoensaios conhecidos per se, por exemplo aglutinação de latex com partículas de latex revestidos com anticorpo ou revestida com antigénio ou hemaglutinação com glóbulos vermelhos sanguíneos revestidos com anticorpo ou revestidos com antigénio, etc.

-200 invento relaciona-se também com esto jos para teste para a determinação qualitativa e quantitativa dos anticorpos monoclonais contendo CEA do invento e/ou seus derivados e, facultativamente, outros anticorpos monoclonais ou policlonais e/ou adjuntos.

Os estojos do teste de acordo com o in vento para um radioimunoensaio contém, por exemplo, um veiculo apropriado , não revestido ou revestido com um anticorpo monoclonal do invento, facultativamente congelado pelo frio ou soluções concentradas de um anticorpo monoclonal ou policlonal em relação ao CEA e/ou um seu derivado marcado com radio, solução de CEA padrão (normalizadas), soluções tampão e, facultativamente, polipeptideos e detergentes para evitar adsorção não especifica e formação de agregados, pip£ tas, recipientes de reacção, curvas de calibração, manuais de instrução, etc.

Os estojos do teste de acordo com o invento para um imunoensaio enzimático, contém, por exemplo, um veiculo apropriado, por exemplo placas de monotitulação ou folhas de nitrocelulose, facultativamente soluções secas por congelação ou concentradas de um anticorpo monoclonal do invento e de um anticorpo monoclonal ou policlonal marcado por enzima em relação ao CEA ou em relação a um primeiro anticorpo reconhecendo CEA, substratos enzimáticos sob uma for ma sólida ou dissolvida, soluções de CEA padrões, soluções de tampão e, facultativamente, polipeptideos e detergentes, pipetas, recipientes de reacção, curvas de calibração, quadros de escala de cores, manuais de instrução, etc.

Os estojos de teste de acordo com o in vento para um teste de imunofluorescência contem, por exemplo, um veiculo apropriado por exemplo, coberturas de plástico ou lâminas de vidro facultativamente secas por congela

ção ou soluções concentradas de um anticorpo monoclonal do invento e de um anticorpo policlonal marcado com fluoresceina reconhecendo o anticorpo monoclonal, soluções de tampão e, facultativamente, soluções de CEA padrão, polipepetideos e detergentes, pipetas, recipientes de reacção, manuais de instrução , etc.

invento e seus

Além disso, o derivados são usados ção de imagem in vivo de tumores.

in vivo , o anticorpo ou conjugado com xo com um nucleto de monoclonal do dio um quelato radio, por de rhenium, das para metal formando um compleexemplo iodo, etc, e as técnicas de exploração por primários e metastáticos.

detectar tumores technetium, rádio são usaesta finalidade, o anticorpo radio injectado, por exemplo, intravenosamente e o doente é explorado com um formador de imagens gama com intervalos regulares. Os tumores expressando CEA fixarão mais anticorpos radioactivos do que os outros tecidos reconhecidos pela câmara de imagens gama.

τ 131_T anticorpos monoclonais marcados com I para a exploração com rádio em quantidades de 3 presentando 15 a activo e

Com e serão claramente ou

De preferência os ¹²³!

são usados /1CI por kg de peso corporal .

Para a actividade biocida to do cancro, os vados conjugados tal como foi aqui A em ca a 50 ^pg reno tratamenanticorpos do invento são usados como dericom substâncias citostáticas ou citotóxicas anteriormente descrito, por exemplo ricina marcados com rádio, ou ainda administrados liposomas contendo reagentes biocidas. A dose terapeutipara mamíferos varia entre aproximadamente 1 mg e 5 mg por kg de peso corporal para os próprios anticorpos monoclonais, e entre 0,1 mg e 5 mg por kg do peso corporal para con como derivados

jugados com drogas citotóxicas, dependendo do estado do doen te e do modo de aplicação.

invento também se relaciona com preparações farmacêuticas contendo o anticorpo monoclonal do invento e/ou seus derivados com uma especificidade elevada em relação ao CEA como foi aqui anteriormente indicado. As preparações farmacêuticas contêm, por exemplo, o anticorpo monoclonal do invento ou seus derivados numa quantidade eficaz juntamente ou em mistura com veículos inorqânicos ou orgânicos, sólidos ou líquidos, farmaceuticamente aceitáveis.

São preferidas preparações farmacêuticas para aplicação parentérica. As preparações para aplicação intramuscular, subcutânea ou intravenosa são, por exemplo, soluções ou suspensões aquosas isotónicas , facultativamente preparadas pouco antes da sua utilização a partir de preparações liofilizadas ou concentradas.

As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e conter adjuvantes por exemplo para conservação, estabilização, humidificação , emulsificação ou solubilização dos ingredientes, sais para a regulação da pressão osmótica, tampão e/ou compostos que regulem a viscosidade, por exemplo carboxicelulose de sódio, dextrano , polivinilpirrolidona ou gelatina.

São preparadas por métodos conhecidos nesta técnica, por exemplo por mistura, dissolução ou liofilização convencionais; e contêm aproximadamente 0,01% a apro ximadamente 50% dos ingredientes activos. As preparações para injecções são processadas, introduzidas em ampolas ou frascos , e seladas em condições assépticas de acordo com mé_ todos conhecidos nesta técnica.

Os exemplos que se seguem ilustram o

invento mas não o limitam de qualquer modo.

Abreviaturas

BSA	albumina do soro bovino
FCS	soro de niteto fetal
ELISA	ensaio de imunoabsorção ligado a enzima
meio HAT	meio hipoxantina/aminopterina/1imidina
NCA	antigénio de reacção cruzada não especifico
PBS	solução salina tamponada com fosfato

Exemplo 1: Preparação da linhagem celular CE25 do hibridoma

1.1 Purificação do antigénio carcinoembriónico (CEA)

São extraídas com solução salina metás_ tase do figado do carcinoma do colon (nas 6 horas após a mor te). 1 volume de tecido é primeiro homogenizado em 3 volumes de tampão fosfato 0,02 M pH 7,4 a 42C durante 10 minutos, num Sorrall Omnimixer a 8.000 rpm.

O homogenato crú é então centrifugado a 8.000 g durante 15 minutos a 42C. O produto flutuante transparente é aplicado a um imunoabsorvente consistindo numa reunião dos anticorpos monoclonais MAb 35 e MAb 115 anti CEA conhecidos Haskell et al., Câncer Res. 43, 3857, 1983; Buchegger et al., J. Exp. Med. 158, 413, 1983) e MAb 73 (Buchegger et al., Immunol. Letters 5, 85, 1982) ligados

-24com Sepharose activada com CnBr . 0 CEA é submetido a eluição com tiocianato de amónio 2M. Após uma cromatografia final com Sepharose 6B obtem-se CEA com uma pureza de 90%.

1.2 Imunização de ratinhos Balb/c

Ratinhos Balb/c com dois meses de idade são imunizados com CEA por injecção intraperitoneal de 15 pg de CEA purificado extraído com solução salina com adjuvante de Freund completo. Após 4 meses, é administrada uma série de injecções intensificadoras compreendendo 15, 50 e 150 pg da mesma preparação salina de CEA sem adjuvante de Freund administradas intraperitonealmente 5, 4 e 3 dias antes da fusão, respectivamente.

1.3. Fusão celular

A fusão celular é realizada g

x 10 células do baço de ratinhos imunizado e 1,5 usando 1 , 5 x 10⁷ células de mieloma

P3-NS2/lAg4 de ratinho de acordo com métodos convencionais descritos previamente (Koehler & Milstein, Nature 256 , 495, 1975). Após lavagem, as células são de novo suspensas em 48 ml de meio essencial mínimo de Dulbecco padrão Gibco No. 0422501). 3 x 10^ células normais de ratinho do exsudado peritoneal são adicionadas com células ali mentadoras.

As células são distribuídas por recipientes Costar 96 x 0,5 ml e alimentadas 3 vezes por semana com meio padrão de selecção HAT durante 3-6 semanas. Quando o crescimento das células de hibridoma se torna visível , os produtos flutuantes são testados tal como foi descrito no Exemplo 1.4. Os hibridomas positivos são reclonados e armazenados .

1.4 Ensaio de detecção do anticorpo

Fluidos de cultura dos hibridomas em crescimento são testados quanto à presença de anticorpo anti-CEA por meio de uma modificação do ensaio de Farr (J. Infect. Dis. 103 , 239, 1958) tal como foi previamente descrito Acco11a et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 77 , 563, 1980). Diluições 1:10 (v/v) dos produtos flutuantes da cultura de células são 125 incubadas em duplicado com CEA marcado com I em tampão HCl-Tris 0,02M, pH 7,4. A ligação do CEA aos anticorpos é precipitada a 4°C adicionando solução de sulfato de amónio saturada , fria , na presença de soro humano normal.

As linhagens de células de hibridoma segregando anticorpos anti-CEA que reconhecem epítopos de CEA não presentes ou antigénio NCA^^ ou NCA^ de reacção cru zada não especifico, em glicoproteina biliar ou em granuloei tos, e ligados a CEA humano com uma afinidade de pelo menos (1,6 í 0,3) x ΙΟ^θ litros/mol, por exemplo linhagem celular CE25 segregando MAb CE25, são seleccionadas para outros estudos .

1.5 Armazenamento e processamento do hibridoma

As células de hibridoma seleccionadas podem ser feitas crescer em cultura, congeladas a -80°C ou em azoto liquido sendo então reactivadas. As células são clonadas pelo método de limitação de diluição e são expandidas formando ascite em ratinhos Balb/c preparada com pristano .

A linhagem celular CE25 foi depositado na Collection Nationale de Culturas de Microorganismos (Colecção Nacional de Microorganismos) do Instituto Pasteur, Paris, em 15 de Dezembro, 1987, sob o numero de acesso 1-719 .

Exemplo 2: Isolamento e purificação do anticorpo monoclonal MAb CE 25 e preparação de derivados

2.1 Síntese in vivo

Ratinhos Balb/c com 8-10 semanas de idade são pré-tratados intraperitonealmente e com 0,5 ml de pristano (Aldrich). 1-3 semanas mais tarde, 2-5 x 10θ células de hibridoma clonadas são inoculadas intraperitonealmente. Após 8-10 dias ó fluido da ascite é recolhido, centrifugado a 800 x g e armazenado a -20°C ou a -80°C.

O fluido da ascite descongelado é centrifugado a 50000 x g durante 60 minutos. E removida cuidadosamente numa camada de gordura flutuando à superfície, e a concentração da proteína é ajustada até uma concentração de 10-12 mg/ml.

A imunoglobulina crua é precipitada por adição gota a gota de 0,9 equivalente por volume de sulfato de amónio saturado a 0°C, sendo então dissolvida em tampão fosfato 0,04 M pH 8 e submetido a diálise utilizando o mesmo tampão. Obtem-se uma fracção de imunoglobulina imunologicamente activa por cromatografia em celulose DEAE-D52 (Whatman) onde MAb CE25 é eluido no volume vazio.

Essas preparações proporcionando entre 5 e 15 mg de anticorpo por ml de ascite podem ser usadas di rectamente ou podem ser preparados fragmentos de anticorpo para aplicação in vitro e in vivo (Exemplo 2.3).

2.2 Síntese in vitro

E obtida uma pré-cultura da linhagem celular CE25 cultivando células de hibridoma a uma temperatura fisiológica (à volta de 37°C) em meio RPMI 1640, contendo 10% de FCS até uma densidade celular final de 5 x 10® a 10® células por ml. A totalidade da pré-cultura é introduzida em recipientes de cultura Bellco e ajustada até um volume to tal de 1.500 ml com meio RPMI 1640 recente/10% de FCS.

A cultura é agitada a cerca de 37°C sob CC>2 a 5% a 30 rpm durante dois a três dias, sendo então diluída até um volume total de 3.000 ml com RPMI 1640/10% de FCS e agitada durante mais sete a dez dias. Após este pe_ riodo de tempo 95% das células estão mortas. O caldo de cul tura é centrifugado a 1.000 x g durante 20 minutos a 4°C.

O produto flutuante é filtrado através de um filtro com um tamanho de poros de 0,2 um em condições de esterilidade. A imunoglobulina crua é precipitada por meio de adição lenta gota a gota de 0,9 eguivalente de volume de sulfato de amónio saturado a 0°C. Este precipitado é purificado tal como foi descrito no Exemplo 2.1.

2.3 Preparação do fragmento

Os fragmentos F(ab')2 de MAb CE25 são preparados usando digestão por pepsina (2-4%, p/p) em tampão acetato 0,2M pH 4 durante 22 horas a 37°C (Lamyoi & Nisonoff,

J. Immunol . Methods 56 , 235, 1983). F (ab' ) 2 fragmentos são purificados por cromatografia em Sephadex G150 onde os fragmentos F(ab')2 100 KD são eluidos sob a forma de um único pico e os pequenos produtos de digestão são bem separados.

A IgGl e F(ab')2 dos ratinhos de contro lo são purificados por métodos idênticos a partir de ascite dos ratinhos injectados com células de mieloma P3 x 63 (Koehler & Milstein, Nature 256, 495, 1975). A dextrose do gel poliacrilamida-SDS de acordo com Laemmli (Nature 227, 680, 1970) revela uma pureza superior a 95% das fracções IgG e F(AB')2.

Marcação com rádio de MAb CE 25 e dos seus fragmentos

MAb CE25 ou fragmentos são marcados com 131

I pelo método da cloramina-T a fim de proporcionar activi_ dades especificas de 8-9 pCi/pg de proteína. Não se observou marcação preferencial dos MAbs intactas em comparação com os fragmentos. O iodo ligado à proteína é separado do iodo livre por cromatografia em Sephadex, a qual

131 de menos de 1% de I ligado a proteínas noreactividade é controlada por incubação Sepharose activada com CnBr (Pharmacia).

revela a presença agregadas. A imude CEA ligado a

Exemplo 3:

Caracterização do anticorpo monoclonal MAb CE25

3.1. Determinação da classe e subclasse de MAb CE25

A classe e subclasse do anticorpo mono clonal MAb CE25 produzido por células de hibridoma clonadas é determinada pela conhecida técnica de Ouchterlony de imuno difusão agar-gel usando classe e subclasse de anticorpos de coelho específicos (Bionetics). Os resultados são confirmados por um imunoensaio enzimático (ELISA) do modo que se segue: Placas de microtitulação são revestidas com 1 μg por re cipiente de uma preparação de imunoglobulina de coelho de

uma classe - ou sub-classe - especifica de soro (Bionetics) em 50 μΐ de PBS. A capacidade de ligação livre da placa é saturada com um tampão de 1% de albumina do soro bovino em

PBS contendo 0,2% de NaN^ (p/v), pH 7,4.

Sondas de 100 μΐ contendo anticorpos monoclonais são incubados no recipiente a 37°C durante 1 hora. As placas são lavadas com PBS, sendo então incubadas a 37°C durante 1 hora com uma preparação de imunoglobulina de coelho conjugado com fosfatase com a mesma especificidade que foi usada para revestimento das placas.

O enzima fixado é desenvolvido por in cubação (37°C, 30 minutos) com uma solução do substrato enzimático fosfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml em tampão dietanolamina a 10% contendo MgCl₂ 0,5 mM e NaN^ a 0,02% (p/v), pH 9,8) e medindo a densidade óptica a 405 nm. O anticorpo monoclonal MAb CE25 pertence à classe IgGl .

3.2 Reactividade cruzada com antigénios de tecido normal

A linhagem de células de hibridoma

CE25 flutuante é testada quanto a reactividade cruzada com granulocitos presentes em cortes congelados de baço, pancreas, pulmão e figado normais; por meio de coloração indirecta com imunoperoxidase. Além disso, a ausência de reacção cruzada com glicoproteina biliar é determinada em cortes de tecido hepático humano normal.

Para coloração do antigénio com MAB anti-CEA usa-se uma técnica com três camadas de biotina-avidina-peroxidase (Guesdon et al., J. Histochem. Cytochem. 27, 1131, 1979). Em resumo, cortes pelo criostato com 10 jum são fixados durante 10 minutos em acetona à temperatura ambiente lavada em PBS frio contendo Thimerosal 5 x 10“^ m _e tratados

com a 7% para abolir a actividade da peroxidase endógena. Os cortes são então incubados durante 60 minutos com _H1 de fluido de cultura não diluído a partir da linhagem de células do hibridoma anti-CEA ou a partir da linhagem de células do mieloma P3 x 63Ag8 usadas como controlo.

A segunda incubação, de 15 minutos, faz-se com anticorpo IgG de cavalo anti-ratinho bioestanhado, seguindo-se uma terceira incubação, de 15 minutos, com o con jugado avidina-peroxidase (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA. Todas as incubações são realizadas à temperatura ambiente sendo seguidas por uma lavagem com PBS.

Finalmente, a actividade da peroxidase é revelada adicionando uma solução preparada recentemente contendo 0,4% de 3-amino-9-etil-carbazole e 0,015% de ^H2°2 ' e os tecidos são contra-corados com hematoxilina (Schreyer et al. , in: Sordat , 4th Int. Workshop sobre animais imunodeficientes em pesquisa experimental, Basel 1984).

Os resultados são resumidos no quadro que se segue:

imunoperoxidase em	coloração resultante
carcinoma do colon	++
pancreas normal	-
(duetos pancreáticos)
figado normal	-
(duetos biliares)
pulmão normal	( + )
(células epiteliais)
granulocitos de baço	-

simbolos:

++ coloração fortemente positiva , (+) coloração ocasional de algumas células epiteliais alveolares , nenhuma coloração

A especificidade de MAb CE25 é ainda analisada por um radioimunoensaio usando antigénios NCA^ e NCA_g5 com reacção cruzada não específicos marcada com rádio purificados. O estudo é realizado tal como foi descrito no exemplo 1.4 para , 125_T marcado com I o ensaio Farr exceptuando o facto de CEA

125 ser substituído por NCA marcado com I.

NCA é purificado a partir de extracto com ácido perclórico de pulmão normal por filtração sobre Sephadex G-200 seguindo-se imunoabsorção sobre uma coluna CNBr-Sepharose 4B contendo IgG de um antisoro anti-CEA de cabra com reacção cruzada conhecida com NCA (Heumann et al. , in: Lehmann , Carcino-embryonic proteins, Vol. 11, Amsterdam 1979).

NCAgg e NCAgg são ainda purificados por colunas de imunoadsorção contendo MAbs cada um destes reconhecendo dois NCA (Buchegger et al . , Int. J. Câncer 3 3 , 643, 125

1984). NCA_qt. é marcado com I pelo método com cloramina 125

T, NCAgg é marcado com I com o reagente de Balton e Hunter (Amersham, Bucks., England).

Os resultados do teste são:

radioimunoensaio em	percentagem de antigénio marcado com radio precipitado
125T
I CEA	54
125,.
I NCAcc	0
55
125,.
i nca95	1

Além disso, muda-se a ligação de MAb

125

CE25 marcado com I a CEA ligado a Sepharose activada com CNBr e as células de tumor de colon Co 112 fixadas com glutaraldeido após incubação durante a noite a 25°C e ligação a leucócitos humanos recentemente preparados, embalados, após incubação durante 4 horas a 4°C.

Os resultados são indicados a seguir:

125 I MAb ligando-se a	percentagem do input de MAb marcados com radio
CEA imobilizado em	75
CNBr Sepharose
Células Co 112 fi-	60
xadas
Granulocitos recentes	< 1.7

Os resultados atrás referidos indicam que MAb CE 25 é um bom candidato para a localização óptima de tumor juntamente com acumulação mínima, não especifica na medula óssea e figado.

3.3 Determinação de constantes de afinidade

A uma quantidade limitada de MAb CE25, são adicionados

125 quantidãdes crescentes de CEA marcado com

I em PBS tal como foi

Nat1. Acad.

mano normal

TL’ é adicionado

563 descrito por Accolla et al.

1980) .

(Proc .

Após 16 horas, seguindo-se sulfato de amónio satu o soro hurado frio para precipitar CEA ligado a anticorpos. A radioactividade da amostra total e do'precipitado é determinada por contagem de y .

Para calcular a constante de afinidade curvas de saturação obtidas em equilíbrio são transformados e analisadas pelo método de Scatchard (Ann.N.Y.Acad.Sei. 51 , 660, 1949).

MAb CE 25 liga-se a CEA humano com uma afinidade de pelo menos (1,6 ί 0,3) x ΙΟ^θ litros/mol.

3.4 Determinação do epítopo reconhecido por MAb CE 25

A determinante antigénica (epítopo) de CEA reconhecida por MAb CE 25 é avaliada por meio de uma 125 técnica de inibição cruzada em que MAb CE25 marcado com I é testado quanto à sua capacidade de ligação a CEA não marcado seguindo-se incubação com um excesso 1.000 vezes maior de outro MABs anti-CEA, tal como foi descrito anteriormente por Accolla et al. (Proc. Natl . Acad. Sei. 77 , 563, 1980) e Haskell et al . (câncer Res. 43 , 3857, 1983). Os resultados indicam que MAb CE25 tem uma especificidade única em relação a um epítopo de CEA nãó reconhecido por qualquer um dos MAb anti-CEA previamente publicados.

Comparado com a especificidade do epítopo de MAbs previamente descritos por Buchegger et al. (Int. J. Câncer 3 3 , 643, 1984 ), o epítopo reconhecido por MAb CE25 está estericamente em relação intima com um epítopo reconhecido pelo conhecido MAb 202.

A ligação de MAb CE25 é fortemente ini bida por MAb 202. Os dois epítopos são contudo claramente diferentes , visto que MAb 202 revela uma reacção cruzada for te com granulocitos facto completamente ausente do MAb CE25.

epítopo reconhecido por MAb CE25 na molécula de CEA ou é repetitivo ou é mais acessível ao anticorpo monoclonal do que os epítopos reconhecidos por outros MAbs anti-CEA. Isto é sugerido por ensaios de ligação em que MAb CE25 (1 ng) marcado com rádio é incubado com células vivas de carcinoma do colon (3 x 10θ células).

-35Neste teste, MAb CE 25 liga-se até 36% enquanto que os MAbs anti-CEA e MAb 73 se ligam a um nivel inferior a 16%.

Estes resultados são confirmados por outros ensaios de ligação em que quantidades crescentes de MAb CE25 e o MAb 35 altamente especifico e bem caracterizado são incubados ou com CEA purificado ligado a Sepharose activada por CnBr ou a células vivas de carcinoma do colon tal como se descreve a seguir.

Para os ensaios de ligação à Sepharose -CEA, concentrações crescentes de dois anticorpos monoclonais marcados com rádio (0,15 - 40 jug) são incubados durante 16 horas a 25°C com 3 ^jg de CEA ligado a Sepharose -CnBr. A l.i gação não especifica é determinada por incubação com Sepharose - CnBr contendo proteina irrelevante e é subtraído. Os resultados demonstram que cerca de 4 vezes mais MAb CE25 se liga à Sepharose - ligada a CEA do que MAb 35.

Resultados muito semelhantes são obti dos num ensaio com células vivas de carcinoma do colon. As células do carcinoma de colon são feitas crescer em 96 placas de cultura de tecido após lavagem, quantidades crescentes de MAbs marcadas com rádio (2-450 jug) são então incubadas com as células aderentes durante 4 horas a 37°C num meio de cultura.

A ligação não especifica é determinada usando quantidades elevadas de MAb não marcado para inibir a ligação especifica e é subtraída. Tal como no ensaio com Sepharose - CEA atrás descrito, obtem-se uma ligação 4 vezes maior de MAb CE 25 às células de carcinoma de colon em comparação com MAb 35.

-36Assim, a ligação superior de MAb CE25 a células expressando CEA torna o anticorpo um candidato pro missor para o diagnóstico e aplicação da terapêutica.

Exemplo 4: Imunocintigrafia em ratinhos rapados

4.1 Modelos de tumor de ratinho rapado

O carcinoma do colon humano T380 (Martin & Halpern, Câncer Res. 44 , 5475, 1984; Mach et al. , Nature 248 , 704, 1974) transplantados seriadamente subcutaneamente para ratinhos rapados (Iffa Credo, Arbesle, France) , é usado como alvo para MAbs anti-CEA marcados com rádio e fragmentos.

O tumor T380 revela relativamente poucas áreas (superfícies) necróticas até tamanhos de mais de 1 g devido a um elevado grau de vascularização. O tumor é moderadamente diferenciado e contêm numerosos pseudolumens que são ricos em CEA, rodeados por células epiteliais com um grau mais baixo de organização.

Foi descrita a produção de CEA e a libertação na corrente sanguínea. Podem ser extraídos 15 a 45 pg de CEA por grama de tumor, e 10 a 18 ng por hora são produzidos e libartados para o sangue a partir de 1 g de tumor (Martin & Halpern, Câncer Res. 44 , 5475, 1984).

4.2 Injecção analítica a ratinhos rapados apresentando tumor

MAb CE 25, MAB 35 e MAb D17, cada um deles reconhecendo diferentes epítopos da molécula CEA, e os seus fragmentos F(ab')2 são marcados com rádio com pelo

método da cloramina T, dando origem a uma fica final de 8-9 jjCi/jug da proteína, venosamente a do colon T380 grupos de 0,2 de 3-4 ratinhos actividade especisendo injectados intra apresentando tumores nus a 1,5 gramas.

São usadas misturas de anticorpos e os se conseguir uma boa e rápida penetrado tumor assim como libertação de elevadas seus fragmentos para ção dos nódulos, quantidades de anticorpos durante um período de tempo mais longo. Anticorpos em fragmentos ou intactos

131'

I podem também irradiar diferentes áreas rais .

marcados com dos nódulos turno

A marcação com tendo em vista uma boa penetração dissecados 3 dias após a injecção 2 dias após injecção de F(ab')2.

tumoral e o tecido normal (T/N) são calculadas relação entre tumor e peso total (média T/N).

do de

As tumor.

também vantajosa

Os ratinhos são intactos ou anticorpos relações entre o tecido assim como a

A média T/N expressa a radioactividade do tumor/g em comparação com a dade do peso total/g incluindo todos os orgãos dissecada.

relação da radioactivie a carcassa

Os resultados são resumidos no quadro que se segue:

i I -H

k£>		kD
*	-	*
	co
	LH	CM

Relações T/N em ratinhos dissecados após injecção de doses terapêuticas de MAbs anti-CEA e fragmentos

c

Ή	E 0	E
Φ tn O	a ra	3
73	73	E
O	m E	Φ
73	u ω •r~>	73
	tn

		tn
O
-C	1	E
c	3	Φ
m	E
E		E
Π3	O	O
E	75	E

ml •H 73

Φ

O

105

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o		co

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xr		CO
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•—(	Ή	<—1

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CM	CM	r—I

m n n in r-~ cm

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	r-	r—1
co	CM	CM
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o	o	O

X	x:	X
	CM	co
CM	Γ-*	kO i—1

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tn		•H	O
O	Φ	U	73	*

Média T/N indica a taxa de radioactividade por grama do tumor em comparação com o ratinho total (sem tumor) incluindo sangue e carcassa.

4.3 Injecção terapêutica de ratinhos nús apresentando tumor do colon T380

Para demonstrar a possibilidade de se obter regressão do tumor de carcinomas injecção de MAbs anti-CEA marcados com do colon humano por

13!i são realizados as experiências gue se seguem.

Com fins terapêuticos, anticorpos intactos são misturados com os seus fragmentos F(ab')2 numa relação 1:2. Um mg desta mistura é marcado por cloramina T com 10 mCi de até uma actividade especifica de 8 pCi/ ^jg de proteína .

A ratinhos nús machos com 7 semanas de ida de são feitos transplantes de tumor do colon T380 e distribuem-se ao acaso 3-4 ratinhos por cada gaiola.

Os tumores são medidos três dias antes e no dia da injecção marcada com rádio, isot é, 10 dias após a transplantação quando os tumores estão bem estabelecidos e organizados e em crescimento exponencial. São escolhidos 4 grupos de ratinhos com tumores em crescimento de tamanhos variados.

O primeiro grupo é injectado intraveno 131 ^— samente com anticorpos marcados com 600 yiCi I , o segundo 131 com IgG normal marcado com 600 pCi I (também intactos e F(ab')2 misturados). Um terceiro grupo é injectado com uma quantidade correspondente de 75 ^ig de anticorpos anti-CEA não marcados, e um guarto grupo não recebe qualquer injecção .

A tiroideia dos ratinhos injectados com proteínas marcados com é protegida adicionando solução de Lugol a 5% à agua para beber (0,5 ml por 300 ml de água), carregando 3 dias antes da injecção e mantendo essa

-40adição até às 6 semanas em condições filtro e com são dos os seguintes. Os ratinhos assépticas usando gaiolas cobertas com acesso limitado a 2 pessoas, dias, e diâmetros do tumor em mantidos papel de

Inicialmente todos os mais tarde uma vez por semana, dimensões.

são medivolume

Usando fórmula rl x r2 x r3 x 4/3 7T r = radius ) as são calculados os volumes do tumor. A precisão para +10% como se medi ções do tamanho de cada tumor é de cerca ver i ficou por medições feitas por da totalidade do corpo usando ration, Houston vidas.

diferentes pessoas. A contagem um RADX Assayer 1 (RADX Corpo, Texas) permite a determinação de duas meias então calculada

A irradiação pelas fórmulas da totalidade do corpo

2.13 x T.eff x 1,44 x C x r ads (T.eff em horas, C em pCi/g, ^E(b

0,19 para

131 °Ύ

2,13 x T.eff x 1,44 (u r ) . en ι rads i=l (f = frequência de raios γ de raios ~y

E = energia ) multiplicado en and Cunningham, in: Friedman, = coeficiente de absorção linear (u dio (r), ver Johns in the Bannerstane Division of American lectures , φ = pelo rá

Monograph Radiation on

Therapy, Springfield 1978).

A ra os ratinhos é devida irradiação da totalidade do corpo pa em 90% à radiação /¾ e em 10% à radiação

Os ratinhos dissecados às 24 e às 72 h e no dia 7 após a injecção do Mab marcado com rádio em dose terapêutica são analisados quanto às relações (taxas) T/N. Uma relação T/N média total é calculada a partir das relações entre o tumor e a totalidade do corpo nestes animais tomando em consideração uma fase de enriquecimento e de diminuição putativa da radioactividade no tumor.

diação do corpo.

e 7 dias, e dissecados às apenas à racalculada em comparação com a dose da totalidade são examinados histologicamente aos 1 , obtem-se autoradiografia a partir de tumores 24

Uma dose no tumor devida

Os tumores e 72 horas após a injecção.

A coloração com imunoperoxidase usando porco e conjugado de peroxidase-IgG anti-porco é realizada em 3 tumores desenvolvendo-se tarde após injecção T380 não

MAbs anti-CEA de com anticorpo marcado com rádio assim como tratado nos ratinhos nús. O sangue de 4-5 com rádio ou de ratinhos do tumor ratinhos injectados com MAb marcado tados apresentando tumores e faz-se a contagem dos glóbulos brancos não traé obtido semanalmente após injecção com anticorpo do sangue.

Finalmente, cinco ratinhos, que sobrevivem durante 1/2 ano após os protocolos de terapêutica preliminar, são examinados histologicamente e por coloração com imunoperoxidase quanto às restantes células túmorais viáveis e à sua expressão em CEA. A tiroideia, fígado, rim, pulmão e baço destes últimos ratinhos são analisados morfologicameri te quanto às lesões provocadas pela radiação.

tamanho de enxertos de tumores bem estabelecidos aumenta até aos 6 dias após a injecção com anticorpo marcado com rádio mas nessa altura estabelece-se a regressão do tumor durante 4-12 semanas.

Isto deve corresponder quer a uma destruição de mais de 99% das células do tumor quer à destruição de uma percentagem inferior mas acompanhada por uma acen tuada inibição, da proliferação celular.

Um grupo principal de controlo de ratinhos é injectado com a mesma quantidade de Iggl normal ¹³¹I intacta marcada com e dos seus fragmentos F(ab')2. progressão do tumor é retardada durante 1 a 3 semanas em paração com os controlos não tratados, mas não regressão do tumor.

com se observa qualquer tumor em

Os resultados (evolução do tamanho do ratinhos tratados e dro que se segue.

No dia da tumor variam entre 47-50 mi/ controlos são resumidos no quatamanhos médios do injecção os nos quatro grupos de ratinhos Observa-se um aumento rápido nos grupos 28 dias que se seguem.

Em ratinhos injectados com tamanho médio do tumor após diminui até um valor mínimo anticorpos marcados com rádio o , 3 inicial ate 122 mm , no dia 28 (grupo a).

marcado com rádio observou-se uma progressão tante do tumor com um tamanho médio do tumor um aumento de 44 mm com

IgG normal lenta mas cons3 de 449 mm no dia 28.

Evolução dos tamanhos dos tumores em ratinhos tratados e controlos

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Novos resultados indicam que ratinhos nús em que se transplantou tumor podem ficar completamente curados dos seus tumores usando fragmentos F(ab*)2 marcados 131 com I de tres MAbs. 8 de entre 10 ratinhos sobreviveram um ano sem reincidência do tumor.

Os tumores dissecados 24 e 72 horas após injecção de doses terapêuticas de misturas anticorpo/

131 /fragmento marcados com I não revelam qualquer modificação histológica detectável por meio de-microscopia óptica. Em contraste, são observados superfícies desiguais de necrose e numerosas células picnóticas nos tumores dissecados 7 dias após a injecção.

Nos animais que sobreviveram 6 meses após a imunoterapêutica com rádio, são analisados vários orgãos pelo microscópio óptico. As tiroideias, rins, pulmões e baço têm um aspecto normal.

A ausência de mortalidade entre os ra tinhos tratados indica que os efeitos da imunoterapêutica com rádio sobre a hematopoiese são insignificantes.

Exemplo 5 :

Ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA)

5.1 Processo de ensaio

Placas de microtitulação de polipropileno (Dynatech) são revestidas durante um a 37°C e durante a noite a 4°C com 150 ^il anticorpo monoclonal MAb CE 25 (10 jug/ml ) periodo de 2 horas de uma solução do num tampão pH 8,6 (solução salina a 0,9% tamponada com carbonato contendo 0,02% de azida de sódio).

As placas são lavadas cinco vezes com PBS , e locais reactivos à proteína ainda presentes são saturados por incubação durante 1 hora a 37°C com 250 /j1 de um tampão pH 7,4 (0,2% de gelatina e 0,2% de NaN^ em PBS). As placas revestidas deste modo podem ser mantidas a 4°C neste tampão durante alguns dias.

μΐ de uma série de diluições de uma solução de teste ou de uma solução padrão contendo CEA humano purificado, 50 pl de tampão pH 7,4 e 50 jul de uma solução de anticorpo MAb 35 anti-CEA monoclonal marcado com fosfatase alcalina reconhecendo um epítopo de CEA diferente diluído 1:100 com tampão pH 7,4 são misturados e incubados nos reser vatórios das placas de microtitulação durante 2 horas a 37°C e durante 30 minutos a 4°C.

As placas são lavadas cinco vezes com PBS, sendo então incubadas durante 30 minutos a 37°C com 150 μΐ de uma solução de fosfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml em 10% de tampão dietanolamina, MgCl₂ 0,5 mM, pH 9,8). Medindo a densidade óptica a 405 nm, é determinado a quantidade de p-nitrofenol libertado, a qual é proporcional à quantidade de fosfatase enzimática ligado e desse modo proporcional à quantidade de CEA na solução do teste.

O ELISA pode também ser realizado usan do MAb CE 25 marcado com enzima e revestindo as placas de microtitulação com o anticorpo MAb 35 anti-CEA monoclonal reconhecendo um epítopo de CEA diferente.

5.2 Estojo de teste para ELISA

Um estojo de teste para o ensaio descri to no Exemplo 5.1 contem:

placas de microtitulação de polipropileno, ml de anticorpo MAb CE25 monoclonal (10 pg/ml) em solução salina tamponada com carbonato (0,9% de NaCl, 0,42% de NaHCO^ 0,0072% de Na₂CO₃, 0,02% de NaN₃), ml do anticorpo MAb 35 monoclonal ligado à fosfatase alcalina reconhecendo, um epítopo de CEA diferente (0,3 mg de anticorpo por ml) em tampão Tris (0,05 M, MgCl₂ 1 mM, BSA a 1%, 0,02% de NaN₃, pH 8,0), ml de solução padrão contendo 5 ^Jg de CEA humano purificado, 3 00 ml de PBS ,

300 ml de tampão pH 7,4 (0,2% de gelatina e 0,2% de NaN₃ em PBS ) , ml de fosfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml) em tampão dietano lamina (1 mg/ml), (10% de MgCl^ 0,5 mM, 0,02% de NaN₃ , ajustado para pH 8,9 com HC1), curva de calibração, escala de intensidade da cor, manual de instruções.

Exemplo 6: Preparação farmacêutica para aplicação parentérica

-4Ί 120 mg de anticorpo MAB CE 25 monoclonal preparado de acordo com o Exemplo são dissolvidos em 5 ml de solução salina fisiológica. A solução é feita passar através de um filtro bacteriológico, e o filtrado é introduzido numa ampola em condições assépticas. A ampola é preferencialmente armazenada no frio, por exemplo a -20°C.

-48REIVINDICAÇÕES

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais específicos em relação ao antigénio carcinoembriónico humano (CEA), e seus derivados, que reconhecem epítopos de CEA não presentes em antigénios NCA nca₉₅ biliar ou nos de reacção cruzada não específicos, granulocitos e que se ligam de pelo menos uma afinidade (1,6 í 0,3) x

   55 ^OU na glicoproteina ao CEA humano com ΙΟ^θ litros/mol, caracterizado pelas células multiplicados do hibridoma gue segregam o anin vitro ou in vivo, e, se deseticorpo serem jado, os anticorpos resultantes serem convertidos derivados.

   nos seus
2. 2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as células do hibridoma que segregam o anticorpo serem injectadas intraperitonealmente em ratinhos Balb/c que tenham sido facultativamente pré-tratados com um hidrocarboneto, e após 8-10 dias, o liquido ascitico é colhido destes animais.
3. 3θ. - Processo de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por se preparar o anticorpo monoclo nal com a designação de MAb CE25, e seus derivados.
4. 4ê. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um derivado de um anticorpo monoclonal , caracterizado por o anticorpo monoclonal ser con jugado com um enzima, um marcador fluorescente , um quelato de metal, uma substância citostática, avidina , biotina, e substâncias afins.

   -495â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um derivado de um anticorpo monoclonal, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser mar cado radioactivamente.
5. 6â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um derivado de um anticorpo monoclonal, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser cli vado enzimaticamente ou quimicamente dando origem a um fragmento .
6. 7â. - Linha celular de hibridoma carac terizado por segregar um anticorpo monoclonal especifico em relação ao antigénio carcinoembriónico humano (CEA) reconhecendo epitopos de CEA não presentes no antigénio NCAç.<_ ou NCAg,- de reacção cruzada não-especificos na glicoproteina biliar ou nos granulocitos, e que se ligam ao CEA humano com uma afinidade de pelo menos (1,6 + 0,3) x ΙΟ^θ litros/mol.
7. 8â. - Linha celular do hibridoma de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ter a designação CE25 .
8. 9â. - Processo para a preparação de uma linha celular de hibridoma de acordo com a reivindicação 7 ou 8 , caracterizado por ratinhos Balb/c serem imunizados com CEA humano purificado ou com um CEA humano purificado conten do veiculo antigénico, por as células produtoras de anticorpo dos ratinhos Balb/c serem fundidas com células P3-NS2/lAg4, por as células híbridas obtidas na fusão serem clonadas , e por serem seleccionados os clones celulares que segregam os anticorpos desejados.

   lOâ. - Processo de acordo com a reivindicação 9 , caracterizado por os ratinhos Balb/c serem imunizados com CEA purificado extraído com solução salina.

   ' llâ. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas contendo um anticorpo monoclonal especifico em relação ao CEA humano e/ou seus derivados preparados por meio de um processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ó anticorpo monoclonal ser misturado com um veiculo farmacêutico.
9. 12â. - Método para a terapia do cancro em mamíferos, caracterizado por um anticorpo monoclonal e/ou seus derivados preparados por um processo de acrodo com a reivindicação 1, serem administrados ao referido mamífero numa dosagem de 0,1 a 5 mg por kg do peso corporal.