CN117980327A - 抗体的特异性偶联 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由连接IgG抗体或类抗体蛋白重轻链之间半胱氨酸位点的制备均一的抗体偶联物或类抗体蛋白的偶联物的方法。本发明还涉及以特定方式制备偶联物的方法，包括生成抗体或类抗体蛋白试剂的特异性巯基，然后与药物/连接符复合物反应，或生成抗体或类抗体蛋白质试剂的蛋白分子，同时在一锅中与合成制备的连接符‑药物组装体反应以提供超过75％，在大多数情况下超过80％的有效载荷连接在IgG抗体或抗体样蛋白的重‑轻链之间的特定半胱氨酸位点的偶联物。它还涉及均一偶联物在靶向预防或治疗癌症、感染和免疫疾病的方法。

Description

抗体的特异性偶联
技术领域
本发明涉及通过连接抗体中某些半胱氨酸位点的硫基制备均一的抗体偶联物或类抗体蛋白分子/试剂的偶联物的方法。本发明还涉及以特定方式制备偶联物的方法，包括生成抗体或类抗体蛋白试剂的特异性巯基，然后与药物/连接子复合物反应，或生成抗体或类抗体蛋白质试剂的特异性巯基，同时在一锅中与合成制备的连接子-药物组装体反应。它还涉及均一偶联物在靶向预防或治疗癌症、感染和免疫疾病的方法。
技术背景
如今，ADC的发展步伐正在加快，过去5年的临床试验数量增加了三倍多，12个上市ADC中有7个在过去2年中，获得了美国FDA的批准，凸显了对这种变革性癌症治疗方法的热情。通过连接子将有效载荷和抗体偶联是决定ADC质量、安全性、疗效和整体成功的关键方面(M.Acchione、H.Kwon等人，2012，mAbs 4：3，362-372；M.J.Birrer，K.N.Moore等人，2019，J.National Cancer Inst.，111(6)，538-549)。美国FDA发布的一份报告指出，对于目前处于临床开发阶段的大多数ADC，剂量限制性毒性(DLT)似乎与靶向抗原无关，而是由有效载荷/连接子复合物有关(H.Saber和J.K.Leighton，Regulatory Toxicology andPharmacology 71(2015)444–452)；众所周知，ADC的连接子和偶联位点对ADC在制备和储存过程中的稳定性，以及体内血液循环中的毒性强弱，也起重要作用(J.R.McCombs和S.C.Owen，2015，AAPS Journal17，339–351)。
因此，现在对ADC化学和设计的研究和发展方向之一就是扩展连接子-有效载荷和偶联化学，以解决ADC对目标疾病的剂量限制性毒性(DLT)问题(Lambert，J.M.2016，Ther.Deliv.7，279-82；Zhao，R.Y.等人，2011，J.Med.Chem.54，3606-23)。目前，为扩展ADC治疗窗口(TW)，主要的研发工作集中在开发新型的可靠的定点ADC偶联方法，获得的ADC似乎具有循环半衰期更长，疗效更高，更能降低脱靶毒性，更优的体内药代动力学(PK)，生产工艺批间一致性更好等特性(Hussain，A.F.，等，Pharmaceuticals(Basel)，2021，14(4)，343；Sadiki，A.，等，Antib Ther.2020，3(4)，271-284；Wolska-Washer，A.；Robak，T.，DrugSaf，2019，42(2)，295-314；Tsuchikama，K.，An，Z.，Protein Cell.2018，9(1)，33-46；Thomas，A.等，Lancet Oncol.2016，17(6)，e254-e262；Strop，P.，等2013Chem.Biol.20，161-67；Wakankar，A.mAbs，2011，3，161–172；Zhao，R.Y.等，2011，J.Med.Chem.54，3606-23)。
近年来开发了几种用于定点偶联制备ADC的方法，(Panowski，S，2014，mAbs6，34)。它们包括在抗体上引入未配对的半胱氨酸，例如经改造的反应性半胱氨酸残基，即Genentech的THIOMAB技术(Junutula，J.R.，等2010Clin.Cancer Res.16，4769；Junutula，J.R.，等2008Nat Biotechnol.26，925-32；美国专利8，309，300；7，855，275；7，521，541；7，723，485，WO2008/141044)，用茂原链轮丝菌转谷氨酰胺酶引入谷氨酰胺标签(mTG)(Strop，P.，Bioconjugate Chem.，2014，25，855–862；Strop，P.，等.，2013，Chem.Biol.20，161–167；美国专利8，871，908，专利权人Rinat-Pfizer)或是用微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)引入(Dennler，P.，等，2014，Bioconjug.Chem.25，569–578.美国专利申请20130189287InnatePharma；美国专利7，893，019Bio-Ker S.r.l.(IT))，引入硫代海藻糖(Okeley，N.M.，等2013Bioconjugate Chem.24，1650)，通过诱变引入非天然氨基酸(Axup，J.Y.，等，2012，Proc.Natl.Acad.Sci.109，16101–16106；Zimmerman，E.S.，等，2014，Bioconjug.Chem.25，351–361；Wu，P.，等，2009Proc.Natl.Acad.Sci.106，3000-5；Rabuka，D.，等，2012Nat.Protoc.7，1052-67；美国专利8，778，631和美国专利申请20100184135，WO2010/081110，申请人Sutro Biopharma；WO2006/069246，2007/059312，美国专利7，332，571，7，696，312，和7，638，299，专利权人，Ambrx；WO2007/130453，美国专利7，632，492和7，829，659，专利权人Allozyne)，引入硒代半胱氨酸(Hofer，T.，等2009，Biochemistry 48，12047–12057；美国专利8，916，159，专利权人US National Cancer Institute)，使用甲酰甘氨酸生成酶(FGE)将位于CXPXR共有序列中的半胱氨酸转化为甲酰甘氨酸(FGly)(Drake，P.M.，等，2014，Bioconjug.Chem.25，1331–1341；Carrico，I.S.等7，985，783；8，097，701；8，349，910，和美国专利申请20140141025，20100210543，申请人Redwood Bioscience)；使用半乳糖基和唾液酸转移酶通，过糖工程引入唾液酸(Zhou，Q.，等2014，Bioconjug.Chem.，25，510-520，美国专利申请20140294867，申请人Sanofi-Genzyme)；引入赖氨酸的环丙烯衍生物，然后与四嗪衍生物进行Diels-Alder环加成反应，产生1，4-二氢哒嗪(Oller-Salvia，B.等，2018Angew Chem Int Ed Engl，57，2831-2834)。
然而，上述方法均需要对抗体进行工程改造和重新优化细胞培养条件，通常还有蛋白表达低、偶联产量低或偶联位点有限等问题。因此，研究者开发了通过重新桥接天然抗体链间二硫键的简单的均一偶联方法，例如使用溴或二溴马来酰亚胺连接子(下一代马来酰亚胺，NGM)(Schumacher，F.F.，等2014，Org.Biomol.Chem.12，7261–69；UCL CancerInstitute)，或使用二溴嘧啶二酮(A.Maruani，等，Nat.Commun.，2015，6，6645；M.T.Lee，等，Chem.Sci.，2017，8，2056)，或三碳桥的双烷基化试剂(Badescu，G.，等，2014，Bioconjug.Chem.25，1124–36；WO2013/190272，WO2014/064424，申请人PolyTherics Ltd)，或通过亚芳基二丙腈(ADPN)分子(Koniev，O.，等，2018MedChemComm.2018，9，827-830)。最近，Coumans等人使用2-(二苯基磷基)-苯磺酸(diPPBS)作为还原剂，可以仅还原工程化的半胱氨酸而不破坏抗体中的链间二硫键，用于制备ADC(R.G.E.Coumans，等，BioconjugateChem.2020，31，2136-2146)。Wuxi Biologics Co.，应用Zn2+离子(ZnCl2缓冲液)控制抗体中的胱氨酸选择性还原，然后与含有马来酰亚胺连接子的有效负载反应以提高ADC生产的均一性(PCT/CN2020/075162)。然而，大多数抗体储存在基于磷酸盐的缓冲液中，例如PBS缓冲液，锌阳离子在磷酸盐缓冲液中会迅速沉淀形成磷酸锌，因为磷酸锌在中性或碱性pH条件下的溶解度常数为9.1x 10-33(Martin，R.Bruce.“Solubility and Solubility Products(about J.Chem.Educ.1998，75，1179-1181and J.Chem.Educ.1998，75，1182-1185)”J.Chem.Educ.2000，77，1558；Dupuis，V.，等，1992，Biomaterials，13(7)，467-470；https/ www.chm.uri.edu/weuler/chm112/refmater/KspTable.html)。因此，当在还原抗体时使用ZnCl2，必须精确控制磷酸根阴离子的量和缓冲液的pH值，以避免形成磷酸锌沉淀。
我们曾经公开了几种将天然抗体链间二硫化物被还原产生的一对巯基重新桥接的偶联方法，例如使用溴马来酰亚胺和二溴马来酰亚胺连接子(WO2014/009774)，2，3-二取代琥珀酸/2-单取代/2，3-二取代富马酸或马来酸连接子(WO2015/155753，WO2016/596228)，乙炔二羧基连接子(WO2015/151080，WO2016/596228)，肼连接子(WO2015/151081)和丙烯酰基或丙酰基连接子(WO2018/086139)。在本专利申请中，我们扩展了早期专利申请中制备均一偶联物方法的范围，在锌氨基络合物/螯合物配位作用下控制抗体链间二硫键选择性的还原，然后进行偶联或同时偶联。与ZnCl2相比，锌氨基配合物在抗体中二硫键被配位还原时具有更多优势。首先，锌氨基络合物比ZnCl2体积大得多，可以更有空间选择性地插入某些位置(更具体地，如插入IgG1抗体的重轻链之间的二硫键位置)；其次，锌氨基络合物在水基溶液中更稳定，例如，锌氨络合物离子的稳定常数为2.9x 109(https：//chempedia.info/info/stability_constants/)，因而会减缓在中性pH磷酸盐缓冲液中沉淀。更重要的是，使用锌氨基配合物以化学计量比例还原IgG抗体轻链和重链之间二硫键，而不还原抗体重链(在铰链区)之间的二硫键，可以实现轻重琏链间两个相邻巯基的双烷基化。我们之前的数据(WO2016/059622)和其他研究结果(S.Shao，等，Bioorg Med ChemLett.2018，28，1363)均证明了双烷基化更容易在铰链区重链链内方式进行，而不是在链间二硫键之间偶联。总之，本发明的偶联方法生产工艺稳健，能高产率获得均一的偶联物，无需抗体工程改造，解决了目前ADC制备方法中的一个短板。这种偶联方法也可以直接应用于其它类抗体蛋白质。与传统异质ADC相比，所得的均一ADC显示出良好的药代动力学特征，更优的疗效和更低的体内毒性。
发明概述
本发明提供一种将抗体偶联物或类抗体蛋白偶联物的，特别是抗体-药物偶联物(ADC)的均一性提高的偶联方法，其中超过75％的有效载荷(药物)特异性结合至抗体的重轻链之间二硫键位点。
这种均一偶联包括以下三个关键步骤：
(a)在包含有效量的过渡金属阳离子-氨基螯合物/络合物(M(NR1R2R3)m1 m2+)和还原剂(例如三(2-羧乙基)膦(TCEP))存在的缓冲体系(例如PBS、Mes、Bis-Tris、Bis-Tris丙烷、Pipes、Aces、Mopso、Bes、Mops、Hepes、Tes、Pipps、Dipso、Tapso、Heppso、Tris-up、Tris-HCl、Tricine、Hepps、Gly-Gly、Bicine、Taps、Hepee、Acetates、Histidine、Citrates、MES或Borates等)中，孵育类抗体蛋白，特别是IgG抗体，选择性地还原抗体或类抗体蛋白的链间二硫键，产生巯基；
(b)加入有效量的带有巯基反应基团的连接子，或有效负载/连接子复合物/组合物(例如，含有马来酰亚胺末端的药物)，与步骤(a)产生的巯基反应；和
(c)加入有效量的氧化剂(例如脱氢抗坏血酸(DHAA))以重新氧化未反应的巯基，然后纯化所得偶联物；
(d)步骤(c)也可以被替换为：加入有效量的胱氨酸或相关二硫化合物以淬灭未反应的还原剂，同时胱氨酸被还原产生半胱氨酸，可以淬灭含有巯基反应基团(例如马来酰亚胺)的过量连接子或连接子/有效负载复合物；
过渡金属阳离子-氨基螯合物/络合物，M(NR1R2R3)m1 m2+，其中M选自但不限于Zn2+、Cu2+、Fe2+、Cd2+、Ni2+、Cr2+、Cr3+、Ti2+、Ti3+、Co2+、Mn2+、Mn3+、Ag+、Hg2+，其中R1、R2和R3独立地选自C1-C8烷基、C2-C8的杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基、C3-C8的芳基、芳基-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；m1选自1、2、3、4、5、6、7或8；m2选自1、2、3、4、5或6；优选M为Zn，m1为1、2、3或4；m2为1、2、3或4。
此外，(NR1R2R3)m1可以形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体，这些聚合物在N、R1、R2和R3之间共价连接；N、R1、R2或R3本身可以形成杂环、碳环、二杂环或二碳环。
步骤(a)中使用的过渡金属阳离子-氨基螯合物/络合物M(NR1R2R3)m1 m2+的浓度为0.01mM–1.0mM，或0.5～20蛋白质摩尔当量，可溶解在水溶性有机溶剂，选自乙醇、甲醇、丙醇、丙二醇、DMA、DMF、DMSO、THF、CH3CN，再加入到反应体系中。
还原剂是有机膦，优选为三(2-羧乙基)膦(TECP)或三(羟丙基)膦，其在反应溶液中的浓度为0.02mM-1.0mM，或1.0-20蛋白质摩尔当量。步骤(c)中加入的氧化剂可以是DHAA、Fe3+、I2、Cu2+、Mn3+、MnO2、或Fe3+/I-的混合物。反应溶液中所用氧化剂的浓度为0.02mM-1.0mM，或1-100的蛋白质摩尔当量。偶联反应的优选pH通常在约5.0至8.0之间，更优选为约5.5至7.5。偶联反应的优选温度通常为约-5至约40℃，更优选为约0至37℃；最佳为约2至8℃。偶联反应的优选时间通常为约15分钟至约48小时，更优选为约30分钟至过夜(10～16小时)。最佳反应条件(例如pH、温度、缓冲液、反应物浓度)当然具体取决于所使用的类抗体蛋白、有效负载/连接子复合物、还原剂和/或M(NR1R2R3)m1 m2+。
偶联过程中的抗体或类抗体蛋白可以是任何类型的抗体或蛋白，只要蛋白中含有两个或多个在被还原时能被区分的二硫键即可。有效负载/连接子复合物可以是任何类型或形式，只要它包含一个巯基反应基团即可。
总之，通过本发明的方法制备的ADC，超过80％的有效载荷偶联在抗体的Fab区域中，而常规方法中约40％的有效载荷在抗体的Fab区域中，使用WO2020164561的方法，约70％的有效载荷位于抗体的Fab区域。从以下实施例、实验和附图的详细描述中，本发明以及改进的偶联工艺对于提高ADC均一性的优点将变得更加明显。
附图的简要说明
图1.锌氨基络合物配合抗体中二硫键还原的建议机理。
图2.N-去糖基化和还原后ADC的中等水平表征。(a)去糖基化和DTT还原后获得的ADC片段的rpHPLC色谱图。连接有零个或一个药物分子的轻链(LC)(L0和L1)，以及连接有零个、一个、两个或三个药物分子的重链(H0、H1、H2和H3)。(b)表格总结了不同ADC片段的质量和比例以及从峰面积测量的平均DAR。结果表明，有效载荷主要结合在轻重链之间的位点。
图3.载有药物/连接子(C-408b)的肽的MS和MS/MS谱图。(a)[GEC]+1个有效载荷，(b)[SCDK]+1个有效载荷，表明有效载荷主要在轻重链之间的位点偶联。
图4.UPLC-MS分析的BCMA偶联物C-408b经过水解酶水解产生载药肽百分比。(a)轻链(LC)肽[GEC]连接了零个或一个药物分子(D0和D1)，(b)重链(HC)肽[SCDK]臂上的连接零个或一个药物分子(D0和D1)，(c)HC肽[THTCPPCPAPELLXXXXXXXXXXXXXX XX]在铰链处连接了零个、一个或两个药物分子(D0、D1和D2)。(这里的X指氨基酸，将在单独的专利申请中公开)。结果表明，有效载荷主要(超过85％)在抗体轻重链之间的半胱氨酸位点偶联。
图5.BCMA抗体与C-406偶联物的HIC-HPLC分析，常规偶联工艺制备(无锌氨基络合物，2.2～4.0当量的TCEP，pH 7.0～7.2)。(5a)：室温，6.0当量的化合物406，4小时偶联，DAR＝4.0，D4＝41.96％；(5b)：4±2℃，6.0当量的化合物406，5小时偶联，DAR＝4.2，D4＝47.16％；(5c)：4±2℃，6.5当量的化合物406，5小时偶联，DAR＝5.1，D4＝40.03％。
图6.BCMA抗体与C-406偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.0～2.4当量的氯化锌，pH＝7.2，4±2℃，持续15±2小时。(6a)：2.0当量的ZnCl2，4.0当量的TCEP，6.0当量的化合物406，DAR＝4.2，D4＝68.15％；(6b)：2.2当量的ZnCl2，4.0当量的TCEP，6.5当量的化合物406，DAR＝4.7，D4＝68.39％；(6c)：2.4当量的ZnCl2，3.5当量的TCEP，6.5当量的化合物406，DAR＝4.6，D4＝62.53％；(6d)：2.4当量的ZnCl2，4.0当量的TCEP，6.5当量的化合物406，DAR＝5.1，D4＝65.16％。
图7.BCMA抗体与C-406偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.4当量的Z-11，4.0当量TCEP，6.5当量的化合物406，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.6，D4＝79.81％。
图8.EGFR抗体与C-038偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.4当量的Z-28，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物038，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.2，D4＝79.68％。
图9.EGFR抗体与C-111偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.4当量的Z-28，3.4当量的TCEP，6.0当量的化合物111，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.4，D4＝80.39％。
图10.EGFR抗体与C-226的偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.4当量的Z-28，3.4当量的TCEP，6.0当量的化合物226，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.4，D4＝77.94％
图11.EGFR抗体与C-227的偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.4当量的Z-28，3.4当量的TCEP，6.0当量的化合物038，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.0，D4＝78.73％。
图12.BCMA抗体与C-325偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.4当量的Z-28，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物325，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.1，D4＝80.11％。
图13.Trop2抗体与C-334偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.4当量的Z-28，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物334，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.2，D4＝81.15％。
图14.Her2抗体与C-334偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.4当量的Z-28，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物334，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.4，D4＝80.82％。
图15.CD33抗体与C-334偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.4当量的Z-28，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物334，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.4，D4＝79.93％。
图16.EGFR抗体与C-379偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.4当量的Z-28，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物379，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.4，D4＝79.02％。
图17.EGFR抗体与C-385偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.2当量的Z-21，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物385，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝3.8，D4＝69.54％。
图18.EGFR抗体与C-387偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.2当量的Z-21，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物387，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.1，D4＝77.25％。
图19.CD33抗体与C-413d偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.2当量的Z-21，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物413d，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.1，D4＝76.70％。
图20.EGFR抗体与C-422a偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.2当量的Z-21，3.4当量的TCEP，6.0当量的化合物422a，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.2，D4＝76.58％。
图21.EGFR抗体与C-431a偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.2当量的Z-21，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物431a，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.1，D4＝77.97％。
图22.Her2抗体与C-431a偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.2当量Z-21，3.6当量TCEP，6.0当量化合物431a，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.2，D4＝79.44％。
图23.Steap1抗体与C-412c偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.2当量的Z-21，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物412c，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.4，D4＝80.01％。
图24.Steap1抗体与C-428c偶联物的HIC-HPLC分析，制备过程使用了2.2当量的Z-21，3.6当量的TCEP，6.0当量的化合物428c，pH＝7.2，4±2℃，5小时，DAR＝4.4，D4＝79.83％。
图25.显示了通过本专利申请的方法制备的EGFR抗体与C-031、C-038、C-066、C-071、C-093、C-111、C-118、C-208、C-214和C-216的偶联物(除C-066和C-071具有D8>75％外，所有D4>75％)，以及紫杉醇加EGFR裸抗，常规偶联的方法制备的D4＝41％ C-038偶联物和PBS缓冲液，在人肺腺癌HCC-827细胞模型上的抗肿瘤效果的比较，剂量为6mg/kg，静脉一次注射。该图表明，所有10种偶联物具有比紫杉醇加EGFR裸抗更好的抗肿瘤活性(6mg/kgEGFR抗体和10mg/kg紫杉醇，静脉注射，3xQW(每周注射连续3周))，并且用本发明方法制备的C-038偶联物比通过常规方法制备的偶联物具有更好的体内活性。
图26显示了通过本发明方法制备的Trop2抗体与C-216，C-218，C-328，C-384，C-408b，C-412c，C-422a，C-425a和C-431c的偶联物(D4>75％(78～83％)，DAR＝4.2～4.4)以及常规方法制备C-408b偶联物(D4＝42％，DAR＝4.2)和PBS缓冲液的抗肿瘤作用的比较，使用人胃癌NCI-N87细胞模型，剂量为6mg/kg，静脉一次注射。该图表明所有9种偶联物都具有抗肿瘤活性，用本发明方法制备的C-408b偶联物比常规方法制备的偶联物具有更好的体内活性。
图27.显示了通过本发明的方法制备的BCMA-抗体与C-227，C-403a，C-403b，C-408b，C-412e，C-412f，C-428c和C-431a的偶联物(D4>75％(78～83％)，DAR＝4.1～4.4)，以及常规偶联方法制备的C-408b偶联物(D4＝47％，DAR＝4.2)和PBS缓冲液的抗肿瘤作用的比较，使用人多发性骨髓瘤NCI-H929细胞模型，剂量为6mg/kg，静脉一次注射。该图表明所有9种偶联物都具有抗肿瘤活性，用本发明方法制备的C-408b偶联物比常规方法制备的偶联物具有更好的体内活性。
发明内容
定义
“烷基”是指在烷烃上除去一个或两个氢原子而产生的脂肪烃基团或单价基团。它可以是直链或是支链的，在链中具有C1-C8(1-8个碳原子)。“支链”是指直链烷基上连接有一个或多个低碳数的烷基，如甲基、乙基或丙基。示例性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、3-戊基、辛基、壬基、癸基、环戊基、环己基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2，3，4-三甲基戊基、3-甲基-己基、2，2-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、3，5-二甲基己基、2，4-二甲基戊基、2-甲基庚基、3-甲基庚基、正庚基、异庚基、正辛基和异辛基。C1-C8烷基可以是未被取代的或被一个或多个基团取代，包括但不限于C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2，-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中每个R'独立地选自于C1-C8烷基和芳基。
“卤素”指氟、氯、溴或碘原子；优选氟和氯原子。
“杂烷基”指其中1至4个碳原子独立地被选自O、S和N的杂原子所取代的C2-C8烷基。
“碳环”指含有3到8个碳原子的饱和或不饱和单环，或含有7到13个碳原子的饱和或不饱和双环。单环碳环有3到6个环原子，典型的有5或6个环原子。双环碳环有7到12个环原子，构成[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]的双环系统，或有9个或10个环原子，构成[5、6]或[6，6]的双环系统。具有代表性的C3-C8的碳环包括但不限于：-环丙基、-环丁基、-环戊基、-环戊二烯基、-环己基、-环己烯基、-1，3-环己二烯基、-1，4-环己二烯基、-环庚基、-1，3-环庚二烯基、-1，3，5-环庚三烯基、-环辛基和-环辛二烯基。
“C3-C8碳环”可以是未被取代的或被一个或多个基团取代，包括但不限于C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中每个R'独立地选自C1-C8烷基和芳基。
“烯基”指含有碳-碳双键的直链或支链脂肪烃基团，链内含有2-8个碳原子。示例性的烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基。
“炔基”指含有碳-碳三键的直链或支链脂肪烃基团，链内含有2-8个碳原子。示例性的炔基包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、5-戊炔基、正戊炔基、己炔基、庚炔基和辛炔基。
“亚烷基”是指含1-18个碳原子的饱和的支炼或直链或环状烃基，并带有两个通过从母体烷烃的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子而产生的一价自由基。典型的亚烷基包括但不限于：亚甲基(-CH2-)、1，2-乙基(-CH2CH2-)、1，3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。
“亚烯基”指含2-18个碳原子的不饱和的支炼或直链或环状烃基，并带有两个通过从母体烯烃的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子而产生的一价自由基。典型的亚烯基包括但不限于：1，2-亚乙基(-CH＝CH-)。
“亚炔基”指含2-18个碳原子的不饱和的支炼或直链或环状烃基，并带有两个通过从母体炔的相同或两个不同碳原子上除去两个氢原子而产生的一价自由基。典型的亚炔基包括但不限于：乙炔、炔丙基和4-戊炔基。
“芳基”或“芳香基”指由一个或多个环组成的芳香或杂芳香基团，包含三至十四个碳原子，优选六至十个碳原子。术语“杂芳基团”是指芳香基团上的一个或几个碳，最优是一个、两个、三个或四个碳原子，被氧(O)、氮(N)、硅(Si)、硒(Se)、磷(P)或(S)所取代，优选被氧、硫和氮所取代而产生的基团。术语“芳基”或“芳香基”也指其中一个或几个氢原子独立地被-R’、卤素、-OR’，-SR’、-NR’R”、-N＝NR’、-N＝R’、-NR’R”、-NO2、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2OR’、-OS(O)2OR’、-PR’R”、-P(O)R’R”、-P(OR’)(OR”)、-P(O)(OR’)(OR”)或-OP(O)(OR’)(OR”)所取代而产生的芳基团。其中R’和R”独立地为氢、烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、芳烷基、羰基或其药用盐。
“杂环”指其中一到四个环碳原子独立地被O、N、S、Se、B、Si或P等杂原子所取代而产生的的环结构。优选的杂原子是O、N和S。在《化学与物理手册》第78版的225-226页(TheHandbook of Chemistry and Physics，78th Edition，CRC Press，Inc.，1997-1998，p.225to 226)上也有杂环化合物的相关描述，在此引作参考。优选的非芳基杂环包括环氧基、氮丙啶基、硫杂丙基、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、环氧乙烷基、四氢呋喃基、二氧戊环基、四氢吡喃基、二恶烷基、二氧戊环基、呱啶基、呱嗪基、吗啉基、吡喃基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氢噻喃基、二噻烷基、硫代吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢吡啶基、二氢吡啶基、四氢嘧啶基、二氢噻喃基、氮杂环庚烷基，以及上述基团与苯基缩合得到的稠环体系。
术语“杂芳基”或“芳基杂环”是指含3到14，优选5至10个原子的芳香性杂环、包含单环、双环或多环。示例包括吡咯基、吡啶基、吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、咪唑基、噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1，2，4-噻二唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、咔唑基、苯并咪唑基、异恶唑基、吡啶基-N-氧化物，以及上述基团与苯基缩合得到的稠环体系。
“烷基”、“环烷基”、“烯基”、“炔基”、“芳基”、“杂芳基”、“杂环”等，也包含各自对应的“亚烷基”、“亚环烷基”、“亚烯基”、“亚炔基”、“亚芳基”、“亚杂芳基”、“亚杂环”等，为论述方便，本专利申请对它们未做完全区分。
“芳烷基”指一类非环烷基，其中一个与碳原子(通常为末端或sp3碳原子)键合的氢原子被芳基取代。典型的芳烷基包括芐基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙-1-基、萘并芐基、2-萘基苯基-1-基等。
“杂芳烷基”指一类非环烷基，其中一个与碳原子(通常为末端或sp3碳原子)键合的氢原子被杂芳基取代。杂芳烷基的实例有2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基。
“羟基保护基”的实例包括甲氧基甲基醚、2-甲氧基乙氧基甲基醚、四氢吡喃基醚、芐基醚、对甲氧基芐基醚、三甲基甲硅醚、三乙基硅醚、三异丙基硅醚、叔丁基二甲基硅醚、三苯基甲基硅醚、乙酸酯、取代乙酸酯、特戊酸酯、苯甲酸酯、甲磺酸酯和对甲苯磺酸酯。
以下缩写为本发明所采用，其定义为：Boc，叔丁氧基羰基；BroP，溴代十四烷基鏻六氟磷酸盐；CDI，1，1'-羰基二咪唑；DCC，二环己基碳二亚胺；DCE，二氯乙烷；二氯甲烷，二氯甲烷；DIAD，偶氮二甲酸二异丙基酯；DIBAL-H，二异丁基氢化铝；DIPEA二异丙基乙胺；DEPC，二乙基氰基磷酸酯；DMA，N，N-二甲基乙酰胺；DMAP，4-(N，N-二甲基氨基)吡啶；DMF，N，N-二甲基甲酰胺；DMSO，二甲基亚砜；DTT，二硫苏糖醇；EDC，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；ESI-MS，电喷雾质谱；乙酸乙酯，乙酸乙酯；HATU，O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐；HOBt，1-羟基苯并三唑；HPLC，高效液相色谱；NHS，N-羟基琥珀酰亚胺；MMP，4-甲基吗啉；PAB，对氨基苯甲酸；PBS，磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.5)；PEG，聚乙二醇；SEC，尺寸排阻色谱；TCEP，三(2-羧乙基)膦；TFA，三氟乙酸；THF，四氢呋喃；Val，缬氨酸。
“氨基酸”可以是天然或非天然的，优选α-氨基酸。天然氨基酸可以由遗传密码所编码，它们是丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸和缬氨酸。非天然氨基酸是蛋白质氨基酸的衍生物，包括羟脯氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、γ-氨基丁酸(神经递质)、鸟氨酸、瓜氨酸、β-丙氨酸(3-氨基丙酸)、γ-羧基谷氨酸、硒代半胱氨酸(存在于许多非真核以及大多数真核细胞中、但不是由DNA直接进行编码)、吡咯赖氨酸(仅在一些古细菌和一种细菌中发现)、N-甲酰基甲硫氨酸(通常是细菌、线粒体和叶绿体中蛋白质中最初的氨基酸)、5-羟色氨酸、L-二羟基苯丙氨酸、三碘甲腺原氨酸、L-3，4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)和O-磷酸丝氨酸。术语“氨基酸”还包括氨基酸类似物和模拟物。类似物是具有与天然氨基酸相同结构通式H2N(R)CHCO2H的化合物，其中R在天然氨基酸里。类似物的实例包括高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸-亚砜和甲硫氨酸甲基锍。更优的是氨基酸模拟物，它是具有与α-氨基酸的化学结构不同、但是作用方式类似的化合物。天然氨基酸多为“L”立体化学构型，“非天然氨基酸”也用于代表“D”构型的氨基酸。在本专利申请中使用1至8个氨基酸时、其序列优选为蛋白水解酶可识别的序列。许多水解酶识别序列是本领域已知的，可以参见：Matayoshi等.Science 247：954(1990)；Dunn等.Meth.Enzymol.241：254(1994)；Seidah等.Meth.Enzymol.244：175(1994)；Thornberry，Meth.Enzymol.244：615(1994)；Weber等.Meth.Enzymol.244：595(1994)；Smith等.Meth.Enzymol.244：412(1994)；及Bouvier等.Meth.Enzymol.248：614(1995)；此处引作参考。特别是选自以下序列：Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Cit-Cit、Val-Lys、Ala-Ala-Asn、Lys、Cit、Ser及Glu。
“药学上”或“药学上可接受的”是指当分子实体和组合物酌情施用于动物或人时，不会产生不利、过敏或其他不良反应。
“药学上可接受的溶剂化物”或“溶剂化物”是指一种或多种溶剂分子与本发明公开的化合物的结合物。形成药学上可接受的溶剂合物，溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
“药学上可接受的辅料”包括任何载体、稀释剂、佐剂或其它，例如防腐剂或抗氧化剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和药剂用于药物活性物质在本领域内是熟知的。任何传统介质或药剂，除非与活性成分不兼容，也可以考虑将其用于治疗组合物中。补充活性成分也可以加入组合物中，成为合适的治疗组合。
本专利申请中，“药用盐”是指所公开化合物的衍生物，通过制备母体化合物的酸盐或碱盐来获得。药学上可接受的盐包括由无毒无机酸或有机酸与母体化合物形成的常规无毒盐或季铵盐。例如，所述常规无毒盐包括衍生自无机酸(例如盐酸、氢溴酸盐、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等)的盐；以及由有机酸(例如乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、草酸、富马酸、马来酸及乳酸等制备的盐。另外的加成盐包括铵盐，如三甲胺、葡甲胺、丙三醇等的盐、金属盐、如钠、钾、钙、锌或镁盐。
本发明的药用盐可由含有碱性或酸性部分的母体化合物，通过常规化学方法合成。通常而言，这些盐可以通过在水或有机溶剂中或两者的混合物中，向母体化合物里，加入等eq.的适当碱或酸来制备。一般来说，乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是非水介质的首选。适用盐的列表见于1985年由麦克出版公司出版的《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)，其公开内容纳入本文作参考。
“施用”或“给药”是指以任何方式向受试者转移、递送、引入或运输药物或其他药剂。这些方式包括口服用药、局部接触、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内、鼻内、皮下或鞘内给药。本发明还考虑使用装置或器械来施用药剂。这种装置可以使用主动或被动型传输，而且可以是缓释或快速释放递送装置。
生物缓冲液的缩写及化学名称如下：
ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)，pH 6.1-7.5(pKa＝6.88)的缓冲体系。
ADA(N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸，N-(氨基甲酰甲基)亚氨基二乙酸)，pH6.0-7.2(pKa＝6.65)的缓冲体系。
AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)，pH 7.8-9.7的缓冲体系。
AMPSO(N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)。
BES(N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)。
Bicine(双(N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸)，双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷)，pH5.8-7.2(pKa＝8.35)的缓冲体系。
BisTris(双-(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷))。
BisTris丙烷(1，3-双[三(羟甲基)甲氨基]丙烷)。
DIPSO(N，N-双(2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)，pH 7.0-8.2的缓冲体系。
Gly-Gly(双甘氨酸，甘氨酰-甘氨酸)，pH 7.5-8.9(pKa＝8.30)的缓冲体系。
HEBPS(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(4-丁磺酸))是HEPES和EPPS的同系物，具有较高的pKa(pKa＝8.30)，pH 7.6-9.0的缓冲体系。
HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，2-吗啉乙烷磺酸，2-(4-吗啉代)乙磺酸，2-(N-吗啉代)乙磺酸，吗啉-4-乙磺酸水合物)，pH 6.8-8.2缓冲体系；20℃下的pKa7.45-7.65)
HEPPS或EPPS(3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸水合物，4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)水合物)，pH 7.3-8.7(pKa＝8.00/哌嗪环)的缓冲体系。
HEPPSO(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)水合物)。
MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸一水合物)，pH 5.2-7.1(pKa 6.16)的缓冲体系。
MOBS(4-吗啉丁烷磺酸，3-(N-吗啉代)丁磺酸半钠盐)是具有较高pKa的MES和MOPS的同系物，pH 6.9-8.3(pKa 7.6)的缓冲体系。
MOPS(4-吗啉丙磺酸钠盐)。
MOPSO(β-羟基-4-吗啉代丙磺酸，3-吗啉代-2-羟基丙磺酸)。
PIPES(哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)，pH 6.1-7.5(pKa＝6.80)缓冲体系。
POPSO(哌嗪-1，4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物)。
TAPS([(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸)。
TAPSO(2-羟基-3-[三(羟甲基)甲氨基]-1-丙磺酸)。
TES(2-[(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基]乙磺酸)。
Tricine(哌嗪-N，N’-双[2-羟基丙磺酸])，pH 7.4-8.8(pKa 8.16)缓冲体系。
术语“抗体”在本专利申请中以最广义使用，涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段(只要它们具有所需的抗原结合活性)，含抗体的融合蛋白，以及任何其他构型修饰的包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子。抗体包括任何种类的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且该抗体不需要是任何特定种类的。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的类型。免疫球蛋白有五种主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分并且与完整抗体所结合的抗原结合。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将包含基本上所有的，至少一个，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)源自非人抗体HVR，所有或基本上所有的FR源自人抗体的FR。人源化抗体任选地，可包含至少一部分源自人抗体的抗体恒定区。抗体的“人源化形式”，例如非人抗体，是指经过人源化的抗体。术语“可变区”或“可变结构域”是指涉及抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，如Kindt等人编写Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。与特定抗原结合的抗体，可以通过任意与该抗原结合的一个抗体的VH或VL，在互补的VL或VH展示库中筛选，而获得。(参见，如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991))。
本专利申请中，“单克隆抗体”是指获得自基本同质的抗体群的抗体，即构成群体的个体抗体是相同的，除了可能少量存在的自然发生的突变。单克隆抗体具有高度特异性，靶向单个抗原位点。此外，与多克隆抗体制品相反，它们通常包含靶向不同决定簇(表位)的不同种抗体，每种单克隆抗体只靶向抗原上的单一决定簇。
修饰语“单克隆”表示抗体的特征是指获得自基本上同质的抗体群体，不应被理解为需要通过任何特定方法制备抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler和Milstein在Nature 256：495，1975中首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备，例如美国专利4816567中描述的重组DNA方法。另外，也可以通过使用McCafferty等人在Nature 348：552-554，1990中描述的技术，将单克隆抗体从噬菌体文库中分离出来。
本专利申请中，“人源化”抗体是指非人(例如鼠)抗体，为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗体的抗原结合子序列)，其中包含最少的源自非人免疫球蛋白序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的，且具有所需的特异性、亲合力和功能的CDR的残基所替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体中引入的残基既不在受体抗体中，也不在导入的CDR或框架序列中，目的是进一步改进和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上所有，至少一个，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，所有或基本上所有的FR区都是人免疫球蛋白共有序列的区。优选的人源化抗体还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)，通常是源自人免疫球蛋白。优选的是具有如WO 99/58572中所述修饰的Fc区的抗体。其他形式的人源化抗体，具有相对于原始抗体改变了的一个或多个CDR(CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDRH3)，也称为“衍生”来自原始抗体的一个或多个CDR。
本专利申请中，“人抗体”意指包含与由人类产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或通过本领域技术人员已知的或本专利申请公布的，制备人源抗体的任何技术所制备的抗体。人抗体包括含有至少一种人重链多肽或至少一种人轻链多肽的抗体。其中一个例子是由鼠轻链和人重链多肽构成的抗体。可以使用本领域已知的各种技术制备人源抗体。在一个实施例中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等，Nature Biotechnology，14：309-314，1996；Sheets等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：6157-6162，1998；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381，1991；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581，1991)。人抗体也可以免疫动物制备，将动物，如鼠的内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活，再将人类免疫球蛋白基因转入动物内源性基因座。此方法记载在美国专利5，545，807；5，545，806；5，569，825；5，625，126；5，633，425；和5，661，016。或者，可以通过将产生靶向目标抗原的抗体的人B淋巴细胞永生化，来制备人抗体(这种B淋巴细胞可以从个体或cDNA的单细胞克隆中回收，也可以在体外免疫)。参考如Cole等.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77，1985；Boerner等.，J.Immunol.，147(1)：86-95，1991；和美国专利5，750，373。
术语“嵌合抗体”是指其可变区序列来源于一个物种而恒定区序列来源于另一物种的抗体，例如可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指代任何长度的氨基酸链，优选为相对短的(例如，10-100个氨基酸)。该链可以是线链或支链，可以包含修饰的氨基酸，和/或可以被非氨基酸隔断。该术语还包括天然或通过干预修饰的氨基酸链；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分偶联。该定义还包括，例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，多肽可以以单链或关联链存在。
“单价抗体”的每分子包含一个抗原结合位点(例如IgG或Fab)。在一些情况下，单价抗体可以具有多个抗原结合位点，但所述结合位点应来自不同的抗原。
“单特异性抗体”的每个分子包含两个相同的抗原结合位点(例如IgG)，两个结合位点结合抗原上的相同表位。因此，它们互相竞争结合一种抗原分子。自然界中发现的大多数抗体都是单特异性的。在一些情况下，单特异性抗体也可以是单价抗体(例如Fab)。
“二价抗体”的每个分子包含两个抗原结合位点(例如，IgG)。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。然而，二价抗体可能是双特异性的。
“双特异性”或“双重特异性”抗体是具有两个不同抗原结合位点的杂交抗体。双特异性抗体的两个抗原结合位点结合两个不同的表位，这些表位可能位于相同或不同的蛋白质靶点上。
“双功能”抗体是指在两臂上具有相同抗原结合位点(即相同氨基酸序列)，但每个结合位点可以识别两种不同的抗原。
“异多聚体”、“异多聚体复合物”或“异多聚体多肽”是包含至少第一多肽和第二多肽的分子，其中第二多肽与第一多肽至少差一个氨基酸残基。异多聚体可以包含由第一和第二多肽形成的“异二聚体”或当除了第一和第二多肽之外还存在多肽时，形成的更高级的三级结构。
“异二聚体”、“异二聚体蛋白质”、“异二聚体复合物”或“异多聚体多肽”是由第一多肽和第二多肽的分子构成的分子，其中第二多肽的氨基酸序列与第一多肽的氨基酸序列相差至少一个氨基酸残基。
本专利申请中，“铰链区”、“铰链序列”及其它变体的含义，为本领域公知，在如Janeway等，ImmunoBiology：the immune systemin health and disease，(ElsevierScience Ltd.，NY)(4th ed.，1999)；Bloom等，Protein Science(1997)，6：407-415；Humphreys等，J.Immunol.Methods(1997)，209：193-202中有所描述。
本专利申请中，“类免疫球蛋白铰链区”、“类免疫球白铰链序列”及其变体是指类免疫球蛋白或类抗体分子(例如，免疫粘附素)的铰链区和铰链序列。在一些实施例中，类免疫球蛋白铰链区可以来自或衍生自任何IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4亚型，或者来自IgA，IgE，IgD或IgM，包括其嵌合形式，例如嵌合IgG1/2铰链区。
本专利申请中的术语“免疫效应细胞”或“效应细胞”是指人免疫系统中天然细胞库内的细胞，可以将其激活以影响靶细胞的活力。靶细胞的活力可以包括细胞生存、增殖和/或与其他细胞相互作用的能力。
本发明中的抗体可以通过本领域公知的技术而制备，例如重组技术，噬菌体展示技术、合成技术或这类技术的组合，或者本领域中的其他已有技术(参见，如JayasenaS.D.，Clin.Chem.，45：1628-50，1999以及Fellouse F.A.，等，J.Mol.Biol.，373(4)：924-40，2007)。
本专利申请中，术语“细胞毒剂”是指能够抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞死亡或被破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、In111、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、Zr89、F18和Lu的放射性同位素，例如Lu177)；化学治疗剂或药物(例如，tubulysin、美登素、澳瑞他汀、DNA小沟结合剂(例如PBD二聚体)、杜卡霉素、拓扑异构酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、DNA烷基化剂、甲氨蝶呤、阿得拉霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)，阿霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如小分子毒素，来源于细菌、真菌、植物或动物的酶活毒素，包括它们的片段和/或变体；以及本专利申请中公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。
“连接子”是一个化学结构片断，为一个共价键或原子链，将抗体共价连接至药物部分。在各种实施例中，连接子包括二价基团例如烷基二基、芳基二基、杂芳基二基，片断例如：-(CR2)nO(CR2)n--、烷氧基(例如聚氧乙烯基、PEG、聚亚甲氧基)和烷基氨基(例如聚乙烯氨基)的重复单元；和二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。在各种实施例中，连接子可以包含一个或多个氨基酸残基，例如缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和鸟氨酸。
在本说明书和权利要求书中，词语“包括(comprise)”、“包括(comprising)”、“包含(including)”和“包含(includes)”用于说明所述特征、整数、组份或步骤的存在，但它们不排除一个或多个其他特征、整数、组份、步骤或其组份的存在或共存。本发明申请公开的新型偶联物使用桥连接子。一些合适的连接子和它们的合成的示例记载在说明书实施例1-468中。
本发明的偶联方法
如上所述，本发明的偶联过程中的一个关键因素是过渡金属阳离子-氨基络合物M(NR1R2R3)m1 m2+，它配位生物分子的某些二硫键，优选抗体中的某些链间二硫键，使其被选择性还原。前期的LC-MS研究表明，IgG抗体的链间二硫键比链内二硫键更容易被还原，轻链和重链之间的二硫键比两条重链之间的二硫键更容易被还原。IgG抗体的两个重链间上部二硫键比下部的二硫键更容易被还原。此外，CH2结构域中的二硫键最容易被还原。VL、CL、VH和CH1结构域中的二硫键具有相似且中等的可被还原性，而CH3结构域中的二硫键最不易于还原(Liu H，等Anal.Chem.，2010，82，5219–5226)。在2～8℃的低温下，使用ZnCl2盐与发明WO2020164561的IgG抗体的二硫键配位，可以区分进行上述的的还原。这里，用于本发明偶联过程中的过渡金属阳离子-氨基配合物M(NR1R2R3)m1 m2+体积很大，不仅可以配位二硫键进行还原，而且在空间上阻碍还原剂(如TCEP)接近IgG抗体的两条重链之间的二硫键，从而产生更好的还原选择性，随后与药物/连接子复合物偶联。
过渡金属阳离子-氨基螯合物/络合物，M(NR1R2R3)m1 m2+，其中M选自，但不限于，Zn2 +、Cu2+、Fe2+、Cd2+、Ni2+、Cr2+、Cr3+、Ti2+、Ti3+、Co2+、Mn2+、Mn3+、Ag+、Hg2+；其中R1、R2和R3独立地选自C1-C8烷基；C2-C8的杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8的芳基、芳基烷基、杂芳基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；m1选自1、2、3、4、5、6、7、或8；m2选自1、2、3、4、5、6、或7。优选的，M为Zn2+，m1选自1、2、3、或4，且m2是2、3或4。更优选m1为2。
此外，(NR1R2R3)m1能够形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体，其中这些聚合物在N、R1、R2和R3之间共价连接；N、R1、R2和/或R3自身可以形成杂环、碳环、二杂环或二碳环。
当优选的M为Zn时，优选的M(NR1R2R3)m1 m2+示例如下：Zn(NH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH2CH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH(CH3)2)2 2+、Zn(NH2C(CH3)3)2 2+、Zn(NH2CH2C(CH3)3)2 2+、Zn(NH(CH3)2)2 2+、Zn(NH(CH2CH3)2)2 2+、Zn(NH(CH(CH3)2)2)2 2+、Zn(NH(C(CH3)3)2)2 2+、Zn(NH(CH(CH2CH3)2)2)2 2+、Zn(NH(CH2C(CH3)3)2)2 2+、Zn(NH(CH2C(CH2CH3)3)2)2 2+、Zn(NH(CH2CH2C(CH3)3)2)2 2+、Zn(NH2CH2CH2OH)2 2+、Zn(NH(CH2CH2OH)2)2 2+、Zn(N(CH2CH2OH)3)2 2+、Zn(NH2CH2COOH)2 2+、Zn(NH2CH2CONH2)2 2+、Zn(NH2CH2COOCH3)2 2+、Zn(NH2CH2COOCH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH2COOC(CH3)3)2 2+、Zn(NH2CH2COOCH(CH3)2)2 2+、Zn(NH2CH2CH2COOH)2 2+、Zn(NH(CH2COOH)2)2 2+、Zn(N(CH2CH2COOH)3)2 2+、Zn(NH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH2CH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH(CH3)2)4 2+、Zn(NH2C(CH3)3)4 2+、Zn(NH2CH2C(CH3)3)4 2+、Zn(NH(CH3)2)4 2+、Zn(NH(CH2CH3)2)4 2+、Zn(NH(CH(CH3)2)2)4 2+、Zn(NH(C(CH3)3)2)4 2+、Zn(NH(CH(CH2CH3)2)2)4 2+、Zn(NH(CH2C(CH3)3)2)4 2+、Zn(NH(CH2C(CH2CH3)3)2)4 2+、Zn(NH(CH2CH2C(CH3)3)2)4 2+、Zn(NH2CH2CH2OH)4 2+、Zn(NH(CH2CH2OH)2)4 2+、Zn(N(CH2CH2OH)3)4 2+、Zn(NH2CH2COOH)4 2+、Zn(NH2CH2CONH2)4 2+、Zn(NH2CH2COOCH3)4 2+、Zn(NH2CH2COOCH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH2COOC(CH3)3)4 2+、Zn(NH2CH2COOCH(CH3)2)4 2+、Zn(NH2CH2CH2COOH)4 2+、Zn(NH(CH2COOH)2)4 2+、Zn(N(CH2CH2COOH)3)4 2+、
/>
上述所有络合阳离子对应的阴离子选自，但不限于Cl-、Br-、I-、SO4 2-、HSO4 -、NO3 -、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -、CO3 2-、HCO3 -、HCOO-、CH3COO-、F3CCOO-、Cl3CCOO-、FCH2COO-、ClCH2COO-、F2CHCOO-、Cl2CHCOO-、BF4 -、SO3 2-、HSO3 -、CH3SO3-、C6H5CH2SO3-、C6H5SO3-、C6H5COO-、C6H5CH2COO-、C6F5O-、C6H4(OH)COO-、C6H2F3O-、C6 H4(NO2)O-、C6 H2(NO2)3O-、等。
反应液中的过渡金属阳离子-氨基络合物当量为抗体摩尔数的0.5～20倍，优选1.0-5.0倍，更优选1.5-3.0倍。可以将过渡金属阳离子-氨基络合物与水混溶性有机溶剂一起加入到反应溶液中，有机溶剂选自，但不限于乙醇、甲醇、丙醇、丙二醇、DMA、DMF、DMSO、THF或CH3CN。
在反应溶液中，与过渡金属阳离子-氨基络合物一起使用的还原剂选自三(2-羧乙基)膦(TCEP)，(P(CH2CH2COOH)3)。可以是其他还原剂，例如三(羟丙基)-膦(P(CH2CH2CH2OH)3)、P(CH2CH3)3、P(CH2CH2CH3)3、P(CH2CH2-CH2CH3)3、P(CH(CH3)2)3、P(CH2CH＝CH2)3、P(CH2CH2CN)3、P(CH(CH3)2)2(CH2CH2NH2)、P(CH2CH2CONH2)3、P(CH2CH2CONHCH3)3、P(CH2CH2CH2NHCOCH3)3、NaB(CN)H3、(C6H11)2P(CH2)4P(C6H11)2、(C6H11)2P(CH2)3P-(C6H11)2、二环己基(乙基)膦、双[2-(二叔丁基膦基)乙基]胺、三环己基膦、1，2-乙二基双[二环己基]-膦、双[2-(二环己基膦基)乙基]胺、三[2-(二苯基膦基)乙基]-膦([(C6H5)2PCH2CH2]3P)、三苯基膦、磺酰化三苯基膦(2-(二苯基膦基)苯磺酸(diPPBS)、3-(二苯基膦基)苯磺酸、4-(二苯基膦基)苯磺酸、3，3'，3”-膦三基三苯磺酸)。优选还原剂为TECP或P(CH2CH2CH2OH)3，更优选为TECP。反应溶液中还原剂的浓度可以是0.04mM-0.4mM，或为使用的抗体摩尔数的1.0-10.0当量。优选地，还原剂以抗体的2.0-4.0当量使用。
用于选择性还原的最佳缓冲液选自，但不限于PBS、Mes、Bis-Tris、Bis-Tris丙烷、Pipes、Aces、Mopso、Bes、Mops、Hepes、Tes、Pipps、Dipso、Tapso、Heppso、Tris-up、Tris-HCl、Tricine、Hepps、Gly-Gly、Bicine、Taps、Hepee、乙酸盐、组氨酸、柠檬酸盐、MES、硼酸盐，或上述两种、三种或四种缓冲液组分的组合。缓冲液的pH为4.0-9.0，优选为5.0-7.5，更优选为5.5-7.5。反应中缓冲液的浓度为0.02–1.0M，优选为20–200mM，更优选为20–100mM。并且可以加入最多30％可与水混合(混溶)的有机溶剂，如DMA、DMF、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、异丙醇、二恶烷、丙二醇或乙二醇均可作为共溶剂加入水基缓冲溶液中。
还原反应的最佳温度一般控制在-5～40℃左右，反应时间为15分钟～48小时。但在蛋白偶联领域中，反应时间和温度可以由本领域技术人员根据具体的蛋白，如抗体来确定，这是很好理解的。例如，还原反应可以控制在通常在约-5至约40℃之间，优选为约0至37℃的温度；更优选为约2至8℃，更确切地为4±1℃。偶联过程反应时间为15分钟至12小时，优选在约2至8℃的温度下，反应时间为约30分钟至15小时(过夜反应)。
在还原过程中或还原完成后，将药物/连接子复合物/组合物直接加入到还原反应的溶液中进行偶联。药物/连接子复合物/组合物结构式表示为(I)，(II)或(III)：
其中：Lv1和Lv2是巯基反应基团，独立地选自于：
卤代乙酰基；/>酰卤基；/>/>
马来酰亚胺；单取代马来酰亚胺；/>二取代马来酰亚胺；/>单取代的琥珀酰亚胺；/>二取代琥珀酰亚胺；-CHO醛；乙烯磺酰基；/>丙烯酰基；/>2-(甲苯磺酰氧基)乙酰基；/>2-(甲磺酰氧基)乙酰基；/>2-(硝基苯酚基)乙酰基；/>(二硝基苯基)乙酰基；2-(氟代苯酚基)-乙酰基；/>2-(二氟苯酚基)-乙酰基；/>2-((三氟甲基磺酰基)氧基)乙酰基；/>苯乙烯，/>乙烯基吡啶，/>乙烯基吡嗪，/>乙烯基-1，3，5-三嗪，/>取代的甲磺酰基，/>2-(五氟苯氧基)乙酰基；/>甲基砜苯基恶二唑(ODA)；/>丙烯酰基，卤代丙烯酰基，/>丙炔酰基，/>2，3-二卤代丙烯酰基，/>芳基钯配合物，/>双(苯磺酰基)-马来酰亚胺，/>双卤代哒嗪二酮，/>双苯硫基哒嗪二酮，2-((甲基磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>2-((烷基或芳基-磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>氰乙炔基，/>乙炔基；/>炔基，/>亚芳基二丙腈(ADPN)，二乙烯基吡啶，/>二乙烯基吡嗪，二乙烯基三嗪，或/>3，4-双(马来酰亚胺)-2，5-二氧代吡咯烷，/>/>/>
/> 其中X1’和X2’独立地为F、Cl、Br、I、OTf、OMs、OC6H4(NO2)、OC6H3(NO2)2、OC6F5、OC6HF4、或Lv3；X2是O、NH、N(R1)、或CH2；R3和R5独立地为H、R1、芳基团、杂芳香族或芳香族、其中一个或几个H原子独立地被-R1、-卤素、-OR1、-SR1、-NR1R2、-NO2、-S(O)R1、-S(O)2R1或-COOR1取代；Lv3和Lv3’独立地为离去基团，选自F、Cl、Br、I、硝基苯氧基；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；苯氧基；苯巯基、二硝基苯氧基；五氟苯氧基；四氟苯氧基；二氟苯氧基；单氟苯氧基；五氯苯酚；三氟甲磺酸酯；咪唑；二氯苯氧基；四氯苯氧基；1-羟基苯并三唑；对甲苯磺酸；甲磺酸；2-乙基-5-苯基异恶唑-3′-磺酸酯，自身形成的酸酐，或与其他酸酐，例如乙酸酐、甲酸酐形成的酸酐；或使用缩合试剂生成的多肽偶联反应中间体或Mitsunobu反应的中间体；
在式(II)和式(III)中，其中和/>选自于：
双取代马来酰亚胺；/>单取代琥珀酰亚胺；二取代琥珀酰亚胺；/>双苯硫基马来酰亚胺，/>双卤代哒嗪二酮，/>双苯硫基哒嗪二酮，2-((甲基磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>2-((烷基或芳基磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>亚芳基二丙腈(ADPN)，二乙烯基吡啶，/>二乙烯基吡嗪，/>二乙烯基三嗪，或/>4-双(马来酰亚胺)-2，5-二氧代吡咯烷，/> />
/>
/>
其中Lv3、Lv3’、X1’和X2’如前文所述；两个原子中间的连接键表示可以连接两个原子中的任何一个。
L1和L2是，相同或不同，独立地选自O、NH、S、NHNH、N(R3)、N(R3)N(R3’)、结构式为(OCH2CH2)pOR3、或(OCH2CH(CH3))pOR3、或NH(CH2CH2O)pR3、或NH(CH2CH(CH3)O)pR3、或N[(CH2CH2O)pR3][(CH2CH2O)p’R3’]、或(OCH2CH2)pCOOR3、或CH2CH2(OCH2CH2)pCOOR3的聚乙二醇单元、其中p和p’独立地选自0至约1000的整数、或上述组合；C1-C8烷基；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；其中R3和R3’独立地为H；C1-C8烷基；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；或1-8个碳原子的酯、醚或酰胺；或定义中所述的1～8个天然或非天然氨基酸；或结构式为(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙二醇单元、其中p是0至约1000的整数，或上述组合；
L1和L2独立地可以含有自我毁灭或非自我毁灭的组分、肽单元、腙键、二硫化物、酯、肟、酰胺或硫醚键。自我毁灭单元包括但不限于，与对氨基芐基氨甲酰基(PAB)的电子结构相似的芳香化合物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇的衍生物、杂环PAB类似物、β-葡糖醛酸苷、以及邻或对氨基芐基缩醛。
优选的自我毁灭型连接子组分具有以下结构之一：
其中(*)是另外的间隔体或可断裂的连接子单元，或细胞毒剂、和/或细胞结合分子(CBA)的连接点；X1、Y1、Z2和Z3独立地为NH、O、或S；Z1独立地为H、NH、O或S；v是0或1；U1独立地为H、OH、C1～C6烷基、(OCH2CH2)nF、Cl、Br、I、OR5、SR5、NR5R5’、N＝NR5、N＝R5、NR5R5’、NO2、SOR5R5’、SO2R5、SO3R5、OSO3R5、PR5R5’、POR5R5’、PO2R5R5’、OPO(OR5)(OR5’)、或OCH2PO(OR5(OR5’)其中R5和R5’如前文所定义；优选地R5和R5’独立地选自H、C1～C8烷基、C2～C8烯基、炔基或杂烷基、C3～C8芳基、杂环、碳环、环烷基、杂环烷基、杂芳烷基、烷基羰基或糖苷；或药用阳离子盐。
非自我毁灭型连接子组分为以下结构之一：
/>
其中(*)是另外的间隔体R1或可断裂的连接子单元、或细胞毒性分子和/或细胞结合分子的连接点；X1、Y1、U1、R5、R5’如前文所定义；r是0-100；m和n独立地为0-6。
更优选地，L1或L2可独立地由一个或多个下列连接子组分构成：6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”或“af”)、对氨基芐氧基羰基(“PAB”)、4-硫代戊酰基(“SPP”)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1酰基(“MCC”)、(4-乙酰基)氨基苯酰基(“SIAB”)、4-硫丁酰基(SPDB)、4-硫-2-羟基磺酰基-丁酰基(2-Sulfo-SPDB)，或含有1-8个天然或非天然氨基酸单元的天然或非天然肽。
进一步优选地，L1和L2独立地是可断裂连接子。术语“可断裂”是指连接子上包含至少一个可在生理条件下被破坏的键，例如pH、酸、碱、氧化作用、代谢、生化或酶不稳定的键。应当理解，导致键断裂不一定是生物或代谢过程，而可能是一个标准化学反应，例如水解或取代反应。这种生理条件的例子有pH值比细胞浆内pH低的内涵体，和/或它能够与细胞内巯基发生二硫键交换反应，恶性细胞内存在的毫摩尔浓度的大量谷胱甘肽。
可断裂连接子(L，L1或L2)的实例包括但不限于：
-(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t-、-(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-、-(Aa)r-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-、-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t-、-(CR5R6)m-(CR7＝CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r-、-(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-、-(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-、-(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-、-(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-、-(CR5R6)m(CO)(Aa)t-(CR9R10)n(OCH2CH2)r-、-(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-、-(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-、-(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-、-(CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-、-(CR5R6)m-苯基-CO(Aa)t(CR7R8)n-、-(CR5R6)m-呋喃-CO(Aa)t(CR7R8)n-、-(CR5R6)m-恶唑-CO(Aa)t(CR7R8)n-、-(CR5R6)m恶唑-CO-(Aa)t(CCR7R8)n-、-(CR5R6)t-噻吩-CO(CR7R8)n-、-(CR5R6)t-咪唑-CO-(CR7R8)n-、-(CR5R6)t-吗啉-CO(Aa)t-(CR7R8)n-、-(CR5R6)t哌嗪-CO(Aa)t(CR7R8)n-、-(CR5R6)t-N-甲基哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-、-(CR5R)m-(Aa)t苯基-、-(CR5R6)m-(Aa)t呋喃-、-(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-、-(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-、-(CR5R6)m-噻吩-(Aa)t-、-(CR5R6)m-咪唑(Aa)t-、-(CR5R6)m-吗啉-(Aa)t-、-(CR5R6)m-哌嗪-(Aa)t-、-(CR5R6)m-N-甲基哌嗪-(Aa)t-、-K(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t-、-K(CR5R6)m(CR7R8)n-(Aa)r(OCH2CH2)t-、-K(Aa)r(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-、-K(CR5R6)m(CR7R8)n-(OCH2CH2)r(Aa)t-、-K(CR5R6)m(CR7＝CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r-、-K(CR5R6)m-(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-、-K(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-、-K(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-、-K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-、-K(CR5R6)m(CO)(Aa)t-(CR9R10)n(OCH2CH2)r-、-K(CR5R6)m(NR11CO)-(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-、-K(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-、-K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-、-K(CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-、-K(CR5R6)m-苯基-CO(Aa)t(CR7R8)n-、-K-(CR5R6)m-呋喃-CO(Aa)t-(CR7R8)n-、-K(CR5R6)m-恶唑-CO(Aa)t(CR7R8)n-、-K(CR5R6)m-恶唑-CO(Aa)t-(CR7R8)n-、-K(CR5R6)t-噻吩-CO(CR7R8)n-、-K(CR5R6)t咪唑-CO-(CR7R8)n-、-K(CR5R6)t吗啉-CO(Aa)t(CR7R8)n-、-K(CR5R6)t哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-、-K(CR5R6)t-N-甲基哌嗪CO(Aa)t(CR7R8)n-、-K(CR5R)m(Aa)t苯基、-K-(CR5R6)m-(Aa)t呋喃-、-K(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-、-K(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-、-K(CR5R6)m-噻吩-(Aa)t-、-K(CR5R6)m-咪唑(Aa)t-、-K(CR5R6)m-吗啉(Aa)t-、-K(CR5R6)m-哌嗪-(Aa)tG、-K(CR5R6)mN-甲基哌嗪(Aa)t-；其中m、Aa、m、n、R3、R4、和R5定义如前文所描述；t和r独立地为0–100；R6、R7、和R8独立地选自H；卤化物；C1～C8烷基、芳基、烯基、炔基、醚、酯、胺或酰胺，任选地被一种或多种卤化物取代，CN、NR1R2、CF3、OR1、Aryl、杂环、S(O)R1、SO2R1、-CO2H、-SO3H、-OR1、-CO2R1、-CONR1、-PO2R1R2、-PO3H或P(O)R1R2R3；K是NR1、-SS-、-C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-C＝NH-O-、-C＝N-NH-、-C(＝O)NH-NH-、O、S、Se、B或C3-C6杂芳基。
连接子L1和L2的组分的示例结构有：
(包含MC，6-马来酰亚胺己酰基)，/> (MP，马来酰亚胺丙酰基)，/> (PAB，p-对氨基芐氧基酰胺基)， (含缬氨酸-瓜氨酸(VC))，/> (MCC，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯)，((4-乙酰基)氨基苯甲酸酯)，/> (4-硫代-2-羟基磺酰丁酸酯，2-磺基-SPDB)，/>4-硫代戊酸酯(SPP)，/>4-硫代丁酰基(SPDB)，/>4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-酰基(MCC)，/>马来酰亚胺乙氨基(ME)，/>4-硫代-2-羟基磺酰基丁酰基(2-Sulfo-SPDB)，/>芳基巯醚基(PhSS)，/>(4-乙酰基)氨基苯酰基(SIAB)，/>氧芐基硫醚基，氨基苄基硫醚基，/>二氧基苄基硫醚基，二氨基苄基硫醚基，/>氨基氧基苄基硫醚基，烷氧基氨基(AOA)，/>亚乙基氧基(EO)，/>二硫，4-甲基-4-二硫代戊酸(MPDP)，/>三唑，/>烷基磺酰基，/>烷基磺胺，/>砜基二磺胺，/>磷二酰胺，烷基膦酰胺，/>膦酸，/>N-甲基烷基膦酰胺，
N，N’-二甲基磷二酰胺，/>烷基膦二酰胺，/>
肼，乙脒，/>肟，/>二乙酰肼，/>氨基乙基胺，/>氨基乙基-氨基乙基-胺， />
/> (ala-phe)，(lys-phe)，或两个或多个的组合；其中/>是连接位点；X2、X3、X4、X5、或X6，独立地选自NH、NHNH、N(R12)、N(R12)N(R12’)、O、S、C1-C6烷基、C2-C6杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基、C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、CH2OR12、CH2SR12、CH2NHR12、或1～8氨基酸；其中R12和R12’独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；或C1-C8酯、醚或酰胺；或结构式为(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙二醇单元，其中p是0至约1000的整数，或两个或多个的组合。
另外，L1、L2、X1、X2、X3、X1’、X2、和X3可独立地缺省。
E1是连接两个巯基可反应基团Lv1和Lv2的连接基团。E1选自CH、CH2、NH、NHNH、N(R3)、N(R3)N(R3’)、N＝N、N-N、P、P(＝O)、S、Si、C2-C8烷基、杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；含有1～4个氨基酸残基的肽、优选自天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、色氨酸、丙氨酸；或以下结构之一：
其中/>是连接位点；
D是细胞毒性药物、或治疗性药物、或免疫治疗性蛋白、或用于增强细胞结合蛋白试剂的结合力或稳定性的功能性分子、或细胞表面受体结合剂，例如抗体或抗体片段、或siRNA或DNA分子。
细胞毒药物选自但不限于：
1)化疗药物：a)烷基化剂，氮芥：氯苯那普，氯普那嗪，环磷酰胺，达喀尔巴嗪，雌二醇氮芥，异环磷酰胺，氮芥，盐酸二甲氧胺，氧化二氮芥，盐酸氨氯地平，麦考酚酸，卫矛醇，呱泊溴烷，新氮芥，苯芥胆甾醇，松龙苯芥，噻替呱，曲磷胺对，尿嘧啶；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新、比折来新及其合成类似物)；多卡霉素(包括KW-2189和CBI-TMI、及其合成类似物)；苯并二氮卓二聚体(包括吡咯并苯二氮卓(PBD)或托美霉素，吲哚并苯并二氮卓，咪唑并苯并噻二氮卓或恶唑烷并苯并二氮卓的二聚体)；亚硝基脲(卡莫司汀，洛莫司汀，氯化梭菌素，福莫司汀，尼莫司汀，拉莫司汀)；烷基磺酸酯(白苏芬、树苏芬、磺胺异丙磺胺和皮苏芬)；三氮烯(达喀尔巴嗪)；含铂化合物(卡铂，顺铂，奥沙利铂)；吖丙啶类，苯并二氢吡喃酮，卡洛酮，美妥替派和乌雷多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺，三亚乙基三胺，三乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基甲基胺；b)植物生物碱：长春花生物碱(长春新碱，长春碱，长春地辛，长春瑞滨，去甲长春碱)；紫杉醇类(紫杉醇，多西紫杉醇及其类似物)；美登素类(DM1、DM2、DM3、DM4、美登素、安沙霉素及其类似物)；cryptophycin(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；埃博霉素，软珊瑚醇，迪莫利德，草苔虫内酯，海兔毒素，奥瑞他汀，微管毒素，ephalostatin；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑制素；c)DNA拓扑异构酶抑制剂，依托泊苷替尼(9-氨基喜树碱，喜树碱，克立那托，多拉霉素，依托泊苷，磷酸依托泊苷，伊立替康，米托蒽醌，诺消灵，视黄酸(视黄醇)，替尼泊苷，拓扑替康，9-硝基喜树碱(RFS2000))；丝裂霉素(丝裂霉素C)；d)抗代谢物，抗叶酸剂，DHFR抑制剂(甲氨蝶呤，曲麦克特，二甲叶酸，蝶罗呤，氨喋呤(4-氨基苯甲酸)或其他叶酸类似物)；IMP脱氢酶抑制剂(麦考酚酸，噻唑呋林，利巴韦林，EICAR)；核糖核苷酸还原酶抑制剂(羟基脲，去铁胺)；嘧啶类似物，尿嘧啶类似物(安西他滨，阿扎胞苷，6-氮尿嘧啶，卡培他滨(希罗达)，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，脱氧氟尿苷，依诺他滨，5-氟尿嘧啶，氟尿苷，ratitrexed(Tomudex)；胞嘧啶类似物(阿糖胞苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷，氟达拉滨)；嘌呤类似物(硫唑嘌呤，氟达拉滨，巯嘌呤，硫胺素，硫鸟嘌呤)；叶酸补充剂，弗洛林酸；e)激素疗法剂，受体拮抗剂，抗雌激素(甲地孕酮，雷洛昔芬，他莫昔芬)，LHRH兴奋剂(戈斯他林，醋酸亮丙瑞林)；抗雄激素药(比卡鲁胺，氟他胺，卡鲁司酮，丙酸倍他雄酮，表雄甾醇，戈舍瑞林，亮丙瑞林，美替利定，尼鲁米特，睾内酯，曲洛司坦及其他雄激素抑制剂)；维甲类化合物，维生素D3类似物(CB1093，EB1089，KH1060，胆钙化醇，麦角钙化甾醇)；光动力疗法剂(维替泊芬，酞菁，光敏剂Pc4，去甲氧基-竹红菌素A)；细胞因子(干扰素-α，干扰素-γ，肿瘤坏死因子(TNF)，含TNF的人蛋白)；f)激酶抑制剂，BIBW 2992(抗-EGFR/Erb2)，伊马替尼，吉非替尼，呱加他尼，索拉非尼，达沙替尼，舒尼替尼，厄洛替尼，尼洛替尼，拉帕替尼，阿西替尼，帕唑帕尼，凡德他尼，E7080(抗VEGFR2)，mubritinib，普纳替尼(AP24534)，bafetinib(INNO-406)，bosutinib(SKI-606)，卡博替尼，维莫德吉，iniparib，鲁索利替尼，CYT387，阿西替尼，tivozanib，索拉非尼，贝伐单抗，西妥昔单抗，曲妥珠单抗，雷珠单抗，帕尼单抗，伊斯平斯；g)抗生素，如烯二炔类抗生素(加利车霉素，特别是加利车霉素γ1，δ1，α1和β1，达因霉素，包括达因霉素A和脱氧米霉素，埃斯培拉霉素，卡塔尔霉素，C-1027，maduropeptin，新卡嗪奥斯汀和相关色蛋白烯二炔抗生素)，aclacinomysins，放线菌素，安曲霉素，重氮丝氨酸，博来霉素，卡诺霉素，卡拉霉素，洋红霉素，嗜癌素，色霉素，达金霉素，柔红霉素，去柔红霉素，6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸，阿霉素，吗啉-阿霉素，氰基吗啉-阿霉素，2-吡咯啉阿霉素和脱氧柔红霉素，表柔比星，阿柔比星，伊达比星，马可霉素，nitomycin，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，Peplomycin，potfiromycin，嘌呤霉素，奎拉霉素，罗道霉素，链黑霉素，链脲霉素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；i)聚酮化合物(番荔素)，特别是bullatacin和bullatacinone；吉西他滨，环氧酶素(如卡菲偌米布)，硼替佐米，沙利度胺，来那度胺，pomalidomide，tosedostat，zybrestat，PLX4032，STA-9090，Stimuvax，allovectin-7，Xegeva，Provenge，Yervoy，异戊二烯化抑制剂(如洛伐他汀)，多巴胺能神经毒素(如星形孢菌素)，放线菌素(如放线菌素D，更生霉素)，博莱霉素(如博来霉素A2，博莱霉素B2，培洛霉素)，蒽环类抗生素(如柔红霉素)，鹅膏毒素，阿霉素(亚德里亚霉素)，伊达比星，表柔比星，吡柔比星，佐柔比星，米托蒽醌，MDR抑制剂(如维拉帕米)，Ca2+ATP酶抑制剂(如毒胡萝卜素)，组蛋白去乙酰酶抑制剂(伏立诺他，罗米地辛，帕比司他，丙戊酸，Mocetinostat(MGCD0103)，Belinostat，PCI-24781，恩替诺特，SB939，Resminostat，Givinostat，AR-42，CUDC-101，萝卜硫素，曲古抑菌素A)；塞来昔布，格列酮类，表没食子儿茶素没食子酸酯，双硫仑，Salinosporamide A；抗肾上腺药物，氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦，醋葡醛内酯，醛磷酰胺，氨基乙酰丙酸，安吖啶，阿拉伯糖苷，bestrabucil，比生群，edatraxate，defofamine，美可辛，地吖醌，依氟鸟氨酸(DFMO)，elfomithine，依利醋铵，依托格鲁，硝酸镓，胞嘧啶，羟基脲，伊班膦酸盐，香菇多糖，氯尼达明，米托胍腙，米托蒽醌，莫呱达醇，二胺硝吖啶，喷司他丁，蛋氨氮芥，吡柔比星，鬼臼酸，2-乙肼，甲基苄肼；呱嗪二酮丙烷；根霉素；西佐；螺环锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素，疣孢菌素A，杆孢菌素A和anguidine)，聚氨酯，siRNA，反义药物和核酸分解酶。
2)自身免疫疾病药物选自环孢菌素，环孢菌素A，氨基己酸，硫唑嘌呤，溴隐亭，苯丁酸氮芥，氯喹，环磷酰胺，皮质类固醇(例如安西奈德，倍他米松，布地奈德，氢化可的松，氟尼缩松，丙酸氟替卡松，氟可龙达那唑，地塞米松，曲安奈德，二丙酸倍氯米松)，DHEA，依那西普，羟基氯喹，英夫利昔单抗，美洛昔康，甲氨蝶呤，麦考酚酸酯，泼尼松，西罗莫司，他克莫司。
3)抗感染性疾病药物，包括但不限于a)氨基糖苷类：阿米卡星，阿司米星，庆大霉素(奈替米星，西索米星，异帕米星)，潮霉素B，卡那霉素(阿米卡星，阿贝卡星，氨基脱氧卡那霉素，地贝卡星，妥布霉素)，新霉素(framycetin，巴龙霉素，核糖霉素)，奈替米星，壮观霉素，链霉素，妥布霉素，甲基姿苏霉素；b)酰胺醇类：迭氮氯霉素，氯霉素，氟苯尼考，甲砜霉素；c)安沙霉素：格尔德霉素，除莠霉素；d)碳青霉烯类：比阿培南，多利培南，厄他培南，亚胺培南/西司他丁，美罗培南，帕尼培南；e)头孢烯：碳头孢烯(洛拉卡比)，头孢乙腈，氯氨苄青霉素，头孢拉定，头孢羟氨，头孢洛宁，头孢噻啶，头孢噻吩或头孢金素，头孢氨苄，头孢来星，头孢孟多，头孢匹林，羟胺唑头孢菌素，氟唑头孢菌素，孢西酮，唑啉头孢菌素，头孢拉宗，头孢卡品，头孢达肟，头孢吡，头孢克肟，头孢西丁，头孢罗齐，头孢甲氧环烯胺，头孢替唑，头孢呋辛，头孢克肟，头孢地尼，头孢托仑，头孢吡，头孢他美，头孢甲肟，头孢地嗪，头孢尼西，头孢呱酮，头孢雷特，头孢噻肟，噻乙胺唑头孢菌素，头孢唑兰，头孢氨苄，头孢咪唑，头孢匹胺，头孢匹罗，头孢泊肟，头孢罗齐，头孢喹诺，头孢磺啶，头孢他啶，头孢特仑，头孢布腾，头孢噻林，头孢唑肟，头孢吡普，头孢曲松，头孢呋辛，头孢唑南，头霉素(头孢西丁，头孢替坦，头孢氰唑)，氧(碳)头孢烯(氟氧头孢，拉氧头孢)；f)糖肽：博来霉素，万古霉素(奥利万星，特拉万星)，替考拉宁(达巴万星)，雷莫拉宁；g)甘氨酰环素：如替加环素；h)β-内酰胺酶抑制剂：青霉烷(舒巴坦，他唑巴坦)，氧青霉烷(克拉维酸)；i)林可酰胺：克林霉素，林可霉素；j)脂肽：达托霉素，A54145，钙依赖性抗生素(CDA)；k)大环内酯类：阿奇霉素，克霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素，氟雷霉素，交沙霉素，酮内酯(泰利霉素，塞红霉素)，麦迪霉素，米卡霉素，竹桃霉素，利福霉素(异烟肼、利福平，利福布丁，利福喷汀)，罗匹霉素，罗红霉素，大观霉素，螺旋霉素，他克莫司(FK506)，醋竹桃霉素，泰利霉素；l)单环胺：氨曲南，替吉莫南；m)恶唑烷酮类：利奈唑胺；n)青霉素类：阿莫西林，氨苄青霉素(匹氨西林，海洛西林，巴氨西林，氨苄青霉素，阿霉素)，阿替代西林，阿洛西林，苄青霉素，苄星青霉素苄青霉素，苄星青霉素苯氧甲基青霉素，克洛西林，普鲁卡因青霉素(美替西林)，美洛西林，甲氧西林，萘夫西林，苯唑西林，醋甲西林，青霉素，非奈西林，苯氧基甲基青霉素，呱拉西林，氨苄西林，磺苯西林，替莫西林，替卡西林；o)多肽：杆菌肽，粘菌素，多粘菌素B；p)喹诺酮类：阿拉曲沙星，巴洛沙星，环丙沙星，克林沙，达氟沙星，二氟沙星，依诺沙星，恩诺沙星，加雷沙星，加替沙星，吉米沙星，格帕沙星，卡诺曲伐沙星，左氧氟沙星，洛美沙星，麻保沙星，莫西沙星，那氟沙星，诺氟沙星，奥比沙星，氧氟沙星，培氟沙星，曲伐沙星，格帕沙星，西他沙星，司帕沙星，替马沙星，托沙星，曲伐沙星；q)链阳性菌素：普那霉素，奎奴普丁/达福普汀；r)磺胺类：氨芐磺胺，偶氮磺胺，磺胺嘧啶，磺胺甲异唑、磺胺酰亚胺、磺胺吡啶、磺胺异恶唑、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑(复方磺胺甲恶唑)；s)类固醇抗菌药物：如夫西地酸；t)四环素类：强力霉素，金霉素，氯米西环素，地美环素，雷莫昔林，美西环素，美他环素，米诺环素，土霉素，潘美环素，吡咯烷甲基四环素，四环素，甘氨酰环素(如替加环素)；u)其他类型的抗生素：番荔枝素，胂凡纳明，细菌萜醇抑制剂(杆菌肽)，DANAL/AR抑制剂(环丝氨酸)，dictyostatin，圆皮海绵内酯，软珊瑚醇，埃博霉素，乙胺丁醇，依托泊苷，法罗培南，夫西地酸，呋喃唑酮，异烟肼，laulimalide，甲硝唑，莫匹罗星，NAM合成抑制剂(例如磷霉素)，呋喃妥因，紫杉醇，普兰西霉素，吡嗪酰胺，奎奴普丁/达福普汀，利福平，他唑巴坦替硝唑，乌菊花素。
4)抗病毒药物：a)侵入/融合抑制剂：阿帕韦洛，马拉韦罗，vicriviroc，gp41(恩夫韦肽)，PRO 140，CD4(艾巴利珠单抗)；b)整合酶抑制剂：雷特格韦，elvite-gravir，globoidnan A；c)成熟抑制剂：bevirimat，vivecon；d)神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦，扎那米韦，帕拉米韦；e)核苷和核苷酸：阿巴卡韦，阿昔单韦，阿德福韦，阿莫西韦，阿昔单抗，溴夫定，西多福韦，克拉夫定，地塞米松，去羟肌苷(ddI)，elvucitabine，恩曲他滨(FTC)，恩替卡韦，泛昔洛韦，氟拉西林(5-FU)，3’-氟取代的2’，3’-脱氧核苷类似物，如3’-氟-2’，3’-双脱氧胸苷(FLT)和3’-氟-2’，3’-双脱氧鸟苷(FLG)，福米韦生，9-鸟嘌呤，碘苷，拉米夫定(3TC)，1-核苷(例如β-1-胸苷和β-1-2'-脱氧胞苷)，喷昔洛韦，racivir，利巴韦林，迪替丁，司他夫定(d4T)，塔利巴韦林(viramidine)，替比夫定，替诺福韦，三氟尿苷伐昔洛韦，缬更昔洛韦，扎西他滨(ddC)，齐多夫定(AZT)；f)非核苷类：金刚烷胺，阿替吡啶，卡普韦林，二芳基嘧啶(依曲韦林，rilpivirine)，地拉夫定，二十二烷醇，乙米韦林，依法韦仑，膦甲酸(磷酰基甲酸)，咪喹莫特，聚乙二醇干扰素，洛韦胺，洛德腺苷，甲吲噻腙，奈韦拉平，NOV-205，长效干扰素α，鬼臼毒素，利福平，金刚乙胺，瑞喹莫德(R-848)，醋胺金刚烷；g)蛋白酶抑制剂：安普那韦，阿扎那韦，boceprevir，darunavir，福萨那韦，印地那韦，洛匹那韦，奈非那韦，普来可那立，利托那韦，沙奎那韦，telaprevir(VX-950)，替拉那韦；h)其它类型的抗病毒药物：抗体酶，阿比朵尔，calanolide a，ceragenin，氰维林-n，二芳基嘧啶，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，膦甲酸，格里菲辛，taribavirin(viramidine)，羟基脲，KP-1461，米替福新，普来可那立，混成抑制剂，利巴韦林，seliciclib。
5)通过本发明的桥连接子偶联的药物还包括放射性同位素。其中实例有3H，11C，14C，18F，32P，35S，64Cu，68Ga，86Y，99Tc，111In，123I，124I，125I，131I，133Xe，177Lu，211At或213Bi。放射性同位素标记的抗体可用于受体靶向成像实验，或者可用于如抗体药物偶联物的靶向治疗(Wu等，Nature Biotechnology 2005，23(9)：1137-1146)。细胞结合分子，例如抗体可以连结配体试剂，用文献(Current Protocols in Immunology，卷1和2，Coligen等编写，Wiley-Interscience，New York，N.Y.，Pubs.(1991))所述的方法与放射性金属结合、螯合或生成络合物。可以络合金属离子的螯合配体包括DOTA，DOTP，DOTMA，DTPA和TETA(Macrocyclics，Dallas，美国德州)等。
6)上述任何药物的药学上可接受的盐，酸或其衍生物。
在另一个实施例中，药物可以是发色分子，得到的偶联物可用于检测，监测或研究细胞结合分子与靶细胞的相互作用。发色分子可以吸收一种光，如紫外光，荧光，红外光，近红外光或可见光；发色分子包括黄色素，红细胞，虹彩色素，白细胞，黑色素和蓝绿色素的一类或一个亚类，荧光分子(吸收光后再发光的荧光化学物质)的一类或一个亚类，视觉光转导分子的一类或一个亚类，光子分子的一类或一个亚类，冷光分子的一类或一个亚类和荧光素化合物的一类或一个亚类。
发色分子可选自，但不限于，非蛋白质有机荧光团，例如氧杂蒽衍生物(荧光素，罗丹明，俄勒冈绿，伊红和德克萨斯红)；花青衍生物(花青，吲哚羰花青，氧杂花青，硫代花青和部花青)；方酸衍生物和环取代的方酸，包括Seta，SeTau和Square染料；萘衍生物(丹酰和氟硅酸钠衍生物)；香豆素衍生物；恶二唑衍生物(吡啶基恶唑，硝基苯并恶唑和苯并恶二唑)；蒽衍生物(蒽醌类，包括DRAQ5，DRAQ7和CyTRAK橙)；芘衍生物(级联蓝等)；恶嗪衍生物(尼罗红，尼罗蓝，甲酚紫，恶嗪170等)；吖啶衍生物(黄醇黄素，吖啶橙，吖啶黄等)；芳基甲胺衍生物(金胺，结晶紫，孔雀石绿)和四吡咯衍生物(卟吩，酞菁，胆红素)。
生色分子选自以下荧光化合物的任何类似物和衍生物：CF染料(Biotium)，DRAQ和CyTRAK探针(BioS-tatus)，BODIPY(Invitrogen)，Alexa Fluor(Invitrogen)，DyLightFluor(Thermo Scientific，Pierce)，Atto和Tracy(Sigma Aldrich)，FluoProbes(Interchim)，Abberior染料(Abberior)，DY和MegaStokes染料(Dyomics)，Sulfo Cy染料(Cyandye)，HiLyte Fluor(AnaSpec)，Seta，SeTau和Square染料(BiosearchTechnologies)，SureLight染料(APC，RPEPerCP，Phycobilisomes)(ColumbiaBiosciences)，APC，APCXL，RPE，BPE(Phyco-Biotech)。
广泛使用的可与本发明连接子反应或偶联的荧光化合物的实例有：别藻蓝蛋白(APC)，氨基胭脂蛋白，APC-Cy7偶联物，BODIPY-FL，Cascade Blue，Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy3B，Cy5，Cy5.5，Cy7，荧光素，FluorX，羟基香豆素，丽丝胺罗丹明B，萤光黄，Me-甲氧基香豆素，NBD，Pacific Blue，Pacific Orange，PE-Cy5偶联物，PE-R-藻红蛋白(PE)，Red 613，Seta-555-Azide，Seta-555-DBCO，Seta-555-NHS，Seta-580-NHS，Seta-680-NHS，Seta-APC-780，Seta-PerCP-680，Seta-R-PE-670，SeTau-380-NHS，SeTau-405-马来酰亚胺，SeTau-405-NHS，SeTau-425-NHS，SeTau-647-NHS，Texas Red，TRITC，TruRed，X-Rhodamine。
可以与本发明的连接子相连，用于研究核酸或蛋白质的荧光化合物，选自下列化合物或其衍生物：7-AAD(7-氨基放线菌素D，CG-选择性的)，吖啶橙，色霉素A3，CyTRAK橙(Biostatus)，DAPI，DRAQ5，DRAQ7，溴化乙锭，Hoechst33258，Hoechst33342，LDS 751，光辉霉素，碘化丙啶(PI)，SYTOX蓝，SYTOX绿，SYTOX橙，噻唑橙，TO-PRO，菁染料单体，TOTO-1，TO-PRO-1，TOTO-3，TO-PRO-3，YOSeta-1，YOYO-1。可以与本发明的连接子相连，用于研究细胞的荧光化合物，选自下列化合物或其衍生物：DCFH(2'，7'-二氯二氢荧光素，氧化形式)，DHR(二氢罗丹明123，氧化形式，光催化氧化)，Fluo-3(AM酯，pH>6)，Fluo-4(AM酯，pH7.2)，Indo-1(AM酯，低/高钙(Ca 2+))，SNARF(pH 6/9)。优选的荧光化合物选自：别藻蓝蛋白(APC)，AmCyan1(四聚体，Clontech)，AsRed2(四聚体，Clontech)，蓟绿(单体，MBL)，Azurite，B-藻红蛋白(BPE)，Cerulean，CyPet，DsRed单体(Clontech)，DsRed2(“RFP”，Clontech)，EBFP，EBFP2，ECFP，EGFP(弱二聚体，Clontech)，Emerald(弱二聚体，Invitrogen)，EYFP(弱二聚体，Clontech)，GFP(S65A突变)，GFP(S65C突变)，GFP(S65L突变)，GFP(Y66H突变)，GFP(Y66W突变)，GFPuv，HcRed1，J-Red，Katusha，Kusabira Orange(单聚体，MBL)，mCFP，mCherry(单体，MBL)，mKate(TagFP635，单体，Evrogen)，mKeima-Red(单体，MBL)，mKO，mOrange，mPlum，mRaspberry，mRFP1(单体，Tsien实验室)，mStrawberry，mTFP1，mTurquoise2，P3(藻胆体络合物)，多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质络合物(PerCP)，R-phycoerythrin(RPE)，T-Sapphire，TagCFP(二聚体，Evrogen)，TagGFP(二聚体，Evrogen)，TagRFP(二聚体，Evrogen)，TagYFP(二聚体，Evrogen)，tdTomato(串联二聚体)，Topaz，TurboFP602(二聚体，Evrogen)，TurboFPP635(二聚体，Evrogen)，TurbogFP(二聚体，Evrogen)，TurboRFP(二聚体，Evrogen)，TurboYFP(二聚体，Evrogen)，Venus，野生型GFP型，YPet，Zsgreen1(四聚体，Clontech)，ZsYellow1(四聚体，Clontech)。
在另一个实施例中，药物可以是聚亚烷基二醇，哺乳动物给药时，用于延长细胞结合分子抗体，或类抗体蛋白分子的半衰期。聚亚烷基二醇包括但不限于聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇以及环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物；优选的是PEG，更优选的是单官能活化的羟基PEG(例如，单个末端活化的羟基PEG，包括羟基PEG-活性酯，羟基PEG-单醛，羟基PEG-单胺，羟基PEG-单酰肼，羟基PEG-单肼基甲酸酯，羟基PEG-单碘乙酰胺，羟基PEG-单马来酰亚胺，羟基PEG-邻二硫吡啶，羟基PEG-单肟，羟基PEG-单苯基碳酸酯，羟基PEG-单苯基乙二醛，羟基PEG-单噻唑烷-2-硫酮，羟基PEG-单硫代酯，羟基PEG-单巯基，羟基PEG-单三嗪和羟基PEG-单乙烯基砜)。
在某些实施例中，聚亚烷基二醇分子量为约10Da至约200kDa，优选约88Da至约40kDa的分子量；具有两个分支，每个分支分子量为约88Da至约40kDa；更优选的具有两个分支，每个分支约88Da至约20kDa。在一个具体实施例中，聚亚烷基二醇是聚乙二醇，分子量为约10kDa，20kDa，或40kDa。在具体的实施例中，PEG是PEG 10kDa(直链或支链)，PEG 20kDa(直链或支链)或PEG 40kDa(直链或支链)。许多美国专利公开了直链或支链“非抗原性”PEG聚合物及其衍生物或偶联物的制备，见美国专利5，428，128；5，621，039；5，622，986；5，643，575；5，728，560；5，730，990；5，738，846；5，811，076；5，824，701；5，840，900；5，880，131；5，900，402；5，902，588；5，919，455；5，951，974；5，965，119；5，965，566；5，969，040；5，981，709；6，011，042；6，042，822；6，113，906；6，127，355；6，132，713；6，177，087，和6，180，095。
在另一个实施例中，D更优选为有效的细胞毒剂，选自tubulysin及其类似物、美登素及其类似物、紫杉烷(taxane)及其类似物、CC-1065及其类似物、柔红霉素或多柔比星及他们的类似物、鹅膏毒素及其类似物、苯并二氮卓二聚体(例如吡咯并苯二氮卓(PBD)、托美霉素、氨茴霉素、吲哚并苯并二氮卓、咪唑并苯并噻二氮卓或恶唑烷并苯并二氮卓的二聚体)及其类似物、加利车霉素类和烯二炔类抗生素类似物、放线菌素及其类似物、氮丝菌素及其类似物、博来霉素及其类似物、表柔比星及其类似物、他莫昔芬及其类似物、伊达比星及其类似物、多拉司他汀及其类似物、澳瑞他汀(包括单甲基澳瑞他汀(MMAE)、MMAF、澳瑞他汀PYE、澳瑞他汀TP、澳瑞他汀2-AQ、6-AQ、EB(AEB)、和EFP(AEFP))及其类似物、康普瑞汀、多卡霉素及其类似物、喜树碱、格尔德霉素及其类似物、甲氨喋呤及其类似物、噻替派及其类似物、长春地辛及其类似物、长春新碱及其类似物、半米塔林及其类似物、nazumamide及其类似物、spliceostatin、a pladienolide、微晶蛋白及其类似物、放射敏素及其类似物、alterobactin及其类似物、a microsclerodermin及其类似物、theonellamide及其类似物、esperamicin及其类似物、PNU-159682及其类似物、蛋白激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂、烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)抑制剂、免疫毒素和立体异构体、等排体、类似物、或以上衍生物。
Tubulysin及其类似物为本领域专业技术人员熟知，可以根据已知方法从天然来源分离或者根据已知方法制备合成(例如Balasubramanian R.，等，J.Med.Chem.，2009，52，238–40；Wipf P.，等，Org.Lett.，2004，6，4057–60；Pando O.，等，J.Am.Chem.Soc.，2011，133，7692–5；Reddy，J.A.，等，Mol.Pharmaceutics，2009，6，1518–25；Raghavan B.，等，J.Med.Chem.，2008，51，1530–33；Patterson A.W.，等，J.Org.Chem.，2008，73，4362–9；Pando O.，等，Org.Lett.，2009，11(24)，5567–9；Wipf，P.，等，Org.Lett.，2007，9(8)，1605–7；Friestad，G.K.，Org.Lett.，2004，6，3249–52；Peltier，H.M.，等，J.Am.Chem.Soc.，2006，128，16018–9；Chandrasekhar S.，等，J.Org.Chem.，2009，74，9531–4；Liu Y.，等，Mol.Pharmaceutics，2012，9，168–75；Friestad G.K.，等，Org.Lett.，2009，11，1095–8；Kubicek K.，等，Angew Chem Int Ed Engl，2010.49：4809-12；Chai Y.，等，Chem Biol，2010，17：296-309；Ullrich A.，等，Angew Chem Int Ed Engl，2009，48，4422-5；Sani M.，等，Angew Chem Int Ed Engl，2007，46，3526-9；Domling A.，等，Angew Chem Int EdEngl，2006，45，7235-9；专利申请：Zanda M.，等，加拿大专利申请CA 2710693(2011)；ChaiY.，等，欧洲专利申请2174947(2010)，WO 2010034724；Leamon，C.等，WO2010033733，WO2009002993；Ellman，J.，等，PCT WO2009134279；WO 2009012958，美国专利申请20110263650，20110021568；Matschiner G.，等，WO2009095447；Vlahov I.，等，WO2009055562，WO 2008112873；Low P.，等，WO2009026177；Richter W.，WO2008138561；Kjems J.，等，WO 2008125116；Davis M.；等，WO2008076333；Diener J.；等，美国专利申请20070041901，WO2006096754；Matschiner G.，等，WO2006056464；Vaghefi F.，等，WO2006033913；Doemling A.，德国专利申请DE102004030227，WO2004005327，WO2004005326，WO2004005269；Stanton M.，等，美国专利申请20040249130；Hoefle G.，等，德国专利申请DE10254439，DE10241152，DE10008089；Leung D.，等，WO2002077036；Reichenbach H.，等，德国专利申请DE19638870；Wolfgang R.，US20120129779；Chen H.，美国专利申请20110027274。在专利PCT/IB2012/053554中描述了能应用本申请中的工艺与细胞结合分子偶联的tubulysin的优选结构。
Tubulysin类似物具有式(IV)的结构：
或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或多晶结构；或其旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中是独立地连接到L1和/或L2的连接位点；
其中R1、R2、R3、和R4独立地为H、C1～C8烷基、C2～C8杂烷基或杂环、C3～C8芳基、芳基烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂烷基环烷基、碳环或烷基羰基；或R1R2、R1R3、R2R3、R3R4、R5R6、R11R12或R13R14形成的3～7元碳环、环烷基、杂环、杂环烷基、芳基或杂芳基环体系；当独立或同时连接到L1或L2时，R1和R2可以独立地缺省，Y1是N或CH；
其中R5、R6、R8、R10和R11独立地为H、或C1～C4烷基或杂烷基；
其中R7独立地为H、R14、-R14C(＝O)X1R15；或-R14X1R15；X1是O、S、S-S、NH、CH2或NR14；
其中R9选自于H、OH、-O-、＝O、-OR14、-OC(＝O)R14、-OC(＝O)NHR14-、-OC(＝O)R14SSR15-、OP(＝O)(OR14)-、-OC(＝O)NR14R15、OP(＝O)(OR14)、或OR14OP(＝O)(OR15)；
其中R11独立地为H、R14、-R14C(＝O)R16、-R14X2R16、-R14C(＝O)X2、其中X2是-O-、-S-、-NH-、-N(R14)-、-O-R14-、-S-R14-、-S(＝O)-R14-、或-NHR14；
其中R12是R15、-OH、-SH、-NH2、NH、NHNH2、-NH(R15)、-OR15、-R15COR16、-R15COOR16、-R15C(O)NH2、-R15C(O)NHR17、-SR16、R15S(＝O)R16、-R15P(＝O)(OR17)2、-R15OP(＝O)(OR17)2、-CH2OP(＝O)(OR17)2、-R15SO2R17、-R15X2R16、-R15C(＝O)X2、其中X2是-O-、OH、SH、-S-、NH2、-NH-、-N(R15)-、-O-R15-、-S-R15-、-S(＝O)-R15-、CH2或-NHR15-；
R13和R14独立地为H、O、S、NH、N(R15)、NHNH、-OH、-SH、-NH2、NH、NHNH2、-NH(R15)、-OR15、CO、-COX2、-COX2R16、R17、F、Cl、Br、I、SR16、NR16R17、N＝NR16、N＝R16、NO2、SOR16R17、SO2R16、SO3R16、OSO3R16、PR16R17、POR16R17、PO2R16R17、OP(O)(OR17)2、OCH2OP(O)(OR17)2、OC(O)R17、OC(O)OP(O)(OR17)2、PO(OR16)(OR17)、OP(O)(OR17)OP(O)(OR17)2、OC(O)NHR17；-O-(C4-C12糖苷)、-N-(C4-C12糖苷)、C1～C8烷基、杂烷基、C2-C8烯基、炔基、杂烷基，杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基，或2-8个碳原子的酯、醚或酰胺；或包含1-8个氨基酸的肽(NH(Aa)1～8或CO(Aa)1～8，N-端或C-端1-8个相同或不同的氨基酸)，或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯基单元，其中p是0至约1000的整数，或上述基团的组合；X2是O、S、S-S、NH、CH2、OH、SH、NH2、CHR14或NR14；
R15、R16和R17独立地为H、C1～C8烷基、杂烷基；C2-C8烯基、炔基、杂烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、烷基羰基、或Na+、K+、Cs+、Li+、Ca2+、Mg+、Zn2+、N+(R1)(R2)(R3)(R4)、HN+(C2H5OH)3盐；
Y1和Y2独立地为N或CH；q是0或1；当q＝0，Y3不存在，Y4、Y5、Y6和Y7独立地为CH、N、NH、O、S、或N(R1)，所以Y2、Y4、Y5、Y6和Y7形成呋喃、吡咯噻吩、噻唑、噁唑和咪唑、吡唑、三唑、四唑、噻二唑杂芳环；当q＝1、Y3、Y4、Y5、Y6和Y7独立地为CH或N时，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6和Y7形成苯、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、四嗪、五嗪的芳环；
Tubulysin类似物的结构实例如下所示：
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其中R20是H；C1-C8直链或支链烷基或杂烷基、C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基、C3-C8芳基、芳烷基、杂环基、碳环基、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基的直链或支链；碳酸酯(-C(O)OR17)，氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；或1-8碳的羧酸盐、酯、醚或酰胺；或1～8个氨基酸；或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙烯氧基单元，其中p是0至约1000的整数；或R20缺省氧与碳形成酮，或上述组合；Z3和Z3独立地为H、OH、NH2、O、NH、COOH、COO、C(O)、C(O)、C(O)NH、C(O)NH2、R18、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、OPO(OR18)2、NHPO(OR18)2、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC(O)R18、OC(O)NHR18、OSO2(OR18)、O-(C4-C12-糖苷)、直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳烷基、杂环基、碳环基、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基的直链或支链；碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R17和R18独立地为H、直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R19是H、OH、NH2、OSO2(OR18)、XCH2OP(O)(OR18)2、XPO(OR18)2、XC(O)OP(O)(OR18)2、XC(O)R18、XC(O)NHR18、C1～C8烷基或羧酸酯；C2～C8烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3～C8芳基或烷基羰基；或药用盐；X是O、S、NH、NHNH、或CH2；R7定义同上；其中连接位点在式IV-01-IV-79中，与根据式(IV)中所示相同。
加利车霉素及其相关的烯二炔抗生素的描述见于：Nicolaou K.C.等，Science1992，256，1172-1178；Proc.Natl.Acad.Sci USA.1993，90，5881-8；美国专利4，970，198；5，053，394；5，108，912；5，264，586；5，384，412；5，606，040；5，712，374；5，714，586；5，739，116；5，770，701；5，770，710；5，773，001；5，877，296；6，015，562；6，124，310；8，153，768。示例性烯二炔包括但不限于，加利车霉素、埃斯培拉霉素、uncialamicin、达内霉素和它们的衍生物。
加利车霉素的结构优选下式：
或元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或多晶结构；或其旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中是与L1或L2连接的位点；
格尔德霉素是与Hsp90(热休克蛋白90)结合的苯醌安沙霉素抗生素，已被用作抗肿瘤药物。示例性的格尔德霉素包括但不限于17-AAG(17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)和17-DMAG(17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素)。
美登素或其衍生物美登素类化合物通过抑制微管蛋白的聚合，来抑制有丝分裂期间微管的形成，从而抑制细胞增殖。见Remillard等，Science 189：1002-1005(1975)。示例性的美登素和美登素类化合物包括但不限于mertansines(DM1、DM4)、美登素及其衍生物，以及安司霉素。美登素记载在下列美国专利中：4，256，746；4，361，650；4，307，016；4，294，757；4，294，757；4，371，533；4，424，219；4，331，598；4，450，254；4，364，866；4，313，946；4，315，929；4，362，663；4，322，348；4，371，533；4，424，219；5，208，020；5，416，064；5，208，020；5，416，064；6，333.410；6，441，163；6，716，821；7，276，497；7，301，019；7，303，749；7，368，565；7，411，063；7，851，432和8，163，888。美登素的结构优选如下式：
其中是与L1或L2连接的位点。
喜树碱(CPTs)及其衍生物是拓扑异构酶抑制剂，可阻止DNA重新连接，因此引起DNA损伤并导致细胞凋亡，其描述见于：Shang，X.F.等，Med Res Rev.2018，38(3)：775-828；Botella，P.和Rivero-Buceta，E.J Control Release.2017，247：28-54；Martino，E.等，Bioorg Med Chem Lett.2017，27(4)：701-707；Lu，A.，等，Acta Pharmacol Sin 2007，28(2)：307–314。它包括SN-38，拓扑替康，伊立替康(CPT-11)，西利替康(DB-67，AR-67)，科西特康(BNP-1350)，Etirinotecan，依喜替康，Lurtotecan，Gimatecan(ST1481)，贝洛替康(CKD-602)，鲁比替康(Rubitcan)和其他(Shang，X.F.等，Med Res Rev.2018，38(3)：775-828)。迄今为止，已有三种CPT类似物，拓扑替康，伊立替康和贝洛特康获批用于癌症化学疗法(Palakurthi，S.，Expert Opin Drug Deliv.2015；12(12)：1911-21；Shang，X.F.等，MedRes Rev.2018，38(3)：775-828)，SN-38和Exatecan还被用于临床试验中ADC偶联物的有效荷载(Ocean，A.J.，Cancer.2017，123(19)：3843-3854；Starodub，A.N.等，Clin CancerRes.2015，21(17)：3870-8；Cardillo，T.M.等，Bioconjug Chem.2015，26(5)：919-31；Ogitani，Y.等，Bioorg Med Chem Lett.2016，26(20)：5069-5072；Takegawa，N.等，Int JCancer.2017Oct 15；141(8)：1682-1689；美国专利7，591，994；7，999，083，8，080，250、8，268，317；美国专利申请20130090458、20140099258、20150297748、20160279259)。
喜树碱(CPT)的结构如下式所示：
或一种或多种元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或多晶结构；或其旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中R1，R2和R4独立地选自H、F、Cl、Br、CN、NO2、C1-C8烷基；O-C1-C8烷基、NH-C1-C8烷基；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；C2-C8酯、醚、酰胺、碳酸酯、尿素或氨基甲酸酯；R3为H、OH、NH2、C1-C8烷基、O-C1-C8烷基；NH-C1-C8烷基；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C2-C8酯、醚、酰胺、碳酸酯、尿素或氨基甲酸酯；或R1R2、R2R3和R3R4独立形成元碳环、杂环、杂环烷基、芳基或杂芳基环系统。其中/>是分子中与L1或L2连接的位点。
喜树碱优选自下列的结构：
/>
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或一种或多种元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；其中是连接到L1或L2的位点；P1是H、OH、NH2、COOH、C(O)NH2、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、OPO(OR18)2、NHPO(OR18)2、OC(O)R18、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC(O)NHR18、OC(O)N(C2H4)2NCH3、OSO2(OR18)、O-(C4-C12-糖苷)、OC(O)N(C2H4)2CH2N(C2H4)2CH3、O-(C1-C8支链或支链的烷基)、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基、C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R17和R18独立地为H、直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)。
Combretastatins是天然酚类，在肿瘤中具有破坏血管的作用。示例性combretastatins及其衍生物包括但不限于combretastatin A-4(CA-4)、CA4-βGals、CA-4PD、CA4-NPs和ombrabulin。
紫杉烷类，包括细胞毒性天然产物紫杉醇(Taxol)和半合成衍生物多西紫杉醇(Taxotere)，以及它们的类似物，优选可用于偶联，可参考下列文献：K C.Nicolaou等.，J.Am.Chem.Soc.117，2409-20，(1995)；Ojima等，J.Med.Chem.39：3889-3896(1996)；40：267-78(1997)；45，5620-3(2002)；Ojima等.，Proc.Natl.Acad.Sci.，96：4256-61(1999)；Kim等.，Bull.Korean Chem.Soc.，20，1389-90(1999)；Miller，等.J.Med.Chem.，47，4802-5(2004)；U.S.Patent No.5，475，011 5，728，849，5，811，452；6，340，701；6，372，738；6，391，913，6.436，931；6，589，979；6，596，757；6，706，708；7，008，942；7，186，851；7，217，819；7，276，499；7，598，290；7，667，054。紫杉烷优选结构如下：
其中是连接到L1或L2的位点；Ar和Ar’独立地是芳基或杂芳基。
蒽环类药物是哺乳动物DNA拓扑异构酶II抑制剂，能够稳定DNA链被切断并与类抗体蛋白质共价连接处的DNA-酶络合物。在过去的几十年中，这些抗癌剂在治疗多种形式的实体瘤和急性白血病中一直发挥着重要作用。然而，蒽环类药物会导致心血管疾病的发病和死亡(Sagi，J.C.，等，Pharmacogenomics.2016，17(9)，1075-87；McGowan，J.V.，等，Cardiovasc Drugs Ther.2017，31(1)，63-75)。因此，为了增强此类分子的比活性同时降低心脏毒性，研究人员将蒽环类药物与细胞结合抗体，或类抗体蛋白质分子偶联，以提高这些药物治疗指数(Mollaev，M.等，Int J Pharm.2018Dec 29.pii：S0378-5173(18)30991-8；Rossin，R.，等，Bioconjug Chem.2016，27(7)：1697-706；Dal Corso，A.，等，J ControlRelease.2017，264：211-218)。
示例性蒽环类药物包括但不限于柔红霉素、多柔比星(即阿霉素)、表柔比星、伊达比星、伐柔比星和米托蒽醌。本申请中的蒽环类药物的结构优选自下式：
/>
/>
其中是与L1或L2连接的位点。
长春花生物碱是一类抗有丝分裂和抗微管生物碱，通过抑制癌细胞分裂而起作用。长春花生物碱包括长春碱，长春新碱，长春地辛，环氧长春碱，长春瑞滨，长春质碱，长春花碱，长春胺醇，维尼丁，米诺维辛，甲氧基米诺维辛，长春花草碱，脱氧长春氨醇，长春蔓晶，长春胺，长春西汀，长春布宁。长春花生物碱优选长春碱，长春新碱，结构式如下：
/>
其中是连接到L1或L2位点；
海兔毒素(Dolastatins)及其肽类似物和衍生物，澳瑞他汀(auristatins)，是高效的抗有丝分裂剂，已被证明具有抗癌和抗真菌活性。参见，如美国专利申请5，663，149和Pettit等，Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965，1998。示例性的海兔毒素和澳瑞他汀包括但不限于海兔毒素10、澳瑞他汀E(AE)、澳瑞他汀EB(AEB)、澳瑞他汀EFP(AEFP)、MMAD(单甲基澳瑞他汀D或单甲基海兔毒素10)、MMAF(单甲基澳瑞他汀F或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-苯丙氨酸)、MMAE(单甲基澳瑞他汀E或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-norephedrine)、5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)，澳瑞他汀F苯二胺(AFP)和其他新型澳瑞他汀化合物。澳瑞他汀在以下文献中都有描述：Int.J.Oncol.15：367-72(1999)；Molecular Cancer Therapeutics，vol.3，No.8，pp.921-32(2004)；美国专利申请11134826，20060074008，2006022925，美国专利4414205，4753894，4764368，4816444，4879278，4943628，4978744，5122368，5165923，5169774，5286637，5410024，5521284，5530097，5554725，5585089，5599902，5629197，5635483，5654399，5663149，5665860，5708146，5714586，5741892，5767236，5767237，5780588，5821337，5840699，5965537，6004934，6033876，6034065，6048720，6054297，6054561，6124431，6143721，6162930，6214345，6239104，6323315，6342219，6342221，6407213，6569834，6620911，6639055，6884869，6913748，7090843，7091186，7097840，7098305，7098308，7498298，7375078，7462352，7553816，7659241，7662387，7745394，7754681，7829531，7837980，7837995，7902338，7964566，7964567，7851437，7994135。澳瑞他汀的结构优选自以下结构：式(Ih-01)、(Ih-02)、(Ih-03)、(Ih-04)、(Ih-05)、(Ih-06)、(Ih-07)、(Ih-08)、(Ih-09)、(Ih-10)、和(Ih-11)。
/>
或一种或多种元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；其中R1、R2、R3、R4和R5独立地为H；C1-C8直链或支链烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酯、醚、酰胺、胺、杂环烷基或酰氧基胺；或包含1-8个氨基酸的肽，或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯基单元，其中p为1至约1000的整数。两个Rs：R1R2、R2R3、R1R3或R3R4可以形成烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或烷基环烷基的3～8元环状；
当连接到位点时，Y1和Y2独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)和C(O)NR1；当未连接到位点/>时，(独立地与L1和/或L2连接)为OH、NH2、NHNH2、NHR5、SH、C(O)OH、C(O)NH2、OC(O)NH2、OC(O)OH、NHC(O)NH2、NHC(O)SH、OC(O)NH(R1)、N(R1)C(O)NH(R2)、C(O)NHNHC(O)OH和C(O)NHR1；R12是OH、NH2、NHR1、NHNH2、NHNHCOOH、O-R1-COOH、NH-R1-COOH、NH-(Aa)nCOOH、O(CH2CH2O)pCH2CH2OH、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NR1R1’、NHOH、NHOR1、O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH-Ar-COOH、NH-Ar-NH2、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH-SO3H、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H、R1-NHSO3H、NH-R1-NHSO3H、O(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2、OR1、R1-NHPO3H2、R1-OPO3H2、O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2、OR1-NHPO3H2、NH-R1-NHPO3H2、NH(CH2CH2NH)pCH2-CH2NH2、NH(CH2CH2S)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2NH)pCH2CH2OH、NH(CH2CH2S)pCH2-CH2OH、NH-R1-NH2、或NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2、其中Aa是1-8个相同或者不同的氨基酸；p是1-5000；R1、R2、R3、R4、R5、R5’、Z1、Z2和n的定义同前文。
Hemiasterlin及其类似物(例如，HTI-286)与微管蛋白结合，破坏正常的微管动力学，以化学计量数解聚微管蛋白。美登素的结构优选下式：
其中R1、R2、R3、R4和R5独立地为H；C1-C8直链或支链烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酯、醚、酰胺、胺、杂环烷基或酰氧基胺；或含有1-8个氨基酸的肽、或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯单元、其中p是1至约5000的整数；另外，R2R3可以形成3～8个环的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或烷基环烷基。
艾日布林(Eribulin)主要与微管正端的少数高亲和力位点结合，具有细胞毒性和非细胞毒性作用机制。它的细胞毒性作用与其抗有丝分裂活性有关，在长期且不可逆的有丝分裂阻断后诱导了癌细胞的凋亡(Kuznetsov，G.等，Cancer Research.2004，64(16)：5760-6；Towle，M.J，et al，Cancer Research。2010，71(2)：496-505)。除了基于细胞毒性和抗有丝分裂的机制外，在人类乳腺癌模型中的临床前研究还表明，Eribulin还对存活的癌细胞和残余肿瘤的生物学功能产生复杂影响，而这些似乎与它的抗有丝分裂作用无关。Eribulin已被美国FDA批准用于治疗转移性乳腺癌，这些乳腺癌病人已接受至少两种针对晚期疾病的前期化疗方案，包括基于蒽环类和紫杉烷类的化学疗法，以及用于治疗不能通过手术去除(无法切除)或已进展(转移)的脂肪肉瘤(一种软组织肉瘤)。Eribulin已被用作ADC偶联物的有效荷载(US20170252458)。其优选结构如下式Eb01：
是独立地连接到L1和/或L2的位点；
烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂(NAMPT)可以是ADC有效荷载，因为它们具有独特的高活性的机制(Sampath D等，Pharmacol Ther 2015；151，16-31)。NAMPT调节细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的水平，而NAD是维持能量和组成代谢的重要氧化还原辅助因子。NAD在新陈代谢中具有几个重要作用。它在氧化还原反应中充当辅酶，在ADP-核糖基化反应中作为ADP-核糖部分的供体，作为第二信使分子环状ADP-核糖的前体，并作为细菌DNA连接酶的底物，和一类被称为Sirtuins的酶使用NAD+去除蛋白质中乙酰基。除了这些代谢功能外，NAD+还是可以自发地或通过调节机制从细胞中释放出腺嘌呤核苷酸(Smyth L.M.，等，J.Biol.Chem.2004，279(47)，48893–903；Billington R.A.，等，Mol Med.2006，12，324–7)，因此可能具有重要的细胞外功能(Billington R.A.，等，Mol Med.2006，12，324–7)。当存在NAMPT抑制剂时，NAD的水平降至代谢所需的水平以下，从而产生能量危机并因此导致细胞死亡。到目前为止，NAMPT抑制剂候选药物FK-866，CHS-828和GMX-1777已经进入临床试验，但每种药物在发生任何客观缓解之前都遇到了剂量限制的毒性作用(Holen K.，等，InvestNew Drugs 2008，26，45-51；Hovstadius，P.，等，Clin Cancer Res 2002，8，2843-50；Pishvaian，M.J.，等，J Clin Oncol 2009，27，3581)。因此，使用ADC靶向递送NAMPT抑制剂可能会避免全身毒性，从而获得更大的治疗指标。NAMPT抑制剂的结构优选为下式NP01、NP02、NP03、NP04、NP05、NP06、NP07、NP08和NP09：
或一种或多种元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；其中与前文相同；X5是F、Cl、Br、I、OH、OR1、R1、OPO3H2、OSO3H、NHR1、OCOR1、NHCOR1。
苯二氮卓二聚体及其类似物(例如，吡咯并苯二氮(PBD)或(tomaymycin)的二聚体、吲哚并苯二氮/>(IGN)二聚体、咪唑并苯并噻二氮杂二聚体或恶唑烷基苯并二氮杂二聚体)含有一个或多个能与双链DNA结合的亚胺官能团或其等效物。PBD和IGN分子基于天然产物安曲霉素，以序列选择性方式与DNA相互作用，优先选择嘌呤-鸟嘌呤-嘌呤序列。根据本发明优选的苯二氮/>二聚体的例子出现在下列文献：美国专利8，163，736；8，153，627；8，034，808；7，834，005；7，741，319；7，704，924；7，691，848；7，678，787；7，612，062；7，608，615；7，557，099；7，528，128；7，528，126；7，511，032；7，429，658；7，407，951；7，326，700；7，312，210；7，265，105；7，202，239；7，189，710；7，173，026；7，109，193；7，067，511；7，064，120；7，056，913；7，049，311；7，022，699；7，015，215；6，979，684；6，951，853；6，884，799；6，800，622；6，747，144；6，660，856；6，608，192；6，562，806；6，977，254；6，951，853；6，909，006；6，344，451；5，880，122；4，935，362；4，764，616；4，761，412；4，723，007；4，723，003；4，683，230；4，663，453；4，508，647；4，464，467；4，427，587；4，000，304；美国申请20100203007，20100316656，20030195196。抗体-苯二氮/>二聚体偶联物的结构示例如下所示：PB01、PB02、PB03、PB04、PB05、PB06、PB07、PB08、PB09、PB10、PB11、PB12、PB13、PB14、PB15和PB16。
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或一种或多种元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；其中X1、X2、Y1、Y2、R5’、Z1、Z2和n的定义如前文所述；优选的X1、X2、Y1和Y2独立地为O、N、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH、C(O)NHNHC(O)和C(O)NR1；R1、R2、R3、R1’、R2’、和R3’独立地为H、F、Cl、＝O、＝S、OH、SH、C1-C8直链或支链的苄基、芳基、烯基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酯(COOR5或–OC(O)R5)、醚(OR5)、酰胺(CONR5)、氨基甲酸酯(OCONR5)、胺类(NHR5，NR5R5’)、杂环烷基、或酰氧基胺(-C(O)NHOH、-ONHC(O)R5)、或含有1-20个天然或非天然氨基酸的肽、或结构式如(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯基单元、其中p是1至5000的整数。两个R基团、如R1R2、R2R3、R1R3、R1’R2’、R2’R3’或R1’R3’可以独立地形成3～8元环的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或烷基环烷基；X3和Y3独立地为N、NH、CH2或CR5，X3和Y3之一可以缺省；其中R1，和R2是C1-C8直链或支链烷基，杂烷基；C3-C8芳基、杂芳基、烷基环烷基、酰氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、烷基芳基氨基、烷基芳基巯基；或1-6相同或不同的氨基酸/肽序列(Ar)r，r＝1-6；其中R4、R5、R5’、R6、R12和R12’独立地为H、OH、NH2、NH(CH3)、NHNH2、COOH、SH、OZ3、SZ3、F、Cl、或C1-C8直链或支链烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺；Z3是H、OP(O)(OM1)(OM2)、OCH2OP(O)(OM1)(OM2)、OSO3M1、或O-糖苷(葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、葡糖醛酸苷/葡糖醛酸、阿洛糖苷、果糖苷等)、NH-糖苷、S-糖苷或CH2-糖苷；M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4或NR1R2R3；X6是CH、N、P(O)NH、P(O)NR1、CHC(O)NH、C3-C8芳基、杂芳基、烷基环烷基、酰氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、烷基芳基氨基或Aa(氨基酸，优选自Lys、Phe、Asp、Glu、Ser、Thr、His、Cys、Tyr、Trp、Gln、Asn、Arg)；的定义如前所述。
CC-1065类似物和多卡霉素类似物优选用于本专利申请的偶联物。CC-1065类似物和多卡霉素类似物的例子以及它们的合成记载于：Warpehoski，等，J.Med.Chem.31：590-603(1988)；D.Boger等.，J.Org.Chem；66；6654-61，2001；美国专利：4169888，4391904，4671958，4816567，4912227，4923990，4952394，4975278，4978757，4994578，5037993，5070092，5084468，5101038，5117006，5137877，5138059，5147786，5187186，5223409，5225539，5288514，5324483，5332740，5332837，5334528，5403484，5427908，5475092，5495009，5530101，5545806，5547667，5569825，5571698，5573922，5580717，5585089，5585499，5587161，5595499，5606017，5622929，5625126，5629430，5633425，5641780，5660829，5661016，5686237，5693762，5703080，5712374，5714586，5739116，5739350，5770429，5773001，5773435，5786377，5786486，5789650，5814318，5846545，5874299，5877296，5877397，5885793，5939598，5962216，5969108，5985908，6060608，6066742，6075181，6103236，6114598，6130237，6132722，6143901，6150584，6162963，6172197，6180370，6194612，6214345，6262271，6281354，6310209，6329497，6342480，6486326，6512101，6521404，6534660，6544731，6548530，6555313，6555693，6566336，6586618，6593081，6630579，6756397，6759509，6762179，6884869，6897034，6946455，7049316，7087600，7091186，7115573，7129261，7214663，7223837，7304032，7329507，7329760，7388026，7655660，7655661，7906545，和8 012978。应用本发明的连接子的抗体-CC-1065类似物的偶联物的结构示例如CC01、CC02、CC03、CC04、CC05、CC06和CC07：
其中当连接到位点时，X1、X2、Y1和Y2独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)和C(O)NR1；或者当未连接到连接位点/>时，为OH、NH2、NHNH2、NHR1、SH、C(O)OH、C(O)NH2、OC(O)NH2、OC(O)OH、NHC(O)NH2、NHC(O)SH、OC(O)NH(R1)、N(R1)C(O)NH(R2)、C(O)NHNHC(O)OH和C(O)NHR1；Z3是H、PO(OM1)(OM2)、SO3M1、CH2PO(OM1)(OM2)、CH3N(CH2CH2)2NC(O)-、O(CH2CH2)2NC(O)-、R1、或糖苷；其中R1、R2、R3、M1、M2和n的定义同前文所述。
毒伞肽及其类似物是包含至少十种有毒化合物的亚组，最初在一些有毒蘑菇属中发现的，最著名的是伞形毒蕈和其他几种蘑菇，也优选用于本专利偶联物。这十种毒伞肽，即a-鹅膏毒素，β-鹅膏毒素，γ-鹅膏毒素，ε-鹅膏毒素，Amanullin，Amanullinic acid，Amaninamide，Amanin，Proamanullin，其合成前体为含35个氨基酸的蛋白，被脯氨酰寡肽酶切割后，得到含8个氨基酸的刚性双环肽(Litten，W.1975Scientific American232(3)：90–101；H.E.Hallen，等2007Proc.Nat.Aca.Sci.USA 104，19097–101；K.Baumann，等，1993Biochemistry 32(15)：4043–50；Karlson-Stiber C，Persson H.2003，Toxicon 42(4)：339–49；Horgen，P.A.等.1978Arch.Microbio.118(3)：317–9)。毒伞肽通过抑制RNA聚合酶II(Pol II)，关闭基因转录和蛋白质生物合成而杀死细胞(Brodner，O.G.和Wieland，T.1976Biochemistry，15(16)：3480–4；Fiume，L.，Curr Probl Clin Biochem，1977，7：23-8；Karlson-Stiber C，Persson H.2003，Toxicon 42(4)：339–49；Chafin，D.R.，Guo，H.&Price，D.H.1995J.Biol.Chem.270(32)：19114–19；Wieland(1983)Int.J.Pept.ProteinRes.22(3)：257-76)。可以从收集的伞形毒蕈蘑菇中产生毒伞肽(Yocum，R.R.1978Biochemistry 17(18)：3786-9；Zhang，P.等，2005，FEMS Microbiol.Lett.252(2)，223-8)，或使用担子菌(Muraoka，S.and Shinozawa T.，2000J.Biosci.Bioeng.89(1)：73-6)或A.fissa发酵(Guo，X.W.，等，2006Wei Sheng Wu Xue Bao 46(3)：373-8)，或通过培养Galerina fasciculata或Galerina helvoliceps而制备(WO/1990/009799，JP11137291)。但是，这些分离和发酵的产量很低(少于5mg/L培养物)。在过去的三十年中，已经报道了几种毒伞肽及其类似物的制备(W.E.Savige，A.Fontana，Chem.Commun.1976，600–1；Zanotti，G.，等，Int J Pept Protein Res，1981.18(2)：162-8；Wieland，T.，等，Eur.J.Biochem.1981，117，161–4；P.A.Bartlett等，Tetrahedron Lett.1982，23，619–22；Zanotti，G.，等，Biochim Biophys Acta，1986.870(3)：454-62；Zanotti，G.等，Int.J.Peptide Protein Res.1987，30，323–9；Zanotti，G.，等，Int.J.Peptide ProteinRes.1987，30，450–9；Zanotti，G.，等，Int J Pept Protein Res，1988.32(1)：9-20；G.Zanotti，T.等，Int.J.Peptide Protein Res.1989，34，222–8；Zanotti，G.，等，Int JPept Protein Res，1990.35(3)：263-70；Mullersman，J.E.and J.F.Preston，3rd，IntJPept Protein Res，1991.37(6)：544-51；Mullersman，J.E.，等，Int J Pept ProteinRes，1991.38(5)：409-16；Zanotti，G.等，Int J Pept Protein Res，1992.40(6)：551-8；Schmitt，W.等，J.Am.Chem.Soc.1996，118，4380–7；Anderson，M.O.，等，J.Org.Chem.，2005，70(12)：4578-84；J.P.May，等，J.Org.Chem.2005，70，8424–30；F.Brueckner，P.Cramer，Nat.Struct.Mol.Biol.2008，15，811–8；J.P.May，D.M.Perrin，Chem.Eur.J.2008，14，3404–9；J.P.May，等，Chem.Eur.J.2008，14，3410–17；Q.Wang，等，Eur.J.Org.Chem.2002，834–9；May，J.P.and D.M.Perrin，Biopolymers，2007.88(5)：714-24；May，J.P.，等.，Chemistry，2008.14(11)：3410-7；S.De Lamo Marin，等，Eur.J.Org.Chem.2010，3985–9；Pousse，G.，等.，Org Lett，2010.12(16)：3582-5；Luo，H.，等.，Chem Biol，2014.21(12)：1610-7；Zhao，L.，等，Chembiochem，2015.16(10)：1420-5)，其中大多数是部分合成的方法。由于其极强的效力和独特的细胞毒性机制，毒伞肽已被用作偶联物的有效荷载(Fiume，L.，Lancet，1969.2(7625)：853-4；Barbanti-Brodano，G.and L.Fiume，Nat New Biol，1973.243(130)：281-3；Bonetti，E.，M.等，Arch Toxicol，1976.35(1)：p.69-73；Davis，M.T.，Preston，J.F.Science1981，213，1385–1388；Preston，J.F.，等，Arch Biochem Biophys，1981.209(1)：63-71；H.Faulstich，等，Biochemistry 1981，20，6498–504；Barak，L.S.，等.，ProcNatl Acad Sci U S A，1981.78(5)：3034-8；Faulstich，H.and L.Fiume，MethodsEnzymol，1985.112：225-37；Zhelev，Z.，A.等，Toxicon，1987.25(9)：981-7；Khalacheva，K.，等，Eksp Med Morfol，1990.29(3)：26-30；U.Bermbach，H.Faulstich，Biochemistry1990，29，6839–45；Mullersman，J.E.and J.F.Preston，Int.J.Peptide ProteinRes.1991，37，544–51；Mullersman，J.E.and J.F.Preston，Biochem Cell Biol，1991.69(7)：418-27；J.Anderl，H.Echner，H.Faulstich，Beilstein J.Org.Chem.2012，8，2072–84；Moldenhauer，G.，等，J.Natl.Cancer Inst.2012，104，622–34；A.Moshnikova，等；Biochemistry 2013，52，1171–8；Zhao，L.，等.，Chembiochem，2015.16(10)：1420-5；Zhou，B.，等.，Biosens Bioelectron，2015.68：189-96；WO2014/043403，US20150218220，EP1661584)。我们一直在研究毒伞肽。应用在本发明申请中的毒伞肽的实例优选以下Am01，Am02和Am03结构：
或一种或多种化学元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；其中X1，和Y1独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH2、CHNH、CH2O、C(O)NHNHC(O)和C(O)NR1；R7、R8、和R9独立地为H、OH、OR1、NH2、NHR1、C1-C6烷基、或缺省；Y2是O、O2、NR1、NH、或缺省；R10是CH2、O、NH、NR1、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O、OC(O)O、C(O)、OC(O)、OC(O)(NR1)、(NR1)C(O)(NR1)、C(O)R1或缺省；R11是OH、NH2、NHR1、NHNH2、NHNHCOOH、O-R1-COOH、NH-R1-COOH、NH-(Aa)rCOOH、O(CH2CH2O)pCH2CH2OH、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NR1R2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-COOH、NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH-Ar-COOH、NH-Ar-NH2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-NHSO3H、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H、R1-NHSO3H、NH-R1-NHSO3H、O(CH2CH2O)p-CH2CH2NHPO3H2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2、OR1、R1-NHPO3H2、R1-OPO3H2、O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2、OR1-NHPO3H2、NH-R1-NHPO3H2、或NH(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2、其中(Aa)r指1-8个氨基酸；n和m1独立地为1-20；p是1-5000；R1、R2和Ar的定义在本专利申请中前后相同；的定义如前文所述。
Spliceostatins和pladienolides是抗肿瘤化合物，它们与剪接体SF3b相互作用，抑制剪接。Spliceostatin的例子包括但不限于spliceostatin A、FR901464和(2S，3Z)-5-{[(2R，3R，5S，6S)-6-{(2E，4E)-5-[(3R，4R，5R，7S)-7-(2-肼基-2-氧乙基)-4-羟基-1，6-二氧杂吡啶[2.5]辛-5-基]-3-五甲基-2，4-二烯-1-基-l}-2，5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧基-3-烯-2-基醋酸酯，其母核结构如下：
Pladienolide的示例包括但不限于Pladienolide B、Pladienolide D和E7107。
蛋白激酶抑制剂可以抑制催化类抗体上丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸残基磷酸化的激酶的活性，并调节蛋白质的功能。蛋白激酶抑制剂可用于治疗由于过度活跃的蛋白激酶(包括突变或过表达的激酶)引起的癌症，或调节细胞功能以克服其他疾病驱动因素。蛋白质激酶抑制剂优选Adavosertib、阿法替尼、阿昔替尼、巴非替尼、博舒替尼、柯美替尼、克唑替尼、卡波替尼、达沙替尼、恩曲替尼、厄达非替尼、厄洛替尼、福他替尼、吉非替尼、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、莫比替尼、尼洛替尼、帕唑帕尼、帕那替尼、波纳替尼、Rebastinib、瑞戈非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、SU6656、托法替尼、凡德替尼、维罗非尼、恩曲替尼、帕博西、Ribociclib、阿贝西利、达可替尼、来那替尼、(CO-1686)、奥希替尼、AZD3759、纳扎替尼(EGF816)，具有下示结构，PK01～PK40：
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其中Z5和Z5’独立地选自O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)和C(O)NR1。
MEK抑制剂可抑制在某些癌症中过度活跃的丝裂原活化蛋白激酶MEK1和/或MEK2。MEK抑制剂特别适用于治疗BRAF突变的黑色素瘤和KRAS/BRAF突变的结肠直肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。MEK抑制剂选自PD0325901、塞鲁替尼(AZD6244)、cobimetinib(XL518)、瑞法替尼、曲美替尼(GSK1120212)、pimasertib、比美替尼(MEK162)、AZD8330、RO4987655、RO5126766、WX-554、E6201、GDC-0623、PD-325901和TAK-733。优选的MEK抑制剂为曲美替尼(GSK1120212)、考美替尼(XL518)、比尼替尼(MEK162)、塞鲁替尼，结构如下：
其中Z5选自O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)和C(O)NR1。
用作偶联物有效载荷的蛋白酶抑制剂优选自：卡非佐米、克林霉素、瑞他莫林、Indibulin，结构如下所示：
免疫毒素是一种大分子药物，通常是由细菌或植物蛋白衍生的细胞毒蛋白，如白喉毒素(DT)、霍乱毒素(CT)、天花粉蛋白(TCS)、淀粉酶、假单胞菌外毒素A(ETA)、红原毒素、白喉毒素、AB毒素、III型外毒素等。它也可能是一种剧毒的细菌成孔原毒素，需要蛋白水解处理才能激活。这种原毒素的一个例子是前溶氧素及其基因修饰形式topalysin。Topalysin是一种修饰的重组蛋白，经过工程设计，可以被前列腺中的一种酶选择性激活，从而在不损伤邻近组织和神经的情况下导致局部细胞死亡和组织破坏。本发明中的免疫毒素优选地通过本发明中的方法，与具有游离氨基、巯基或羧酸基的氨基酸结合；并且更优选地与N-末端氨基酸结合。
此外，细胞受体激动剂、细胞刺激分子或细胞内信号分子也可以作为药物通过本发明的方法偶联。细胞结合配体或受体激动剂选自：叶酸衍生物、谷氨酸脲衍生物、生长抑素及其类似物(选自奥曲肽(Sandostatin)和兰瑞肽(Somatuline))、芳基磺胺、垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)(PAC1)、血管活性肠肽(VIP/PACAP)(VPAC1，VPAC2)、黑色素细胞刺激激素(α-MSH)、胆囊收缩素(CCK)/胃泌素受体激动剂、铃蟾素(选自Pyr-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)/胃泌素释放肽(GRP)。神经降压素受体配体(NTR1，NTR2，NTR3)；物质P(NK1受体)配体；神经肽Y(Y1–Y6)；归巢肽包括RGD(Arg-Gly-Asp)，NGR(Asn-Gly-Arg)，二聚体和多聚体环状RGD肽(选自cRGDfV)，TAASGVRSMH和LTLRWVGLMS(硫酸软骨素蛋白聚糖NG2受体配体)和F3肽；细胞穿透肽(CPPs)；肽激素选自促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂和拮抗剂，以及促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂，通过靶向卵泡刺激素(FSH)促黄体激素(LH)，以及睾酮产生而作用，如布舍瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OtBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt)，戈那瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，戈舍瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OtBu)-Leu-Arg-Pro-AzGly-NH2)，组氨瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(N-benzyl)-Leu-Arg-Pro-NHEt)，亮丙瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt)，那法瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-2Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，曲普瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，纳法瑞林、地洛林、阿贝瑞林(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-(N-Me)Tyr-D-Asn-Leu-异丙基Lys-Pro-DAla-NH2)，西曲瑞克(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2)，地加瑞克(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-4-aminoPhe(L-hydroorotyl)-D-4-aminoPhe(carba-moyl)-Leu-异丙基Lys-Pro-D-Ala-NH2)，和地加瑞克(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-Tyr-D-(N9，N10-diethyl)-homoArg-Leu-(N9，N10-diethyl)-homoArg-Pro-D-Ala-NH2)；模式识别受体(PRRs)，选自类Toll受体(TLRs)配体，C型凝集素和结节状的受体(NLRs)配体；降钙素受体激动剂；整合素受体及其受体子类(选自αVβ1、αVβ3、αVβ5、αVβ6、α6β4、α7β1、αLβ2、αIIbβ3)激动剂(选自GRGDSPK，cyclo(RGDfV)(L1)及其衍生物[环状(-N(Me)R-GDfV)，环状(R-Sar-DfV)，环状(RG-N(Me)D-fV)，环状(RGD-N(Me)f-V)，环状(RGDf-N(Me)V-)(西仑吉肽)]；Anticalin(脂质运载蛋白的衍生物)；Adnectins(10个FN3(纤连蛋白))；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)；Avimers；EGF受体，或VEGF受体激动剂。
细胞结合分子/配体或细胞受体激动剂选自LB01(叶酸)、LB02(PMSA配体)、LB03(PMSA配体)、LB04(PMSA配体)、LB05(生长抑制素)、LB06(生长抑制素)、LB07(奥曲肽、生长抑制素类似物)、LB08(兰瑞肽、生长抑制素类似物)、LB09(伐普肽(Sanvar)、生长抑制素类似物)、LB10(CAIX配体)、LB11(CAIX配体)、LB12(胃泌素释放肽受体(GRPr)、MBA)、LB13(促黄体激素释放激素(LH-RH)和GnRH配体)、LB14(促黄体激素释放激素(LH-RH)和GnRH配体)、LB15(GnRH拮抗剂、Abarelix)、LB16(钴胺素、维生素B12类似物)、LB17(钴胺素、维生素B12类似物)、LB18(用于αvβ3整联蛋白受体、环状RGD五肽)、LB19(VEGF受体的异二价肽配体)、LB20(神经髓质素B)、LB21(蛙皮素，作用于G蛋白偶联受体)、LB22(TLR2，作用于类Toll受体)、LB23(作用于雄性激素受体)、LB24(西仑吉肽或环(-RGDfV-)αv整合素受体、LB23(氟可的松)、LB25(利福布汀类似物)、LB26(利福布汀类似物)、LB27(利福布汀类似物)、LB28(氟氢可的松)、LB29(地塞米松)、LB30(丙酸氟替卡松)、LB31(丙酸倍氯米松)、LB32(醋酸曲安奈德)、LB33(泼尼松龙)、LB34(泼尼松龙)、LB35(甲基强的松龙)、LB36(倍他米松)、LB37(伊立替康类似物)、LB38(克唑替尼类似物)、LB39(硼替佐米类似物)、LB40(卡菲佐米类似物)、LB41(卡非佐米类似物)、LB42(亮丙瑞林类似物)、LB43(曲普瑞林类似物)、LB44(克林霉素)、LB45(利拉鲁肽类似物)、LB46(半长春新碱类似物)、LB47(瑞他帕林类似物)、LB48(丁布尔类似物)、LB49(长春碱类似物)、LB50(利西森肽类似物)、LB51(奥西丁尼类似物)、LB52(核苷类似物)、LB53(厄洛替尼类似物)和LB54(拉帕替尼类似物)，其结构如下所示：
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其中X4、和Y1独立地为O、NH、NHNH、NR1、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH2、C(O)NHNHC(O)和C(O)NR1。
在另一个实施例中，一种，两种或更多种DNA、RNA、mRNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和PIWI相互作用RNA(piRNA)作为药物，通过本发明的方法偶联：
其中是连接本专利的支链连接子的位点；/>是单链或双链的DNA、RNA、mRNA、siRNA、miRNA、或piRNA；X1、和Y独立地为O、NH、NHNH、NR1、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH2、C(O)NHNHC(O)和C(O)NR1。
在一些实施例中，本发明方法中步骤(c)中(在偶联反应步骤之后)加入氧化剂，优选为脱氢抗坏血酸(DHAA)，以再次氧化未反应的巯基，从而将使抗体或类抗体蛋白中的二硫键重构，使抗体具有更长的半衰期。反应溶液中氧化剂的浓度可以是0.01mM-1.0mM。
除了在本发明方法中加入DHAA以外，也可以在步骤(c)中加入过量的二硫化合物如胱氨酸来替代DHAA。因此，二硫化合物可以被过量的还原剂，例如步骤(b)中的TCEP还原，形成巯基化合物，该巯基化合物同时与过量的含有巯基反应基团的连接子或连接子/有效负载复合物(例如马来酰亚胺)反应，生成的巯基-琥珀酰亚胺连接子/有效负载复合物随后通过色谱法被去除。
在一些实施例中，在本发明的偶联过程中，在抗体或类抗体蛋白中引入特定巯基(在本发明的偶联方法下，当抗体或类抗体蛋白是IgG抗体时，很可能仅重-轻链之间的二硫键被还原，产生巯基)，然后巯基在偶联过程中同时或依次与式(I)、(II)或(III)中的结构反应，形成如下所示式(V)、(VI)或(VII)中的偶联物：
其中n是1–20；n’是1-10；优选地n是1-8和n’是1-4；更优选地n是2-4且n’是1-2；D1、D2、L1、L2和E1如前文所述；S(硫)由类抗体蛋白质(例如抗体)中二硫键，在本发明的方法下被还原而产生；mAb是一种类抗体蛋白；其中Lv1'和Lv2'独立地是mAb中的巯基与前文所述的Lv1和Lv2反应得到的基团。Lv1’和Lv2’独立具有以下结构：
其中X2’和R3定义与前文相同。
在式(VI)和式(VII)中，片段和/>独立地选自：/>/>
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其中R1、R2、X2的定义同前文所述；mAb是类抗体蛋白，优选抗体。优选地，当类抗体蛋白是抗体时，偶联特异性地在抗体的重轻链之间的巯基上进行。
在一些实施例中，根据本专利发明的方法，其中具有下述式(VIII)、(IX)或(X)的连接子可以先与抗体或类抗体蛋白中的巯基(当抗体或类抗体蛋白是IgG抗体时，通常是重轻链之间的巯基)选择性还原，然后与细胞毒性药物或细胞毒性药物/连接子复合物缩合，形成如式(V)、(VI)或(VII)的偶联物：
其中L1、L2、E1、Lv1和Lv2与式(I)，(II)和(III)中的定义相同；其中Lv5和Lv6独立地选自：
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其中X1’是F、Cl、Br、I、OTs(甲苯磺酸酯)、OTf(三氟甲磺酸酯)、OMs(甲磺酸酯)、OC6H4(NO2)、OC6H3(NO2)2、OC6F5、OC6HF4或Lv3；X2’是O、NH、N(R1)或CH2；R3和R5独立地为H、R1、芳香基、杂芳基或其中一个或多个H原子独立地被-R1、-卤素、-OR1、-SR1、-NR1R2、-NO2、-S(O)R1、-S(O)2R1、或-COOR1取代的芳香基团；Lv3和Lv3’为离去基团，独立地选自F、Cl、Br、I、硝基苯氧基、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、苯氧基、苯巯基、二硝基苯氧基、五氟苯氧基、四氟苯氧基、二氟苯氧基、一氟苯氧基、五氯苯氧基、三氟甲磺酸酯、咪唑、二氯苯氧基、四氯苯氧基、1-羟基苯并三唑、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、2-乙基-5-苯基异恶唑鎓-3'-磺酸酯，自身形成的酸酐，或与其他酸酐形成的酸酐，例如乙酸酐、甲酸酐、或肽偶联反应或与Mitsunobu反应的缩合试剂反应产生的中间分子；其中官能团Lv5和/或Lv6也可以与细胞毒性药物中的巯基反应，只要其反应速率比Lv1或Lv2与类抗体蛋白，特别如抗体中的巯基速率快或慢至少一倍。
在一些实施例中，在本发明的偶联过程中，在抗体或类抗体蛋白中引入特定巯基(在本发明的偶联方法下，当抗体或类抗体蛋白是IgG抗体时，很可能仅重-轻链之间的二硫键被还原，产生巯基)，然后巯基在偶联过程中同时或依次与上述式(VIII)、(IX)或(X)的连接子反应，形成以下式(XI)、(XII)或(XIII)的类抗体蛋白/连接子复合分子，然后与细胞毒性药物D1或D2独立地反应，形成如式(V)、(VI)或(VII)的偶联物。
其中Lv5、Lv6、L1、L2、E1、Lv1’Lv2’、mAb、n和n’定义如前文所述。
在一些实施例中，根据本发明的方法，其中上述式(VIII)、(IX)或(X)的连接子可以首先与细胞毒性药物反应形成如式(I)、(II)或(III)的细胞毒性药物/连接子复合物分子，然后根据本发明的方法与抗体或类抗体蛋白中的被还原产生的巯基独立地反应，形成如式(V)、(VI)或(VII)的偶联物。式(VIII)、(IX)或(X)中的结构与细胞毒性药物的第一步缩合反应可以在单独的容器中进行，得到如式(I)、(II)或(II)的细胞毒药物/连接子复合物分子，任选地，在与类抗体蛋白中的巯基偶联之前可以通过层析、萃取或沉淀进行纯化。优选地，类抗体蛋白中二硫键特异性还原和与式(I)、(II)或(III)进行偶联反应在同一锅中进行，中间体不分离。
为了区分Lv5和/或Lv6与细胞毒性药物之间的反应，以及Lv1和/或Lv2与类抗体蛋白中的巯基之间的反应，式(VIII)、(IX)或(X)中的连接子参与的反应可以在独立或不同的反应容器中进行。例如，含有氨基的药物可以在缩合试剂，如EDC、TBTU或BrOP的存在下与连接子中的羧酸基团发生缩合，得到带有酰胺键的如式(I)、(II)或(III)，经修饰的药物/连接子复合物。该缩合反应可以在生理缓冲溶液中进行，其中式(VIII)、(IX)或(X)连接子一端的羧酸基团被N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)、五氟苯基、二硝基苯基酯，或羧酰氯等基团活化，再与带有氨基的药物反应，以产生如式(I)、(II)或III)的药物/连接子复合物，应用本申请的方法，随后或同步与类抗体蛋白质上的巯基偶联，形成如式(V)、(VI)或(VII)的偶联物。
在另一个实施例中，式(VIII)、(IX)或(X)的连接子的一个末端带有巯基反应性基团(例如马来酰亚胺基、乙烯基磺酰基、卤代乙酰基、丙烯酸基、取代丙炔基)，另一个末端带有可与药物反应的基团(例如羟基琥珀酰亚胺基(NHS)、五氟苯基、二硝基苯基酯、氨基、烷氧基氨基，或可进行点击化学反应的基团(例如叠氮化物、炔烃、二苯并环辛基、BCN((1R，8S，9s)-双环[6.1.0]九-4-炔-9-基甲醇))。应用本申请的方法，在pH 4.5-7.5、2℃–40℃(优选2℃-8℃)的缓冲溶液中，在加入或不加入0～30％可与水混合(可混溶)的有机溶剂的情况下，与类抗体蛋白质(优选抗体)的巯基偶联，以独立地得到如式(XI)，(XII)或(XIII)的类抗体蛋白质-连接子偶联物。然后，将带有能与式(XI)、(XII)或(XIII)上的反应性基团反应的药物，依次或同时加入到反应溶液中，得到如式(V)、(VI)或(VII)的偶联物。任选地，可以在第二步，与药物进行缩合之前，纯化如式(XI)、(XII)或(XIII)的类抗体蛋白-连接子偶联物，并且可以改变缩合条件，例如将pH调节至6.5-8.0，和/或将温度调节至20-45℃。
在一些实施例中，在本发明的偶联工艺中，在与药物偶联之前，类抗体蛋白可以通过连接如式(XI)、(XII)或(XIII)的异源双功能交联剂来修饰，例如用胺至巯基(琥珀酰亚胺基(NHS)酯/马来酰亚胺、NHS酯/吡啶基二巯基、NHS酯/卤乙酰基)，二氮杂嘧啶(SDA)至巯基、叠氮基至巯基、炔基至巯基、巯基至糖(马来酰亚胺/酰肼、吡啶基二硫酚/酰肼、卤代乙酰基/酰肼)、羟基至巯基(异氰酸酯/马来酰亚胺)、巯基至DNA(马来酰亚胺/psoralen、吡啶基二硫酚/psoralen、卤代乙酰基/psoralen)、巯基至羧基(碳二亚胺)的连接子。
药物/细胞毒性剂的反应基团以不同的方式，与如式(XI)、(XII)或(XIII)的经修饰的抗体-连接子偶联物反应，制得最终偶联物。例如，通过二硫键连接的偶联物，第一步，如式(VIII)、(IX)或(X)的连接子，应用本发明的类抗体蛋白的还原和偶联方法，在2℃-8℃，pH 4.5-6.0下与类抗体蛋白偶联，随后在20℃-40℃，pH 6.5–8.0下，含有游离巯基的药物和连接于修饰的类抗体蛋白的连接子中的二硫键(例如吡啶基二硫部分)之间，进行二硫键交换。在加入含有游离巯基的药物之前，反应中过量的还原剂(例如TCEP或三(3-羟丙基)膦)最好能被去除。
通过硫醚连接的偶联物，首先使两个末端均含有马来酰亚胺基或卤代乙酰基或乙基磺酰基或取代的丙炔基等具有巯基反应性基团的连接子，与抗体中的巯基反应来实现，所述巯基为抗体通过本专利申请的方法，在2℃至8℃，pH 4.5至6.0下还原获得，得到如式(XI)、(XII)或(XIII)的抗体-连接子偶联物，随后与含有巯基的药物在pH 6.5至8.0下、20℃至40℃下反应，得到如式(V)、(VI)或(XIII)的偶联物。如果两步反应选择相同的pH和/或温度条件，则使用超过四倍当量的含有双末端巯基反应性基团的连接子进行偶联。应当注意，优选的二硫化物或巯基-醚连接的偶联物的合成方法，是先化学合成具有式(I)、(II)或(III)的含二硫化物或巯基-醚键的药物-连接子复合物；之后根据本发明的方法，与蛋白质(抗体)中的巯基反应。
酸不稳定腙键连接的偶联物的合成，可以应该本领域已知的方法，通过羰基与连接子中的酰肼部分的反应来实现。(例如，P.Hamann等，Cancer Res.53，3336-34，1993；B.Laguzza等，J.Med.Chem.，32；548-55，1959；P.Trail等，Cancer Res.，57；100-5，1997)。带有三唑键的偶联物的合成可以应用点击化学，通过药物的1-炔基团与连接子中的叠氮基部分反应来实现(Huisgen cycloaddition)(Lutz，J-F.等，2008，Adv.Drug Del.Rev.60，958–70；Sletten，E.M.等2011，AccChem.Research44，666–76)。肟连接的偶联物的合成是通过含有酮或醛的修饰类抗体蛋白与含有氧胺基的药物反应实现的。带有羟基或巯基的药物可以与如式(XI)、(XII)或(XIII)的，带有卤素的改性连接子，特别是羧酸酯的α卤化物，在温和的碱存在，如pH 8.0～9.5条件下反应，得到如式(I)，(II)，或(III)的，带有醚或巯基醚键的改性药物/连接子复合物。在脱水剂如EDC或DCC的存在下，含有羟基的药物可以与如式(XI)、(XII)或(XIII)的带有羧基的连接子缩合，得到酯键，然后应用本发明的方法，使药物/连接子复合物与类抗体蛋白发生偶联。含有氨基的药物可以与如式(VIII)或(XI)，类抗体蛋白连接子上的羧酸NHS酯、咪唑、硝基苯氧基；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；甲基磺酰基苯氧基；二硝基苯氧基；五氟苯氧基；四氟苯氧基；二氟苯氧基；单氟苯氧基；五氯苯氧基；三氟甲磺酸酯；咪唑；二氯苯氧基；四氯苯氧基；1-羟基苯并三唑；甲苯磺酸酯；甲磺酸酯；2-乙基-5-苯基异噁唑-3′-磺酸酯，进行反应，通过酰胺键形成偶联物。
在进一步的实施例中，在本专利发明的方法下，所得式(V)、(VI)、或(VII)的偶联物与抗体的重-轻链之间的半胱氨酸位点的连接超过75％，与抗体的重-重链之间的半胱氨酸位点(铰链区)的连接少于15％。通常，对于式(V)或(VII)，当药物/抗体比(DAR)为4时，抗体中药物数量的百分比分布为：D0<1％、D2<10％、D4>75％、D6<10％、D8<10％；对于式(VI)、当药物/抗体比(DAR)为4时，抗体中药物数量的百分比分布为：D0<1％，D1<10％，D2>75％，D3<10％，D4<10％。
可通过标准生化手段纯化所得偶联物，如Sephadex G25或Sephacryl S300柱凝胶过滤、吸附色谱、离子(阳离子或阴离子)交换色谱或透析(超滤(UF)和渗滤(DF))。在一些情况下，与小分子药物偶联的类抗体蛋白小分子(如<10KD)可通过色谱法纯化，如HPLC、中压柱色谱法或离子交换色谱法。
通常，式(V)，(VI)，或(VII)的偶联物优选地由式(I)、(XII)或(XIII)的药物/连接子复合物在一锅反应中制备。当类抗体蛋白还原生成的巯基与式(I)、(XII)或(XIII)的药物/接头复合物末端的巯基反应性基团反应时，可以使用Ellman试剂，测量反应过程中游离巯基的数量，进而监测二硫键的还原和巯基的偶联。可使用波长范围为190-390nm，优选240-380nm，更优选240-330nm的紫外光谱来监测偶联反应。因此，可以在控制温度环境下，在石英比色皿或Pyrex管中进行和监测偶联反应。偶联物的药物/蛋白质(抗体)比(DAR)也可通过药物和蛋白在240-380nm波长范围内的吸光度，计算浓度而获得，或者通过测量每种药物/蛋白质片段的疏水相互作用色谱(HIC-HPLC)积分面积而获得，或者通过毛细管电泳(CE)，和/或LC-MS或LC-MS/MS或CE-MS(液相色谱(LC)或CE与质谱(MS)联用，测量每种药物/蛋白质片段LC或CE积分面积和MS峰强度)。还应注意，本发明的偶联方法中，当药物或药物/连接子复合物在水基缓冲溶液中的溶解性不好时，可加入最多30％的可与水混合(混溶)的有机溶剂，例如DMA、DMF、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、异丙醇、二恶烷、丙二醇或乙二醇，作为在水基缓冲溶液中的共溶剂。
类抗体蛋白修饰反应的水溶液缓冲体系的pH在4和9之间，优选在6.0和7.5之间，并且可以包含任何在这些pH范围可用的非亲核性缓冲盐。典型的缓冲液包括磷酸盐、乙酸盐、三乙醇胺盐酸、HEPES和MOPS缓冲液，其中可含有其他组分，如环糊精、蔗糖和盐，例如NaCl和KCl。本专利申请的定义部分列出了可用于偶联过程的其他生物缓冲液。反应进程可以通过测量在特定紫外波长(如254nm)或其他合适波长下的吸光度减少量，或在特定紫外波长(如280nm)或其他合适波长下吸光度增加量。反应完成后，经修饰的细胞结合类抗体蛋白的分离可以用常规方式进行，例如使用凝胶过滤色谱法或吸附色谱法。
当使用二硫化物交换反应修饰类抗体蛋白时，可通过测量通过释放的硝基吡啶硫酮、二硝基吡啶二硫酮、吡啶硫酮、羧基氨基吡啶二硫酮或二羧基氨基吡啶二硫酮基团的紫外光谱吸光度来评估修饰进行的程度。若不含发色基团，可通过LC-MS(优选UPLC-QTOF质谱)，或毛细管电泳-质谱(CE-MS))监测修饰或偶联反应。连接子化合物可与具有合适取代基的药物，优选细胞毒性剂，发生反应。例如，带有氨基或羟基取代基的经修饰类抗体蛋白，可以与带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的药物反应，带有巯基取代基的经修饰类抗体蛋白，可以与带有马来酰亚胺基或卤乙酰基的药物反应。此外，带有羰基(酮或醛)取代基的经修饰类抗体蛋白，可以与带有酰肼或烷氧基胺的药物反应。本领域技术人员可以根据连接子上可用官能团的反应活性，容易地确定使用哪种连接子。
通过本发明的方法制备的如式(V)、(VI)、和(VII)的偶联物，超过80％的药物在抗体的重-轻链之间的半胱氨酸连接，示例如下：
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或一种或多种元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中p、p1、p2、和p3独立地为0-100；m、m1、和m2独立地为0-20；n是1-10；
P1是H、OH、NH2、COOH、C(O)NH2、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、OPO(OR18)2、NHPO(OR18)2、OC(O)R18、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC(O)NHR18、OC(O)N(C2H4)2NCH3、OSO2(OR18)、O-(C4-C12-糖苷)、OC(O)N(C2H4)2CH2N(C2H4)2CH3、O-(C1-C8直链或支链烷基)、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸脂(-C(O)OR17)，氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R17和R18独立地为H、链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；
R1、R2、R3、R1’、R2’、R3’、和R4独立地为H、C1～C8烷基；C2～C8杂烷基、或杂环；C3～C8芳基、芳基烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂烷基环烷基、碳环或烷基羰基；或R1R2、R1R3、R2R3、R3R4、R1’R2’、R1’R3’、或R2’R3’形成3～7元碳环、环烷基、杂环、杂环烷基、芳香基或杂芳香基环系；
R4、R5、R5’、和R6，独立地为H、C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺、或(Ar)r、r＝1-6(氨基酸或具有相同或不同氨基酸序列的肽)；
R7、R8、和R9独立地为H、OH、OR1、NH2、NHR1、C1-C6烷基、或缺省；
R10是CH2、O、NH、NR1、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O、OC(O)O、C(O)、OC(O)、OC(O)(NR1)、(NR1)C(O)(NR1)、C(O)R1或缺省；
R11是OH、NH2、NHR1、NHNH2、NHNHCOOH、O-R1-COOH、NH-R1-COOH、NH-(Aa)rCOOH、O(CH2CH2O)pCH2CH2OH、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NR1R2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-COOH、NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH-Ar-COOH、NH-Ar-NH2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-NHSO3H、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H、R1-NHSO3H、NH-R1-NHSO3H、O(CH2CH2O)p-CH2CH2NHPO3H2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2、OR1、R1-NHPO3H2、R1-OPO3H2、O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2、OR1-NHPO3H2、NH-R1-NHPO3H2、或NH(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2、其中(Aa)r是1-8个氨基酸；n和m1独立地为1-20；p是1-1000；R1、R2和Ar，的定义如本申请中前文所述；定义同上；
R12和R12’独立地为H、＝O、OR1、NH2、NH(CH3)、NHNH2、COOH、SH、OZ3、SZ3、F、Cl、或C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺；
R25、R26和R25’独立地为H、Ac、R1、C(O)NHR1、C(O)R1、R1COOH、R1COOR2、R1OR2、R1CONHR2、CH2OAc、CH2NHAc、R1NH2、NR1R2、N+R1R2R3、CH2CONH(CH2)q1COOH、CH2CONH(CH2)q1COOR1、CH2CONH(CH2)q1N+R1R2R3、或(Aa)r；
X1、X2、X4、Y1和Y2，当与位点连接，独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、CH2、CHNH、CH2O、C(O)NHNHC(O)、OCH2C6H4NH、NHCH2C6H4NH、SCH2C6H4NH和C(O)NR1；当未与/>位点连接，为OH、NH2、NHNH2、NHR1、SH、C(O)OH、C(O)NH2、OC(O)NH2、OC(O)OH、NHC(O)NH2、NHC(O)SH、OC(O)NH(R1)、N(R1)C(O)NH(R2)、C(O)NHNHC(O)OH和C(O)NHR1；另外，当与S连接时Y2可以是O、O2、NR1、NH、或缺省；
X3和Y3独立地为N、NH、CH、CH2或CR1，或X3和Y3之一可以缺省；其中R1是C1-C8直链或支链烷基、杂烷基；C3-C8芳基、杂芳基、烷基环烷基、酰氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、烷基芳基氨基、烷基芳基巯基；(Ar)r、r＝1-6(氨基酸或具有相同或不同氨基酸序列的肽)；
X3是H、CH3或X1’R1’、其中X1’是NH、N(CH3)、NHNH、O、或S；且R1’是H、C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺；
Z3’是H、COOR1、NH2、NHR1、OR1、CONHR1、NHCOR1、OCOR1、OP(O)(OM1)(OM2)、OCH2OP(O)(OM1)(OM2)、OSO3M1、R1、或O-糖苷(葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、葡糖醛酸苷/葡糖苷酸、阿洛苷、果糖苷等)、NH-糖苷、S-糖苷或CH2-糖苷；M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4、NR1R2R3；
Z3是H、OP(O)(OM1)(OM2)、OCH2OP(O)(OM1)(OM2)、OSO3M1、PO(OM1)(OM2)、SO3M1、CH2PO(OM1)(OM2)、CH3N(CH2CH2)2NC(O)-、O(CH2CH2)2NC(O)-、R1、或O-糖苷(葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、葡糖醛酸苷/葡糖苷酸、阿洛苷、果糖苷等)、NH-糖苷、S-糖苷或CH2-糖苷；M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4、NR1R2R3；
X5是F、Cl、Br、I、OH、OR1、R1、OPO3H2、OSO3H、NHR1、OCOR1、NHCOR1、CN或OCH2OP(O)(OM1)(OM2)；
Y5是NH、NHNH、NR1、O、OCH2C6H4NH、NHCH2C6H4NH、SCH2C6H4NH、R1、(Ar)r，r＝1-6(具有相同或不同氨基酸序列的氨基酸或肽)；
X6和Y6独立地为CH、C(O)、N、P(O)NH、P(O)NR1、CHC(O)NH、C1-C8直链或支链烷基、或杂烷基；C3-C8芳基、杂芳基、烷基环烷基、酰氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、烷基芳基氨基或Aa(氨基酸、优选自Lys、Phe、Asp、Glu、Ser、Thr、His、Cys、Tyr、Trp、Gln、Asn、Arg)；
Z5和Z5’独立地选自O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；
X8是O、S、NH、NHNH、NHR1、SR12、SSR12、SSCH(CH3)R1、SSC(CH3)2R1、或R1；
其中R1、R2和R3独立地为H、C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺；
Lv1是同前文定义的离去基团。优选地Lv1为F、Cl、Br、I、OTs、OMS、OC6H3(NO2)2、OC6F5、OC6H4(NO2)、OC6Cl5；
M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4、NR1R2R3；的定义与前文相同。
优选的如式(I)、(II)和(III)的药物/连接子复合物，应用本发明的方法，超过80％的总药物在重-轻链之间的半胱氨酸连接，结构如下图所示：
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或一种或多种元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；其中m、m1、m2、n、P1、R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12、R12’、R25、R26、R25’、X1、X2、X3、X5、X6、Y1、Y2、Y6、Z3、Z5、p、p1、p2、p3、q1、q2、Lv1、Aa、(Aa)r、Ar和mAb的定义同前文一致。
类抗体蛋白
用于偶联的类抗体蛋白优选是一种细胞结合类抗体蛋白分子，能够与具有治疗意义或者能被生物学修饰的细胞群体结合、形成复合物或反应。
为方便本节和其他地方的讨论，“类抗体蛋白”应理解为包括“类抗体蛋白和肽”，除非上下文另有说明。可以应用于本发明申请的偶联物的类抗体蛋白，包括比如肽、多肽、抗体、抗体片段、酶、细胞因子、趋化因子、受体、血液因子、肽激素、毒素、转录类抗体蛋白或多聚体类抗体蛋白，它们在结构上具有链间二硫键。
酶包括糖特异性酶、蛋白水解酶等，例如美国专利4179337中公开的氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。值得注意的特定酶包括天冬酰胺酶、精氨酸酶、腺苷脱氨酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、胆红素氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖醛酸苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酯酶和谷氨酰胺酶。
血液类抗体蛋白包括白蛋白、转铁蛋白、因子VII、因子VII或因子IX、血管性血友病因子、胰岛素、促肾上腺皮质激素、胰高血糖素、生长抑素、生长激素、胸腺素、甲状旁腺激素、色素激素、生长调节素、红细胞生成素、促黄体生成素、下丘脑释放因子、抗利尿激素、催乳素、白细胞介素、干扰素，例如IFN-α。或IFN-β、集落刺激因子、血红蛋白、细胞因子、抗体、抗体片段、绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲状腺激素和组织纤溶酶原激活剂。
其他值得关注的类抗体蛋白是Dreborg等在Crit.Rev.Therap.Drug CarrierSyst.(1990)6 315-365公开的过敏原类抗体蛋白，其当与聚合物如聚(烯化氧)偶联时具有降低过敏性的作用，因此适合用作耐受性诱导剂。公开的过敏原中有豚草抗原E、蜜蜂毒液、螨过敏原等。
值得关注的还有糖多肽如免疫球蛋白、卵清蛋白、脂肪酶、葡糖脑苷脂酶、凝集素、组织纤溶酶原激活剂和糖基化白细胞介素、干扰素和集落刺激因子，免疫球蛋白如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段。特别值得关注的是用于临床医学的诊断和治疗目的受体和配体结合类抗体蛋白，以及抗体和抗体片段。
本专利申请中优选的类抗体蛋白为：(A)由抗体、类抗体蛋白分子、前抗体、纳米抗体、肽、包被在聚合物胶束上的抗体、抗体-脂质体、基于脂蛋白的药物载体、包被在纳米颗粒上的抗体、抗体-树枝状聚合物、以及包被或连接有类抗体蛋白(抗体)的上述颗粒，或上述物质的组合；
(B)类抗体蛋白、全长抗体(多克隆抗体、单克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体))、单链抗体、结合靶细胞的抗体片段、单克隆抗体、单链单克隆抗体、结合靶细胞的单克隆抗体片段、嵌合抗体、结合靶细胞的嵌合抗体片段、结构域抗体、结合靶细胞的结构域抗体片段、表面重塑抗体、表面重塑单链抗体、或结合靶细胞的表面重塑抗体片段、人源化抗体或表面重塑抗体，人源化单链抗体或与靶细胞结合的人源化抗体片段、抗独特型(抗-Id)抗体、CDR's、双抗体、三抗体、四抗体、小抗体、前抗体、前抗体片段、小免疫类抗体蛋白(SIP)、淋巴因子类抗体蛋白、激素型类抗体蛋白、生长因子类抗体蛋白、集落刺激因子类抗体蛋白、营养转运类抗体蛋白、大分子量类抗体蛋白、融合类抗体蛋白、激酶抑制剂类抗体蛋白、基因靶向类抗体蛋白，包被在纳米颗粒上的类抗体蛋白，或抗体或大分子量类抗体蛋白修饰的高分子。
抗体片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv(Parham、J.Immunol.1983，131，2895-2902)；由Fab表达库产生的片段，上述任何抗体的表位结合片段，能免疫特异性结合癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原；由免疫系统产生的类抗体蛋白质，能够识别、结合特定抗原或具有期望的生物学活性(Miller等J.of Immunology 2003，170，4854-4861)；干扰素(如I、II、III型)；多肽；淋巴因子如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、GM-CSF、干扰素-γ(IFN-γ)；激素例如胰岛素、TRH(促甲状腺激素释放激素)、MSH(促黑素细胞激素)、类固醇激素如雄激素和雌激素；生长因子和集落刺激因子、如表皮生长因子(EGF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、转化生长因子(TGF)如TGFα、TGFβ、胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、G-CSF、M-CSF和GM-CSF(Burgess，Immunology Today 1984，5，155-158)、牛痘生长因子(VGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、小分子量的蛋白质、多肽、肽和肽激素，如铃蟾肽，胃泌素，胃泌素释放肽、血小板衍生的生长因子、白细胞介素和细胞因子，例如，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-6(IL-6)，白血病抑制因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；维生素，如叶酸；脱辅基蛋白和糖蛋白，如转铁蛋白(O'Keefe等，J.Biol.Chem.1985260 932-937)；糖结合蛋白或脂蛋白，如凝集素；细胞营养传递分子；小分子抑制剂，如前列腺特异性膜抗原(PSMA)抑制剂和小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，非肽或任何其它细胞结合分子或物质，如生物活性聚合物(Dhar，等，Proc.Natl.Acad.Sci.2008，105，17356-61)，融合蛋白，激酶抑制剂，基因靶向剂，生物活性树枝状大分子(Lee，等，Nat.Biotechnol.2005，23，1517-26；Almutairi，等；Proc.Natl.Acad.Sci.2009，106，685-90)，纳米粒子(Liong，等，ACS Nano，2008，19，1309-12；Medarova，等，Nat.Med.2007，13，372-7；Javier，等，Bioconjugate Chem.2008，19，1309-12)，脂质体(Medinai，等，Curr.Phar.Des.2004，10，2981-9)和病毒外壳(Flenniken，等，VirusesNanotechnol.2009，327，71-93)。
一般而言，如果适当的单克隆抗体是可用的，则优选单克隆抗体作为细胞表面结合剂。抗体可以是鼠源，人源，人源化，嵌合或源于其他物种。
用于本发明中的抗体的生产包括体内或体外方法或其组合。生产多克隆抗受体肽抗体的方法在本领域是公知的，例如美国专利4，493，795中所述。通常是通过将骨髓瘤细胞，与已经用所需抗原免疫的小鼠的脾细胞融合，来制备单克隆抗体(G.；Milstein，C.Nature 1975，256：495-497)。详细的过程在“Antibodies--A Laboratory Manual，Harlow and Lane，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1988)”中有描述，此处引作参考。具体地，可以用目标抗原，如从靶细胞、完整的病毒、灭活的全病毒和病毒蛋白质分离的抗原，来免疫小鼠，大鼠，仓鼠或任何其它哺乳动物而制备。通常使用聚乙二醇(PEG)6000将脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过对HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶)的敏感性来筛选融合细胞。通过它们免疫反应特异性受体的能力或抑制靶细胞上的受体活性的能力，可以确定实施本发明的单克隆抗体的杂交瘤。
用于本发明中的单克隆抗体的生产在单克隆杂交瘤培养物里进行，其中包含营养培养基和能分泌具有合适抗原特异性的抗体分子的杂交瘤。培养物在合适的条件下保持足够长的一段时间，以使杂交瘤将抗体分子分泌到培养基。然后收集含有抗体的培养基。使用通过公知的技术进一步分离抗体分子，如蛋白质A亲和层析，阴离子、阳离子、疏水或体积排阻色谱法(特别是通过蛋白质A亲和层析和体积排阻色谱法)，离心，差异溶解度或任何其他纯化蛋白质的标准技术。
可用于制备这些组合物的培养基在本领域中是公知的，并且可商业获得，也包括合成培养基。一个合成的培养基的例子是Dulbecco最少必需培养基(DMEM；Dulbecco等.，Virol.1959，8，396)补充有4.5g/ml葡萄糖，0-20mM谷氨酰胺，0-20％胎牛血清，几个ppm的Cu，Mn，Fe或Zn等重金属或/和重金属盐，以及消泡剂如聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
另外，生产抗体的细胞系也可以通过融合以外的技术来获得，例如将成瘤DNA移植至B淋巴细胞，或成瘤病毒转染，如爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV，也称为人类疱疹病毒4(HHV-4))或卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)，见于美国专利4，341，761；4，399，121；4，427，783；4，444，887；4，451，570；4，466，917；4，472，500；4，491，632；4，493，890。单克隆抗体也可以通过含末端羧基的抗受体肽或肽制备，这些都为如本领域所公知，可参考文献Niman等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80：4949-4953；Geysen等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，82：178-182；Lei等.Biochemistry 1995，34(20)：6675-6688。通常，作为产生抗受体肽单克隆抗体免疫原，抗受体肽或肽类似物可以单独使用或连接至免疫原性载体。
用作本发明中结合分子的单克隆抗体也可以通过其他本领域已知的技术获得。特别有用的是制造完整人源抗体的方法。一种方法是噬菌体显示技术，它使用亲和富集的方式，可用于选择能与抗原特异性结合的人源抗体。噬菌体展示技术在文献中也有详细描述，噬菌体展示库的构建和筛选在本领域也是众所周知的，可参考文献：Dente等，Gene.1994，148(1)：7-13；Little等，Biotechnol Adv.1994，12(3)：539-55；Clackson等.，Nature1991，352：264-628；Huse等.，Science 1989，246：1275-1281。
通过与非人如小鼠细胞融合的杂交瘤产生的单克隆抗体，可以被人源化以避免产生人类抗小鼠抗体。常见的抗体人源化方法是互补决定区移植技术，这些方法也已被详细地描述，如美国专利5，859，205和6，797，492；Liu等，Immunol Rev.2008，222：9-27；Almagro等，Front Biosci.2008，13：1619-33；Lazar等，MolImmunol.2007，44(8)：1986-98；Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.2006，103(10)：3557-62，此处引为参考。完整人抗体也可以通过用免疫原免疫携带大部分的人类球蛋白重轻链的转基因小鼠、兔子、猴子或其他哺乳动物来制备。这些老鼠的例子有：Xenomouse(Abgenix/Amgen)，HuMAb-Mouse(Medarex/BMS)和VelociMouse(Regeneron)，参考美国专利6，596，541，6，207，418，6，150，584，6，111，166，6，075，181，5，922，545，5，661，016，5，545，806，5，436，149和5，569，825。用于人类治疗时，小鼠的可变区域和人的恒定区域也可以被融合，成为“嵌合抗体”，它在人类身上的免疫原性显著低于小鼠单抗(Kipriyanov等，MolBiotechnol.2004，26：39-60；Houdebine，CurrOpinBiotechnol.2002，13：625-9)。另外，在抗体可变区域的定点诱变能导致抗体具有较高的亲和性和特异性(Brannigan等，Nat Rev Mol Cell Biol.2002，3：964-70；Adams等，J Immunol Methods.1999，231：249-60)，抗体恒定区域的改变可以提高其介导结合和细胞毒性的效应功能。
恶性肿瘤细胞抗原的免疫特异性抗体也可以从商业途径获得或通过任何已知方法生产，例如化学合成或重组表达技术。对恶性肿瘤细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列编码可以商业获得，例如从GenBank数据库或类似数据库，文献出版物获得，或从常规克隆和测序得到。
除了抗体之外，与目标细胞上的表位或相应的受体相互作用(结合、阻断、靶向或其他类型作用)的一种肽或蛋白质也可以作为结合分子。这些类抗体肽或蛋白质可能是任何随机的类抗体肽或蛋白质，它们对表位或相应的受体有亲和力，不一定非得是免疫球蛋白家族成员。这些肽可以通过类似噬菌体显示抗体的技术分离出来(Szardenings，JRecept Signal Transduct Res.2003；23(4)：307-49)。从随机肽库中获得的肽可以同抗体和抗体片段类似地被使用。类抗体肽或蛋白质结合分子可以偶联或连接至大分子或其他物质，包括但不限于白蛋白、聚合物、脂质体、纳米粒子、树形分子，只要这样的连接能保留肽或蛋白质的抗原结合特异性。
在治疗癌症、自身免疫性疾病和/或传染性疾病的偶联物上，和药物分子通过本发明的连接子连接的抗体的例子包括，但不限于3F8(抗GD2)、阿巴单抗(抗CA-125)、阿昔单抗(抗CD41(整联蛋白α-IIb)、阿达木单抗(抗TNF-α)、Adecatumumab(抗EpCAM、CD326)、阿非莫单抗(抗TNF-α)、Afutuzumab(抗CD20)、Alacizumab单抗(抗VEGFR2)、ALD518(抗IL-6)、Alemtuzumab(Campath、MabCampath、抗CD52)、Altumomab(抗CEA)、Anatumomab(抗TAG-72)、Anrukinzumab(IMA-638、抗-IL-13)、Apolizumab(抗-HLA-DR)、阿奇单抗(抗-CEA)、阿塞珠单抗(抗-L-选择蛋白CD62L)、Atlizumab(tocilizumab、Actemra、RoActemra、抗-IL-6受体)、Atorolimumab(抗-Rhesus因子)、Bapineuzumab(抗-β淀粉样蛋白)、Basiliximab(Simulect、抗CD25(IL-2受体的α链))、Bavituximab(抗磷脂酰丝氨酸)、Bectumomab(LymphoScan、抗-CD22)、贝利单抗(Benlysta、LymphoStat-B、抗BAFF)、Benralizumab(抗CD125)、Bertilimumab(抗CCL11(eotaxin-1))、Besilesomab(Scintimun、抗CEA相关抗原)、贝伐单抗(Avastin、抗VEGF-A)、Biciromab(FibriScint、抗纤维蛋白IIβ链)、Bivatuzumab(抗-CD44v6)、Blinatumomab(BiTE、抗CD19)、Brentuximab(cAC10、抗-CD30 TNRSF8)、Briakinumab(抗IL-12、IL-23)、Canakinumab(Ilaris、抗IL-1)、Cantuzumab(C242、抗CanAg)、Capromab、
Catumaxomab(Removab、抗EpCAM、抗CD3)、CC49(抗TAG-72)、Cedelizumab(抗CD4)、Certolizumab单抗(Cimzia抗TNF-α)、西妥昔单抗(爱必妥、IMC-C225、抗EGFR)、Citatuzumab bogatox(抗EpCAM)、Cixutumumab(抗IGF-1)、Clenoliximab(抗CD4)、Clivatuzu-mab(抗MUC1)、Conatumumab(抗TRAIL-R2)、CR6261(抗流感A血凝素)、Dacetuzumab(抗CD40)、Daclizumab(Zenapax、抗CD25(IL-2受体α链))、Daratumumab(抗CD38(环ADP核糖水解酶)、Denosumab(Prolia、抗RANKL)、Detumomab(抗B淋巴瘤细胞)、Dorlimomab、Dorlixizumab、Ecromeximab(抗GD3神经节苷脂)、Eculizumab(Soliris、抗-C5)、Edobacomab(抗内毒素)、Edrecolomab(Panorex、MAb17-1A、抗-EpCAM)、Efalizumab(Raptiva、抗LFA-1(CD11a))、Efungumab(Mycograb、抗Hsp90)、Elotuzumab(抗SLAMF7)、Elsilimomab(抗IL-6)、Enlimomab单抗(抗ICAM-1(CD54))、Epitumomab(抗episialin)、依他珠单抗(抗-CD22)、Erlizumab(抗-ITGB2(CD18))、Ertumaxomab(Rexomun、抗HER2/neu、CD3)、依他拉单抗(Abegrin、抗整联蛋白αvβ3)、Exbivirumab(抗乙肝表面抗原)、Fanolesomab(NeutroSpec、抗CD15)、Faralimomab(抗干扰素受体)、Farletuzumab(抗叶酸受体1)、Felvizumab(抗呼吸道合胞病毒)、Fezakinumab(抗-IL-22)、Figitumumab(抗-IGF-1受体)、Fontolizumab(抗-IFN-γ)、Foravirumab(抗狂犬病病毒糖蛋白)、Fresolimumab(抗TGF-β)、Galiximab(抗CD80)、Gantenerumab(抗β淀粉样蛋白)、Gavilimomab(抗CD147(basigin))、Gemtuzumab(抗CD33)、Girentuximab(抗碳酸酐酶9)、Glembatumumab(CR011、抗GPNMB)、Golimumab(Simponi、抗-TNF-α)、Gomiliximab(抗-CD23(IgE受体))、Ibalizumab(抗-CD4)、Ibritumomab(抗CD20)、Igovomab(Indimacis-125、抗CA-125)、Imciromab(Myoscint、抗心肌肌凝蛋白)、Infliximab(Remicade、抗TNF-α)、Intetumumab(抗CD51)、Inolimomab(抗CD25(IL-2受体α链)、伊珠单抗(抗-CD22)、Ipilimumab(抗CD152)、Iratumumab(抗CD30(TNFRSF8))、Keliximab(抗-CD4)、Labetuzumab(CEA-Cide、抗CEA)、Lebrikizumab(抗IL-13)、Lemalesomab(抗NCA-90(粒细胞抗原))、Lerdelimumab(抗TGFβ2)、Lexatumumab(抗TRAIL-R2)、Libivirumab(抗乙肝表面抗原)、Lintuzumab(抗CD33)、鲁米木单抗(抗CD40)、鲁米单抗(抗CD23(IgE受体)、Mapatumumab(抗TRAIL-R1)、马西莫单抗(抗T-细胞受体)、马妥珠单抗(抗EGFR)、Mepolizumab(Bosatria、抗IL-5)、Metelimumab(抗TGFβ1)、Milatuzumab(抗CD74)、Minretumomab(抗TAG-72)、Mitumomab(BEC-2、抗GD3神经节苷脂)、Morolimumab(抗恒河猴因子)、Motavizumab(Numax、抗呼吸道合胞病毒)、Muromonab-CD3(Orthoclone OKT3、抗CD3)、Nacolomab(抗C242)、Naptumomab(抗5T4)、那他珠单抗(Tysabri、抗整联蛋白α4)、奈巴单抗(抗内毒素)、Necitumumab(抗EGFR)、Nerelimomab(抗-TNF-α)、Nimotuzumab(Theracim、Theraloc、抗-EGFR)、Nofetumomab、Ocrelizumab(抗CD20)、奥利木单抗(Afolimomab、抗LFA-1(CD11a))、Ofatumumab(Arzerra、抗CD20)、Olaratumab(抗PDGF-Rα)、Omalizumab(Xolair、抗IgE Fc区)Oportuzumab(抗EpCAM)、Oregovomab(OvaRex、抗CA-125)、Otelixizumab(抗CD3)、Pagibaximab(抗脂磷壁酸)、Palivizumab(Synagis、Abbosynagis、抗呼吸道合胞病毒)、帕尼单抗(Vectibix、ABX-EGF、抗EGFR)、Panobacumab(抗铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、帕考珠单抗(抗IL-4)、Pemtumomab(Theragyn、抗MUC1)、Pertuzumab(Omnitarg、2C4、抗HER2/neu)、Pexelizumab(抗C5)、Pintumomab(抗腺癌抗原)、Priliximab(抗-D4)、Pritumumab(抗波形蛋白)、PRO140(抗-CCR5)Racotumomab(1E10、抗-N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc、NGNA)-神经节苷脂GM3))、Rafivirumab(抗狂犬病病毒糖蛋白)、Ramucirumab(抗VEGFR2)、Ranibizumab(Lucentis、抗VEGF-A)、Raxibacumab(抗炭疽毒素、保护性抗原)、Regavirumab(抗巨细胞病毒糖蛋白B)、Reslizumab(抗-IL-5)、Rilotumumab(抗-HGF)、Rituximab(MabThera、Rituxanmab、抗-CD20)、Robatumumab(抗-IGF-1受体)、Rontalizumab(抗IFN-α)、Rovelizumab(LeukAr-rest、抗CD11、CD18)、Ruplizumab(Antova、抗CD154(CD40L))、Satumomab(抗TAG-72)、Sevirumab(抗巨细胞病毒)、Sibrotuzumab(抗FAP)、西法木单抗(抗IFN-α)、Siltuximab(抗IL-6)、Siplizumab(抗CD2)、Smart MI95(抗CD33)、Solanezumab(抗β淀粉状蛋白)、Sonepcizumab(抗鞘氨醇-1-磷酸)、Sontuzumab(抗-episialin)、Stamulumab(抗-myostatin)、Sulesomab(LeukoScan、抗NCA-90(粒细胞抗原))、Tacatuzumab(抗α甲胎蛋白)、Tadocizumab(抗整联蛋白αIIbβ3)、Talizumab(抗IgE)、Tanezumab(anti-NGF)、Taplitumomab(抗CD19)、Tefibazumab(Aurexis、(抗凝聚因子A))、Telimomab、Tenatumomab(抗腱生蛋白C)、Teneliximab(抗CD40)、Teplizumab(抗CD3)、TGN1412(抗CD28)、Ticilimumab(Tremelimumab、抗-CTLA-4)、Tigatuzumab(抗TRAIL-R2)、TNX-650(抗IL-13)、Tocilizumab(Atlizumab、Actemra、RoActemra、IL-6受体)、Toralizumab(抗CD154(CD40L))、Tositumomab(抗CD20)、曲妥珠单抗(赫赛汀、抗HER2/neu)、Tremelimumab(抗CTLA-4)、Tucotuzumab celmoleukin(抗EpCAM)、Tuvirumab(抗乙型肝炎病毒)、Urtoxazumab(抗大肠杆菌)、Ustekinumab(Stelara、抗-IL-12、IL-23)、Vapaliximab(抗-AOC3(VAP-1))、维多珠单抗(抗整联蛋白α4β7)、维妥珠单抗(抗CD20)、Vepalimomab(抗AOC3(VAP-1))、Visilizumab(Nuvion、抗CD3)、Vitaxin(抗血管整合素avb3)、Volociximab(抗整联蛋白α5β1)、Votumumab(HumaSPECT、抗肿瘤抗原CTAA16.88)、Zalutumumab(HuMax-EGFR、Zanolimumab(HuMax-CD4、抗-CD4)、Ziralimumab(抗-CD147(basigin))、Zolimomab(抗-CD5)、依那西普Alefacept/>Abatacept/>Rilonacept(Arcalyst)、14F7(抗IRP-2(铁调节蛋白2))、14G2a(抗GD2神经节苷脂、源于Nat.Cancer Inst.、治疗黑素瘤和实体瘤)、J591(抗-PSMA、源于WeillCornell医学院、治疗前列腺癌)、225.28S(抗HMW-MAA(高分子量黑素瘤相关抗原)、SorinRadiofarmaci SRL(源于意大利米兰、治疗黑色素瘤)、COL-1(抗CEACAM3、CGM1、源于NatCancer Inst.治疗结肠直肠癌和胃癌)、CYT-356/>治疗前列腺癌)、HNK20(OraVaxInc.治疗呼吸道合胞病毒感染)、ImmuRAIT(源于Immunomedics、治疗NHL)、Lym-1(抗HLA-DR10，Peregrine Pharm)、MAK-195F(抗TNF(肿瘤坏死因子、TNFA、TNF-α，TNFSF2，源于Abbott/Knoll，治疗脓毒症中毒性休克)、MEDI-500(T10B9、抗CD3、TRαβ(T细胞受体α/β)、源于MedImmune Inc、用于移植物抗宿主疾病病)、RING SCAN(抗TAG 72(肿瘤相关糖蛋白72)、源于Neoprobe Corp.、用于乳腺癌、结肠癌和直肠癌)、Avicidin(抗EPCAM(上皮细胞粘附分子))、抗-TACSTD1(肿瘤相关钙信号转导1)、抗GA733-2(胃肠肿瘤相关蛋白2)、抗EGP-2(上皮糖蛋白2)、抗KSA、KS1/4抗原、M4S、肿瘤抗原17-1A、CD326(源于NeoRx公司、治疗结肠癌、卵巢癌、前列腺癌和NHL)、LymphoCide(源于Immunomedics)、Smart ID10(源于ProteinDesign Labs)、Oncolym(源于Techniclone Inc)、Allomune(源于BioTransplant)、抗VEGF(源于Genentech)、CEAcide(源于Immunomedics)、IMC-1C11(源于ImClone Systems)和Cetuximab(源于ImClone)。
其他可作为细胞结合分子/配体的抗体，包括但不限于，以下抗原的抗体：氨肽酶N(CD13)、膜联蛋白A1、B7-H3(CD276、各种癌症)、CA125(卵巢癌)、CA15-3(各种癌症)、CA19-9(各种癌症)、L6(各种癌症)、路易斯Y(各种癌症)、路易斯X(各种癌症)、甲胎蛋白(各种癌症)、CA242(结直肠癌)、胎盘碱性磷酸酶(各种癌症)、前列腺特异抗原(前列腺癌)、前列腺酸磷酸酶(前列腺癌)、表皮生长因子(各种癌症)、CD2(霍奇金症、NHL淋巴瘤、多发性骨髓瘤)、CD3ε(T细胞淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、自身免疫性疾病、恶性腹水)、CD19(B细胞恶性肿瘤)、CD20(非霍奇金淋巴瘤)、CD22(白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、SLE)、CD30(霍奇金淋巴瘤)、CD33(白血病、自身免疫性疾病)、CD38(多发性骨髓瘤)、CD40(淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(CLL))、CD51(转移性黑色素瘤、肉瘤)、CD52(白血病)、CD56(小细胞肺癌、卵巢癌、梅克细胞癌、以及液体肿瘤、多发性骨髓瘤)、CD66e(各种癌症)、CD70(转移性肾细胞癌和非霍奇金淋巴瘤)、CD74(多发性骨髓瘤)、CD80(淋巴瘤)、CD98(各种癌症)、粘液素(各种癌症)、CD221(实体肿瘤)、CD227(乳腺癌、卵巢癌)、CD262(非小细胞肺癌及其他癌症)、CD309(卵巢癌)、CD326(实体肿瘤)、CEACAM3(结肠直肠癌、胃癌)、CEACAM5(癌胚抗原、CEA、CD66e)(乳腺、结直肠癌和肺癌)、DLL3或DLL4(delta-like-3或delta-like-4)、EGFR(表皮生长因子受体、各种癌症)、CTLA4(黑色素瘤)、CXCR4(CD184、血液肿瘤，实体肿瘤)、Endoglin(CD105、实体瘤)、EPCAM(上皮细胞粘附分子、膀胱癌、头颈癌、结肠癌、NHL前列腺癌、卵巢癌)、ERBB2(表皮生长因子受体2、肺癌、乳腺癌、前列腺癌)、FCGR1(自身免疫性疾病)、FOLR(叶酸受体、卵巢癌)、GD2神经节苷(各种癌症)、G-28(细胞表面抗原糖脂质、黑色素瘤)、GD3独特型(各自癌症)、热休克蛋白(各种癌症)、HER1(肺癌、胃癌)、HER2(乳腺癌、肺癌和卵巢癌)、HLA-DR10(NHL)、HLA-DRB(NHL、B细胞白血病)、人绒毛膜促性腺激素(各种癌症)、IGF1R(类胰岛素生长因子1受体、实体瘤、血癌)、IL-2受体(白介素2受体、T细胞白血病和淋巴瘤)、IL-6R(白介素6受体、多发性骨髓瘤、风湿性关节炎、Castleman病、白细胞介素6依赖肿瘤)、整合蛋白(αvβ3、α5β1、α6β4、αllβ3、α5β5、αvβ5、各种癌症)、MAGE-1(各种癌症)、MAGE-2(各种癌症)、MAGE-3(各种癌症)、MAGE 4(各种癌症)、抗转铁蛋白受体(各种癌症)、p97(黑色素瘤)、MS4A1(跨膜4结构域亚家族A成员1、非霍奇金B细胞淋巴瘤、白血病)、MUC1或MUC1-KLH(乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、支气管癌和α胃肠道癌)、MUC16(CA125)(卵巢癌)、CEA(结直肠癌)、gp100(黑色素瘤)、MART1(黑色素瘤)、MPG(黑素瘤)、MS4A1(跨膜4结构域亚家族A成员1、小细胞肺癌、NHL)、Nucleolin、Neu癌基因产物(各自癌症)、P21(各种癌)、抗(N-羟乙酰神经氨酸)抗体结合部位(乳腺癌、黑色素瘤)、类PLAP睾丸碱性磷酸酶(卵巢癌、睾丸癌)、PSMA(前列腺瘤)、PSA(前列腺癌)、ROBO4、TAG 72(肿瘤相关糖蛋白72、AML、胃癌、结肠直肠癌、卵巢癌)、T细胞跨膜蛋白(各种癌症)、Tie(CD202b)、TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B、各种癌症)、TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B、多发性骨髓瘤、NHL、其他癌症、RA和SLE)、TPBG(滋养细胞糖蛋白、肾细胞癌)、TRAIL-R1(TNF相关坏死诱导配体受体1、淋巴瘤、NHL、结直肠癌、肺癌)、VCAM-1(CD106、黑色素瘤)、VEGF、VEGF-a、VEGF-2(CD309)(各种癌症)。其它可被抗体识别的、肿瘤相关抗原已被总结和评述(Gerber，等，mAbs 2009，1：3，247-253、Novellino等，Cancer ImmunolImmunother.2005，54(3)，187-207；Franke，等，Cancer BiotherRadiopharm.2000，15，459-76)。
类抗体蛋白，优选为IgG抗体，能够抗肿瘤细胞、病毒感染细胞、微生物感染细胞、寄生虫感染细胞、自身免疫性疾病细胞、活化的肿瘤细胞、髓样细胞、活化的T细胞、受影响的B细胞或黑素细胞。更具体地，所述抗体能够抗表达以下抗原或受体中任一种的异常细胞：CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD58、CD59、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD66、CD68、CD69、CD70、CD72、CD74、CD79、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD85a、CD85b、CD85c、CD85d、CD85e、CD85f、CD85g、CD85h、CD85i、CD85j、CD85k、CD85m、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120、CD120a、CD120b、CD121、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD123a、CD124、CD125、CD126、CD127、CD128、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CDw145、CD146、CD147、CD148、CD149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD156a、CD156b、CD156c、CD156d、CD157、CD158、CD158a、CD158b1、CD158b2、CD158c、CD158d、CD158e1、CD158e2、CD158f2、CD158g、CD158h、CD158i、CD158j、CD158k、CD159、CD159a、CD159b、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167、CD167a、CD167b、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CDw186、CD187、CD188、CD189、CD190、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CD198、CD199、CDw198、CDw199、CD200、CD201、CD202、CD202(a，b)、CD203、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CDw210a、CDw210b、CD211、CD212、CD213、CD213a1、CD213a2、CD214、CD215、CD216、CD217、CD218、CD218a、CD218、CD21b9、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235、CD235a、CD235b、CD236、CD237、CD238、CD239、CD240、CD240ce、CD240d、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD250、CD251、CD252、CD253、CD254、CD255、CD256、CD257、CD258、CD259、CD260、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD281、CD282、CD283、CD284、CD285、CD286、CD287、CD288、CD289、CD290、CD291、CD292、CD293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300、CD300a、CD300b、CD300c、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD307f、CD308、CD309、CD310、CD311、CD312、CD313、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD323、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD330、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD341、CD342、CD343、CD344、CD345、CD346、CD347、CD348、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD356、CD357、CD358、CD359、CD360、CD361、CD362、CD363、CD364、CD365、CD366、CD367、CD368、CD369、CD370、CD371、CD372、CD373、CD374、CD375、CD376、CD377、CD378、CD379、CD381、CD382、CD383、CD384、CD385、CD386、CD387、CD388、CD389、CRIPTO、CR、CR1、CRGF、CRIPTO、CXCR5、LY64、TDGF1、4-1BB、APO2、ASLG659、BMPR1B、5AC、5T4(Trophoblast糖蛋白、TPBG、WNT-活化抑制因子1或WAIF1)、腺癌抗原、AGS-5、AGS-22M6、启动素受体激酶1、AFP、AKAP-4、ALK、α整合素、αvβ6、氨基肽酶N、淀粉样蛋白β、雄激素受体、促血管新生蛋白因子2、促血管新生蛋白因子3、膜联蛋白A1、炭疽毒素保护性抗原、抗转移蛋白受体、AOC3(VAP-1)、B7-H3、炭疽杆菌、BAFF(B细胞启动因子)、BCMA、B淋巴瘤细胞、bcr-abl、蛙皮素、BORIS、C5、C242抗原、CA125(糖抗原125、MUC16)、CA-IX(或CAIX、碳酸酐酶9)、CALLA、CanAg、犬红斑狼疮IL31、碳酸酐酶IX、心肌肌凝蛋白、CCL11(C-C片段趋化因子11)、CCR4(C-C趋化因子受体4)、CCR5、CD3E(ε)、CEA(癌胚抗原)、CEACAM3、CEACAM5(癌胚抗原)、CFD(因子D)、Ch4D5、胆囊收缩素2(CCK2R)、CLDN18(Claudin-18)、丛生因子A、cMet、CRIPTO、FCSF1R(集落刺激因子1受体)、CSF2(集落刺激因子2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、CTAA16.88肿瘤抗原、CXCR4、C-X-C趋化因子受体4、环状ADP核糖核酸酶、细胞周期蛋白B1、CYP1B1、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、Dabigatran、DLL3(类Δ配体3)、DLL4(类Δ配体4)、DPP4(双肽-肽酶4)、DR5(死亡受体5)、大肠杆菌shiga毒素类型-1、大肠杆菌shiga毒素类型-2、ED-B、EGFL7(类EGF结构域蛋白7)、EGFR、EGFRII、EGFRvIII、内皮因子、内皮素B受体、内毒素、EpCAM(上皮细胞粘附分子)、EphA2、Episialin、ERBB2(表皮生长因子受体2)、ERBB3、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、大肠杆菌、ETV6-AML、FAP(成纤维细胞活化蛋白α)、FCGR1、甲胎蛋白、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白额外结构域-B、FOLR(叶酸受体)、叶酸受体α、叶酸水解酶、Fos相关抗原1、呼吸道合胞病毒的F蛋白、卷曲受体、岩藻糖GM1、GD2神经节苷脂、G-28(细胞表面抗原糖脂)、GD3独特型、GloboH、Glypican 3、N-羟乙酰神经氨酸、GM3、GMCSF受体α链、生长分化因子8、GP100、GPNMB(跨膜糖蛋白NMB)、GUCY2C(鸟苷酸环化酶2C)、鸟苷酸环化酶C(GC-C)、肠鸟苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶C受体、热稳定肠毒素受体(hSTAR)、热休克蛋白、血凝素、乙肝表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1(人类表皮生长因子受体1)、HER2、HER2/neu、HER3(ERBB-3)、IgG4、HGF/SF(肝细胞生长因子/分散因子)、HHGFR、HIV-1、组蛋白络合物、HLA-DR(人类白细胞抗原)、HLA-DR10、HLA-DRB、HMWMAA、人类绒毛膜促性腺激素、HNGF、人类分散因子受体激酶、HPV E6/E7、Hsp90、hTERT、ICAM-1(细胞间粘附分子1)、独特型、IGF1R(IGF–1、类胰岛素生长因子1受体)、IGHE、IFN-γ、流感血凝素、IgE、IgE Fc区、IGHE、白介素(包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-17A、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、或IL-28)、IL31RA、ILGF2(类胰岛素生长因子2)、整合蛋白(α4、αIIbβ3、αvβ3、α4β7、α5β1、α6β4、α7β7、αllβ3、α5β5、αvβ5)、干扰素γ诱导蛋白质、ITGA2、ITGB2、KIR2D、Kappa Ig、LCK、Le、Legumain、Lewis-Y抗原、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原1、CD11a)、LHRH、LINGO-1、脂磷壁酸、LIV1A、LMP2、LTA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE A1、MAGE A3、MAGE 4、MART1、MCP-1、MIF(巨噬细胞迁移抑制因子、或糖基抑制因子(GIF))、MS4A1(跨膜4结构域亚家族A成员1)、MSLN(间皮素)、MUC1(粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)或多态性上皮粘蛋白(PEM))、MUC1-KLH、MUC16(CA125)、MCP1(单核细胞趋化蛋白1)、MelanA/MART1、ML-IAP、MPG、MS4A1、MYCN、髓磷脂相关糖蛋白、Myostatin、NA17、NARP-1、NCA-90(粒细胞抗原)、Nectin-4(ASG-22ME)、NGF、神经细胞凋亡调控蛋白酶1、NOGO-A、Notch受体、核仁素、Neu致癌基因产物、NY-BR-1、NY-ESO-1、OX-40、OxLDL(氧化低密度脂蛋白)、OY-TES1、P21、p53非突变体、P97、PAP、抗(N-羟乙酰神经氨酸)抗体结合部位、PAX3、PAX5、PCSK9、PDCD1(PD-1、程序性细胞死亡蛋白1)、PDGF-Rα(α血小板源生长因子受体)、PDGFR-β、PDL-1、PLAC1、类PLAP睾丸碱性磷酸酶、血小板衍生生长因子受体β、磷酸钠联合转运体、PMEL 17、聚唾液酸、蛋白酶3(PR1)、前列腺癌、PS(磷脂酰丝氨酸)、前列腺癌细胞、铜绿假单胞菌、PSMA、PSA、PSCA、狂犬病病毒糖蛋白、RHD(Rh多肽1(RhPI))、Rhesus因子、RANKL、RhoC、Ras突变、RGS5、ROBO4、呼吸道合胞病毒、RON、ROR1、肉瘤易位断点、SART3、Sclerostin、SLAMF7(SLAM成员7)、SelectinP、SDC1(多配体蛋白聚糖1)、系统性红斑狼疮(a)、生长调节素C、SIP(1-磷酸鞘氨醇)、生长激素抑制素、精子蛋白17、SSX2、STEAP1(6-跨膜上皮前列腺抗原1)、STEAP2、STn、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白)、存活素、T细胞受体、T细胞跨膜蛋白、TEM1(肿瘤血管内皮标记1)、TENB2、Tenascin C(TN-C)、TGF-α、TGF-β(转化生长因子β)、TGF-β1、TGF-β2(转化生长因子2)、Tie(CD202b)、Tie2、TIM-1(CDX-014)、Tn、TNF、TNF-α、TNFRSF8、TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B)、TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B)、TPBG(滋养细胞糖蛋白)、TRAIL-R1(TNF相关坏死诱导配体受体1)、TRAILR2(死亡受体5(DR5))、肿瘤相关的钙信号传感子2、肿瘤特异糖基化的MUC1、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、TRP-1(Trop1)、TRP-2(Trop2)、酪氨酸酶、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-2、VEGFR-1、VEGFR-2、vimentin、WT1、XAGE1、表达胰岛素生长因子受体的细胞、或表达表皮生长因子受体的细胞。
在另一个具体实施例中，本发明的抗体-药物偶联物用于癌症的靶向治疗。目标癌症包括但不限于、肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、大脑肿瘤(脑干神经胶质瘤、小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层和松果体肿瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、类癌肿瘤、胃肠道癌症、未知小细胞癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、尤因家族肿瘤(PNET)、颅内生殖细胞肿瘤、眼癌、眼内黑色素瘤、胆囊癌、胃癌(胃癌)、性腺外生殖细胞瘤、孕周滋养细胞瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病(急性淋巴细胞、急性髓系、慢性淋巴细胞、慢性粒细胞、毛细胞)、嘴唇和口腔癌症、肝癌、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤(艾滋病相关、中枢神经系统、皮肤T细胞、霍奇金病、非霍奇金病)、恶性间皮瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、转移性鳞状颈癌与隐匿性原发性癌、多发性骨髓瘤和其他浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌(上皮、生殖细胞瘤、低恶性肿瘤)、胰腺癌(外分泌、胰岛细胞癌)、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞肿瘤、前列腺癌横纹肌肉瘤、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管(移行细胞)、唾腺癌、赛塞里综合症、皮肤癌(皮肤T细胞淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、黑色素瘤)、小肠肿瘤、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、胸腺瘤(恶性)、甲状腺癌、尿道癌症、子宫癌、不寻常的少年癌症、阴道肿瘤、外阴肿瘤和维尔姆斯瘤。
在另一个具体的实施例中、本发明过的抗体-药物偶联物，可用作治疗或预防自身免疫疾病的成分和方法。自身免疫性疾病包括但不限于，Achlorhydra自身免疫性活动性慢性肝炎、急性播散性脑脊髓炎、急性出血性脑白质炎、艾迪生病、无精症、斑秃、肌萎缩侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗GBM/TBM肾炎、抗磷脂综合征、抗异常酶综合征、关节炎、特应性过敏、特应性皮炎、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病、自身免疫性淋巴组织增生综合征、自身免疫性周围神经病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌综合征I、II和III型、自身免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性葡萄膜炎、Balo病/Balo同心硬化症、Bechets综合征、Berger氏病、Bickerstaff脑炎、Blau综合征、大疱性类天疱疮、Castleman病、Chagas病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、慢性莱姆病、慢性阻塞性肺病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、乳糜泄、Cogan综合征、冷凝集素病、补体成分2缺乏症、颅骨动脉炎、CREST综合征、Crohns病(特发性炎症性肠病)、
库欣综合征、皮肤白细胞增多性血管炎、德戈氏病、Dercum氏病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、Dressler综合征、盘状红斑狼疮、湿疹、子宫内膜异位症、附着点炎相关的关节炎、Eosinophilic筋膜炎、大疱性表皮松解症、结节性红斑、特发性混合性冷球蛋白血症、伊文氏综合征、纤维发育不良性骨化症、纤维肌痛、纤维化性肌炎、纤维性肺泡炎、胃炎、胃肠类天疱疮、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘尔综合征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、过敏性紫癜、妊娠性肝炎、化脓性汗腺炎、休斯综合征(抗磷脂综合征)、低丙球蛋白血症、特发性炎性脱髓鞘疾病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(自身免疫性血小板减少性紫癜)、IgA肾病(伯杰氏病)、包涵体肌炎、炎性脱髓鞘性多神经炎、间质性膀胱炎、过敏性肠综合征、少年特发性关节炎、青少年类风湿性关节炎、川崎氏病、朗伯-伊顿重症肌无力综合征、白细胞碎屑性血管炎、扁平苔癣、硬化性硬化症、线状IgA疾病(LAD)、Lou Gehrig病(也称肌萎缩侧索硬化症)、狼疮性肝炎、红斑狼疮、Majeed综合征、美尼尔氏病、显微镜下多动脉炎、米勒-费希尔综合征、混合性结缔组织病、硬斑病、穆罕默德-哈贝曼病、麦考利综合征、多发性骨髓瘤、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、嗜睡症、视神经脊髓炎(Devic病)、神经性肌强直、眼睑瘢痕性类天疱疮、Opsoclonus myoclonus综合征、Ord甲状腺炎、回文风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神病)、Paraneoplastic小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、睫状体平部炎、天疱疮、寻常型天疱疮、贫血、周围脑脊髓炎、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎症性神经病变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、坏疽性皮肤炎、纯红细胞再生障碍、Rasmussen脑炎、雷诺现象、复发性多软骨炎、赖特综合征、不宁腿综合症、后神经纤维化、类风湿性关节炎、类风湿热、结节病、精神分裂症、施密特综合征、Schnitzler综合征、施尼茨勒综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、脊椎关节病、粘稠血症、Still病、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、苏萨克综合征、Sweet综合征、小舞蹈病、交感神经性贫血、Takayasu动脉炎、颞动脉炎(巨细胞动脉炎)、Tolosa-Hunt综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎(特发性炎性肠病)、未分化结缔组织病、未分化脊柱关节病、血管炎、白癜风、韦格纳肉芽肿病、威尔逊氏综合征、威斯科特-奥尔德里奇综合征。
在另一个具体的实施例中，在用于治疗或预防自身免疫性疾病的偶联物上的抗体，包括但不限于，抗弹性蛋白抗体、Abys抗上皮细胞抗体、抗基底膜胶原蛋白IV型蛋白抗体、抗核抗体、抗ds DNA、抗ss DNA、抗心磷脂抗体IgM、IgG、抗乳糜泻抗体、抗磷脂抗体IgK、IgG、抗SM抗体、抗线粒体抗体、甲状腺抗体、微粒体抗体、T细胞抗体、甲状腺球蛋白抗体、抗SCL-70、抗Jo、抗U.sub.1RNP、抗La/SSB、抗SSA、抗SSB、抗壁细胞抗体、抗组蛋白、抗RNP、C-ANCA、P-ANCA、抗着丝粒、抗纤维蛋白原、抗GBM抗体、抗神经节苷脂抗体、抗Desmogein 3抗体、抗p62抗体、抗sp100抗体、抗线粒体(M2)抗体、类风湿因子抗体、抗MCV抗体、抗拓扑异构酶抗体、抗中性粒细胞胞质(cANCA)抗体。
在某些优选的实施例中，本专利中偶联物上的结合分子，可以与自身免疫性疾病相关的启动淋巴细胞上表达的受体或受体络合物相结合。受体或受体络合物包含，免疫球蛋白基因超家族成员(例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD56、CD70、CD79、CD79b、CD90、CD125、CD137、CD138、CD147、CD152/CTLA-4、PD-1或ICOS)、TNF受体超家族成员(例如CD27、CD40、CD95/Fas、CD134/OX40、CD137/4-1BB、INF-R1、TNFR-2、RANK、TACI、BCMA、骨保护素、Apo2/TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4和APO-3)、整合蛋白、细胞因子受体、趋化因子受体、主要组织兼容性蛋白、凝集素(C型、S型或I型)或补体控制蛋白。
在另一个具体实施例中，可用的对病毒或微生物抗原具有免疫特异性的细胞结合配体是人源化或人单克隆抗体。“病毒抗原”包括但不限于，任何能够引发免疫应答的病毒肽，多肽蛋白(例如HIV gp120、HIV nef、RSV F糖蛋白、流感病毒神经氨酸苷酶、流感病毒血凝素、HTLV Tax、疱疹单纯疱疹病毒糖蛋白(例如gB、gC、gD和gE)和乙型肝炎表面抗原)。“微生物抗原”包括但不限于，任何能够引发免疫应答的微生物肽，多肽，蛋白质，糖，多糖或脂质分子(例如细菌、真菌、致病原生动物或酵母多肽、包括如LPS和荚膜多糖)。可用于治疗病毒或微生物感染的抗体的实例、包括但不限于：帕利珠单抗、它是用于治疗RSV感染的、人源化抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体；PRO542，是一种CD4融合抗体，用于治疗HIV感染；奥斯他韦，是一种用于治疗乙型肝炎病毒的人抗体；PROTVIR，是一种人源化IgG1抗体，用于治疗巨细胞病毒，和抗LPS抗体。
本专利的抗体药物偶联物可用于治疗感染性疾病。这些感染性疾病包括但不限于，不动杆菌属感染、放线菌病、非洲昏睡病(非洲锥虫病)、艾滋病(获得性免疫缺陷综合症)、阿米巴病、无形体病、炭疽、溶血性耶尔森菌感染、阿根廷出血热、蛔虫病、曲霉病、星状病毒感染、巴贝斯虫病、蜡状芽孢杆菌感染、细菌性肺炎、细菌性阴道炎、类杆菌感染、小袋虫病、蛔虫感染、BK病毒感染、黑色发结节病、人芽囊原虫感染、芽生菌病、玻利维亚出血热、疏螺旋体感染、肉毒中毒(和婴儿肉毒中毒)、巴西出血热、布鲁氏杆菌病、伯克霍尔德氏菌感染、布鲁里溃疡、杯状病毒感染(诺如病毒和沙波病毒)、弯曲杆菌病、念珠菌病(念珠菌病、鹅口疮)、猫抓病、蜂窝组织炎、Chagas病(美洲锥虫病)、子囊、水痘、衣原体、肺炎衣原体感染、霍乱、色素母细胞瘤、华支睾吸虫、艰难梭状芽孢杆菌感染、球孢子菌病、科罗拉多蜱热病、普通感冒(急性病毒性鼻咽炎、急性鼻炎)、克雅氏病、克里米亚-刚果出血热、隐球菌病、隐孢子虫病、皮肤幼虫迁徙、环孢子虫病、肠杆菌感染、肠道病毒感染、流行性斑疹伤寒、传染性红斑(第五种疾病)、急疹、姜片虫病、肝片吸虫病、致命性家族性失眠、丝虫病、产气荚膜梭菌食物中毒、自由活体阿米巴感染、梭杆菌感染、气性坏疽(梭菌性肌坏死)、地丝菌病、格斯特曼-斯特拉斯勒-谢克尔病综合征、贾第鞭毛虫病、马鼻疽、淋病、肉芽肿性腹泻(第五性病)、A群链球菌感染、B群链球菌感染、流感嗜血杆菌感染、手足口病(HFMD)、汉坦病毒肺综合征、幽门螺杆菌感染、溶血性尿毒综合征、肾综合征出血热、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、单纯性疱疹、组织胞浆菌病、钩虫感染、人类博卡病毒感染、人类ewingii埃里希体病、人类粒细胞无形体病、人类偏肺病毒感染、人类单核细胞埃里希体病、人乳头瘤病毒感染、人副流感病毒感染、膜壳绦虫病、艾巴氏病毒传染性单核细胞增多症(单)、流行性感冒、等孢子虫病、川崎病、角膜炎、金格杆菌感染、库鲁病、拉沙热、军团病(退伍军人症)、军团病(庞蒂亚克热)、利什曼病、莱姆病、淋巴丝虫病(象皮病)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、疟疾、马尔堡出血热、麻疹、类鼻疽病(惠氏病)、脑膜炎、脑膜炎球菌病、后殖吸虫病、微孢子虫病、传染性软疣、腮腺炎、小鼠斑疹伤寒(地方性斑疹伤寒)、支原体肺炎、足菌肿、蝇蛆病、新生儿结膜炎(新生儿眼病)、变异型克雅氏病(vCJD、nvCJD)、诺卡氏菌病、盘尾丝虫病(河盲症)、副球孢子菌病(南美芽生菌病)、肺吸虫病、巴斯德氏菌病、头虱、体虱、阴虱、盆腔炎、百日咳、鼠疫、肺炎球菌感染、肺孢子虫肺炎、肺炎、脊髓灰质炎、普氏菌感染、原发性阿米巴脑膜脑炎、进行性多灶性白质脑病、鹦鹉热、Q热、狂犬病、鼠咬热、呼吸道合胞病毒感染、鼻孢子虫病、鼻病毒感染、立克次体感染、立克次体痘、裂谷热、落基山斑疹热、轮状病毒感染、风疹、沙门氏菌病、SARS(严重急性呼吸综合征)、疥疮、血吸虫病、败血症、志贺氏菌病(Bacillary痢疾)、带状疱疹(带状疱疹)、天花(天花)、孢子丝菌、葡萄球菌食物中毒、感染金黄色葡萄球菌、粪类圆线虫病、梅毒、绦虫病、破伤风、须癣(Barber痒)、头皮癣、体癣、股癣、手癣、掌黑癣、足癣(香港脚)、甲癣(灰指甲)、花斑癣、弓蛔虫病(眼幼虫移行症)、弓蛔虫病(内脏幼虫移行症)、弓形体病、旋毛虫病、滴虫病、鞭虫病(鞭虫感染)、肺结核、兔热病、解脲脲原体感染、委内瑞拉马脑炎、委内瑞拉出血热、病毒性肺炎、西尼罗河热、白毛结节病(白癣)、假结核耶尔森氏菌、耶尔森氏鼠疫杆菌肠道病、黄热病、接合菌病。
本发明的细胞结合分子，更优选为抗体，对抗的病原菌株包括但不限于，鲍氏不动杆菌、以色列放线菌、放线菌和丙酸杆菌、布氏锥虫、HIV(人免疫缺陷病毒病毒)、溶组织内阿米巴、无形体属、炭疽芽孢杆菌、溶血弧菌、胡宁病毒、蛔虫属、曲霉属、星状病毒科、巴贝虫属、蜡状芽孢杆菌、多种细菌、拟杆菌属、大肠杆菌、蛔虫属、BK病毒、结节菌、人芽囊原虫、皮炎芽生菌、马丘波病毒、疏螺旋体属、肉毒梭菌、清风藤属、布鲁氏菌属、通常为洋葱伯克霍尔德菌和其他伯克霍尔德氏菌种、溃疡分枝杆菌、杯状病毒科、弯曲杆菌属、通常为白色假丝酵母和其他假丝酵母属、汉赛巴尔通体、A群链球菌和葡萄球菌、克氏锥虫、杜克雷嗜血杆菌、VZV、沙眼衣原体、科罗拉多蜱热病毒、鼻病毒、冠状病毒、CJD朊病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、新型隐球菌、隐孢子虫属、巴西钩虫、多种寄生虫、环孢子虫、带状绦虫、巨细胞病毒、登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4)-黄病毒、脆弱双歧杆菌、白喉棒状杆菌、裂头绦虫、麦地那龙线虫、埃博拉病毒、棘球绦虫属、埃立克体肠球菌属、肠道病毒属、普氏立克次体、细小病毒B19、人疱疹病毒6和人疱疹病毒7、布氏姜片虫、肝片吸虫和巨大片吸虫、FFI朊病毒、丝虫目超家族、产气荚膜梭菌、梭杆菌属、其他梭状芽孢杆菌、白地霉、GSS朊病毒、肠道贾第虫、伯克霍尔德氏菌、刺孢小芽孢杆菌和革兰氏假丝酵母、淋球菌、肉芽肿克雷伯氏菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、流感嗜血杆菌、肠道病毒、主要是柯萨奇A病毒和肠道病毒71、无名病毒、幽门螺旋杆菌、大肠杆菌O157：H7、布尼亚病毒科、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、荚膜组织胞浆菌、十二指肠腺瘤和壶腹癌流感嗜血杆菌、人博卡病毒、埃里希体、嗜吞噬细胞无嗜血杆菌、人偏肺病毒、查菲埃里希体、人乳头瘤病毒、人副流感病毒、微小膜壳绦虫和缩小膜壳绦虫、艾巴氏病毒、正粘病毒科家族、贝氏等孢球虫、金格杆菌、肺炎克雷伯菌、克雷伯氏菌、嗜肺军团菌、嗜肺军团菌、嗜肺军团菌、利什曼原虫属、麻风分枝杆菌和结核分枝杆菌、钩端螺旋体属、单核细胞增多性李斯特氏菌、伯氏疏螺旋体和其他疏螺旋体属物种、班氏旋毛虫和马来丝虫、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)疟原虫属、马尔堡病毒、麻疹病毒、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、横川后殖吸虫、小孢子虫目门、传染性软疣病毒(MCV)、腮腺炎病毒、伤寒立克次氏体、肺炎支原体、多种细菌和真菌寄生双翅蝇幼虫、沙眼衣原体和淋病奈瑟菌、vCJD朊病毒、诺卡氏菌和其他诺卡氏菌属、盘尾丝虫属、盘鲍拟亚科、副龙属西马尼和其他副属、巴斯德氏菌属、头虱、人体虱、百日咳博德特氏菌鼠疫耶尔森氏菌、肺炎链球菌、肺炎球菌、脊髓灰质炎病毒、普雷沃氏菌属、奈氏格氏杆菌、JC病毒、鹦鹉热衣原体、伯氏考克斯体、狂犬病病毒、单链球菌和螺旋菌、呼吸道合胞病毒、鼻孢子菌、鼻病毒、立克次体属、由小株立克次体、裂谷热病毒、立克次体立克次体、轮状病毒、风疹、沙门氏菌属、SARS冠状病毒、人疥螨、血吸虫属、体细胞属、志贺菌属、水痘带状疱疹病毒、天花少校或天花小、申克孢子丝菌、金黄色葡萄球菌属、金黄色葡萄球菌、链球菌化脓、圆线虫、梅毒螺旋体、绦虫属、破伤风、癣属癣音铀、癣属、絮状表皮癣菌、红色毛癣菌、须毛癣菌、红色毛癣菌、威尼克外瓶霉、毛癣菌属属、细胞死亡属、弓箭毒或弓箭毒、刚地弓形虫、旋毛虫、阴道毛滴虫、三丘里三种、结核分枝杆菌、弗朗西拉图拉菌、尿素和马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、霍乱弧菌、瓜纳里托病毒、西尼罗河病毒、beigelii丝孢、假结核耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、黄热病病毒、毛霉菌目阶(毛霉菌病)和虫霉目阶(虫霉属真菌病)、毛霉菌目绿脓杆菌、弯曲杆菌(弧菌)、气单胞菌、艾氏菌、耶尔森氏菌、志贺痢疾杆菌、志贺氏杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、雅司螺旋体、奋森氏螺旋体、伯氏疏螺旋体、细螺旋体、卡氏肺孢子虫、流产布鲁氏菌、布鲁杆菌、布鲁氏菌、支原体属、普氏立克次体、恙虫病立克次氏体、衣原体属、致病性真菌(烟曲霉、白色念珠菌、荚膜组织胞浆菌)、原生动物(溶组织内阿米巴、Tenas毛滴虫、Hominis毛滴虫、冈比亚锥虫、罗得西亚锥虫、罗氏利什曼原虫、热带利什曼原虫、巴西利什曼原虫、肺孢子虫肺炎、间日疟原虫、恶性疟原虫、疟原虫疟疾)或Helminiths(日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫和钩虫)。
本发明申请的偶联物用作治疗病毒性疾病，其中作为细胞结合配体的其他抗体，包括但不限于靶向下列致病病毒抗原的抗体：痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、小黄病毒、肠病毒、小核糖核酸病毒、细小病毒、呼肠病毒、逆转录病毒、流感病毒、副流感病毒、腮腺炎、麻疹、呼吸道合胞病毒、风疹、虫媒病毒、弹状病毒、沙门氏菌、非a/非b型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、罗托病毒、致癌病毒、如HBV(肝细胞癌)、人乳头状瘤病毒(宫颈癌、肛门癌)、卡波济氏肉瘤相关的疱疹病毒(卡波济氏肉瘤肉瘤)、人类疱疹病毒第四型(鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤)、瘤病毒(默克尔细胞癌)、SV40(猿猴病毒40)、HCV(肝细胞癌)、HTLV-1(成人T细胞白血病/淋巴瘤)、免疫紊乱导致病毒、如人类免疫缺陷病毒(艾滋病)、中枢神经系统病毒、如JCV(进行性多灶性脑白质病)、丙型肝炎病毒(亚急性硬化性全脑炎)、LCV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎)、亚博病毒脑炎、正粘病毒(脑炎性脑炎)、RV(狂犬病)、长鼻病毒、疱疹病毒脑膜炎、拉姆齐亨特综合征II型、脊髓灰质炎病毒(脊髓灰质炎病毒、后脊髓灰质炎综合征)、HTLV-1(热带麻痹性麻痹))、巨细胞病毒(巨细胞病毒视网膜炎、HSV(疱疹性角膜炎)、心血管病毒、如CBV(心包炎，心肌炎)、呼吸系统/急性病毒性鼻内炎/病毒性肺炎、如爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV感染/传染性单核病)、巨细胞病毒、非典冠状病毒(严重急性呼吸综合征)或正黏液病毒、流感病毒a/b/c(流感/禽流感)、副粘病毒、人类副流感病毒、RSV(人类呼吸道合胞病毒)、hMPV；消化系统病毒(腮腺炎病毒、巨细胞病毒(巨细胞病毒食管炎)、腺病毒(腺病毒感染)、轮状病毒、诺瓦克病毒、星状病毒、冠状病毒、乙型肝炎病毒、CBV、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、HGV)；泌尿生殖病毒，如BK病毒，MuV(腮腺炎)。
更进一步，本发明也包括用本发明中偶联物和药学上可接受的载体，稀释剂或辅料构成的组合物，以治疗癌症、感染或自身免疫性疾病。治疗癌症、感染和自身免疫性疾病的方法可以在体外，体内或离体实施。体外用途的实例包括用它处理细胞培养物，以杀死除了不表达靶抗原的变体以外的所有细胞；或者杀死表达不需要的抗原的变体。离体使用的例子包括在进行移植(HSCT)之前对造血干细胞(HSC)进行处理，以杀死患病或恶性肿瘤细胞。例如，在癌症治疗中的自体移植之前或在自身免疫性疾病的治疗中从骨髓中去除肿瘤细胞或淋巴细胞，或在移植之前为了防止移植物抗宿主疾病从同种异体骨髓或组织中除去T细胞和其他淋巴细胞。这样的临床离体治疗可以按如下步骤进行：从患者或其他个体收获骨髓，然后在含有血清的培养基中约37℃下孵育约30分钟至约48小时，在该培养基中加入本发明的偶联物，浓度范围从约1pM至0.1mM。具体的药物浓度和孵育时间应当由专业临床医师决定。孵育后，用含血清的培养基洗涤骨髓细胞，并按照已知的方法通过静脉注射给患者。若患者在骨髓采集和再输注治疗细胞之间，还接受其它治疗(例如消融化疗或全身辐射疗程)的情况下，应使用标准医疗设备将处理后的骨髓细胞在液氮中冷冻储存。
制剂与应用
本专利申请的偶联物被配制成液体，或者适于冻干的形态，冻干后被重新制成液体制剂。液体配方或配制的冻干粉末中的偶联物，为配方的主要成分，占0.01％-99％的重量。一般而言，可在病人上施用，无高水平抗体聚集的液体制剂除了包含0.1g/L-300g/L的偶联物活性成分，还包括一种或多种多元醇(例如糖)、pH值为4.5至7.5的缓冲液、表面活性剂(如聚山梨酸20或80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸和/或蛋氨酸)、强化剂(如甘露醇、山梨醇或氯化钠)、螯合剂(如EDTA)、金属络合物(如锌-蛋白络合物)、可生物降解聚合物(如聚酯)、防腐剂(如苯甲醇)和/或游离氨基酸。
用于制剂的合适缓冲液包括但不限于，有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的钠、钾、铵或三羟乙基氨基盐，氨基丁三醇盐酸、硫酸或磷酸缓冲液。此外，氨基酸阳离子也可用作缓冲液。这些氨基酸包括但不限于，精氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸和组氨酸。精氨酸缓冲液包括精氨酸乙酸盐、精氨酸氯化物、精氨酸磷酸盐、精氨酸硫酸盐，精氨酸琥珀酸盐等。在一个实施例中，精氨酸缓冲液是精氨酸乙酸盐。组氨酸缓冲液的实例包括组氨酸氯化物-精氨酸氯化物、组氨酸乙酸盐-精氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐-精氨酸磷酸盐、组氨酸硫酸盐-精氨酸硫酸盐、组氨酸琥珀酸盐-精氨酸琥珀酸盐等。缓冲液的pH是4.5至pH7.5，优选约4.5至约6.5，更优选约5.0至约6.2。在一些实施例中，缓冲液中有机酸盐的浓度为约10mM至约500mM。
在制剂中可选地的“多元醇”是具有多个羟基的物质。多元醇可用作液体和冻干制剂中的稳定辅料和/或等渗剂。多元醇可以保护生物药物免受物理和化学降解。最好能被排除的共溶剂增加了蛋白质接口处溶剂的有效表面张力，能量最有利的结构构像是表面积最小的那些溶剂。多元醇包括糖(还原和非还原糖)、糖醇和糖酸。“还原糖”是指含有半缩醛基团的糖，它能够还原金属离子，或与蛋白质中的赖氨酸和其他氨基发生反应，“非还原糖”是指不具有还原糖性质的糖。还原糖的例子有果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非还原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松解糖和棉子糖。糖醇选自甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、赤藓糖醇、苏糖醇、山梨醇和甘油。糖酸包括L-葡萄糖酸盐及其金属盐。液体配方或冻干制剂中的多元醇含量，按重量计，为0.0％-20％。在配方中优选浓度约为0.1％到15％的非还原糖，蔗糖或海藻糖，其中由于更好溶液稳定性，海藻糖更优。
在制剂中可选的表面活性剂可选自聚山梨醇酯(聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85等)；泊洛沙姆(如泊洛沙姆188、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)、泊洛沙姆407或聚丙二醇-丙二醇等)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；十二烷基、肉荳蔻酰基、亚油基或硬脂基磺基甜菜碱；十二烷基、肉荳蔻酰基、亚油基或硬脂基肌氨酸；亚油酸、肉荳蔻基或十六烷基甜菜碱；月桂酰氨基丙基、椰油酰胺丙基、亚油酰胺基丙基、肉荳蔻酰基丙基、棕榈酰基丙基或异硬脂酰氨基丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉荳蔻酰胺丙基、棕榈酰丙基或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基椰油酰基钠或甲基油基牛磺酸二钠；十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲基氧化胺、椰油酰胺丙基甜菜碱和可可两性甘氨酸酯；MONAQUATTM系列(如异硬脂基乙基亚胺鎓乙基硫酸盐)；聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物(如Pluronic、PF68等)。优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，如聚山梨醇酯20、40、60或80(Tween20、40、60或80)。制剂中表面活性剂的浓度范围，按照重量计，为0.0％至约2.0％。在某些特定实施例中，表面活性剂浓度为约0.01％至约0.2％。在一个实施例中，表面活性剂浓度为约0.02％。
在制剂中可选的“防腐剂”是可以抑制细菌的化合物。防腐剂的实例包括十八烷基二甲基芐基氯化铵、六甲基氯化铵、苯扎氯铵(烷基芐基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基为长链烷基)和芐索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳香醇如苯酚，丁基和芐基醇，对羟基苯甲酸烷基酯，如甲酯或丙酯，儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。液体配方或冻干粉末中的防腐剂含量，按照重量计，为0.0％-5.0％。在一个实施例中，所用防腐剂是苯甲醇。
在制剂中作为填充物质或张力剂或渗透压调节剂的游离氨基酸，选自但不限于精氨酸、胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸谷氨酸或天冬氨酸中的一种或多种。优选碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。如果组成中包含组氨酸，它可以充当缓冲剂和游离氨基酸，但是当使用组氨酸缓冲液时，通常还要包含一个非组氨酸的游离氨基酸，如赖氨酸。氨基酸可以以D-和/或L-型存在，但L-型比较常见。氨基酸可以任何合适的盐的形式存在，如精氨酸盐酸盐。液体配方或冻干粉末中的氨基酸含量，以重量计，为0.0％-30％。
可选地，制剂还包含甲硫氨酸，谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸或抗坏血酸作为抗氧化剂，在液体配方中浓度最多为约5mg/mL，在冻干粉末中的含量，以重量计，为0.0％-5.0％；可选地，制剂包含金属螯合剂，例如EDTA，EGTA等，在液体配方中浓度为约2mM，在冻干粉末中的含量，以重量计，为0.0％-0.3％。
最终的制剂可以用缓冲液调节剂(如酸，包括HCl、H2SO4、乙酸，H3PO4、柠檬酸等，或是碱，如NaOH、KOH、NH4OH、乙醇胺、二乙醇胺或三乙醇胺、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸三钠、氨基丁三醇等)调节至优选的pH值。制剂还应当被调节至“等渗”，即目标制剂具有与人血基本相同的渗透压。等渗制剂渗透压通常为250至350mOsm。可以使用蒸气压或冰冻型渗透压计测量等渗性。等渗剂选自甘露醇、山梨糖醇、乙酸钠、氯化钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸三钠或NaCl。通常，缓冲盐和等渗剂在制剂中含量最多为30％(重量)。
在液体或冻干制剂中可能有用的其他辅料包括，例如，岩藻糖、纤维二糖、麦芽三糖、褪黑糖、辛酮糖、核糖、木糖醇、精氨酸、组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、赖氨酸、咪唑、甘氨酸、甘露糖基甘油酯、Triton X-100，Puloronic F-127，纤维素，环糊精，(2-羟丙基)-β-环糊精，右旋糖酐(10，40和/或70kD)，聚葡萄糖，麦芽糊精，无花果胶，明胶，羟丙基甲基，磷酸钠，磷酸钾，氯化锌，锌，氧化锌，柠檬酸钠，柠檬酸三钠，氨丁三胺，铜，纤维粘连蛋白，肝素，人血清白蛋白，鱼精蛋白，甘油、EDTA、间甲酚、苯甲醇、苯酚、多元醇，被还原的碳水化合物，其中一羰基被还原为一级或二级醇。
其它可以在本专利申请的液体制剂中使用的辅料还包括：例如调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质如磷脂或脂肪酸脂、类固醇如胆固醇、蛋白质辅料如血清白蛋白(人血清白蛋白)、重组人白蛋白、明胶、酪蛋白、成盐反离子如钠等。这些和另外已知的适用于本发明制剂的药物辅料和/或添加剂为本领域公知，如在由美国医药协会罗威(Rowe)等人编着的第四版《药用辅料手册》(The Handbook of PharmaceuticalExcipients)中所列；以及由威尔金斯出版公司出版(2005)，热纳罗(Gennaro)等人编着的第21版《雷明顿：药学科学与实践》(Remington：the Science and Practice of Pharmacy)中所列。
容纳本专利申请中的偶联物制剂的药物容器或器具有：小瓶，瓶，预填充注射器，预填充或自动注射器。液体配方可以在硼硅酸盐或钠钙玻璃小瓶中冷冻干燥，或滚筒干燥，成饼或粉末形式。固体粉末也可以通过有效的喷雾干燥制备，然后用小瓶或药物容器包装，用于储存和配送。
在更进一步的实施例中，本发明提供了制剂的制备方法，包括以下步骤：(a)冻干包含偶联物，辅料和缓冲体系的液体；(b)在介质中复溶步骤(a)中的冻干混合物，以使得复溶的制剂稳定。步骤(a)重的液体可进一步包含稳定剂和一种或多种辅料，选自前述填充剂、盐、表面活性剂和防腐剂。复溶介质可选用水，如无菌水，抑菌性注射用水(BWFI)、乙酸、丙酸、琥珀酸、氯化钠、氯化镁、氯化钠的酸性溶液、氯化镁的酸性溶液或精氨酸的酸性溶液，其含量为约10至约250mM。
本专利申请的偶联物的液体制剂应具有各种设定的特征。需要考虑的主要问题之一是其稳定性，因为蛋白质/抗体在制造和储存期间，常会形成可溶及不溶的聚集体。此外，溶液中会发生各种化学反应(脱酰胺、氧化、剪切、异构化等)，导致降解产物水平增加和/或生物活性丧失。液体或冻干制剂中的偶联物最好应在25℃下，具有超过6个月的货架期。更优的液体或冻干制剂中的偶联物应在25℃下具有超过12个月的货架期。最为优选的液体制剂应该在2-8℃下具有约24至36个月的货架期，冻干粉末在2-8℃下，应该具有长达约60个月的货架期。液体制剂和冻干制剂应该具有在-20℃或-70℃下至少两年货架期。
在一些实施例中，制剂在冷冻(例如-20℃或-70℃)和融化之后是稳定的，例如在1、2或3个冷冻和融化循环之后。可以用不同的方式定性和/或定量地评估稳定性，包括评估药物/抗体(蛋白质)的比和聚集体的形成(例如，使用UV，尺寸排阻色谱法，通过测量浊度和/或通过目测)；通过使用阳离子交换色谱，图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析、基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)、HPLC-MS/MS或SDS-PAGE分析以比较还原抗体和完整抗体；肽图分析(例如胰蛋白酶或LYS-C)；评估抗体的生物学活性或抗原结合功能。不稳定可能由于以下一种或多种原因：聚集，脱酰胺作用(例如Asn脱酰胺作用)，氧化作用(例如Met氧化作用)，异构化作用(例如Asp异构化作用)，剪切/水解/断裂作用(例如铰链区断裂)，琥珀酰亚胺形成，未成对半胱氨酸，N末端延伸，C末端加工，糖基化差异等。
稳定的偶联物应当在药物制剂中“保持其生物学活性”，例如，如果偶联物的生物活性在给定时间内，例如24个月，按照抗原结合测定和/或体外细胞毒性测定的方法，生物活性可以保持在相差20％，优选10％以内(在测定误差内)。
对于临床体内使用，本发明的偶联物将以溶液或冻干固体的形式提供，可以重新溶解在无菌水中以用于注射。偶联物给药方式的实例如下：每天一次，每周一次，每两周一次，每三周一次，每次四周一次或每月一次，共周，静脉推注。在50至1000mL生理盐水中给药，任选地可向其中添加人血清白蛋白(例如0.5至1mL人血清白蛋白浓缩溶液，100mg/mL)。每周的剂量约为50μg至20mg/kg体重，静脉给药(每次注射10μg至200mg/kg)。治疗后周，患者可能会接受第二个疗程。关于给药方式，辅料，稀释剂，剂量，时间等的具体临床方案可以由熟练的临床医生确定。
用体内或体外的方法杀死选定的细胞群体，进行治疗的医学病症包括任何类型的癌症的恶性肿瘤，自身免疫性疾病，移植排斥和感染(病毒，细菌或寄生虫)。
实现所需生物学效应所需的偶联物的量将取决于许多因素，包括偶联物的化学特性、效力和生物利用度、疾病类型、患者所属的人种、属于患者的疾病状态、给药途径、这些因素都决定着所需剂量、给药方式和给药方案。
一般而言，本发明的偶联物以0.1至10％w/v偶联物含量的生理缓冲液的形式，供肠胃外施用。典型剂量范围为1μg/kg至0.1g/kg体重，每天、每周、每两周、每三周或每月一次，优选的剂量范围是人体等效剂量0.01mg/kg至25mg/kg体重，每周、每两周、每三周或每月一次。药物的优选剂量可能取决于下列变量，如疾病或病症的进展的类型和程度，特定患者的总体健康状况，所选化合物的相对生物学功效，药物的制剂，给药方式(静脉内，肌肉内或其他)，结合物通过所选递送途径的药代动力学特性，给药速度(推注或连续输注)和给药方案(在给定时间内重复次数)。
经由本发明的偶联物也能够以单位剂型给药，其中术语“单位剂量”是指能够施用于患者并且易于处理和包装的单剂量，如下所述，可以是保持物理和化学稳定单位剂量，可以是具有活性的偶联物或者药学上可接受的组合物。因此，典型的每日/每周/每两周/每月的总剂量范围是0.01至100mg/kg体重。作为一般指导，人类的单位剂量范围为1mg至3000mg，每天或每周，每两周，每三周或每月一次。优选地，单位剂量范围是1至500mg，每月一次至四次，甚至更优选地，1mg至100mg每两周一次，每两周一次或每三周一次。通过与一种或多种药学上可接受的辅料混合，可以将本发明提供的偶联物配制成药物组合物。这样的单位剂量组合物可以通过口服使用，特别是以片剂，简单胶囊或软胶囊的形式；或鼻内给药，特别如散剂，滴鼻剂或气雾剂形式；或在皮肤上使用，例如局部使用药膏、乳霜、乳液、凝胶或喷雾剂，或通过透皮贴剂。所述组合物可以方便地以单位剂量形式给药，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备，例如，Remington中所记载：The Science and Practice ofPharmacy，21th ed.；Lippincott Williams&Wilkins：Philadelphia，PA，2005。
所述制剂包括药物组合物，其中本发明的化合物配制用于口服或肠外给药。对于口服给药，片剂、丸剂、粉末、胶囊、片剂等可含有一种或多种以下成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素或黄蓍胶，稀释剂如淀粉或乳糖，崩解剂如淀粉和纤维素衍生物，润滑剂如硬脂酸镁，助流剂如胶体二氧化硅，甜味剂如蔗糖或糖精，调味剂如薄荷或水杨酸甲酯。胶囊可以是硬胶囊或软胶囊的形式，其通常由明胶混合物，任选地可与增塑剂混合，以及淀粉胶囊制成。此外，给药剂型也包含改变其物理形式的各种其他材料，例如糖、虫胶或肠溶剂涂层。其他口服剂型的糖浆或丹药可能含有甜味剂、防腐剂、染料、着色剂和调味剂。此外，活性化合物可以制成快速溶解、改性释放或缓释制剂，其中缓释制剂优选为双峰型。优选的片剂含有任何组合的乳糖、玉米淀粉、硅酸镁、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮、硬脂酸镁或滑石。
用于非肠道给药的液体制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳剂的剂型。液体组合物可以包括粘合剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、甜味剂、调味剂和着色剂等。非水性溶剂包括醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和有机酯如油酸乙酯。水性载体包括醇和水的混合物、缓冲介质和盐水。尤其是，生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以被用作辅料，控制活性化合物释放。静脉注射载体可包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格葡萄糖的补充剂等。其他可能有用的活性化合物的肠外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。
替代的给药方式包括吸入制剂，包括干粉、气雾剂或滴剂。它们可以是水溶液，含有如聚氧乙烯-9-脲基醚、甘胆酸酯和脱氧胆酸酯，油状溶液，以滴鼻液形式给药，或是鼻内施用的凝胶。用于口腔给药的制剂，包括锭剂或锭片，还可以含调味基料，如蔗糖或阿拉伯胶，以及其他辅料，如甘胆酸盐。适合直肠给药的制剂优选单位剂量栓剂，具有固体基载体，如可可脂，并且可以包括水杨酸盐。局部应用于皮肤的制剂优选软膏、乳膏、乳液、膏剂、凝胶、喷雾、气雾剂或油的形式。可使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇或它们的组合。适用于透皮给药的制剂可以是离散的贴片，可以是亲脂性乳液或缓冲水溶液，溶解和/或分散在聚合物或粘合剂中。
在另一个实施例中，包含治疗有效量的如式(V)，(VI)，(VII)的偶联物或本申请所述的任何偶联物的药物组合物，可以与其他治疗剂同时施用，例如化学治疗剂，放射疗法，免疫治疗剂，自身免疫疾病剂，抗感染剂或其他偶联物，协同有效地治疗或预防癌症，自身免疫性疾病或传染性疾病。协同药物或放射治疗可以在施用偶联物之前或之后施用，或者在施用本发明的偶联物前或之后至少一小时、12小时、一天、一周、两周、三周、一个月，或者是在数个月之前或之后。
协同剂优选自以下药物中的一种或几种：阿巴西普，阿贝西比利，醋酸阿比特龙，Abraxane，对乙酰氨基酚/氢可酮，Acalabrutinib，Aducanumab，Adalimumab，ADXS31-142，ADXS-HER2，阿法替尼双马来酸酯，Aldesleukin alectinib，Alemtuzumab，Alitretinoin，ado-trastuzumab emtansine，安非他命/右旋苯丙胺，阿那曲唑，阿立哌唑，蒽环类药物，阿立哌唑，阿扎那韦，阿妥唑单抗，阿托伐他汀，阿韦拉单抗，阿昔布西汀，Brentuximabvedotin，Brigatinib，Budesonide，Budesonide/福莫特罗，Bupre-norphine，Cabazitaxel，Cabozantinib，Capmatinib，Capecitabine，carfilzomib，嵌合抗原受体工程T(CAR-T)细胞，Celecoxib，Ceritinib，Cetuxib，Cetuximab，克唑替尼，克比美替尼，科森蒂斯，克唑替尼，CTL019，达比加群，达布拉非尼，达卡巴嗪，达克珠单抗，达科替尼，达托霉素，达拉他珠单抗，达比波锡阿尔法，达鲁那韦，达沙替尼，地尼洛芬，地诺单抗，Depakote，地兰索拉唑，地塞哌甲酯，地塞米松，Dinutuximab，多西环素，度洛西汀，Duvelisib，Durvalumab，依洛珠单抗，/埃洛珠单抗/艾美洛韦，依诺肝素，恩沙替尼，恩扎鲁胺，依泊汀阿尔法，厄洛替尼，埃索美拉唑，依佐匹克隆，依那西普，依维莫司，依西美坦，依维莫司，艾塞那肽ER，依泽替米贝，依泽替米贝/辛伐他汀，非诺贝特，非格拉斯汀，芬戈利莫德，丙酸氟替卡松，氟替卡松/沙美特罗，Fulvestrant，Gazyva，吉非替尼，Glatiramer，醋酸高斯瑞林，伊克替尼，伊马替尼，伊布替尼，伊布替尼，依德利西布，异环磷酰胺，英夫利昔单抗，咪喹莫特，ImmuCyst，Immuno BCG，伊尼帕里、阿斯巴肽胰岛素、地塞米尔胰岛素、甘精胰岛素、利斯普洛胰岛素、α-干扰素、α-1b干扰素、α-2a干扰素、α-2b干扰素、β-干扰素、β-1a干扰素、β-1b干扰素、γ-1a干扰素、拉帕蒂尼、伊普利单抗、异丙托品溴铵/沙丁胺醇、异唑MIB、卡努马、醋酸兰诺肽、利奈多明，利奈酰胺，甲磺酸利奈替尼，来曲唑，左旋甲状腺素，左旋甲状腺素，利多卡因，利奈唑胺，利拉鲁肽，利地塞米松，LN-144氯雷替尼，美金刚，甲基哌啶酮，美托洛尔，Mekinist，美西他滨/利吡韦林/替诺福韦，莫达非尼，莫米松，Mycidac-C，尼西妥单抗，Neratinib，尼洛替尼，尼拉帕利布，尼古拉单抗，Ofatumumab，奥比妥珠单抗，奥拉帕尼，奥美沙坦，奥美沙坦/氢氯噻嗪，奥马珠单抗，Omega-3脂肪酸乙酯，Oncorine，Oseltamivir，Osimertinib，羟考酮，Palbociclib，帕利珠单抗，帕尼单抗，Panobinostat，帕唑帕尼，Pembrolizumab，PD-1抗体，PD-L1抗体，培美曲塞，帕妥珠单抗，肺炎球菌结合疫苗，泊马利度胺，普瑞巴林，ProscaVax，普萘洛尔，喹硫平，雷贝拉唑，普鲁巴新223氯化镭，雷洛昔芬，雷洛昔韦，雷莫昔单抗，雷珠单抗，雷戈非尼，利妥昔单抗，利伐沙班，罗米地辛，瑞舒伐他汀，鲁索替尼磷酸盐，沙丁胺醇，Savolitinib，Semaglutide，Sevelamer，西地那非，Siltuximab，Sipuleucel-T，西他列汀，西他列汀/二甲双胍，Solifenacin，Solanezumab，Sonidegib，索拉非尼，舒尼替尼，Tacrolimus，Tacrimus，塔帕西拉非，Tacrimustataparal，他唑帕尼，替莫唑胺，替西罗莫司，替诺福韦/恩曲他滨，替诺福韦二吡呋酯富马酸酯，睾丸激素凝胶，沙利度胺，TICE BCG，碘托溴铵，替沙吉林，托瑞米芬，曲美替尼，曲妥珠单抗，曲贝汀(Ecteinascidin 743)，曲美替尼，曲美单抗，三氟吡啶/替吡西酯，维甲酸，Uro-BCG，Ustekinumab，Valsartan，Veliparib，Vandetanib，Vemurafenib，Venetoclax，Vorinostat，Ziv-aflibercept，Zostavax及其类似物，衍生物，药学上可接受的盐，载体，稀释剂或辅料，或其组合。
本专利申请中用于偶联的药物/细胞毒性剂可以是本专利中描述的任何药物/细胞毒性剂的类似物和/或衍生物。药物/细胞毒性剂领域的技术人员将容易理解，本文所述的每种药物/细胞毒性剂都可以以一定的方式被修饰，使所得化合物仍保留原始化合物的特异性和/或活性。技术人员还将理解，可以使用许多这些类似物或衍生物来代替本文所述的药物类似物。因此，本发明的药物/细胞毒性剂也包括这些类似物和衍生物。
另一方面，本发明的偶联物和工艺可以应该本领域技术人员众所周知的许多方式实现。例如偶联物中使用的喜树碱类似物可以应用或采用下文中的合成方法，或如本领域技术人员所了解的其它调整的技术方案。对本领域技术人员而言，适当的修饰和取代是显而易见的，且众所周知的，或易于从科学文献中获得的。特别地，例如，这些方法是可以从R.C.Larock，Comprehensive Organic Transformations，2nd Edition，Wiley-VCHPublishers，1999得到。
在下文所述的反应中，可能需要保护最终产物中所需的反应性官能团，例如羟基，氨基，亚氨基，硫代或羧基，以避免它们参与反应。可以根据标准操作规程，使用常规保护基团，例如P.G.Wuts和T.W.Greene，Greene's Protective groups in Organic Synthesis，Wiley Interscience第四版(2006)中所述。一些反应可以在碱，酸或合适的溶剂存在下进行。对该反应中使用的碱，酸和溶剂的性质没有特别的限制，并且在这种类型的反应中常规使用的任何碱，酸或溶剂，亦可在此同等地使用，只要它对分子其他部分没有不利影响。反应可以在很宽的温度范围内进行。通常，我们发现在-80℃至150℃(更优选为约室温至100℃)的温度下进行反应是方便的。反应所需的时间也可以在较大范围内变化，这取决于许多因素，特别是反应温度和试剂的性质。但是，如果反应在上述优选条件下进行，则3小时至20小时的时间通常就足够了。
反应后处理可以通过常规方法进行。比如，可以通过从反应混合物中蒸馏出溶剂后得到反应产物，或者如果需要，在从反应混合物中蒸馏出溶剂后，将残余物倒入水中，然后用与水不混溶的有机溶剂萃取，再从中蒸馏出溶剂。另外，如果需要，可以使用众所周知的技术进一步纯化产物，例如重结晶，再沉淀或各种色谱技术，特别是柱色谱或制备型薄层色谱。
本发明的工艺过程可以用以下实施例进一步说明，但本申请不受限于以下实施例中的描述。前文和以下实施例中引用的所有文献均以其全部内容引做参考。
实施例
下文的实施例进一步描述本发明，但这些实施例无意于限制本发明的范围。以下示例中的细胞系除非另有说明，根据美国典型培养物保藏中心(ATCC)或德国DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DMSZ)或中国科学院上海细胞培养所指定的条件进行培养。除非另有说明，细胞培养试剂来自Invitrogen Corp.。所有无水溶剂都通过商业途径获得，并在氮气下储存在Sure-Seal瓶中。PEG化合物购自中国嘉兴的BiomatrikInc。一些化合物，当未明确来源时，由中国境内CRO公司(例如药明康德，皓元生物，瑞博制药)提供。实验动物通过GemPharmatech.Co.，Ltd，Najing，China和ShanghaiSLAC Laboratory Animal Co.，Ltd.，Shanghai，China，采购自国家遗传工程小鼠资源库。T-DM1通过中国香港的一家药房从罗氏公司购买。所有其他试剂和溶剂均以市售最高等级购买，无需进一步纯化即使用。用Varain PreStar HPLC进行制备HPLC分离。HPLC分析在Agilent 1260上进行。质谱数据来自配备有Waters Acquity UPLC分离模块和Acquity TUV检测器的Waters Xevo QTOF质谱仪。NMR光谱分析在浙江理工大学化学系WNMR-I 400MHz仪器上进行。化学位移(δ)以百万分率(ppm)报告，以四甲基硅烷0.00ppm作基准，偶合常数(J)以Hz报告。C，H和/或N的元素分析由浙江理工大学化学系提供，在Elementar UNICUBE上进行。在Agilent ICPOES 730ICP-MS上进行金属原子的定量分析。
实施例1.丙-2-胺氯化锌络合物(Z-01)的合成
将氯化锌(6.0g，44.03mmol)溶解在50mL甲醇中并在冰水浴中冷却至约5℃。将丙-2-胺(10.4g，176.11mmol)溶解在60mL甲醇中，然后滴加进氯化锌的甲醇溶液，同时保持溶液温度低于5℃。在胺溶液滴加过程中，缓慢出现白色固体沉淀。滴加完成后，将溶液自然升温至室温并缓慢搅拌过夜，产生更多的白色固体沉淀。将200mL乙酸乙酯加入到混合物中，并将混合物搅拌10分钟。将得到的白色固体过滤，用甲醇洗涤，之后用真空泵干燥，得到8.9g锌丙烷-2-胺氯化络合物，为灰白色固体，79.4％收率。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝3.61(s，4H)，3.12-3.06(m，2H)，1.12(d，J＝6.3Hz，12H)。元素分析，计算值：C，28.32；H，7.13；N，11.01；实测值：C，28.08；H，7.10；N，11.20。
实施例2.乙醇胺氯化锌络合物(Z-02)的合成
实验步骤同实施例1，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和乙醇胺(10.8g，176.11mmol)作为起始物，得到8.2g氯化乙醇胺锌络合物，为灰白色固体，72.6％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ3.77(s，2H)，3.50(t，J＝5.6Hz，2H)，2.69(t，J＝5.7Hz，2H).元素分析，计算值：C，18.59；H，5.46；N，10.84；实测值：C，18.25；H，5.02；N，10.30。
实施例3.二乙醇胺氯化锌络合物(Z-03)的合成
(Z-03)
实验步骤同实施例1，以氯化锌(6.0g，44.03mmol)和二乙醇胺(18.5g，176.11mmol)为起始物，得到12.2g二乙醇胺氯化锌络合物，为灰白色固体，80.4％收率。1HNMR(400MHz，DMSO)δ4.60(s，2H)，3.59(m，8H)，3.35(m，4H)，2.72(s，8H)。元素分析，计算值：C，27.73；H，6.40；N，8.08；实测值：C，27.25；H，6.05；N，7.80。
实施例4.高哌嗪氯化锌配合物(Z-04)的合成
实验步骤与实施例1相同，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和哌嗪(15.2g，176.11mmol)作为起始物，得到9.2g氯化高哌嗪锌络合物，为灰白色固体，73.6％收率。1HNMR(400MHz，DMSO)δ4.34(s，2H)，3.01–2.85(m，8H)，1.87–1.75(m，2H).元素分析，计算值：N，11.85；实测值：N，11.50。
实施例5.哌嗪氯化锌络合物(Z-05)的合成
步骤同实施例1，以氯化锌(6.0g，44.03mmol)和哌嗪(15.2g，176.11mmol)为起始物，得到7.6g哌嗪氯化锌络合物，为灰白色固体，收率94.0％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ2.73(s，8H)。元素分析，计算值：C，21.60；H，4.53；N，12.59；实测值：C，21.10；H，4.69；N，12.30。
实施例6.邻苯二胺氯化锌络合物(Z-06)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和邻苯二胺(19.1g，176.11mmol)作为起始物，得到9.5g邻苯二胺氯化锌络合物，为灰白色固体，88.3％收率。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝6.55-6.51(m，2H)，6.43-6.39(m，2H)，4.43(s，4H).元素分析，计算值：C，29.48；H，3.30；N，11.46；实测值：C，29.70；H，3.63；N，11.30。
实施例7.丙二胺氯化锌络合物(Z-07)的合成
步骤同实施例1，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和丙二胺(13.0g，176.11mmol)作为起始物，得到8.1g丙二胺氯化锌络合物，为灰白色固体，87.4％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ3.93(s，2H)，3.82(s，2H)，2.86–2.66(m，2H)，2.24(s，1H)，1.09(d，J＝6.5Hz，3H)。元素分析，C3H10Cl2N2Zn(207.95)计算值：C，17.12；H，4.79；Cl，33.70；N，13.31；Zn，31.07。
实施例8.1，2-环己烷二胺氯化锌络合物(Z-08)的合成
步骤同实施例1，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和1，2-环己二胺(20.1g，176.11mmol)作为起始物，得到8.5g 1，2-环己二胺氯化锌络合物，为灰白色固体，77.7％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ3.89(s，4H)，2.27–2.11(m，2H)，1.65(d，J＝9.9Hz，2H)，1.59–1.45(m，2H)，1.32-1.26(m，2H)，1.19-1.14(m，2H)。元素分析，计算值C6H14Cl2N2Zn(247.98)：N，11.18；Zn，26.10，实测值N，10.88；Zn，25.95。
实施例9.甲胺氯化锌络合物(Z-09)的合成
步骤同实施例1，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和甲胺盐酸盐(20.1g，176.11mmol)作为起始物，得到9.5g甲胺氯化锌络合物，为灰白色固体，94.0％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.71(s，6H)，2.37(d，J＝3.6Hz，6H)。元素分析，计算值C2H10Cl2N2Zn(195.95)：N，14.12；Zn，32.95，实测值N，13.96；Zn，32.82。
实施例10.乙胺氯化锌络合物(Z-10)的合成
步骤同实施例1，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和乙胺溶液(19.9g，176.11mmol，40％w.t)作为起始物，得到8.3g乙胺氯化锌络合物，为灰白色固体，84.0％收率。1HNMR(400MHz，DMSO)δ3.76–3.50(m，4H)，2.66(q，J＝7.2Hz，4H)，1.10(t，J＝7.2Hz，6H)。元素分析，C4H14Cl2N2Zn(223.98)计算值：N，12.37；Zn，28.87，实测值N，12.08；Zn，28.72。
实施例11.2-甲基丙烷-1，2-二胺氯化锌络合物(Z-11)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和2-甲基丙烷-1，2-二胺(15.5g，176.11mmol)作为起始物，得到7.8g 2-甲基丙烷-1，2-二胺氯化锌络合物，为灰白色固体，收率79.6％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ4.02(s，2H)，3.78(s，2H)，2.43(d，J＝5.6Hz，2H)，1.12(s，6H)。元素分析，C4H12Cl2N2Zn(221.97)计算值：N，12.48；Zn，28.80；实测值：N，12.35；Zn，28.58。
实施例12.(3R，4S)-四氢呋喃-3，4-二胺氯化锌络合物(Z-12)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(2.0g，14.68mmol)和(3R，4S)-四氢呋喃-3，4-二胺(5.1g，29.35mmol)作为起始物，得到3.8g(3R，4S)-四氢呋喃-3，4-二胺氯化锌络合物，为灰白色固体，83.7％收率。
实施例13.吡咯烷氯化锌络合物(Z-13)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和吡咯烷(15.5g，176.11mmol)作为起始物，得到11.0g吡咯烷氯化锌络合物，为灰白色固体，90.4％收率。1HNMR(400MHz，DMSO)δ4.46(s，2H)，2.85(t，J＝6.2Hz，8H)，1.81–1.65(m，8H)。元素分析，计算值C8H18Cl2N2Zn(276.01)：N，10.06；Zn，23.47.实测值：N，9.88；Zn，23.59。
实施例14.N-甲基咪唑氯化锌络合物(Z-14)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和N-甲基咪唑(14.5g，176.11mmol)作为起始物，得到10.0g N-甲基咪唑氯化锌络合物，为灰白色固体，90.4％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.09(s，2H)，7.39(d，J＝1.4Hz，2H)，
7.06(t，J＝1.3Hz，2H)，3.77(s，6H)。元素分析，计算值C8H12Cl2N4Zn(297.97)：N，18.64；Zn，21.76；实测值：N，18.40；Zn，21.58。
实施例15.哌啶氯化锌络合物(Z-15)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和哌啶(15.0g，176.11mmol)作为起始物，得到10.5g哌啶氯化锌络合物，为灰白色固体，收率77.8％。1HNMR(400MHz，DMSO)δ4.00(s，2H)，2.80(t，J＝4.6Hz，8H)，1.61–1.45(m，12H)。元素分析，C10H22Cl2N2Zn(304.04)计算值：N，9.14；Zn，21.33；实测值：N，8.83；Zn，21.50。
实施例16.吡啶氯化锌络合物(Z-16)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和吡啶(13.9g，176.11mmol)作为起始物，得到9.5g吡啶氯化锌络合物，为灰白色固体的，73.2％收率。1HNMR(400MHz，DMSO)δ8.61(dt，J＝4.4，1.7Hz，4H)，7.94–7.86(m，2H)，7.49(ddd，J＝7.6，4.4，1.5Hz，4H)。元素分析：计算值C10H10Cl2N2Zn(291.95)：N，9.51；Zn，22.20.实测值：N，9.35，Zn，21.90。
实施例17.2-甲基吡啶氯化锌络合物(Z-17)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和2-甲基吡啶(16.1g，176.11mmol)作为起始物，得到11.3g 2-甲基吡啶氯化锌络合物，为灰白色固体，79.6％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.48(ddd，J＝5.0，1.9，0.9Hz，2H)，7.72(td，J＝7.7，1.9Hz，2H)，7.29(d，J＝7.8Hz，2H)，7.22(ddd，J＝7.7，5.4，1.2Hz，2H)，2.50(s，6H)。元素分析：计算值C12H14Cl2N2Zn(319.98)：N，8.69；Zn，20.27；实测值：N，8.35，Zn，20.12。
实施例18.6-甲基吡啶-2-胺氯化锌络合物(Z-18)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和6-甲基吡啶-2-胺(12.7g，117.41mmol)作为起始物，得到2.3g 6-甲基吡啶-2-胺氯化锌络合物，为灰白色固体，32.0％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.25(dd，J＝8.2，7.2Hz，1H)，6.34(d，J＝7.2Hz，1H)，6.23(d，J＝8.2Hz，1H)，5.75(s，2H)，2.23(s，3H)。元素分析：计算值C6H8Cl2N2Zn(241.94)：N，11.46；Zn，26.75；实测值：N，11.25，Zn，26.48。
实施例19.吗啉氯化锌络合物(Z-19)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(6.0g，44.03mmol)和吗啉(15.2g，176.11mmol)作为起始物，得到8.1g吗啉氯化锌络合物，为灰白色固体，收率为89.5％。1HNMR(400MHz，DMSO)δ3.64–3.59(m，8H)，2.79(dd，J＝5.6，4.0Hz，8H)。化学结构：C8H18Cl2N2O2Zn；精确分子量：308.0037；元素分析：N，9.02；Zn，21.05，实测值：N，8.81；Zn，20.75。
实施例20.甲基哌嗪氯化锌络合物(Z-20)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和甲基哌嗪(11.8g，117.41mmol)作为起始物，得到8.1g甲基哌嗪氯化锌络合物，为灰白色固体，收率为82.5％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ2.81(t，J＝5.0Hz，8H)，2.37(s，8H)，2.15(s，6H)。化学式：C10H24Cl2N4Zn；精确分子量：334.0669；元素分析：N，16.64；Zn，19.42，实测值：N，16.80；Zn，18.98。
实施例21.吡啶-2-基甲烷胺氯化锌络合物(Z-21)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和吡啶-2-基甲烷胺(12.7g，117.41mmol)作为起始物，得到6.2g吡啶-2-基甲烷胺氯化锌络合物，为灰白色固体，收率为86.8％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.55(dt，J＝5.2，1.4Hz，1H)，7.99(td，J＝7.7，1.7Hz，1H)，7.58–7.53(m，1H)，7.51(ddd，J＝7.5，5.2，1.2Hz，1H)，4.09(s，2H)，4.06(s，2H)。化学式：C12H16Cl2N4Zn；精确分子量：350.0043；元素分析：N，15.89；Zn，18.54，实测值：N，16.21；Zn，18.72。
实施例22.4-甲基噻唑氯化锌络合物(Z-22)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和4-甲基噻唑(11.6g，117.41mmol)作为起始物，得到6.5g 4-甲基噻唑氯化锌络合物，为灰白色固体，66.2％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ9.02(d，J＝2.0Hz，2H)，7.33(dt，J＝2.0，1.0Hz，2H)，2.43(d，J＝1.0Hz，6H)。
实施例23.4-甲苯-1，2-二胺氯化锌络合物(Z-23)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和4-甲苯-1，2-二胺(14.3g，117.41mmol)作为起始物，得到5.8g 4-甲苯-1，2-二胺氯化锌络合物，为灰白色固体，77.0％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ6.42(d，J＝7.7Hz，1H)，6.36(d，J＝2.0Hz，1H)，6.21(dd，J＝7.7，2.0Hz，1H)，4.30(s，4H)，2.08(s，3H)。化学式：C7H10Cl2N2Zn；精确分子量：255.9513；元素分析：N，10.84；Zn，25.30；实测值：N，10.42；Zn，25.73。
实施例24.2，3-丁二胺氯化锌络合物的合成(Z-24)
步骤与实施例1相同，将氯化锌(800mg，5.87mmol)和2，3-丁二胺(939.2mg，5.87mmol)作为起始物，得到1.90g 2，3-丁二胺氯化锌络合物，为灰白色固体，87.1％收率。1HNMR(400MHz，DMSO)δ8.61(s，5H)，3.54-3.47(m，2H)，1.29(d，J＝6.5Hz，6H)。
实施例25.恶唑氯化锌络合物(Z-25)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和恶唑(8.1g，117.41mmol)作为起始物，得到7.8g恶唑氯化锌络合物，为灰白色固体，收率为96.8％。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.41(d，J＝0.9Hz，2H)，8.16(t，J＝0.9Hz，2H)，7.27(d，J＝0.9Hz，2H)。化学式：C6H6Cl2N2O2Zn；精确分子量：271.9098；元素分析：N，10.21；Zn，23.83；实测值：N，9.91；Zn，23.70。
实施例26.噻唑氯化锌络合物(Z-26)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和噻唑(10.1g，117.41mmol)作为起始物，得到6.5g噻唑氯化锌络合物，为灰白色固体，72.3％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ9.17(d，J＝1.9Hz，2H)，7.99(d，J＝3.2Hz，2H)，7.82(dd，J＝3.2，1.9Hz，2H)。化学式：C6H6Cl2N2S2Zn；精确分子量：303.8641；元素分析：N，9.14；Zn，21.33；实测值：N，8.96；Zn，20.94。
实施例27.2-氯噻唑氯化锌络合物(Z-27)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和2-氯噻唑(14.0g，117.41mmol)作为起始物，得到7.0g的2-氯噻唑氯化锌络合物，为灰白色固体，63.5％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.78(d，J＝3.6Hz，2H)，7.72(d，J＝3.6Hz，2H).化学式：C6H4Cl4N2S2Zn；精确分子量：371.7861；元素分析：N，7.46；Zn，17.41；实测值：N，7.11；Zn，17.72。
实施例28.4-甲基噁唑氯化锌络合物(Z-28)的合成
步骤与的实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和4-甲基噁唑(9.8g，117.41mmol)作为起始物，得到6.0g 4-甲基噁唑氯化锌络合物，为灰白色固体，67.5％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.26(s，2H)，7.82(p，J＝1.2Hz，2H)，2.11(d，J＝1.3Hz，6H)。元素分析：计算值C8H10Cl2N2O2Zn(299.94)：N，9.34.实测值：N，8.95。
实施例29.2-乙酰吡啶氯化锌络合物(Z-29)的合成
步骤与的实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和2-乙酰吡啶(14.2g，117.41mmol)作为起始物，得到9.0g的2-乙酰吡啶氯化锌络合物，为灰白色固体，81.0％收率。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.75(ddd，J＝4.7，1.7，1.0Hz，1H)，8.05–7.95(m，2H)，7.68(ddd，J＝7.3，4.7，1.5Hz，1H)，2.65(s，3H)。
实施例30.4-二甲基氨基吡啶氯化锌络合物(Z-30)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和4-二甲基氨基吡啶(7.2g，58.70mmol)作为起始物，得到9.1g 4-二甲基氨基吡啶氯化锌络合物，为灰白色固体，81.5％收率。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.08–8.02(m，4H)，6.80–6.76(m，4H)，3.04(s，12H)。元素分析：计算值C14H20Cl2N4Zn：Zn，16.80；N，14.71.实测值：Zn，17.23；N，14.80。
实施例31.4-(吡咯-1-基)吡啶氯化锌络合物(Zn-31)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和4-(吡咯-1-基)吡啶(7.2g，58.70mmol)，得到8.5g 4-(吡咯-1-基)吡啶氯化锌络合物，为灰白色固体，66.8％收率。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.07–8.01(m，4H)，6.66–6.59(m，4H)，2.02–1.93(m，8H)。
实施例32.1-(吡啶-2-基)乙基-1-胺氯化锌络合物(Zn-32)的合成
步骤与实施例1相同，将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和1-(吡啶-2-基)乙基-1-胺(3.6g，29.35mmol)作为起始物，得到6.6g 1-(吡啶-2-基)乙基-1-胺氯化锌络合物，为灰白色固体，87.1％收率。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.61(dt，J＝5.0，1.4Hz，1H)，8.10(td，J＝7.7，1.7Hz，1H)，7.67(dt，J＝8.1，1.1Hz，1H)，7.62(ddd，J＝7.5，5.2，1.2Hz，1H)，4.51(s，2H)，4.43(q，J＝6.8Hz，1H)，1.49(d，J＝6.7Hz，3H)。元素分析：计算值C7H10Cl2N2Zn：Zn，24.74；N，10.83。实测值：Zn，25.19；N，10.84。
实施例33 2，2’-联吡啶氯化锌络合物(Zn-33)的合成
将氯化锌(4.0g，29.35mmol)和2，2’-联吡啶(4.6g，29.35mmol)作为起始物，得到6.5g 2，2’-联吡啶氯化锌络合物，为灰白色固体，75.2％收率。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.77–8.54(m，4H)，8.22(t，J＝7.9Hz，2H)，7.76–7.63(m，2H)。元素分析：计算值C10H8Cl2N2Zn：Zn，21.86；N，9.57.实测值：Zn，22.56；N，9.58。
实施例34.N，N-二甲基哌啶-4-胺(1)的合成
将N-Boc哌啶酮(10g，0.05mol)溶于甲醇(100mL)中，加入二甲胺水溶液(25mL，0.22mol)和10％Pd/C(1g)，将反应烧瓶抽空并重新充满氢气，然后在室温下搅拌。过滤后，将滤液浓缩并与二氯甲烷共沸浓缩三次(3×80mL)，在真空泵浓缩以除去所有二甲胺。将盐酸/甲醇(4M，50mL)加入残余物中并在室温搅拌30分钟。大量白色固体沉淀出来，过滤混合物得到白色固体1(9g，90％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C7H16N2，129.13；实测值129.13。
实施例35.(9H-芴-9-基)4-(二甲氨基)哌啶-1-羧酸甲酯(2)的合成
将化合物13(2.0g，9.9mmol)溶于1，4-二恶烷和水(30mL/50mL)的混合溶液中，加入碳酸氢钠(2.5g，29.8mmol)，将混合物冷却至0℃。滴加9-芴基甲氧基碳酰氯(3.1g，11.9mmol)的1，4-二恶烷(10mL)溶液。加入后，温度逐渐升高至室温。并将反应搅拌1小时。加入100mL 1M盐酸，用乙酸乙酯(3×50mL)洗涤混合物，水相用碳酸钠调节至pH～10，然后用二氯甲烷(3×50mL)萃取。合并的有机相用水(50mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并通过柱色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化，得到化合物2(2.75g，79％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C22H26N2O2，351.20；实测值351.20。
实施例36.(S)-叔丁基(1-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸酯(3)的合成
将对氨基苯甲醇(5.0g，0.04mol)和Boc-L-丙氨酸(8.0g，0.042mol)溶于无水四氢呋喃(100mL)，加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(11g，0.044mol)并在室温下搅拌过夜。将反应混合物倒入水(300mL)中，用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，合并的有机相用水(100mL)洗涤，硫酸钠干燥，过滤，浓缩。粗产物用乙酸乙酯/石油醚(1：3)打浆，过滤得到化合物3(9.8g，84％收率)，为白色固体。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C15H22N2O4：295.16；实测值295.16。
实施例37.(S)-叔丁基(1-((4-(溴甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸酯(4)的合成
将化合物3(3.5g，11.9mmol)和四溴化碳(5.9g，17.8mmol)溶于二氯甲烷(80mL)中，冷却至约0℃，加入三苯膦(4.7g，17.8mmol)。将反应升温至室温，搅拌30分钟后，加入硅胶20g，混匀，用旋转蒸发仪浓缩，上样到硅胶柱(硅胶100g)，用石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到化合物4(2.6克，62％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C15H21BrN2O3：357.07；实测值357.07。
实施例38.(S)-1-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N-(4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酰胺基)苄基)-N，N-二甲基哌啶-4-溴化铵(5)的合成
将化合物4(2.3g，6.4mmol)和化合物2(2.7g，7.7mmol)溶解于无水四氢呋喃(50mL)中，并在室温下搅拌过夜。在旋转蒸发仪上除去大部分四氢呋喃后，将乙酸乙酯(50mL)加入到残余物中。将所得浆液过滤，得到白色固体(4.5g，100％收率)。ESI-MS m/z：M+计算值C37H47N4O5：627.35；实测值627.35。
实施例39.(S)-N-(4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酰胺基)苄基)-N，N-二甲基哌啶-4-溴化铵(6)的合成
将化合物5(1.0g，1.41mmol)溶于DMF(5mL)中，加入哌啶(1mL)。在室温搅拌30分钟后，加入30mL乙酸乙酯，搅拌10分钟。过滤混合物得到白色粉末状固体(550mg，80％收率)。ESI-MS m/z：M+：计算值C22H37N4O3：405.29；实测值405.29。
实施例40.N-(4-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酰胺基)苄基)-1-(((S)-4-乙基-4，9-二羟基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-溴化铵(7)的合成
向10-羟基喜树碱(375mg，1.03mmol)的乙酸(5mL)溶液中加入化合物6(550mg，1.13mmol)和37％甲醛(92mg，1.13mmol)的乙酸溶液(5mL)。将混合物加热至约65℃并搅拌1小时，然后浓缩，与无水甲醇共沸浓缩。在二氯甲烷和少量甲醇中重结晶，得到化合物7(0.5g，63％收率)，为黄色粉末。ESI-MS m/z：M+C43H53N6O8：计算值781.39；实测值781.39.
实施例41.N-(4-(S)-2-氨基丙胺基)苄基)-1-(S)-4-乙基-4，9-二羟基-3，14-二氧基-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-溴化铵(8)的合成
将化合物7(50mg，0.058mmol)溶解于二氯甲烷和三氟乙酸的混合物(2mL/6mL)中，并在室温下搅拌30分钟。然后将混合物浓缩并在真空泵上干燥，得到化合物8(44mg，100％收率)，为黄色固体。ESI-MS m/z：M+C38H45N6O6：计算值681.34；实测值681.34。
实施例42.N-(4-(S)-2-(4-(2，5-二氧-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁胺基)丙胺基)苄基)-1-(S)-4-乙基-4，9-二羟基-3，14-二氧-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-甲酸铵(9)的合成
将化合物8(88mg，0.116mmol)和N-琥珀酰亚胺基4-马来酰亚胺-丁酸酯(49mg，0.140mmol)溶解于DMF(5mL)中，冷却至约0℃，然后加入N，N-二异丙基乙胺(40μL，0.232mmol)。将反应加热至室温，搅拌2小时，浓缩，并通过制备HPLC(乙腈/含甲酸的水)纯化，得到化合物9(66mg，68％收率)。ESI-MS m/z：M+计算值C46H52N7O9：846.38；实测值846.38。
实施例43.1-(叔丁基)5-(五氟苯基)((苄氧基)羰基)-L-谷氨酸(11)的合成
向Cbz-L-Glu-OtBu(135g，0.40mol)的二氯甲烷(2.0L)溶液中加入五氟苯酚(147g，0.80mol)和DIC(202g，1.6mol)。在室温下搅拌1小时，然后浓缩得到标题化合物的粗品(500g)。
实施例44.(S)-30-(苄氧基羰基)氨基)-27-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧代-26-氮杂三十一烷-31-甲酸叔丁基酯的合成(12)
向mPEG8-NH2(153g，0.4mol)的DMF(2.5L)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(206g，1.6mol)和化合物11(500g，0.4mol，粗品)，并在室温下搅拌1小时。所得溶液用二氯甲烷共沸浓缩，稀释，用水洗涤。用二氯甲烷反萃取水层。用0.2N盐酸和盐水洗涤合并的有机相，在无水硫酸钠上干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法纯化(50％乙酸乙酯/石油醚至纯乙酸乙酯，然后10％甲醇/二氯甲烷)得到标题化合物(260g，93％收率)。
实施例45.(S)-30-((苄氧基)羰基)氨基)-27-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧代-26-氮杂三十一烷-31-甲酸(13)的合成
将化合物12(255g，363mmol)溶于二氯甲烷(500mL)和HCOOH(1.0L)中，然后在室温下搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷(3L)稀释并用水(1.5L×3)洗涤。将有机相浓缩并用乙酸乙酯(1.5L)稀释，用5％ NaHCO3溶液(3L)萃取。使用浓盐酸将水层调节至pH 2～3，然后用二氯甲烷萃取，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到标题化合物(230g，98％收率)。
实施例46.五氟苯酚基(S)-30-(((苄氧基)羰基)氨基)-27-氧杂-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26-氧杂三十一烷-31-酯(14)的合成
向化合物13(220g，340mmol)的二氯甲烷(2.5L)的溶液中加入五氟苯酚(125g，680mmol)和DIC(171g，1.36mol)。将反应在室温下搅拌1小时，然后浓缩得到标题化合物的粗品(550g)。
实施例47.(S)-30-(((苄氧基)羰基)氨基)-27，31-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，32-二氧杂三十六烷-36叔丁基酯(15)的合成
向4-氨基丁酸叔丁酯(65.0g，410mmol)的DMF(2.5L)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(175g，1.36mol)。然后在10-20℃下加入化合物14(550g，0.34mol，粗品)，并将所得混合物在室温下搅拌1小时。真空除去DMF，残余物用二氯甲烷(2L)稀释，用水、0.2N盐酸和盐水洗涤两次，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。用柱色谱法纯化(50％乙酸乙酯/石油醚至纯乙酸乙酯，然后0至5％甲醇/二氯甲烷)得到标题化合物，为黄色油状物(240g，90％收率)。
实施例48.(S)-30-氨基-27，31-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧代-26，32-二氮杂三十六烷-36-叔丁基酯(16)的合成
向化合物15(220g，0.28mol)的甲醇(1.0L)溶液中加入Pd/C(20g，10％Pd/C，含水50％)。混合物在室温下催化加氢(1atm H2)过夜，然后过滤并浓缩，得到标题化合物(167g，91％收率)。
实施例49.(S)-30-(4-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁胺基)-27，31-二氧代-2，五，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，32-二氮杂三十六烷-36-叔丁基酯(17)的合成
向化合物16(167g，0.26mmol)的DMF(1.0L)中加入N，N-二异丙基乙胺(132g，1.02mol)和五氟苯基4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸酯(250g，0.26mol，粗品)。将混合物搅拌1小时，然后浓缩并用二氯甲烷(2.0L)稀释，用水、0.2N盐酸和盐水洗涤两次，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过硅胶柱色谱法(50-100％乙酸乙酯/石油醚和0-10％甲醇/二氯甲烷)，得到标题化合物，为淡黄色油状物(201g，94％收率)。
实施例50.(S)-30-(4-(2，5-二氧代-2，5二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-27，31-二氧基-2，4，8，11，14，17，20，23-八氧代-26，32-二氮杂三十六烷-36-乙酸(18)的合成
将化合物17(16.8g，20.5mmol)溶于二氯甲烷(60mL)和甲酸(120mL)中，然后在室温下搅拌过夜。将反应混合物浓缩并用乙酸乙酯(150mL)萃取。将氯化钠固体加入到水相中直至饱和，并用二氯甲烷(200mL×2)萃取溶液。有机相用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析(0～20％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物(16.4g，含甲酸的粗品)。ESIMS m/z：[M+H]+计算值C34H59O15N4 763.39；实测值763.29。
实施例51.2，5-二氧吡咯烷-1-基(S)-30-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁胺基)-27，31-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧基-26，32-二氮杂三十六烷-36-酯(19)的合成
向化合物18(15.6g，20.5mol)的二氯甲烷(200mL)的溶液中加入NHS(3.7g，32.3mmol)和EDC·HCl(8.3g，43.0mmol)，并在室温下搅拌反应30min，然后用盐水洗涤，在无水硫酸钠上干燥，过滤并浓缩，得到无色油化合物(17.6g、100％收率)。ESIMS m/z：[M+H]+计算值C38H62O17N5 860.41；实测值860.29。
实施例52.N-(4-(9S，17S)-9-(4-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-17-甲基-6，10，15-三氧代-2-氧杂-5，11，16-三氮杂十八酰胺)苄基)-1-((S)-4-乙基-4，9-二羟基-3，14-二氧-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-10-基)甲基-N，N-二甲基哌啶-4-甲酸铵(20)的合成
将化合物8(44mg，0.058mmol)和化合物19(60mg，0.065mmol)溶解于DMF(5mL)中，冷却至约0℃，然后加入N，N-二异丙基乙胺(20μL，0.116mmol)。将反应升温至室温，搅拌2小时，浓缩，通过制备HPLC(乙腈/含甲酸水)纯化，得到化合物20(51mg，58％收率)。ESI-MS m/z：M+计算值C72H101N10O20：1425.72；实测值1425.72。
实施例53.1-(2-氨基-4-氟-5-甲氧基苯基)-2-氯乙酮(21)的合成
将3-氟-4-甲氧基苯胺(5g，35.4mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液滴加到冰水冷却的三氯化硼(1M在二氯甲烷中，38.9mL)溶液中。将反应搅拌10分钟，然后加入氯乙腈(3.2g，42.5mmol)和三氯化铝(5.2g，38.9mmol)。加入完成后，将反应升温至室温。然后回流过夜。然后将反应混合物冷却至约0℃，用2M盐酸(80mL)淬灭并在室温下搅拌2个小时。分离各层，水相用二氯甲烷(3×80mL)萃取。合并的有机相用水(100mL)洗涤，硫酸钠干燥，过滤，浓缩，在硅胶柱上纯化，用石油醚/乙酸乙酯洗脱，得到化合物21(2g，26％收率)，为黄色固体。ESI-MS m/z：[M+H]+C9H9ClFNO2计算值：218.03；实测值218.03。
实施例54.(S)-11-(氯甲基)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮(22)的合成
将化合物21(0.50g，2.29mmol)和(S)-4-乙基-4-羟基-7，8-二氢-1H-吡喃并[3，4-f]吲嗪-3，6，10(4H)-三酮(0.57g，2.19mmol)溶解于无水甲苯(40mL)中，加入对甲苯磺酸(42mg，0.219mmol)。将悬浮液加热回流2天并冷却至室温。除去约三分之二的甲苯后，过滤残余物，滤饼用二氯甲烷洗涤，自然干燥，得到化合物22(0.7g，72％收率)，为灰色粉末状固体。ESI-MS m/z：[M+H]+C22H18ClFN2O5计算值：445.09；实测值445.09。
实施例55.N-(4-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)丙胺基)苄基)-1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃[3'，4'：6，7]吲嗪[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-氯化铵(23)的合成
在0℃，将化合物22(218mg，0.49mmol)、化合物6(200mg，0.49mmol)在DMF(5mL)中的混合物搅拌30分钟，然后加入三乙胺(63μL，0.45mmol)并继续搅拌1小时。将反应浓缩并通过制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到黄色固体状的化合物23(240mg，59％收率)。
实施例56.N-(4-((S)-2-氨基丙酰胺)苄基)-1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧基-4，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-胺(24)的合成
将化合物23(50mg，0.06mmol)溶解于二氯甲烷和三氟乙酸(2mL/6mL)的混合物中，并在室温下搅拌30分钟。然后将混合物浓缩并在真空泵上干燥，得到化合物24(42mg，100％收率)，为黄色固体。ESI-MS m/z：M+C39H46FN6O6计算值：713.35；实测值713.35。
实施例57.N-(4-((30S，38S)-30-(4-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-38-甲基-27，31，36-三氧基-1，5，8，11，14，17，20，23-八氧基-26，32，37-三氮杂三十九酰胺基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧-3，4，12，14-四氢-4-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-甲酸铵(25)
将化合物24(47mg，0.060mmol)和化合物19(60mg，0.66mmol)溶解于DMF(5ml)中，冷却至约0℃，然后加入N，N-二异丙基乙胺(21μL，0.12mmol)。将反应物自然升温至室温并搅拌2小时，浓缩，并通过制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物25(23mg，25％收率)。ESI-MS m/z：M+C73H102FN10O20计算值：1457.73；实测值1457.73。
实施例58.(S)-11-(氨基甲基)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮(26)的合成
将化合物22(80mg，0.18mmol)溶于乙醇(5mL)中，加入六亚甲基四胺(76mg，0.54mmol)，将混合物回流90分钟，然后冷却至室温。加入浓盐酸(100μL)，搅拌30分钟。浓缩后，得到灰白色固体，将其通过制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物26(40mg，52％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C22H20FN3O5计算值：426.14；实测值426.14。
实施例59.(S)-2-(4-(2，5，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰氨基)-N1-(4-((((S)-4-(S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，4，12，14，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'，4'：6，7]吲哚并[1，2，2-b]喹啉-10-基)甲基)-4-氧代丁基)-N5-(2，5，5，8，11，14，14，17，17，20，23-八氧杂二十五烷-4-(((((S)-4-((S)-4，4，4，4，4-25-基)戊二酰胺(27)
将化合物26(40mg，0.094mmol)和化合物19(120mg，0.13mmol)溶于DMF(5mL)中，冷却至约0℃，然后加入N，N-二异丙基乙胺(33μL，0.188mmol)。将反应自然升温至室温，并搅拌2小时，浓缩，通过制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物27(55mg，50％收率。)ESI-MS m/z：[M+H]+C56H76FN7O19计算值：1170.52；实测值1170.52。
实施例60.(1-甲基哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯的合成(28)
将4-(叔丁氧基羰基氨基)哌啶(2g，10mmol)溶于甲醇(30mL)中，然后加入37％甲醛(1.6g，20mmol)和10％Pd/C(0.2g)。将反应在1atm氢气下搅拌过夜后过滤。浓缩滤液，得到化合物28(2.1g，100％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C11H22N2O2计算值：215.17；实测值215.17。
实施例61.(S)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-1-((4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-1-甲基哌啶-1-氯化鎓(29)的合成
将化合物22(50mg，0.112mmol)和化合物28(26mg，0.123mmol)的DMF(3mL)溶液在室温下搅拌2个小时。将反应溶液通过制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物29(33mg，47％收率)。ESI-MS m/z：[M]+C33H40FN4O7计算值：623.29；实测值623.29。
实施例62.(S)-4-氨基-1-((4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-1-甲基哌啶-1-鎓(30)的合成
将化合物29(30mg，0.053mmol)溶于二氯甲烷和三氟乙酸(3mL/1mL)的混合物中，并在室温下搅拌30分钟。然后浓缩并在真空泵上干燥，得到化合物30(33mg，100％收率)。ESI-MS m/z：[M]+C28H32N4O5计算值：477.21；实测值477.21。
实施例63.4-((S)-30-(4-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁胺基)-27，31-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧代-26，32-二氮杂三十六酰胺)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4]：6，7]吲哚唑并[1，2-b]喹啉1-甲基哌啶-1-甲酸鎓(31)的合成
将化合物30(30mg，0.053mmol)和化合物19(60mg，0.079mmol)溶于DMF(5mL)中，冷却至约0℃，然后加入N，N-二异丙基乙胺(18μL，0.106mmol)。将反应升温至室温。搅拌2小时，浓缩，通过制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物31(15mg，21％收率)。ESI-MSm/z：[M]+C62H88FN8O19计算值：1267.61；实测值1267.61。
实施例64.(9H-芴-9-基)甲基4-甲基哌嗪-1-羧酸酯(32)的合成
将1-甲基哌嗪(5.0g，50.0mmol)溶于1，4-二恶烷和水(60mL/100mL)中，加入碳酸氢钠(12.6g，150mmol)，冷却混合物至0℃。滴加9-芴基甲氧基碳酰氯(15.5g，60.0mmol)的1，4-二恶烷(20mL)溶液。加入后，温度逐渐升高至室温，并将反应搅拌3小时。加入300mL 1M盐酸，混合物用乙酸乙酯(2×100mL)洗涤，水相用碳酸钠调节至pH～10，然后用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。合并的有机相用水(250mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并通过柱色谱法(甲醇/二氯甲烷)纯化，得到化合物32(6.5g，40％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C20H22N2O2，323.17；实测值323.19。
实施例65.(S)-4-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-1-(4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酰胺基)苄基)-1-甲基哌嗪-1-溴化鎓(33)的合成
将化合物4(2.3g，6.4mmol)和化合物32(2.1g，6.4mmol)溶解在无水四氢呋喃(100mL)中，并在室温下搅拌过夜。在旋转蒸发仪上除去大部分四氢呋喃后，将乙酸乙酯(200mL)加入到残余物中。将所得浆液过滤，得到白色固体(3.8g，87％收率)。ESI-MS m/z：M+计算值C35H43N4O5：599.32；实测值599.32。
实施例66.(S)-1-(4-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酰胺基)苄基)-1-甲基哌嗪-1-溴化铵(34)的合成
将化合物33(3.12g，4.6mmol)溶于DMF(25mL)中，加入哌啶(3mL)。在室温搅拌后2小时后，加入200mL乙酸乙酯，搅拌10分钟。过滤混合物得到白色固体(1.54g，77％收率)。ESI-MS m/z：M+计算值C20H33N4O3：377.26；实测值377.26。
实施例67.1-(4-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)丙酰胺)苄基)-4-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧基-2，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(35)的合成
将化合物34(0.30g，0.66mmol)、化合物22(0.25g，0.56mmol)在DMF(10mL)中的混合物在0℃搅拌30分钟，然后将N，N-二异丙基乙胺(49μL，0.28mmol))加入并将反应自然升温至室温。搅拌过夜，浓缩，通过制备HPLC纯化(含甲酸的乙腈/水)，得到化合物35(0.40g，80％收率)。ESI-MS m/z：M+C42H50FN6O8计算值：785.37；实测值785.37。
实施例68.1-(4-((S)-2-氨基丙烷基)苄基)-4-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧基-4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(36)的合成
将化合物35(0.30g，0.35mmol)溶于二氯甲烷和三氟乙酸(3mL/3mL)的混合物中，并在室温下搅拌30分钟。然后将混合物浓缩并在真空泵上干燥，得到化合物36(0.27g，100％收率)，为黄色固体。ESI-MS m/z：M+C37H42FN6O6计算值：477.21；实测值477.21。
实施例69.1-(4-((S)-2-(4-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙胺基)苄基)-4-(S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲唑并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-1-甲基哌嗪-1-甲酸鎓(37)的合成
将化合物36(50mg，0.065mmol)和N-琥珀酰亚胺4-马来酰亚胺基丁酸酯(30mg，0.098mmol)溶于DMF(3mL)中，然后加入N，N-二异丙基乙胺(45μL，0.26mmol)，将反应在室温搅拌30分钟，浓缩，并通过制备C-18HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物37(37mg，61％收率)。ESI-MS m/z：M+计算值C45H49FN7O9：850.36；实测值850.36。
实施例70.1-(4-((30S，38S)-30-(4-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-38-甲基-27，31，36-三氧基-1，5，8，11，14，17，20，23-八氧基-26，32，37-三氮杂三十九酰胺基)-4-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧-3，4，12，14-四氢-4-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-1-甲基哌嗪-1-甲酸鎓(38)的合成
将化合物36(70mg，0.092mmol)溶解于DMF(2mL)中，向其中加入化合物18(70mg，0.092mmol)的DMF溶液中，浓缩后，依次加入HATU(52mg，0.138mmol)和三乙胺(52μL，0.368mmol)，并在室温下搅拌反应30分钟。浓缩后，通过制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化残余物，得到化合物38(50.9mg，37％收率)。ESI-MS m/z：[M]+C71H98FN10O20计算值：1429.69；实测值1429.69。
实施例71.1-(4-((S)-17-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-甲基-4，14-二氧代-7，10-二氧-3，13-二氮杂十七酰胺)苄基)-4-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧基-4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-1-甲基-1-甲基哌嗪-1-甲酸鎓(39)的合成
将化合物36(0.10g，0.13mmol)的DMF(1mL)溶液和2，5-二氧吡咯烷-1-基3-(2-(2-(4-(2，5-二氧基-2，5二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)乙氧基)丙酸酯(57mg，0.13mmol)的DMF(2mL)溶液混合，然后加入N，N-二异丙基乙胺(90μL，0.52mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，浓缩，用制备HPLC纯化(含甲酸乙腈/水)，得到化合物39(50.9mg，39％收率)。ESI-MS m/z：M+C52H62N8O12计算值：1009.45；实测值1009.45。
实施例72.(S)-3-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸(40)的合成
冰水浴中，向2-氨基-3-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸(1g，4.90mmol)和NaHCO3饱和溶液(20ml)中加入2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸甲酯(1.52g，9.80mmol)。将反应搅拌30分钟，然后倒入含有100ml乙酸乙酯的分液漏斗中，分离有机相，用50ml水和50ml盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到化合物40(1.39g，72％收率)。
实施例73.(S)-五氟苯基3-((叔丁氧羰基)氨基)-2-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸酯(41)的合成
将化合物40(0.10g，0.35mmol)溶解于二氯甲烷(30mL)中，然后加入五氟苯酚(97mg，0.52mmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.13g，0.7mmol)。将反应在室温下搅拌2小时，用二氯甲烷(50mL)稀释，水(200mL)洗涤，硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到化合物41(0.16g，100％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C18H15F5N2O6：451.09；实测值451.09。
实施例74.化合物42的合成
将化合物36(0.05g，0.065mmol)和化合物41(45mg，0.10mmol)溶于DMF(3mL)中，然后加入N，N-二异丙基乙胺(45μL，0.26mmol)。将反应在室温下搅拌1小时，浓缩并通过制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物42(35mg，52％收率)。ESI-MS m/z：M+C49H56FN8O11计算值：951.41；实测值951.41。
实施例75.1-(4-(S)-2-((S)-3-氨基-2-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺)丙酰胺)苄基)-4-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧基-4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓(43)的合成
将化合物42(35mg，0.03mmol)溶解于二氯甲烷(2mL)，并与三氟乙酸(1mL)反应。在室温搅拌后1小时，浓缩反应混合物，与二氯甲烷共沸蒸发两次，用真空泵干燥，得到化合物43(30.4mg，96％收率)。ESI-MS m/z：M+C44H48FN8O9计算值：851.35；实测值851.35。
实施例76.(S)-叔丁基(1-((4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)哌啶-4-基)氨基甲酸酯(44)的合成
将化合物22(50mg，0.11mmol)溶于DMF(3mL)中，然后加入哌啶-4-基-氨基甲酸叔丁酯(25mg，0.12mmol)并在室温下搅拌5小时。将混合物浓缩并通过制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物44(30mg，45％收率)。ESI-MS m/z：
[M+H]+计算值C32H37FN4O7：609.26；实测值609.26。
实施例77.(S)-11-((4-氨基哌啶-1-基)甲基)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮(45)的合成
将化合物44(30mg，0.03mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)中，并与三氟乙酸(2mL)反应。在室温搅拌1小时后，浓缩混合物，与二氯甲烷共沸蒸发两次，真空泵干燥，得到化合物45(25.4mg，100％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C27H30FN45计算值：509.21；实测值509.21。
实施例78.(S)-2-(4-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-N1-(4-(1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)哌啶-4-氨基)-4-氧丁基)-N5-(5，5，8，11，14，14，11，12，14，14，15 17，20，23-八氧杂二十五烷-25-基)戊二酰胺(46)的合成
将化合物45(25.4mg，0.05mmol)溶解于DMF(2mL)中，向其中加入化合物19(38.1mg，0.05mmol)，然后依次加入HATU(28.5mg，0.08mmol)和三乙胺(14μL，0.1mmol)，将反应在室温下搅拌1小时，浓缩并通过制备HPLC(乙腈/含有甲酸的水)纯化，得到化合物46(14.4mg，23％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C61H85FN8O19计算值：1253.59；实测值1253.59。
实施例79.双(2-(2，2，2-三氟乙酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(47)的合成
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在0℃下，向二亚乙基三胺(6.18g，60mmol)的二氯甲烷(120mL)溶液中滴加三氟乙酸乙酯(18.75g，132mmol)的二氯甲烷(60mL)溶液。将溶液搅拌30分钟，然后升温至室温，并搅拌1小时。在室温下滴加二碳酸二叔丁酯(28.78g，132mmol)和三乙胺(13.33g，132mmol)的二氯甲烷(60mL)溶液，并搅拌过夜。将反应混合物用饱和碳酸钠(2×200mL)、水(2×200mL)、盐水(200mL)洗涤，硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯)纯化，得到白色固体(17.4g，73.3％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C13H19F6N3O4计算值：396.30；实测值396.28。
实施例80.双(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(48)的合成
将化合物47(4.28g，10.8mmol)溶解在甲醇(50mL)中，并在室温下与氢氧化钠(5.42g，135mmol)的水(50mL)溶液一起搅拌3小时。将反应浓缩，用二氯甲烷(3×100mL)萃取，有机相用盐水(100mL)洗涤，硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到化合物3(1.8g，82％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C9H21N3O2计算值：204.28；实测值204.12。
实施例81.4，4’-(((叔丁氧羰基)氮杂二基)双(乙烷-2，1-二基))双(氮杂二基))二(4-氧代丁酸)(49)的合成
将化合物48(1.8g，8.8mmol)溶于二氯甲烷(150mL)中，加入琥珀酸酐(2.2g，22.1mmol)。在室温搅拌过夜，将反应浓缩并在硅胶柱上纯化，用二氯甲烷/甲醇洗脱，得到化合物49(2.99g，84％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C17H29N3O8计算值：404.43；实测值404.11。
实施例82.双((S)-4-乙基-4-羟基-3，14-二氧基-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-9-基)4，4'-((叔丁氧羰基)氮杂二基)双(乙烷-2，1-二基))双(氮杂二基)双(4-氧代丁烷酸酯)(50)的合成
向化合物49(853mg，2.1mmol)和(S)-4-乙基-4，9-二羟基-1，12-二氢-14H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H)-二酮(1.71g，4.7mmol)的DMF(100mL)溶液中，依次加入三乙胺(948mg，9.4mmol)以及HATU(1.79g，4，7mmol)。将所得混合物搅拌过夜，然后浓缩，通过硅胶柱(二氯甲烷/甲醇)纯化，得到化合物50(2.84g，100％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C57H57N7O16计算值：1097.10；实测值1097.65。
实施例83.双((S)-4-乙基-4-羟基-3，14-二氧基-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-9-基)4，4'-((氮杂二基双(乙烷-2，1-二基))双(氮杂二苯基))双(4-氧代丁酸酯)(51)的合成
将化合物50(2.84g，2.1mmol)溶于二氯甲烷(40mL)，加入三氟乙酸(20mL)。反应在室温下搅拌1小时，然后浓缩，得到化合物51(3.3g，100％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C52H49N7O14计算值：996.98；实测值996.60。
实施例84.(S)-(S)-4-乙基-4-羟基-3，14-二氧基-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-9-基30-(4-(2，5-二氧-2，5-氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-37-(2-(4-((S)-4-4-乙基-4-羟基-3，14-二氧杂-3，4，12，14-四羟基-1H-吡喃并[3'，6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-9-基)氧基)-4-氧代丁胺基)乙基)-27，31，3641-四氧基-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧基-26，32，37，40-四氮杂四十四烷-44-酯(52)的合成
向化合物51(614mg，0.60mmol)和化合物19(470mg，0.60mmol)的DMF(20mL)溶液中依次加入三乙胺(249mg，2.5mmol)和HATU(234mg，0.60mmol)。将混合物搅拌40分钟，然后浓缩，通过硅胶柱纯化(甲醇/二氯甲烷)，得到化合物52(46mg，5％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C86H105N11O28：17410.81；实测值1742.01。
实施例85.(S)-4-乙基-4-羟基-9-甲氧基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮(53)的合成
将10-羟基喜树碱(2.5g，6.86mmol)溶解于DMF(150mL)中，加入碳酸钾(1.90g，13.72mmol)和甲基碘(1.17g，8.23mmol)，在室温下搅拌反应过夜，向反应混合物中加入石油醚(150mL)和乙酸乙酯(150mL)的混合溶剂并搅拌。沉淀出黄色固体并过滤收集，然后分散在水(20mL)中。滴加1N盐酸至pH 7，再次过滤，得到化合物53(1.0g，38％收率)。ESI-MSm/z：[M+H]+计算值C21H18N2O5 379.38；实测值379.05。
实施例86.双((S)-4-乙基-9-甲氧基-3，14-二氧基-2，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪[1，2-b]喹啉-4-基)(((叔丁氧羰基)氮杂二基)双(乙烷-2，1-二基))二氨基甲酸酯的合成(54)
将化合物53(350mg，0.9mmol)，4-二甲氨基吡啶(339mg，2.8mmol)和三光气(93mg，0.34mmol)在N2下碾碎并均匀混合，然后滴加无水二氯甲烷(8mL)并搅拌10分钟。向混合物中加入化合物48(64mg，0.34mmol)的无水二氯甲烷(4mL)溶液，最后加入三乙胺(93mg，0.9mmol)。搅拌15分钟后，浓缩溶液，并通过硅胶柱(甲醇/二氯甲烷)纯化，得到化合物54(200mg，22％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C53H53N7O14：1013.03；实测值1013.26。
实施例87.双((S)-4-乙基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-4-基)(氮杂二碘(乙烷-2，1-二基))二氨基甲酸酯(55)的合成
将化合物54(200mg，0.2mmol)溶解于二氯甲烷(10ml)中，并与三氟乙酸(5ml)反应4小时。浓缩反应混合物得到化合物55(0.43g，100％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C48H45N7O12计算值：912.91；实测值912.62。
实施例88.双((S)-4-乙基-9-甲氧基-3，14-二氧基-4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-4-基)(((4-(2，5-二氧-2，5-氢-1H-吡咯-1-基)丁酰基)氮杂二酰基)双(乙烷-2，1-二酰基))二氨基甲酸酯(56)的合成
向化合物55(249mg，0.27mmol)和4-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸(60mg，0.32mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入三乙胺(112μL，0.81mmol)和HATU(104mg，0.27mmol)。搅拌反应40分钟，然后用水(20ml)洗涤。有机相浓缩后通过制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物56(50mg)。ESI-MS m/z：
[M+H]+C56H52N8O15计算值1078.06；实测值1078.77。
实施例89.(S)-N，N′-(((((2S，20S)-11-(叔丁氧羰基)-2，20-二甲基-4，7，15，18-四氧基-3，8，11，14，19-五氮杂二十一烷-1，21-二酰基)双(氮杂二酰基))双(4，1-亚苯基))双(亚甲基)双(1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-2，14-二氧基-1，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓)(57)的合成
将化合物24(96mg，0.132mmol)和化合物49(26mg，0.066mmol)溶解在DMF(3mL)中，并冷却至0℃。加入HATU(50mg，0.132mmol)和N，N-二异丙基乙胺(46μL，0.264mmol)，加入完成后在0℃下搅拌30分钟。将反应粗品在制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)(含有0.1％甲酸的乙腈/水)上直接纯化，得到化合物57(80mg，67％收率)。ESI-MS m/z：[M]2+计算值C91H109F2N15O18：868.90；实测值868.90.
实施例90.(S)-N，N′-(((((2S，20S)-2，20-二甲基-4，7，15，18-四氧基-3，8，11，14，19-五氮二十一烷-1，21-二酰基)双(氮杂二基))双(4，1-亚苯基))双(亚甲基)双(1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-4，14-二氧基-2，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓)(58)的合成
将化合物57(80mg，0.043mmol)溶解在二氯甲烷和三氟乙酸(3ml/1ml)的混合物中，并在室温下搅拌30分钟。将反应混合物浓缩，得到化合物58(100％收率)。ESI-MS m/z：[M]2+计算值C86H101F2N15O16：818.87；实测值818.87。
实施例91.(S)-N，N'-(((((2S，20S)-11-((S)-30-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-27，31-二氧代-2，2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，32-二氮杂三十六烷-36-酰基)-2，20-二甲基-4，7，15，18-四氧代-3，8，11，14，19-戊氮杂二十一烷-1，21-二酰基)双(氮杂二基)双(4，1-亚苯基))双(亚甲基)双(1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓)(59)的合成
在0℃下，向化合物58(74mg，0.043mmol)和化合物19(39mg，0.0516mmol)的DMF(3mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(15μL，0.086mmol)。将反应升温至室温并搅拌2小时。浓缩后，通过制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化残余物，得到化合物59(12mg)。ESI-MS m/z：[M]2+计算值C120H157F2N19O30：1191.06；实测值1191.06。
实施例92.2，2'-((叔丁氧羰基)氮杂二基)二乙酸(60)的合成
将亚氨基二乙酸(5.0g，37.6mmol)溶解在四氢呋喃(50mL)和水(50mL)中，与NaHCO3(12.6g，150mmol)混合。在约5℃下缓慢加入Boc2O(9.8g，45.1mmol)，然后将反应升温至室温并搅拌2天。将反应混合物用水(100mL)稀释，用乙酸乙酯(2×30mL)洗涤，然后用浓盐酸调节至pH 1.0。溶液用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并的有机相用水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，用乙酸乙酯/石油醚打浆得到白色固体(5.5g，63％收率)。ESI-MSm/z：[M+H]+计算值C9H15NO6：234.09；实测值234.09。
实施例93.(S)-1，1'-((((2S，2'S)-2，2'-((叔丁氧羰基)氮杂二基)双(乙酰基))双(氮杂二基))双丙酰基)双(氮杂二基)双(4，1-亚苯基)双(亚甲基))双(4-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓)甲酸盐(61)的合成
将化合物36(109mg，0.12mmol)和化合物60(14mg，0.06mmol)的DMF(3mL)溶液冷却至0℃，加入HATU(50mg，0.132mmol)和N，N-二异丙基乙胺(84μL，0.48mmol)。将反应在0℃搅拌30分钟，然后通过制备C-18HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物61(61mg，62％收率)。ESI-MS m/z：[M]2+计算值C83H95F2N13O16：783.85；实测值783.85。
实施例94.(S)-1，1′-(((((2S，2′S)-2，2′-((2，2’-氮杂二基双(乙酰基))双(氮杂二基))双(丙酰基))双((4，1-亚苯基))双(亚甲基))双(4-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧基-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓)甲酸盐(62)的合成
将化合物61(61mg，0.036mmol)溶解在三氟乙酸/二氯甲烷(1mL/3mL)中并在室温下搅拌30分钟。将反应混合物用甲苯(4mL)稀释并浓缩至干，得到化合物62(59.3mg，>100％收率)。ESI-MS m/z：[M]2+计算值C78H87F2N13O14：733.82；实测值733.82。
实施例95.1-(4-((30S，41S)-30-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-37-(2-((S)-1-((4-)((4-(S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪[1，2-b]喹啉-11-甲基)-1-甲基-哌嗪-1-鎓-1-基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-41-甲基-27，31，36，39-四氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧基-26，32，37，40-四氮杂四十二酰胺基)-苄基)-4-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-1-甲基哌嗪-1-鎓-甲酸盐(63)的合成
将化合物62(65mg，0.036mmol)和化合物18(27mg，0.036mmol)的DMF(3mL)溶液冷却至0℃，加入HATU(17.5mg，0.046mmol)和N，N-二异丙基乙胺(26μL，0.144mmol)。在0℃搅拌30分钟，然后通过制备C-18HPLC(含有2％甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物63(39mg，62％收率)。ESI-MS m/z：[M]2+计算值C112H143F2N17O28：1106.01；实测值1106.01。
实施例96.(S)-N，N′-((((2S，2’s)-2，2′-((叔丁氧羰基)氮杂二基)双(乙酰基))双(氮杂二基))双(丙酰基))双(氮杂二基)双(4，1-亚苯基))双(亚甲基)双(1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓)甲酸盐(64)的合成
向冷却至0℃的化合物24(106mg，0.113mmol)和化合物60(13mg，0.056mmol)的DMF(3mL)溶液中，加入HATU(43mg，0.113mmol)和N，N-二异丙基乙胺(39μL，0.226mmol)。将反应搅拌4小时，然后通过制备C-18HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物64(71mg，74％收率)。ESI-MS m/z：[M]2+计算值C87H103F2N13O16：811.8801；实测值811.8875。
实施例97.(S)-N，N′-(((((2S，2’s)-2，2′-((2，2’-氮杂二基双(乙酰基))双-(氮杂二基))双(丙酰基))双(氮杂二基)双(4，1-亚苯基))双(亚甲基)双(1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓)甲酸盐(65)的合成
将化合物64(71mg，0.041mmol)溶解在三氟乙酸/二氯甲烷(1mL/3mL)中并在室温下搅拌30分钟。将反应混合物用甲苯(5mL)稀释并浓缩至干，得到化合物65(70mg，>100收率)。ESI-MS m/z：[M]2+计算值C82H95F2N13O14：761.8539；实测值761.8595。
实施例98.S N-(4-((30S，41S)-30-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-37-(2-(((S)-1-((4-(((1-)(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)哌啶-4-基)二甲基胺)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)-41-甲基-27，31，36，39-四氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧基-26，32，37，40-四氮杂四十二酰胺基)-苄基)-1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓甲酸盐(66)的合成
向冷却至0℃的化合物65(70mg，～0.041mmol)和化合物18(32mg，0.041mmol)的DMF(4mL)的溶液中，加入HATU(19mg，0.049mmol)和N，N-二异丙基乙胺(28μL，0.164mmol)。将反应搅拌4小时，然后通过制备C-18HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物66(43mg，45％收率)。ESI-MS m/z：[M]2+计算值C116H151F2N17O28：1134.04；实测值1134.04。
实施例99.4-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)丙酰胺)苄基(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)氨基甲酸酯(67)的合成
向化合物3的二氯甲烷(2mL)溶液中加入三光气(30mg，0.094mmol)和三乙胺(37μL，0.282mmol)。然后将反应物自然升温至室温并搅拌1小时，浓缩至干。将化合物26(100mg，0.235mmol)溶于DMF(2ml)中并冷却至0℃，向其中加入三乙胺(37μL，0.282mmol)和上述氯甲酸酯。加入完成后，将所得混合物在0℃下搅拌1小时，然后通过制备C-18HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物67(122mg，70％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C38H40FN5O10：746.2838；实测值746.2898。
实施例100.4-(S)-2-氨基丙烷)苄基(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-
二氧代-4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)氨基甲酸酯的合成(68)
将化合物67(122.5mg，0.164mmol)溶解在三氟乙酸/二氯甲烷(1ml/3ml)中，并在室温下搅拌30分钟。将反应混合物用甲苯(4mL)稀释并浓缩至干，得到化合物68(120.2mg，100％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C33H32FN5O8：646.22；实测值646.22。
实施例101.叔丁基双(2-(((S)-1-((4-((((((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)氨甲酰)氧基)苯基)氨基-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸酯的合成(69)
向冷却至0℃的化合物68(120mg，0.164mmol)和化合物60(19mg，0.082mmol)的DMF(3mL)溶液中，加入HATU(62mg，0.164mmol)和N，N-二异丙基乙胺(57μL，0.328mmol)。将反应搅拌8小时，浓缩，然后通过制备C-18HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物69(171mg，70％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C75H76F2N11O20：1488.5237；实测值1488.5295。
实施例102.((((2S，2’s)-2，2′-((2，2’-氮杂二基双(乙酰基)双(氮杂二基)-双(丙炔基)双((4，1-亚苯基))双(亚甲基)双(((s)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)氨基甲酸酯的合成(70)
将化合物69(171mg，0.115mmol)溶解在三氟乙酸/二氯甲烷(1mL/3mL)中，并在室温下搅拌30分钟。将反应混合物浓缩至干，得到化合物70(172mg，>100％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C70H68F2N11O18：1388.46；实测值1388.46。
实施例103.((((2S，2’s)-2，2'-(((S)-30-(4-(2，5-二氧基-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-27，31，36-三氧代-37-(2-氧代乙基)-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，32，37-三氮杂三十九烷-39-酰基)双(氮杂二基)双(4，1-亚苯基)双(亚甲基)双((((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)氨基甲酸酯)(71)的合成
向冷却至0℃的化合物70(172mg，0.115mmol)和化合物18(87mg，0.115mmol)的DMF(3mL)溶液中，加入HATU(52mg，0.138mmol)和N，N-二异丙基乙胺(40μL，0.23mmol)。将反应搅拌4小时，然后通过制备C-18HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物71(122mg，50％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C104H123F2N15O32：2132.84；实测值2132.84。
实施例104.(S)-4-乙基-8-氟-4，9-二羟基-11-甲基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮(72)的合成
将1-(2-氨基-4-氟-5-羟基苯基)乙酮(0.41g，2.5mmol)和(S)-4-乙基-4-羟基-7，8-二氢-1H-吡喃[3，4-f]吲嗪-3，6，10(4H)-三酮(0.62g，2.5mmol)溶于无水甲苯(40mL)中，并加入对甲苯磺酸(46mg，0.25mmol)。将悬浮液回流加热3天，冷却至室温除去溶剂后，用柱层析纯化残余物，得到化合物72(0.69克，收率73％)，为灰色粉末状固体。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C21H17FN2O5：397.11；实测值397.16。
实施例105.(S)-9-(2-溴乙氧基)-4-乙基-8-氟-4-羟基-11-甲基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪-3，14(4H，12H)-二酮的合成(73)
将化合物72(0.69g，1.74mmol)，无水1，2-二溴乙烷(6.4g，34.8mmol)和无水K2CO3(1.2g，8.7mmol)在无水DMF(10mL)中，80℃下机械搅拌16小时。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，过滤后的残留物用DMF充分洗涤。将合并的滤液和洗涤液真空浓缩至干，得到深色残留物，用柱层析纯化(0-5％甲醇/二氯甲烷)，得到化合物73(0.74g，85％)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C23H20BrFN2O5：503.05；实测值503.05。
实施例106.(S)-9-(2-溴乙氧基)-4-乙基-8-氟-4-羟基-11-甲基-10-硝基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮的合成(74)
在0℃下，向搅拌的浓H2SO4(1mL)中缓慢加入化合物73(0.74g，1.47mmol)，将所得澄清溶液冷却至-10℃。将浓硫酸(0.5mL)和发烟硝酸(0.5mL)的混合物预冷却至-10℃，滴加到上述冷却的反应混合物中。将反应混合物升温至0℃，再搅拌1小时，然后缓慢倒在冰片上。将黄色沉淀物过滤收集，并用水，冷的乙醇和乙醚洗涤。洗涤液通过硅藻土垫再次过滤，然后用30％甲醇/二氯甲烷(50mL)洗涤硅藻土滤饼。将有机溶剂蒸发得到了更多的黄色固体。将所有黄色固体合并，用乙醇打浆得到化合物74(0.74g，92％)。ESI-MS m/z[M+H]+：计算值C23H19BrFN3O7：548.04；实测值548.14。
实施例107.(S)-10-氨基-9-(2-溴乙氧基)-4-乙基-8-氟-4-羟基-11-甲基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮的合成(75)
0℃下，向搅拌的浓盐酸溶液(18mL)中，分小份加入化合物74(0.50g，0.91mmol)，15分钟后将所得澄清溶液冷却至-10℃。向反应混合物中分小份加入SnCl2(0.86g，4.55mmol)，并自然升温至室温，搅拌1.5小时，然后慢慢倒在冰块上。过滤收集沉淀，用乙醇和Et2O洗涤，洗涤液用10％甲醇/二氯甲烷萃取。将有机溶液与过滤的沉淀溶解在30％甲醇/二氯甲烷中，然后通过短硅胶垫纯化，用30％甲醇/二氯甲烷洗脱。除去有机溶剂，得到化合物75(0.44g，94％)，无需进一步纯化即可用于下一步。
实施例108.(S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-16-甲基-2，3，12，15-四氢-[1，4]恶嗪并[3，2-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(1H，9H)-二酮(76)的合成
将化合物75(0.44g，0.85mmol)的DMSO(4mL)溶液和NaHCO3(0.10g，1.19mmol)在70℃下搅拌4小时，然后用盐酸(0.1M，8mL)和水(40mL)稀释。将析出的固体过滤，溶解在少量10％甲醇/二氯甲烷中，用(1：20-1：6)甲醇/二氯甲烷作为洗脱液进行柱层析纯化，得到化合物76(0.24g，66％)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C23H20FN3O5：438.14；实测值438.14。
实施例109.(S)-叔丁基(2-(9-乙基-5-氟-9-羟基-16-甲基-10，13-二氧代-2，3，9，10-四氢-[1，4]恶嗪并[3，2-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪[1，2-b]喹啉-1(12H，13H，15H)-基)乙基)氨基甲酸酯(77)的合成
向化合物76(0.20g，0.456mmol)的无水DMF(2mL)溶液中加入NaI(0.68g，4.56mmol)和(2-氯乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.82g，4.56mmol)，将混合物在120℃加热18小时。将反应混合物冷却至室温，真空蒸干，通过柱层析纯化(0-5％甲醇/二氯甲烷)，得到化合物77(0.19g，75％)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C30H33FN4O7：581.23；实测值581.40。
实施例110.(S)-1-(2-氨基乙基)-9-乙基-5-氟-9-羟基-16-甲基-2，3，12，15-四氢-[1，4]恶嗪并[3，2-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(1H，9H)-二酮(78)的合成
向化合物77(0.19g，0.327mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中加入TFA(2.5mL)，并在室温下搅拌反应30分钟。将反应混合物浓缩，与二氯甲烷共沸蒸发3次，得到化合物78，其无需进一步纯化直接用于下一步。
实施例111.化合物79的合成
将上一步得到的化合物78和化合物19(0.45g，0.49mmol)溶解在DMF(5mL)中，冷却至约0℃，然后加入N，N-二异丙基乙胺(172μL，0.98mmol)。将反应升温至室温。搅拌2小时，浓缩，用制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物79(359mg，60％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C59H81FN8O19计算值：1224.56；实测值1224.78。
实施例112.2-氨基-4-氟-5-羟基苯甲醛(80)的合成
在0℃下，向4-氟-3-甲氧基苯甲醛(770mg，5.0mmol)的浓硫酸(10mL)溶液中滴加发烟硝酸(95％，315mg，4.8mmol)。将混合物在室温搅拌1小时，然后倒入冰水中，过滤，滤饼用水洗涤，然后干燥。将所得固体溶于DMF(20mL)中，加入氯化锂(1.6g，25mmol)并将混合物回流4小时，然后倒入水中，滴加浓盐酸至pH 4。溶液用乙酸乙酯萃取，有机层用盐水洗涤，干燥并真空浓缩。向所得残余物中加入乙醇/水(25mL，4：1)、铁粉(1.21g，22mmol)和氯化铵(433mg，8.1mmol)。将混合物在80℃搅拌2h，然后滤出固体。向滤液中加入水，所得混合物用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，干燥，浓缩，柱层析纯化，得到标题化合物(125mg，16收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C7H6FNO 2计算值：156.04；实测值156.04。
实施例113.(S)-4-乙基-8-氟-4，9-二羟基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮(81)的合成
将化合物80(0.125g，0.805mmol)和(S)-4-乙基-4-羟基-7，8-二氢-1H-吡喃并[3，4-f]吲嗪-3，6，10(4H)-三酮(0.202g，0.76mmol)溶于无水甲苯(40mL)中，并加入对甲苯磺酸(13mg，0.076mmol)。将悬浮液回流加热2天，冷却至室温，除去约三分之二甲苯后，过滤残余物并用二氯甲烷洗涤滤料，自然晾干得到化合物81(0.26g，90％收率)，为灰色粉末状固体。ESI-MS m/z：[M+H]+C20H16FN2O5计算值：383.10；实测值383.10。
实施例114.(S)-叔丁基(2-(9-乙基-5-氟-9-羟基-10，13-二氧代-9，10-二氢-[1，3]恶嗪并[5，6-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-2(1H，3H，12H，13H，15H)-基)氨基甲酸乙酯(82)的合成
将N-Boc-乙二胺(50mg，0.31mmol)和多聚甲醛(70mg，0.78mmol)的1，4-二恶烷(5mL)溶液在约100℃下加热2小时，然后冷却至室温，加入化合物81(100mg，0.26mmol)。将反应再次加热至100℃并搅拌2天，冷却至室温。并通过制备C-18HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物82(117mg，80％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C29H31FN4O7计算值：567.22；实测值567.22。
实施例115.(S)-2-(2-氨基乙基)-9-乙基-5-氟-9-羟基-2，3，12，15-四氢-[1，3]恶嗪并[5，6-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(1H，9H)-二酮(83)的合成
将化合物82(117mg，0.208mmol)溶解于三氟乙酸/二氯甲烷(2mL/6mL)并在室温下搅拌1小时。将反应混合物浓缩至干，得到黄色固体83(117g，>100收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C24H23FN4O5计算值：467.17；实测值467.17。
实施例116.(S)-2-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯烷-1-基)丁酰胺-N1-(4-((2-(S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-10，13-二氧代-9，10-二氢-[1，3]恶嗪并[5，6-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-2(1H，3H，12H，13H，15H)-基)乙基)氨基)-4-氧代丁基)-N5-(2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-基)戊二酰胺(84)
将化合物83(120mg，0.208mmol)和化合物19(193mg，0.208mmol)的DMF(5mL)溶液冷却至0℃，加入N，N-二异丙基乙胺(72μL，0.416mmol)。将反应升温至室温。搅拌2小时，浓缩，通过制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物84(100mg，40％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C58H79FN8O19计算值：1211.54；实测值1211.54。
实施例117.(S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-2-(2-羟乙基)-2，3，12，15-四氢-[1，3]恶嗪并[5，6-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-10，13(1H，9H)-二酮的合成(85)
将乙醇胺(19mg，0.31mmol)和多聚甲醛(70mg，0.78mmol)的1，4-二恶烷(5mL)溶液在约100℃下加热2小时，然后冷却至室温，加入化合物81(100mg，0.26mmol)。将反应再次加热至100℃并搅拌2天，冷却至室温，通过制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物85(91mg，75％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C24H22FN3O6计算值：468.15；实测值468.15。
实施例118.(S)-N1-(4-((2-氨基乙基)氨基)-4-氧代丁基)-2-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-N5-(2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-基)戊二酰胺(86)的合成
将1，2-二乙基二胺(300mg，4.99mmol)的四氢呋喃(15mL)溶液和1.0MNaH2PO4(15mL)用0.1M H3PO4调节至pH 7.5。将混合物冷却至并在1小时内，分四份将化合物19(700mg，0.75mmol)加入。再搅拌2小时，将混合物浓缩并通过制备HPLC(含有1％甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物86(528mg，收率82％)。ESI-MS m/z：[M+H]+C36H65N6O14计算值：805.4560；实测值805.4595。
实施例119.2-((S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-10，13-二氧代-9，10-二氢-[1，3]恶嗪并[5，6-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-2(1H，3H，12H，15H)-基)乙基(S)-30-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-27，31，36-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，32，37-三氮杂三十九烷-39-基)氨基甲酸酯(87)的合成
在0℃下，向化合物85(30mg，0.0642mmol)的四氢呋喃(5mL)溶液和N，N-二异丙基乙胺(15μl，0.091mmol)中，加入4-硝基苯基氯甲酸酯(13mg，0.0646mmol)。将混合物在0℃下搅拌4小时，并加入化合物86(55mg，0.0643mmol)和N，N-二异丙基乙胺(10ml，61.2mmol)。将混合物搅拌4小时，浓缩并用制备C-18HPLC(含1％甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物87(39mg，47％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C61H85FN9O21计算值：1298.5845；实测值1298.5935。
实施例120.双(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)4，4'-(((叔丁氧羰基)氮杂二酰基)双(乙烷-2，1-二基)双(氮杂二基)双(4-氧代丁酸酯)(88)的合成
向化合物49(201mg，0.5mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入EDC·HCl(287mg，1.5mmol)和NHS(173mg，1.5mmol)。反应在室温下搅拌1小时，然后用二氯甲烷(50mL)稀释，用水(2×10mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到化合物88(297mg，100％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C25H35N5O12计算值：598.22；实测值598.22。
实施例121.11-(叔丁氧羰基)-4，7，15，18-四氧代-3，8，11，14，19-五氮杂二十一烷-1，21-二酸酯(89)的合成
将H-Gly-OH(94mg，1.25mmol)溶解在水(10mL)中并加入NaHCO3(168mg，2.00mmol)，然后加入化合物88(297mg，0.5mmol)。将反应在室温下搅拌1小时并浓缩，通过制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物89(155mg，60％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C21H35N5O10计算值：518.23；实测值518.23。
实施例122.双(五氟苯基)11-(叔丁氧羰基)-4，7，15，18-四氧代-3，8，11，14，19-五氮杂二十一烷-1，21-二酯(90)的合成
向化合物89(110mg，0.12mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中加入五氟苯酚(48mg，0.26mmol)和EDC·HCl(50mg，0.26mmol)。反应在室温下搅拌2小时，然后用二氯甲烷(50mL)稀释，用水(2×10mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到化合物90(180mg，100％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C33H33F10N5O10计算值：850.20；实测值850.20。
实施例123.双(2-(4-((2-((((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)氨基叔丁基甲酸酯(91)的合成
/>
在冰水浴上向化合物26(55mg，0.13mmol)的DMF(1mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(27mg，0.21mmol)和化合物90(50mg，0.06mmol)。将反应物升温至室温并搅拌1小时，然后浓缩，通过制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物91(20mg，收率为25％)。ESI-MSm/z：[M+H]+C65H72F2N11O18计算值：1332.49；实测值1332.49。
实施例124.N1，N1'-(氮杂二基双(乙烷-2，1-二基))双(N4-((((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)琥珀酰胺(92)的合成
将化合物91(20mg，0.015mmol)溶解在TFA/二氯甲烷(0.5mL/1mL)中，并在室温下搅拌2小时。将反应混合物浓缩至干，生成黄色固体(18.5mg，100％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C60H63F2N11O16计算值：1232.44；实测值1232.44。
实施例125.(S)-2-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-N1-(1-(S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)-13-(2-(2-(S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)-4-氧代丁酰胺基)乙基)-3，6，9，14-四氧杂环氧杂-2，5，10，13-四氮杂十七烷-17-基)-N5-(2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-基)戊二酰胺(93)的合成
在冰浴下，向化合物18(11mg，0.015mmol)的DMF(1mL)溶液中加入HATU(11.4mg，0.03mmol)和N，N-二异丙基乙胺(10μL，0.06mmol)，然后加入化合物92(18.5mg，0.015mmol)。将反应在0℃搅拌1小时，然后通过制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物93(10mg，34％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C94H119F2N15O30计算值：1976.82；实测值1976.82。
实施例126.4-(2-吡啶基二硫代)-4-甲基戊酸(94)的合成
将4-巯基-4-甲基戊酸(Goff，D.等，Bi℃onjugate Chem.1990，1，381-386)(4.67g，31.5mmol)的甲醇(15mL)溶液加入2，2'-二硫代二吡啶(30.0g，136.2mmol)的甲醇(80mL)和100mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.5，70mL)的混合物中。搅拌6小时后，将混合物浓缩，用乙酸乙酯/正己烷(1：1)萃洗。将水相调节至pH 3并用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。将有机层合并，用硫酸钠干燥，过滤，蒸发浓缩，在硅胶柱(甲醇/二氯甲烷/HOAc，1：15：0.01)上纯化，得到标题化合物(7.05g，87％)。ESI-MS m/z：[M+H]+C11H15NO2S2计算值：258.05；实测值258.05。
实施例127.4-(2-吡啶基二硫代)-4-甲基戊酸N-琥珀酰亚胺酯(95)的合成
向4-(2-吡啶基二硫代)-4-甲基戊酸(2.0g，7.78mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.10g，9.56mmol)和EDC·HCl(4.0g，20.8mmol)，将混合物搅拌过夜，蒸发浓缩后在硅胶柱(乙酸乙酯/二氯甲烷，1∶10)上纯化，得到标题化合物(2.48g，90％)。ESI-MS m/z：[M+Na]+计算值C15H18N2O4S2 377.07；实测值377.08。
实施例128.1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基-N-(4-((S)-2-(4-甲基-4-(苯基二硫基)戊酰胺)丙酰胺)苄基)哌啶-4-鎓的合成
在0℃下，将化合物95(15mg，0.04mmol)溶解在DMA(2mL)中，向其中加入化合物24(56.8mg，0.08mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.020mL，0.12mmol)。将反应升温至室温并搅拌2小时，浓缩，用制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物96(32mg，86％收率)。ESI-MS m/z：M+计算值C51H60FN6O7S2：951.39；实测值951.39。
实施例129.(S)-4-乙基-8-氟-4，9-二羟基-11-甲基-10-硝基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮(97)的合成
向化合物72(451.1mg，1.139mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中加入HOAc(1mL)、Ac2O(0.2mL)和浓HNO3(0.3mL，4.665mmol)。将混合物搅拌3小时，用水(10mL)稀释，分离并用二氯甲烷(3×25mL)萃取水溶液。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，在短硅胶柱上纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：10)洗脱，得到标题化合物(361.6mg，72％收率)。ESI-MS m/z：(M+H)+计算值C21H17FN3O7：442.3739；实测值442.3810。
实施例130.(S)-9-(溴甲氧基)-4-乙基-8-氟-4-羟基-11-甲基-10-硝基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮(98)的合成
向化合物97(350.3mg，0.793mmol)，CH2Br2(1mL，14.41mmol)和NaHCO3(0.25g，2.97mmol)的四氢呋喃溶液在70℃下搅拌8小时。将混合物浓缩并用盐酸(0.1M，8mL)和水(40mL)稀释。将析出的固体过滤收集，溶于少量(1：10)乙酸乙酯/二氯甲烷，通过柱层析纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：10-1：6)洗脱，得到标题化合物(0.366g，86％的收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C22H18BrFN3O7计算值：534.0313；实测值534.0385。
实施例131.(S)-8-乙基-4-氟-8-羟基-15-甲基-11，14-二氢-1H-恶唑并[4，5-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-9，12(2H，8H)-二酮(99)的合成
在0℃，搅拌下向四氢呋喃(10mL)和浓盐酸(5mL)的溶液中，分小份加入化合物98(0.360g，0.675mmol)，15分钟后将所得澄清溶液冷却至-10℃。向反应混合物中分小份加入SnCl2(0.384g，2.022mmol)，自然升温至室温，搅拌1.5小时，然后放在冰上冷却。在冰上缓慢加入NaHCO3中和混合物至pH 5.5-6.0，然后在70℃下回流6小时后真空浓缩。过滤收集沉淀，用乙醇和Et2O洗涤，洗涤液用10％甲醇/二氯甲烷萃取。将有机溶液与溶解在30％甲醇/二氯甲烷中的过滤沉淀合并，通过短硅胶柱，然后用20％甲醇/二氯甲烷洗脱。将有机溶剂去除，得到标题化合物(0.120g，两步收率42％)，无需进一步纯化直接用于下一步。ESI-MSm/z：[M+H]+计算值C22H18FN3O5：424.1309；实测值424.1375。
实施例132.(S)-叔丁基(2-((2-(8-乙基-4-氟-8-羟基-15-甲基-9，12-二氧代-2，8，9，11，12，14-六氢-1H-恶唑并[4，5-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-2-氧乙基)氨基甲酸酯(100)的合成
将化合物99(158.3mg，0.344mmol)，2-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙酰氨基)乙酸(Boc-Gly-Gly-OH)(103.9mg，0.447mmol)和EDC(153.5mg，0.799mmol)的DMA(10mL)溶液搅拌8小时。将混合物浓缩并在硅胶柱上纯化，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：10–1：3)洗脱，得到标题化合物(182.6mg，82％收率)。ESI-MS m/z：(M+H)+C31H33FN5O9计算值：638.2263；实测值638.2295。
实施例133.(S)-2-氨基-N-(2-(8-乙基-4-氟-8-羟基-15-甲基-9，12-二氧代-2，8，9，11，12，14-六氢-1H-恶唑并[4，5-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-2-氧乙基)乙酰胺盐酸盐(101)的合成
将化合物100(175.6mg，0.275mmol)，浓盐酸(1mL)和二恶烷(4mL)的混合物搅拌30分钟。将混合物用甲苯(5mL)稀释，浓缩，与二氯甲烷/甲苯(5：5mL，2次)共沸浓缩，得到标题化合物，无需进一步纯化用于下一步(154.6mg、98％收率)。ESI-MS m/z：(M+H)+C26H25FN5O7计算值：538.1739；实测值538.1780。
实施例134.(R)-2-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-丁酰胺基)-N1-(4-(2-(2-(S)-8-乙基-4-氟-8-羟基-15-甲基-9，12-二氧代-2，8，9，11，12，14-六氢-1H-恶唑并[4，5-f]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-4-氧代丁基)-N5-(2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-基)戊二酰胺(102)的合成
向化合物101(47.3mg，0.088mmol)和化合物18(70.1mg，0.092mmol)的DMF(5mL)溶液中加入EDC(55mg，0.286mmol)。搅拌反应8小时，浓缩之后，将残留物通过硅胶柱纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：6–1：3)洗脱，得到标题化合物102(89.3mg，79％收率)。ESI-MS m/z：(M+H)+C60H81FN9O21计算值：1282.5532；实测值1282.5590。
实施例135.2，5，8，11，14，17，20，23-八氧二十五烷-25-基4-甲基苯磺酸酯(103)的合成
向2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-醇(50.0g，0.130mol)的二氯甲烷(200mL)和吡啶(100mL)溶液中加入TsCl(30.2g，0.159mol)。将混合物搅拌过夜，蒸发浓缩后在硅胶柱上纯化，用丙酮/二氯甲烷(1：1至4：1)洗脱，在真空泵上干燥，得到标题化合物57.34g(82.0％收率)。ESI-MS m/z 539.40([M+H]+)。
实施例136.S-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-基硫代乙烷(104)的合成
向2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-基4-甲基苯磺酸酯(57.30g，0.106mol)的四氢呋喃(300mL)溶液和N，N-二异丙基乙胺(50mL)混合物中加入HSAc(10.0g，0.131mol)。将混合物搅拌过夜，浓缩并在硅胶柱上纯化，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：2至4：1)洗脱，并在真空泵上干燥，得到40.51g标题化合物(收率86％)。ESI-MS m/z 443.35([M+H]+)。
实施例137.2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-磺酸(105)的合成
将S-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-基硫代乙烷(40.40g，0.091mol)的乙酸(200mL)溶液和30％ H2O2(100mL)的混合物在35℃下搅拌过夜。将混合物浓缩，用纯水(200mL)和甲苯(150mL)稀释，分离并用水(2×25mL)萃取有机层。将水溶液混合，蒸发浓缩并在真空泵上干燥，得到40.50g的标题化合物(99％的收率，95％的LC-MS纯度)。ESI-MS m/z 449.30([M+H]+)。
实施例138.3，3-N，N-(2”-马来酰亚胺乙基)(2'，5'，8'，11'，14'，17'，20'，23'，26'-九氧杂二十八烷-28'-磺基)氨基丙酸(106)的合成
向2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-磺酸(20.0g，44.62mmol)的四氢呋喃(100mL)和二氯甲烷(100mL)混合溶液中依次加入(COCl)2(25.21g，200.19mmol)和DMF(0.015mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，浓缩，与二氯甲烷/甲苯(1：1，2×50mL)共沸浓缩，然后重新溶解在四氢呋喃(50mL)中。向化合物3-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯烷-1-基)乙基)氨基)-丙酸(7.50g，35.36mmol)的四氢呋喃(100mL)溶液中加入上述磺酰氯溶液。将混合物搅拌过夜，真空浓缩并在硅胶柱上纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：6至1：5)洗脱，并在真空泵上干燥，得到标题化合物14.76g(65％收率)。ESI-MS m/z 643.35([M+H]+)。
实施例139.N-N-琥珀酰亚胺基3，3-N，N-(2”-马来酰亚胺乙基)(2'，5'，8'，11'，14'，17'，20'，23'，26'-九氧杂二十八烷-28'-磺基)氨基丙酸酯(107)的合成
将化合物106(7.50g，11.67mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(1.50g，13.04mmol)和EDC·HCl(10.10g，52.60mmol)在四氢呋喃(100mL)中的混合物搅拌过夜，真空下浓缩并在硅胶柱上纯化，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：4至2：1)洗脱，并在真空泵上干燥，得到标题化合物6.30g(73％收率)。ESI-MS m/z 740.40([M+H]+)。
实施例140.化合物108的合成
在0℃，向H-Gly-Gly-Gly-OH(0.50g，2.03mmol)和化合物107(1.65g，2.22mmol)的DMF(15mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(3mL)。将反应混合物在0℃下搅拌0.5小时，在室温下搅拌4小时。然后将反应混合物浓缩，用硅胶柱纯化(用含0.1％甲酸的95∶5乙腈/水洗脱)，得到标题化合物(1.04g，收率63％)。ESI-MS m/z[M+H]+：C32H56N5O17S计算值814.33；实测值，814.46。
实施例141.化合物109的合成
向化合物108(83.2mg，0.102mmol)和化合物101(55.1mg，0.0960mmol)的DMA(8mL)溶液中加入EDC(95.5mg，0.497mmol)。将混合物搅拌过夜，浓缩并在硅胶柱上纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：6-1：3)洗脱，得到标题化合物(103.3mg，81％收率)。ESI-MS m/z：(M+H)+C58H78FN10O23S计算值：1333.4947；实测值1333.5015。
实施例142.化合物110的合成
将化合物108(0.70g，0.86mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.20g，1.73mmol)和EDC·HCl(1.21g，6.36mmol)在四氢呋喃(20mL)中的混合物搅拌过夜，真空浓缩蒸发，用硅胶柱纯化，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：4～2：1)洗脱，真空泵浓缩干燥得到标题化合物(0.540g，69％收率)。ESI-MS m/z[M+H]+：计算值C36H59N6O19S，911.34；实测值911.42。
实施例143.化合物111的合成
在0℃下，将化合物110(36mg，0.04mmol)溶解于DMF(5mL)中，向其中加入化合物24(56.8mg，0.08mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.020mL，0.12mmol)。将反应升温至室温并搅拌2小时，浓缩，通过制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物111(48mg，80％收率)。ESI-MS m/z：M+C71H99FN11O22S计算值：1508.67；实测值1508.86。
实施例144.(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯的合成(112)
将N-Boc-乙二胺(5.6mL，35.4mmol，1.1eq.)和饱和NaHCO3(60mL)的混合物冷却至0℃，然后分批加入N-甲氧基羰基马来酰亚胺(5.00g，32.2mmol，1.0eq.)。在0℃搅拌30分钟后，将反应升温至室温并搅拌1小时。过滤收集沉淀，冷水洗涤，溶于乙酸乙酯，盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到白色固体(6.69g，87％收率)。ESIMS m/z 241.12([M+H]+)。
实施例145.(2-(1，3)-二氧代-3a、4、7、7a-四氢-1H-4，7-环氧异吲哚-2(3H)-基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(113)的合成
在高压管中，将化合物112(6.00g，25.0mmol)，呋喃(18.0mL)和甲苯(120mL)的溶液加热回流，搅拌16小时。无色溶液在反应过程中变成黄色。然后将混合物冷却至室温并浓缩。所得白色固体用乙醚打浆，得到化合物113(6.5g，84％收率)。ESIMS m/z 309.13([M+H]+)。
实施例146.2-(2-氨基乙基)-3a，4，7，7a-四氢-1H-4，7-环氧异吲哚-1，3(2H)-二酮盐酸盐(114)的合成
在室温下，向化合物113(9.93g，32.2mmol)的二恶烷(15mL)溶液中加入浓盐酸(15mL)，反应3小时。将反应物浓缩，过滤收集所得固体，用乙酸乙酯洗涤滤饼。将固体在烘箱(50℃)中干燥过夜，得到化合物114(6.94g，88％收率)。ESIMS m/z 206.05([M+H]+)。
实施例147.化合物115的合成
在-10℃下，向化合物114(1.22g，5mmol)的四氢呋喃(10mL)和CH3CN(10mL)溶液中加入POCl3(0.47mL，5mmol)。搅拌10分钟后，加入2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂二十八烷-28-胺(2.14g，5mmol)，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.87mL，5mmol)。将反应升温至0℃并搅拌3小时，然后浓缩。残余物用二氯甲烷(10mL)稀释，并通过硅藻土过滤，滤液真空浓缩，得到粗品(～3.7g，～50％纯度)，直接用于下一步。ESIMS m/z 716.29([M+H]+)。
实施例148.化合物116的合成
向2-(2-(2-氨基乙酰胺)乙酰胺)乙酸(Gly-Gly-Gly，0.501g，2.644mmol)的CH3CN(20mL)溶液和N，N-二异丙基乙胺(0.87mL，5mmol)中加入化合物115(1.00g，50％纯，～0.699mmol)。将混合物在40℃下搅拌6小时，浓缩后通过制备HPLC(含甲酸的乙腈/水，Φ＝5厘米，v＝30mL/分钟，从70％水到25％水，45分钟)纯化，得到化合物116(321.5mg，收率约53％)。ESI-MS m/z：(M+H)+C35H62N6O17P计算值：869.3910；实测值869.3995。
实施例149.化合物117的合成
将化合物116(160.1mg，0.184mmol)在DMA(10mL)和甲苯(10mL)中的溶液回流8小时，浓缩并通过制备C-18HPLC纯化(含1％甲酸的乙腈/水，Φ＝3cm，v＝20mL/min，45分钟，从70％水到25％水)，冻干后得到化合物117(125.5mg，85％收率)。ESI-MS m/z：(M+H)+计算值C35H62N6O17P：801.3648；实测值801.3725。
实施例150.化合物118的合成
向化合物36(50mg，0.064mmol)和化合物117(51.5mg，0.064mmol)的DMF(5mL)溶液中加入EDC(99.5mg，0.517mmol)和N，N-二异丙基乙胺(45μL，0.26mmol)。将反应在室温搅拌6小时，浓缩，并通过制备C-18HPLC纯化(含有0.5％甲酸的乙腈/水，Φ＝3cm，v＝20mL/min，从70％水至25％水，45分钟)得到化合物118(66.7mg，71％收率)。ESI-MS m/z：M+C45H49FN7O9计算值：1467.6607；实测值1467.6675。
实施例151.5-氨基-4-(2-氯乙酰基)-2-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(119)的合成
将5-氨基-2-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(5.00g，27.76mmol)溶解在二氯甲烷(20mL)中，然后滴加到冰水冷却的三氯化硼(1M二氯甲烷溶液，38.9mL)溶液中。将反应搅拌10分钟，然后加入氯乙腈(3.2g，42.5mmol)和三氯化铝(5.2g，38.9mmol)。加入完成后，将反应升温至室温。然后回流过夜。然后将反应混合物冷却至约0℃，用2M盐酸(80mL)淬灭并在室温下持续搅拌2个小时。分离各层并用二氯甲烷(3×80mL)萃取水相。合并的有机相用水(100mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，在C-18柱上纯化，用乙醇/水(1：6至1：1)洗脱，得到化合物119(3.05g，43％收率)，为黄色固体。ESI-MS m/z：[M+H]+C11H14ClN2O3计算值：257.0693；实测值257.0725。
实施例152.(S)-11-(氯甲基)-4-乙基-4-羟基-9-甲氧基-N-甲基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-8-甲酰胺(120)的合成
将化合物119(0.59g，2.30mmol)和(S)-4-乙基-4-羟基-7，8-二氢-1H-吡喃并[3，4-f]吲嗪-3，6，10(4H)-三酮(0.57g，2.19mmol)溶解在无水甲苯(40mL)中，加入对甲苯磺酸(42mg，0.219mmol)。将悬浮液加热回流2天并冷却至室温。除去约三分之二的甲苯后，过滤残余物，用二氯甲烷洗涤滤饼，自然晾干，得到灰色粉末状固体化合物120(0.74g，70％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+计算值C24H23ClN3O6：484.1276；实测值484.1220。
实施例153.N-(4-((S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)丙酰胺基)苄基)-1-(((S)-4-乙基-4-羟基-9-甲氧基-8-(甲基氨基甲酰基)-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓甲酸盐(121)的合成
将化合物120(238mg，0.49mmol)，化合物6(200mg，0.49mmol)的DMF(5mL)溶液在0℃下搅拌30分钟，然后加入三乙胺(63μL，0.45mmol)并继续搅拌1小时。将反应液浓缩并通过制备HPLC纯化(乙腈/含有甲酸的水，Φ＝5cm，v＝30mL/min，45分钟，从100％水至50％水)，得到化合物121(242mg，55％收率)，为黄色固体。ESI-MS m/z：M+计算值C46H58N7O9：852.4291；实测值852.4355。
实施例154.N-(4-((S)-2-氨基丙酰胺基)苄基)-1-(((S)-4-乙基-4-羟基-9-甲氧基-8-(甲基氨基甲酰基)-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]-吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓三氟乙酸盐(122)的合成
将化合物121(95mg，0.111mmol)溶解在二氯甲烷和三氟乙酸(2mL/6mL)中，并在室温下搅拌30分钟。将混合物用甲苯(10mL)稀释，然后浓缩并在真空泵上干燥，得到化合物122(108mg，100％收率)，为黄色固体。ESI-MS m/z：M+计算值C41H50N7O7：752.3766；实测值752.3710。
实施例155.N-(4-((30S，38S)-30-(4-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-38-甲基-27，31，36-三氧基-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，32，37-三氮杂三烷酰胺基)苄基)-1-(((S)-4-乙基-4-羟基-9-甲氧基-8-(甲基氨基甲酰基)-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓甲酸盐(123)的合成
将化合物122(60mg，0.061mmol)和化合物19(60mg，0.064mmol)溶解在DMF(5mL)中，冷却至约0℃，然后加入N，N-二异丙基乙胺(21μL，0.12mmol)。将反应升温至室温并搅拌2小时，浓缩，用制备HPLC纯化(含甲酸的乙腈/水，Φ＝3cm，v＝20mL/min，45分钟，从100％水至50％水)，得到化合物123(38.5mg，41％收率)。ESI-MS m/z：M+C75H106N11O21计算值：1496.7559；实测值1496.7595。
实施例156.内消旋2，3-双(苄基氨基)琥珀酸(化合物13)的合成
向内消旋2，3-二溴丁二酸(50g，181mmol)的乙醇(400mL)溶液中逐滴加入苄胺(150mL)。加入完成后，将混合物加热至90℃并搅拌过夜。将混合物冷却至室温并用水稀释。加入6N盐酸直至达到pH 4，得到白色沉淀。过滤沉淀物，用水洗后干燥，得到内消旋2，3-双(苄基氨基)琥珀酸(50g，152mmol，84％)。
实施例157.内消旋2，3-二氨基琥珀酸的合成
向内消旋2，3-双(苄氨基)琥珀酸(18g，55mmol)的AcOH(100mL)和盐酸(100mL)溶液中加入Pd/C(3g，10wt％)，并将混合物在1atm H2环境中，在50℃下搅拌48小时。过滤除去催化剂，并用水洗涤。浓缩滤液，并将残余物溶于1N NaOH(200mL)中。加入乙酸直至达到pH5，得到白色沉淀。过滤沉淀物，用水洗并干燥，得到内消旋的2，3-二氨基琥珀酸(8.7g，＞100％)。
实施例158.内消旋2，3-双(((苄氧基)羰基)氨基)琥珀酸的合成
在0℃下，向内消旋2，3-二氨基琥珀酸(31.74g，214mmol)的四氢呋喃(220mL)和4NNaOH(214mL)溶液中滴加氯甲酸苄酯(61mL，428mmol)。加完后，将混合物升温至室温并搅拌2小时。将反应用水(1600mL)稀释，并用乙酸乙酯(2×1500mL)洗涤。分离出水层，并用浓盐酸酸化直至达到pH 2。将所得溶液搅拌1小时并在5℃下静置以产生白色沉淀。过滤沉淀物，用水洗并干燥，得到内消旋2，3-双((((苄氧基)羰基)氨基)琥珀酸琥珀酸酯(52.2g，125mmol，59％)。
实施例159.(3R，4S)-2，5-二氧四氢呋喃-3，4-二基)二氨基甲酸二苄酯(127)的合成
将内消旋2，3-双(((苄氧基)羰基)氨基)琥珀酸(5.0g，12mmol)在乙酸酐(37.5mL)的溶液中回流20min，冷却并浓缩，得到酸酐。加入CHCl3(37mL)并搅拌，过滤不溶的内消旋异构体，向滤液中加入石油醚，过滤收集固体，得到二苄基((3R，4S)-2，5-二氧四氢呋喃-3，4-二基)二氨基甲酸酯(外消旋混合物，2.0g，5mmol，42％)。
实施例160.4，4'-(((2S，3S)-2，3-双(((苄氧基)羰基)氨基)琥珀酰基)双(氮杂二基))二丁酸二叔丁酯(128)的合成
在约0℃，向二苄基((3S，4S)-2，5-二氧代四氢呋喃-3，4-二基)二氨基甲酸酯(200mg，0.5mmol)的DMF(5ml)溶液中加入氨基丁酸叔丁酯(80mg，0.5mm)。将混合物在0℃搅拌30分钟，然后在室温下搅拌30分钟。将反应溶液重新冷却至约0℃，然后加入N，N-二异丙基乙胺(64mg，0.5mmol)，氨基丁酸叔丁酯(80mg，0.5mmol)和HATU(190mg，0.5mmol)。将反应混合物自然升温至室温并搅拌2小时，然后用二氯甲烷(50ml)稀释，用饱和NaHCO3(20ml)，水(10ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过柱色谱法纯化(二氯甲烷/甲醇＝100：0至10：1)，得到标题化合物(262mg，75％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C36H50N4O10计算值，699.35；实测值，699.35。
实施例161.4，4'-(((2S，3S)-2，3-二氨基琥珀酰基)双(氮杂二基))-二丁酸二叔丁酯(129)的合成
将上述化合物(100mg，0.14mmol)，10％Pd/C(10mg)和甲醇(5ml)的混合物在氢气(5psi)下搅拌过夜。过滤固体并浓缩滤液，得到无色油标题化合物，无需纯化用于下一步(61mg，100％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C20H38N4O6计算值，431.28；实测值，431.28。
实施例162.4，4'-((2S，3S)-2，3-双(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)琥珀酰基)双(氮杂二基))二丁酸二叔丁酯(130)的合成
向化合物129(61mg，0.14mmol)在乙醇(5ml)和PBS(0.1M，pH 7.5，1.0ml)混合物的溶液中，加入2，5-二氧吡咯烷-1-基4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-酰基)丁酸酯(118mg，0.42mmol)。将反应混合物搅拌过夜，浓缩，在硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝100：0至10：1)上纯化，得到标题化合物(65mg，60％收率)。MS-ESI m/z：
[M+H]+计算值C37H56N6O12，777.40；实测值，777.41。
实施例163.4，4'-((2S，3S)-2，3-双(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)琥珀酰基)双(氮杂二基))二丁酸(131)的合成
将化合物130(65mg，0.083mmol)溶于二氯甲烷(6mL)，与三氟乙酸(2mL)反应2小时。反应混合物用甲苯(5mL)稀释，浓缩得到标题化合物(53mg，100％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C28H36N6O12计算值，649.24；实测值，649.24。
实施例164.双(2，5)-二氧代吡咯烷-1-基)4，4'-((2R，3R)-2，3-双(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)琥珀酰基)双(氮杂二基))二丁酸酯(132)的合成
向化合物131(1.10g，1.69mmol)的DMA(30mL)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1-羟基吡咯烷-2，5-二酮)(0.58g，5.08mmol)和EDC·HCl(1.25g，6.54mmol)。将混合物搅拌过夜，浓缩并在硅胶柱上纯化，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：10)洗脱，得到标题化合物(1.30g，91％收率)。ESI-MS m/z[M+H]+：计算值C36H42N8O16 843.27，实测值843.50.
实施例165.(S)-N，N'-N(2S，10S，11S，19S)-10，11双(4-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-2，19-二甲基-4，9，12，17-四氧代-3，8，13，18-四氮杂二十烷-1，20二酰基)双(氮杂二基))双(4，1-亚苯基)双(亚甲基)双(1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓)(133)的合成
将化合物24(94mg，0.12mmol)和化合物132(55mg，0.066mmol)溶于DMA(5mL)中，冷却至约0℃，然后加入N，N-二异丙基乙胺(84μL，0.48mmol)。将反应升温至室温并搅拌2小时，浓缩，用制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物133(23mg，19％收率)。ESI-MSm/z：M2+C106H124F2N18O22计算值：1019.46；实测值1019.50。
实施例166.3-氧代-1-苯基-2，7，10，13，16-五氧杂-4-氮杂十九烷-酸(134)的合成
在500mL烧瓶中，将H2N-PEG4-CH2CH2CO2H(3.0g，11.3mmol，1.0eq.)和K2CO3(4.7g，33.93mmol，3.0eq.)溶于50mL水中，冰水浴冷却，然后滴加CbzCl(2.50g，14.7mmol，1.3eq.)的四氢呋喃(50mL)溶液。将反应升温至室温并搅拌过夜。用1N KHSO4将反应混合物的pH值调节至4-5，用二氯甲烷(200mL×1，100mL×3)萃取，用水(500mL)和盐水(500mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩。将残余物溶解在少量二氯甲烷中，然后上样到硅胶柱上，用2-4％甲醇/二氯甲烷洗脱，将组分合并浓缩，得到3.8g无色油状物(收率84％)。ESI-MS m/z[M+H]+：计算值C19H29NO8 400.2，实测值：400.2。
实施例167.2，5-二氧代吡咯烷-1-基3-氧代-1-苯基-2，7，10，13，16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酯(135)的合成
向CbzHN-PEG4-CH2CH2CO2H(3.8g，9.5mmol，1.0eq.)的50mL无水二氯甲烷溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.3g，11.4mmol，1.2eq.)和EDC·HCl(9.1g，47.5mmol，5.0eq.)。反应在室温下搅拌过夜，然后用水(50mL×2)和盐水(100mL×1)洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗产物直接用于下一步。ESI-MS m/z[M+H]+：C23H32N2O10计算值497.2，实测值：497.2。
实施例168.3，19-二氧代-1-苯基-2，7，10，13，16，23，26，29，32-九氧杂-4，20-二氮杂三十五烷-35-甲酸(136)的合成
在300mL烧瓶中，将H2N-PEG4-CH2CH2CO2H(2.6g，9.5mmol，1.0eq.)和K2CO3(3.9g，28.5mmol，3.0eq.)溶于40mL水中，冰水浴冷却，滴加上述N-羟基琥珀酰亚胺酯粗品(3.8g，9.5mmol)溶在40mL四氢呋喃的溶液，升温至室温并搅拌过夜。使用1N KHSO4将反应混合物的pH值调节至4-5，用二氯甲烷(150mL×1，100mL×2)萃取，用水(200mL)和盐水(200mL)洗涤，无水硫酸钠干燥并浓缩。将残余物溶解在少量二氯甲烷中，上样到硅胶柱上，用4-6％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到无色油状物(4.91g，80％收率)。ESI-MS m/z[M+H]+：C30H50N2O13计算值646.3，实测值：646.3。
实施例169.3，19，35-三氧-1-苯基-2，7，10，13，16，23，26，29，32，39，42，45，48-十三氧杂-4，20，36-三氮五十一烷-51-甲酸叔丁酯(137)的合成
将H2N-PEG4-CH2CH2CO2 tBu(0.48g，1.5mmol，1.0eq.)溶解在3mL DMF中，冰水浴冷却，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.78g，6.0mmol，4.0eq.)，化合物136(0.97g，1.5mmol，1.0eq.)的7mL DMF溶液和HATU(1.72g，4.5mmol，3.0eq.)。将反应液在冰浴上搅拌2小时，用100mL水稀释，用二氯甲烷(100mL×3)萃取，用1N KHSO4(200mL)、饱和碳酸氢钠(200mL)和盐水(200mL)洗，无水硫酸钠干燥，浓缩。将残余物溶解在少量二氯甲烷中，上样到硅胶柱上，用0-5％甲醇/二氯甲烷洗脱。合并组分并浓缩，得到1.22g淡黄色油状物(86％收率)。ESI-MS m/z[M+H]+：C45H79N3O18计算值950.5，实测值：950.5。
实施例170.1-氨基-15，31-二氧代-3，6，9，12，19，22，25，28，35，38，41，44-十二氧杂-16、32-二氮杂四十七烷-47-叔丁基酯(138)的合成
将化合物137(1.22g，1.28mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液与Pd/C(5wt％，500mg)在1atm H2下搅拌2小时。然后将反应通过硅藻土过滤，滤饼用甲醇洗涤。合并滤液和洗涤液并浓缩，得到淡黄色油状物(1.04g，100％收率)。ESI-MS m/z[M+H]+：C37H73N3O16计算值816.5，实测值：816.5。
实施例171.(50R，51R)-二叔丁基50，51-双(((苄氧基)羰基)氨基)-17，33，49，52，68，84-六氧代-4，7，10，13，20，23，26，29，36，39，42，45，56，59，62，65，72，75，78，81，88，91，94，97-二十四氧杂-16，32，48，53，69，85-六氮杂一百烷-1-100二酯(139)的合成
向化合物127(0.26g，0.64mmol)的DMA(10mL)溶液中加入化合物138(1.04g，1.28mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液，然后加入DMAP(0.23g，1.92mmol)和EDC·HCl(0.36g，1.92mmol)。将混合物搅拌过夜，浓缩，用硅胶柱纯化，甲醇/二氯甲烷(1：10)洗脱，得到化合物139(0.81g，63％收率)。ESI-MS m/z：[M+2H]2+C94H162N8O38计算值1006.55；实测值1006.70。
实施例172.(50R，51R)-二叔丁基50，51-二氨基-17，33，49，52，68，84-六氧代-4，7，10，13，20，23，26，29，36，39，42，45，56，59，62，65，72，75，78，81，88，91，94，97-二十四氮杂-16，32，48，53，69，85-六氮杂一百烷-1-100二酯(140)的合成
向化合物139(0.81g，0.40mmol)的甲醇(5mL)溶液中加入Pd/C(100mg，5wt％)，并将混合物在氢气环境下于室温搅拌18小时。然后通过硅藻土过滤除去Pd/C催化剂，滤饼用甲醇洗涤。将滤液和洗涤液合并并浓缩，得到化合物140(0.70g，100％收率)。ESI-MS m/z：[M+2H]2+C78H150N8O34计算值：872.52；实测值872.55。
实施例173.(50R，51R)-二叔丁基50，51-双(4-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-17，33，49，52，68，84-六氧代-4，7，10，13，20，23，26，29，36，39，42，45，56，59，62，65，72，75，78，81，88，91，94，97-四二十氧杂-16，32，48，53，69，85-六氮杂一百烷-1-100二酯(141)和(50S，51S)-50，51双(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-17，33，49，52，68，84-六氧代-4，7，10，13，20，23，26，29，36，39，42，45，56，59，62，65，72，75，78，81，88，91，94，97-二十四氧杂-16，32，48，53，69，85-六氮杂一百烷-1-100二酸(142)的合成
向4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸(0.17g，1.00mmol)和化合物140(0.70g，0.40mmol)的DMF(5mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.88mL，5mmol)和HATU(1.90g，12.56mmol)。将混合物搅拌过夜，浓缩并在硅胶柱上纯化，用1-10％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到油状化合物141，(0.548g，66％收率)。ESI-MS m/z[M+2H]2+：C94H166N10O40计算值2075.1264；实测值2075.1350。
将化合物141(0.54g，0.26mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)并与TFA(2.5mL)反应。将混合物在室温下搅拌30min，用甲苯(20mL)稀释，浓缩，得到标题化合物142(0.488，96％收率)，无需进一步纯化即可用于下一步。ESI-MS m/z[M+H]+：C86H149N10O40计算值1961.9933；实测值1961.9987。
实施例174.(S)-N，N'-N(2S，53S，54S，105S)-53，54-双(4-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-2，105-二甲基-4，20，36，52，55，71，87，103-八氧代-7，10，13，16，23，26，29，32，39，42，45，48，59，62，65，68，75，78，81，84，91，94，97，100-二十四氧杂-3，19，35，51，56，72，88，104-八氮杂一百零六烷-1，106二酰基)双(氮杂二基)双(4，1-亚苯基)双(亚甲基))双(1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓)(143)的合成
/>
将化合物24(47mg，0.060mmol)和化合物142(59mg，0.030mmol)溶解于DMA(5mL)中，冷却至约0℃，然后加入EDC(23.1mg，0.12mmol)和N，N-二异丙基乙胺(21μL，0.12mmol)。将反应升温至室温并搅拌2小时，浓缩，通过制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物143(36mg，36％收率)。ESI-MS m/z：M2+C164H238F2N22O50计算值：1675.8279；实测值1675.8392。
实施例175.2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂二十八烷-28-酸(144)的合成
将2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂二十八烷-28-叔丁基酯(210g，422mmol)溶解于二氯甲烷(400mL)和无水甲酸(1L)中。将所得溶液在室温下搅拌过夜。真空除去所有挥发物，得到标题化合物，为黄色油状物(200g，>100％收率)。
实施例176.2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂二十八烷-28-酰氯(145)的合成
将2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂二十八烷-28-酸(198g，422mmol)溶于二氯甲烷(2.6L)，在室温下加入(COCl)2(275mL)和DMF(0.5mL)。将所得溶液在室温下搅拌3小时。真空除去所有挥发物，得到标题化合物，为黄色油状物(210g，>100％收率)。
实施例177.(S)-34-(((苄氧基)羰基)氨基)-28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十五烷-35酸(146)的合成
将Z-L-Lys-OH(236g，844mmol)，Na2CO3(89.5g，844mmol)和NaOH(33.8g，844mmol)溶解于水(1.6L)中。将混合物用冰盐浴冷却至0℃，向其中加入2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂二十八烷-28-酰氯(210g，422mmol)的四氢呋喃(160mL)溶液。将所得混合物在室温下搅拌1小时，然后用乙酸乙酯(1L)稀释。分离水层，在冰冷下向其中加入浓盐酸直到达到pH 3。用二氯甲烷萃取后，用盐水洗涤有机层，用硫酸钠干燥并浓缩，得到标题化合物，为黄色油状物(290g，97％收率)。
实施例178.(S)-五氟苯基34-(((苄氧基)羰基)氨基)-28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十五烷-35-酸酯(147)的合成
向化合物146(183g，260mmol)的二氯甲烷(2L)溶液中加入五氟苯酚(95.4g，520mmol)和DIC(131g，1.04mol)。反应在室温下搅拌1小时，浓缩得标题产物粗品(430g)。
实施例179.(S)-叔丁基34-((苄氧基)羰基)氨基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-酸酯(148)的合成
在0℃下，向4-氨基丁酸叔丁酯(62.0g，390mmol)的DMF(1.5L)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(134g，1.04mol)。然后在10-20℃，加入化合物147(430g，粗品)，将所得混合物在室温下搅拌1小时。真空除去DMF，残余物用二氯甲烷稀释，用水洗涤。水相用二氯甲烷反萃取。合并的有机相用0.2N盐酸和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。柱色谱法纯化(25％乙酸乙酯/石油醚至纯乙酸乙酯，然后0至5％甲醇/二氯甲烷)得到标题化合物，为黄色油状物(180g，82％收率)。
实施例180.(S)-叔丁基34-氨基-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-酯(149)的合成
向化合物148(78.0g，92.3mmol，1.0eq.)的甲醇(500mL)溶液中加入Pd/C(13g，10wt％，含水50％)。1atm催化加氢反应过夜，然后过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(0至20％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物，为黄绿色油状物(70.2g，92％收率)。
实施例181.(S)-叔丁基34-(4-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-酯(150)的合成
向(S)-叔丁基34-氨基-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-酯(149，0.93g，1.18mmol)的95％乙醇(50mL)和NaH2PO4溶液(0.1M，pH5.0，10mL)中，加入N-琥珀酰亚胺基4-马来酰亚胺基丁酸酯(0.50g，1.77mmol，1.5eq.)。将混合物搅拌过夜，然后浓缩并用水(50mL)稀释，用二氯甲烷(80mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过硅胶柱色谱法(25：1二氯甲烷/甲醇)纯化得到标题化合物，为淡黄色油状物(0.82g，80％收率)。ESIMS m/z 877.52([M+H]+)。
实施例182.(S)-34-(4-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-酸(151)的合成
将(S)-叔丁基34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-酯(0.82g，0.94mmol)溶解在甲酸(50mL)中并在室温下搅拌1小时。将反应混合物浓缩并与甲苯共沸蒸发两次，将残余物置于真空泵上，得到标题化合物(0.80g，粗品)。ESIMS m/z 820.45([M+H]+)。
实施例183.(S)-2，5-二氧代吡咯烷-1-基34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-酯(152)的合成
向(S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-酸(0.80g粗品，0.94mmol)的DMA(5.0mL)溶液中加入NHS(0.12g，1.03mmol)和EDC·HCl(0.27g，1.41mmol)，反应在室温下搅拌2小时，然后用水(15mL)稀释并用乙酸乙酯(3×10mL)萃取。合并的有机相用盐水(10mL)洗，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过硅胶柱(10-50％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到无色油状化合物(0.67g，78％收率)。ESIMS m/z 918.55([M+H]+)。
实施例184.(7S，10R，11R，14S)-二叔丁基10，11双(((苄氧基)羰基)氨基)-6，9，12，15-四氧代-7，14双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-5，8，13，16-四氮杂二十烷-1，20-酯(153)的合成
向化合物127(0.85g，2.00mmol)的DMA(10mL)溶液中加入化合物149(3.20g，4.50mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，DMAP(1.50g，12mmol)和EDC·HCl(2.3g，12mmol)。将混合物搅拌过夜，浓缩并在硅胶柱上纯化，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：10)洗脱，得到化合物153(3.33g，88％收率)。ESI-MS m/z：[M+2H]2+C86H146N8O32计算值902.50；实测值902.55。
实施例185.(7S，10R，11R，14S)-二叔丁基10，11双(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-6，9，12，15-四氧代-7，14双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-5，8，13，16-四氮杂二十烷-1，20二酯(154)
将化合物153(3.33g，1.76mmol)和Pd/C(5wt％，0.10g)在二氯甲烷(50mL)中的混合物在1atm H2压力下氢化过夜，然后经硅藻土(助滤剂)过滤。将滤液浓缩，然后溶解在DMF(10mL)中，向其中加入EDC·HCl(1.00g，5.28mmol)和4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸(1.84g，5.28mmol)。将混合物在室温下搅拌16小时，浓缩，用硅胶柱层析(1：4甲醇/二氯甲烷)纯化，得到油状物(2.56g，78％收率)。ESI-MS m/z：[M+2H]2+C86H148N10O34计算值933.51；实测值933.55。
实施例186.(S)-N，N'-(2S，10S，13R，14R，17S，25S)-13，14双(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-2，25-二甲基-4，9，12，15，18，23-六氧代-10，17双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，8，12，16，19，24-六氮杂二十六烷-1，26二酰)双(氮杂二基)双(4，1-亚苯基)双(亚甲基)双(1-((((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓)甲酸盐(155)
将化合物154(1.00g，0.536mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液和甲酸(5mL)的混合物在室温下搅拌24小时，然后浓缩。将残余物溶解在DMA(5mL)中，加入化合物24(0.64g，0.89mmol)，三乙胺(0.15mL，1.07mmol)和HATU(0.41g，1.07mmol)并在室温下搅拌16小时。在高真空下除去溶剂后，通过制备HPLC(含有甲酸的乙腈/水)纯化残余物，得到标题化合物155(1.06g，63％收率)。ESI-MS m/z：M2+C156H220F2N22O44计算值1571.78；实测值1571.78。
实施例187.4-(双(2-羟乙基)氨基)-4-氧代丁酸甲酯(156)的合成
将琥珀酸二甲酯(20.0g，136.9mmol)和二羟基乙胺(7.20g，68.7mmol)在无水甲苯(500mL)和吡啶(50mL)中的混合物在150℃下加热28小时。将混合物浓缩并在硅胶柱上纯化，用5-25％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱，得到标题化合物(12.5g，83％收率)。ESI-MS m/z242.42([M+Na]+)。
实施例188.4-(双(2-(甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸甲酯(157)的合成
向4-(双(2-羟乙基)氨基)-4-氧代丁酸甲酯(12.0g，49.56mmol)的无水吡啶(350mL)溶液中加入甲磺酰氯(20.0g，175.4mmol)。搅拌过夜后，浓缩混合物，用乙酸乙酯(350mL)稀释，用冷的1M NaH2PO4(2×300mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并蒸发浓缩得到粗产物(～18.8g，>100％收率)。粗产物不经进一步纯化用于下一步。ESI-MS m/z 376.06([M+H]+)。
实施例189.3，6-内氧-Δ-四氢邻苯二甲酰亚胺(158)的合成
向马来酰亚胺(10.0g，103.0mmol)的甲苯(200mL)溶液中加入呋喃(10.0mL，137.4mmol)。将混合物在1L高压灭菌釜中100℃加热8小时。然后冷却到室温，并用甲醇冲洗出固体，浓缩，在乙酸乙酯/正己烷中结晶，得到16.7g(99％)的标题化合物。1H NMR(CDCl3)：11.12(s，1H)，6.68～6.64(m，2H)，5.18～5.13(m，2H)，2.97～2.92(m，2H)；ESI-MSm/z 188.04([M+Na]+)。
实施例190.甲基4-((2-((3aR，4R，7S，7aS)-1，3)-二氧代-3a，4，7，7a-四氢-1H-4，7-环氧异吲哚-2(3H)-基)乙基)(2-((4R，7S，7aS)-1，3-二氧代-3a，4，7，7a-四氢-1H-4，7-环氧异吲哚-2(3H)-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸酯(159)的合成
向4-(双(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸甲酯(157，新制备，90％纯度，8.5g，～20mmol)的DMA(350mL)溶液中，加入3，6-内氧代-Δ-四氢邻苯二甲酰亚胺(158，10.2g，61.8mmol)，碳酸钠(8.0g，75.5mmol)和碘化钠(0.3g，2.0mmol)。混合物在室温下搅拌过夜，浓缩，用乙酸乙酯(350mL)稀释，用饱和NaHCO3溶液(300mL)，盐水(300mL)和1MNaH2PO4(300mL)洗涤。有机层用硫酸钠干燥，过滤，蒸发浓缩，上样到硅胶柱，用10-30％乙酸乙酯/正己烷洗脱，得到标题化合物(7.9g，77％收率)。ESI-MS m/z 536.4([M+Na]+)。
实施例191.4-(双(2-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸(160)的合成
将化合物159(3.0g，5.8mmol)和三甲基锡醇(4.8g，26.4mmol)的1，2-二氯乙烷(150mL)溶液于80℃回流8小时，然后冷却至室温。将残余物上样至短硅胶柱，用二氯甲烷/甲醇洗脱以除去过量的氢氧化三甲基锡。然后将组分合并，浓缩并用DMA和甲苯稀释，加热至120℃并搅拌过夜。将反应混合物上样到硅胶柱上，用5-10％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到标题化合物(1.62g，76％收率)。ESI-MS m/z 386.2([M+Na]+)。
实施例192.N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺(161)的合成
在250mL圆底烧瓶中，将马来酰亚胺(12.0g，123.7mmol)溶于乙酸乙酯(150mL)中，并将溶液冷却至约0℃。然后在15分钟内滴加N-甲基吗啉(14.1mL，12.8g，126.2mmol)的乙酸乙酯(10mL)溶液。之后滴加氯甲酸甲酯(9.60mL，11.5g，123.7mmol)的乙酸乙酯(50mL)中的溶液，并将溶液自然升温至室温，搅拌2小时。将溶液用乙酸乙酯(100mL)稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液，水和饱和氯化钠溶液洗涤。将有机层分离，用硫酸钠干燥，然后过滤。滤液减压浓缩，得到标题化合物固体(15.9g，102.5mmol，82.9％收率)。1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ6.84(s，2H)，3.97(s，3H)。
实施例193.双(2-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基叔丁基甲酸酯(162)的合成
将双(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(4.00g，19.68mmol)溶解在饱和NaHCO3(80mL)和甲醇(10mL)溶液中之后冷却至0℃中。将N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺(6.20g，40.00mmol)加入搅拌的溶液中。在20分钟之后，将反应混合物用水(150mL)稀释并在室温搅拌30分钟。将反应混合物冷却至0℃，将反应混合物过滤并用冰冷的水(100mL)洗涤。高真空干燥得到标题化合物(5.51g，77.1％收率)，为白色固体。ESIMS m/z C17H22N3O6[M+H]+，计算值363.15，实测值364.20。
实施例194.1，1'-(氮杂二基双(乙烷-2，1-二基))双(1H-吡咯-2，5-二酮)盐酸盐(163)的合成
在0℃下，向双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基叔丁基甲酸酯(5.50g，15.14mmol)的二恶烷(40mL)中加入浓盐酸(37％浓度，10mL)。将混合物在冰浴上搅拌30分钟，蒸发，浓缩并与二恶烷/甲苯(1：1，3×40mL)共沸蒸发，高真空干燥，得到标题化合物(4.40g，97％)，无需进一步纯化即可用于下一步。ESIMS m/z C12H14N3O4[M+H]+，计算值264.09，实测值264.20。
实施例195.2-(2-(双(2-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙酸(164)的合成
在冰浴上，向1，1'-(氮杂二基双(乙烷-2，1-二基)双(1H-吡咯-2，5-二酮)盐酸盐(2.01g，6.70mmol)的乙醇(50mL)溶液和NaH2PO4缓冲液(100mL，100mM，pH 7.0)中加入1，4-二恶烷-2，6-二酮(0.80g，6.89mmol)。然后将混合物在室温下搅拌4小时，浓缩，通过硅胶柱纯化，水/CH3CN(1：99-3：97)洗脱，得到标题化合物(2.16g，85％收率)。ESIMS m/zC16H18N3O8[M+H]+计算值380.11，实测值380.20。
实施例196.4-(双(2-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸(165)的合成
在冰浴上，向1，1'-(氮杂二基双(乙烷-2，1-二基)双(1H-吡咯-2，5-二酮)，盐酸盐(2.01g，6.70mmol)的乙醇(50mL)溶液和NaH2PO4缓冲液(100mL，100mM，pH 7.0)中加入二氢呋喃-2，5-二酮(0.68g，6.80mmol)。然后将混合物在室温下搅拌4小时，浓缩，通过硅胶柱纯化，用水/CH3CN(100％ CH3CN至3％ CH3CN/水溶液)洗脱，得到标题化合物(2.09g，86％收率)。ESIMS m/z C16H18N3O7[M+H]+计算值364.11，实测值364.20。
实施例197.2，5-二氧代吡咯烷-1-基2-(2-(双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙酸酯(166)的合成
向2-(2-(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙酸(1.10g，2.90mmol))和N-羟基琥珀酰亚胺(0.36g，3.12mmol)的干燥DMA(40mL)中加入EDC(1.20g，6.25mmol)。将反应混合物搅拌4小时，然后浓缩，用硅胶柱层析(10：1至5：1/乙酸乙酯)纯化，得到标题化合物(1.09g，79％收率)。ESIMS m/z：C20H21N4O10[M+H]+计算值477.12，实测值477.20。
实施例198.2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-(双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸酯(167)的合成
向4-(双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯烷-1-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸(1.05g，2.89mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(0.36克，3.12mmol)的DMA(40mL)溶液中加入EDC(1.20g，6.25mmol)。将反应混合物搅拌4小时，然后浓缩并用硅胶柱层析纯化(10∶1至5∶1二氯甲烷/乙酸乙酯)，得到标题化合物(1.10g，收率83％)。ESIMS m/z：C20H21N4O9[M+H]+计算值461.12，实测值461.20。
实施例199.N-(4-((S)-2-(4-(双)2-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)丙酰胺基)苄基)-1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓(168)的合成
将前一步的粗产物(0.20g)溶解在DMA(5mL)中，在0℃下加入化合物24(0.71g，1.00mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.20g，1.20mmol)。将反应物自然升温至室温并搅拌2小时，浓缩，并用制备HPLC(乙腈/含甲酸的水)纯化，得到化合物168(0.85g，80％收率)。ESI-MS m/z：M+C55H61FN9O12计算值：1058.44；实测值1058.60.
实施例200.(S)-叔丁基34-(4-(双(2-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-酸酯(169)的合成
向化合物149(2.98g，4.20mmol)和化合物165(1.39g，3.82mmol)的DMA(20mL)溶液中加入EDC·HCl(0.80g，4.20mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜，然后加入水(50mL)并用乙酸乙酯(3×40mL)萃取。将合并的有机相用盐水(40mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩。残余物经柱层析纯化(10-50％乙酸乙酯/石油醚)得到无色油状物(3.23g，80％收率)。ESI-MS m/z 1057.85([M+H]+)。
实施例201.(S)-34-(4-(双(2-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-甲酸(170)的合成
将化合物169(3.20g，3.03mmol)在甲酸(10mL)和二氯甲烷(5mL)中的溶液室温搅拌过夜。然后将溶液浓缩并与甲苯共沸浓缩三次，得到无色油状物(3.00g，粗品)，无需进一步纯化即可使用。ESI-MS m/z 1001.50([M+H]+)。
实施例202.(S)-2，5-二氧代吡咯烷-1-基34-(4-(双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-酯(171)的合成
向化合物170(3.00g粗品，3.03mmol)的DMA(15.0mL)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.38g，3.33mmol)和EDC·HCl(0.87g，4.55mmol)，反应在室温下搅拌2小时，然后用水(50mL)稀释，并用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。将合并的有机相用盐水(30mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩。残余物用硅胶柱(10-50％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到无色油(2.90g，90％收率)。ESI-MS m/z 1098.50([M+H]+)。
实施例203.N-(4-((34S，42S)-34-(4-(双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)-42-甲基-28，35，40-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36，41三氮杂四十三烷酰胺基)苄基)-1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓(172)的合成
将化合物171(0.10g，0.091mmol)溶于DMA(5mL)，然后在0℃下加入化合物24(56.8mg，0.08mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.020mL，0.12mmol)。将反应物升温至室温并搅拌2小时，浓缩，用制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物172(84mg，62％收率)。ESI-MS m/z：M+C84H116FN12O24计算值：1695.82；实测值1695.82。
实施例204.叔丁基2-(2-(1，3)-二氧代异吲哚啉-2-基)乙酰基)肼基羧酸酯(173)的合成
在0℃下，向叔丁氧肼(7.08.g，53.5mmol)的二氯甲烷(200mL)溶液中，依次加入三乙胺(13.5mL，97.4mmol)和2-(1，3-二氧代异吲哚啉-2-基)乙酰氯(10.8g，48.7mmol)。在室温下搅拌30分钟后，将混合物倒入冰水(100mL)中并用二氯甲烷(3×100mL)萃取。将合并的有机相用水(100mL)和盐水(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到白色固体(15.5g，收率100％)。ESI-MS m/z 320.12([M+H]+)。
实施例205.2-(1，3)-二氧代异吲哚啉-2-基)乙酰肼(174)的合成
将化合物173(15.5g，48.7mmol)溶于1，4-二恶烷(150mL)中，并与25％盐酸(50mL)在室温下反应1小时。将反应混合物浓缩，然后与甲苯共沸浓缩，得到白色固体(10.6g，100％收率)。ESI-MS m/z 220.06([M+H]+)。
实施例206.2-(1，3)-二氧代异吲哚啉-2-基)-N'-(2-(1，3-二氧代异吲哚啉-2-基)乙酰基)乙酰肼(175)的合成
在0℃下，向化合物174(10.6g，48.7mmol)的四氢呋喃(200mL)溶液中加入三乙胺(13.5mL，97.4mmol)和2-(1，3-二氧代异吲哚啉-2-基)乙酰氯(10.8g，48.7mmol)。将反应物升温至室温并搅拌过夜。通过过滤收集沉淀物，悬浮在水(100mL)中并搅拌20分钟。再次过滤混合物并收集白色固体，得到化合物175(15.7g，80％收率)。ESI-MS m/z 407.09([M+H]+)。
实施例207.2，2'-(1，2-双(2-(1，3)-二氧代异吲哚啉-2-基)乙酰基)肼-1，2-二基)二乙酸二叔丁基酯(176)的合成
在0℃下，将NaH(0.5g，12.3mmol)分批加入化合物175(2.0g，4.92mmol)的DMF(40mL)溶液。将混合物升温至室温并搅拌3小时。加入溴乙酸叔丁酯(2.0g，10.3mmol)并搅拌反应过夜，然后倒入冰水(100mL)中，并用二氯甲烷(3×50mL)萃取。将合并的有机相用水(50mL)，盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，用硅胶柱色谱纯化，得到白色固体(1.5g，收率50％)。ESI-MS m/z 635.23([M+H]+)。
实施例208.2，2'-(1，2-双(2-氨基乙酰基)肼-1，2-二基)二乙酸二叔丁基酯(177)的合成
将化合物176(1.5g，2.36mmol)和肼(442mg，7.08mmol)在乙醇(30mL)中的混合物回流1小时，然后冷却至室温并过滤。将滤液浓缩并用乙酸乙酯(20mL)稀释，再次过滤。将滤液浓缩，得到白色固体177(750mg，85％收率)。ESI-MS m/z 375.22([M+H]+)。
实施例209.2，2'-(1，2-双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基)肼-1，2-二基)二乙酸二叔丁基酯(178)的合成
在0℃下，向化合物177(750mg，2mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液中加入饱和NaHCO3水溶液(30mL)和N-甲氧基羰基马来酰亚胺(622mg，4mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。过滤收集白色固体，得到化合物178(854mg，收率80％)。ESI-MS m/z 535.20([M+H]+)。
实施例210.2，2'-(1，2-双(2-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基)肼-1，2-二基)二乙酸(179)的合成
将化合物178(854mg，1.6mmol)溶解于二恶烷(3mL)中，并与25％盐酸(3mL)在室温下反应2小时。然后浓缩反应物，得到化合物179(675mg，100％收率)。ESI-MS m/z 423.07([M+H]+)。
实施例211.4，4’-((2，2’-(1，2-双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基)肼-1，2-二基)双(乙酰基))双(氮杂二基))二丁酸二叔丁基酯(180)
在0℃下，向化合物179(200mg，0.47mmol)的DMF(5mL)溶液中加入4-氨基丁酸叔丁酯(158mg，0.99mmol)和EDC·HCl(189.7mg，0.99mmol)。将反应混合物升温至室温并搅拌过夜，倒入冰水中，用二氯甲烷(3×10mL)萃取。将合并的有机相用0.2N盐酸(5mL)，水(5mL)，盐水(5mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到白色固体(330mg，100％收率)。
实施例212.双(2，5)-二氧代吡咯烷-1-基)4，4'-((2，2'-(1，2-双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基)肼-1，2-二基)双(乙酰基))双(氮杂二基))二丁酸酯(181)的合成
将化合物180(330mg，0.47mmol)溶于二恶烷(3mL)中，与25％盐酸(3mL)在室温下反应2小时。浓缩反应物，重新溶于DMF(5mL)中，冷却至0℃，然后依次加入N-羟基琥珀酰亚胺(113mg，0.98mmol)和EDC·HCl(189mg，0.98mmol)。将反应物升温至室温并搅拌过夜，倒入冰水中，用二氯甲烷(3×20mL)萃取。将合并的有机相用水(5mL)，盐水(5mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得到白色固体181(369mg，收率100％)。ESI-MS m/z 787.21([M+H]+)。
实施例213.(S)-N，N'-(((((2S，21S)-11，12双(2-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基)-2，21-二甲基-4，9，14，19-四氧代-3，8，11，12，15，20-六氮杂二十二烷-1，22二酰基)双(氮杂二基)双(4，1-亚苯基)双(亚甲基)双(1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓)(182)的合成
在0℃下，将化合物181(31.5mg，0.04mmol)溶于DMA(5mL)，然后加入化合物24(56.8mg，0.08mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.020mL，0.12mmol)。将反应物升温至室温并搅拌2小时，浓缩，用制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物182(57mg，收率72％)。ESI-MS m/z：M2+C102H116F2N18O2计算值：991.42；实测值991.86。
实施例214.4-(双(2-(乙酰硫基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸甲酯(183)的合成
在0℃下，向4-(双(2-(((甲基磺酰基)氧基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸甲酯(新制备，90％纯，8.5g，)的DMA(350mmol)溶液中加入硫代乙酸(10mL，134mmol)，之后加入三乙胺(30mL，215mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，浓缩，用乙酸乙酯(350mL)稀释，用饱和NaHCO3(300mL)，盐水(300mL)和1MNaH2PO4(300mL)洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤，蒸发浓缩，在硅胶柱上纯化，用乙酸乙酯/正己烷(/>乙酸乙酯)洗脱，得到标题化合物(5.1g，76％收率)。ESI-MS m/z[M+Na]+：计算值C13H21NO5S2 358.1；实测值358.2。
实施例215.4-(双(2-(吡啶-2-基二磺酰基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸(184)的合成
向4-(双(2-(乙酰硫基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸甲酯(5.0g，14.9mmol)的四氢呋喃(150mL)溶液中加入NaOH(5.0g，125mmol)的水(100mL)溶液。将混合物在室温下搅拌35分钟，用H3PO4中和至pH 7。然后加入PySSPy(26.0g，118mmol)的四氢呋喃(100mL)溶液，将混合物搅拌4小时，浓缩并在硅胶柱上纯化，用甲醇/二氯甲烷/HOAc洗脱(1：20/0.2)，得到标题产物(5.8g，收率85.6％)。ESI-MS m/z[M+Na]+：C18H21N3O3S4计算值478.0；实测值478.2。
实施例216.2，5-二氧代吡咯烷-1-基4-(双(2-(吡啶-2-基二磺酰基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸酯(185)的合成
向4-(双(2-(吡啶-2-基二硫基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸(5.2g，11.5mmol)的DMA(100mL)溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺(1.6g，13.9mmol)和EDC·HCl(5.0g，26.1mmol)。将混合物搅拌过夜，蒸发浓缩，在硅胶柱上纯化，用乙酸乙酯/二氯甲烷(5％至15％乙酸乙酯)洗脱，得到标题产物(5.8g，85.6％收率)。ESI-MS m/z[M+Na]+：C22H24N4O5S4计算值575.1；实测值575.2。
实施例217.N-(4-((S)-2-(4-(双(2-(吡啶-2-基二磺酰基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)丙酰胺基)苄基)-1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14)-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓(186)的合成
在0℃下，将化合物185(23mg，0.04mmol)溶于DMA(5mL)，然后加入化合物24(56.8mg，0.08mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.020mL，0.12mmol)。将反应物升温至室温并搅拌2小时，浓缩，并用制备HPLC(含甲酸的乙腈/水)纯化，得到化合物186(39mg，85％收率)。ESI-MS m/z：M+C57H65FN9O8S4计算值：1150.38；实测值1150.45。
实施例218.(S)-1-苄基5-叔丁基-2-(14-(苄氧基)-14-氧代四胺基)戊二酸酯(187)的合成
将(S)-1-苄基5-叔丁基2-氨基戊二酸酯盐酸盐(8.70g，26.39mmol)，14-(苄氧基)-14-氧代十四烷酸(9.19mmol)，N，N-二异丙基乙胺(8.0mL，46.0mmol)和EDC(15.3g，80.50mmol)的二氯甲烷(200mL)溶液室温搅拌6小时。将混合物用水(100mL)稀释并分离。用二氯甲烷(100mL)萃取水相。将有机相合并，用盐水洗，硫酸钠干燥，过滤，浓缩并在硅胶柱上纯化(二氯甲烷/乙酸乙酯＝20：1至5：1)，得到标题化合物(13.65g，83％收率)。MS-ESIm/z：[M+H]+C37H54NO7计算值，624.38；实测值，624.38。
实施例219.(S)-5-(苄氧基)-4-(14-(苄基氧基)-14-氧代十四烷酰胺基)-5-氧代戊酸(188)的合成
在4℃下，将化合物187(12.50g，20.05mmol)溶解于二恶烷(30mL)中，并与盐酸(10mL，36％浓盐酸)反应0.5小时。将反应混合物用甲苯(20mL)和DMF(20mL)稀释，在15℃下浓缩，得到标题化合物188(11.26g，99％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C33H46NO7计算值，568.32；实测值，568.34。
实施例220.(S)-35，49二苄基1-叔丁基16，32，37-三氧代-3，6，9，12，19，22，25，28-八氧杂-15，31，36-三氮杂四十九烷-1，35，49-三羧酸酯(189)的合成
将化合物188(10.70g，18.86mmol)，1-氨基-15-氧代-3，6，9，12，19，22，25，28-八氧杂-16-氮杂三十一烷-31-叔丁基酯盐酸盐(11.45g，18.93mmol)，EDC(9.51g，50.01mmol)和N，N-二异丙基乙胺(4.00mL，23.00mmol)在二氯甲烷(200mL)中的混合物搅拌过夜，用盐水(100mL)稀释并分离。用二氯甲烷(100mL)萃取水相。将有机相合并，用盐水洗涤，硫酸钠干燥，过滤，浓缩并在硅胶柱上纯化(二氯甲烷/乙酸乙酯＝10：1至4：1)，得到标题化合物189(18.15g，86％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C59H96N3O17计算值，1118.67；实测值，1118.80。
实施例221.(S)-18-((苄氧基)羰基)-3，16，21，37-四氧代-1-苯基-2，25，28，31，34，41，44，47，50-九氧杂-17，22，38-三氮杂五十三烷-53-酸(190)的合成
在4℃下，将化合物189(10.50g，9.39mmol)溶解于二恶烷(45mL)中，并与盐酸(15mL，36％浓度)反应0.5小时。将反应混合物用甲苯(20mL)和DMF(20mL)稀释，在15℃下浓缩并在硅胶柱上纯化(二氯甲烷/甲醇＝10：1至6：1)，得到标题化合物190(8.67g，87％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C55H88N3O17计算值，1062.60；实测值，1062.68。
实施例222.(18S，59S)-18-((苄氧基)羰基)-59-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，16，21，37，53-五氧基-1-苯基-2，25，28，31，34，41，44，47，50-九氧杂-17，22，38，54-四氮杂六十烷-60-酸(191)的合成
将化合物190(8.50g，8.01mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(3.20g，27.82mmol)、EDC(10.28g，54.10mmol)和N，N-二异丙基乙胺(6.00mL，34.51mmol)的四氢呋喃(150mL)溶液搅拌6小时并真空浓缩，得到NHS酯粗产物。
向(S)-6-氨基-2-(叔丁氧羰基)氨基)己酸盐酸盐(2.75g，9.73mmol)的DMF(100mL)溶液和1.0M Na2PO4(pH 7.5，55mL)中，在1小时内分四批，加入上述制备的酯。将反应混合物在室温下再搅拌3小时。浓缩后，将残余物在硅胶柱上纯化(二氯甲烷/甲醇＝10∶1至4∶1)，得到标题化合物(8.16g，收率79％)。MS-ESI m/z：[M+H]+C66H108N5O20计算值，1289.75；实测值，1289.90。
实施例223.(18S，59S)-59-氨基-18-((苄氧基)羰基)-3，16，21，37，53-五氧代-1-苯基-2，25，28，31，34，41，44，47，50-九氧杂-17，22，38，54-四氮杂六十烷-60-酸盐酸盐(192)的合成
在4℃下，将化合物191(8.10g，6.28mmol)溶解在二恶烷(40mL)中，并与盐酸(15mL，36％浓盐酸)反应0.5小时。将反应混合物用甲苯(20mL)和DMF(20mL)稀释，在15℃下浓缩，得到标题化合物粗品192(7.71g，收率100％)，无需进一步纯化进行下一步。MS-ESIm/z：[M+H]+C61H88N3O17计算值，1190.70；实测值，1190.78。
实施例224.(S)-2-(4-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-丙酸(193)的合成
在0℃下，向N-琥珀酰亚胺基4-马来酰亚胺丁酸酯(7.10g，25.35mmol)和丙氨酸(3.01g，33.80mmol)的DMF(50mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(10mL)。将反应混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后在室温下搅拌1小时。将反应混合物浓缩并在硅胶柱上纯化(流动相为二氯甲烷/甲醇＝10∶1，含0.1％甲酸)，得到化合物193(5.21g，81％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C11H14N2O5计算值，255.09；实测值，255.15。
实施例225.(S)-2，5-二氧代吡咯烷-1-基2-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)丙酸酯(194)的合成
将化合物193(5.15g，20.26mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(2.80g，24.34mmol)，EDC(10.28g，54.10mmol)和N，N-二异丙基乙胺(5.50mL，31.63mmol)的二氯甲烷(70mL)溶液搅拌6小时，真空浓缩并在硅胶柱上纯化(流动相为二氯甲烷/乙酸乙酯＝10：1)，得到化合物194(5.83g，82％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C15H17N3O7计算值，351.11；实测值，351.20。
实施例226.(18S，59S)-18-((苄氧基)羰基)-59-((S)-2-(4-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)丙酰胺基)-3，16，21，37，53-五氧代-1-苯基-2，25，28，31，34，41，44，47，50-九氧杂-17，22，38，54-四氮杂六十烷-60-酸(195)的合成
在0℃下，向化合物192(7.61g，6.39mmol)和化合物194(2.90g，8.280mmol)的DMF(40mL)的溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(7mL)。将反应混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后在室温下搅拌1小时。将反应混合物浓缩并在硅胶柱上纯化(流动相为二氯甲烷/甲醇＝10∶1，含0.1％甲酸)，得到化合物195(7.10g，78％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C72H112N7O22计算值，1426.7782；实测值，1426.7820。
实施例227.(18S，59S)-18-((苄氧基)羰基)-59-((S)-2-(4-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)丙酰胺基)-3，16，21，37，53，60，63，66，69-九氧代-1-苯基-2，25，28，31，34，41，44，47，50-九氧杂-17，22，38，54，61，64，67，70-八氮杂七十二烷-72-酸(196)的合成
将化合物195(7.05g，4.94mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(0.92g，8.00mmol)，EDC(3.01g，15.84mmol)和N，N-二异丙基乙胺(1.00mL，5.75mmol)的四氢呋喃(50mL)溶液搅拌6小时并真空浓缩，得到NHS酯粗品。
向2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙酸(Gly-Gly-Gly)盐酸盐(1.67g，7.40mmol)的DMF(40mL)溶液和1.0M Na2PO4(pH 7.5，15mL)中，在1小时内将上述酯分四批加入。将反应混合物在室温下再搅拌3小时。浓缩后，将残余物在硅胶柱上纯化(二氯甲烷/甲醇＝10∶1至7∶1)，得到标题化合物196(8.16g，收率为79％)。MS-ESI m/z：[M+H]+C78H121N10O25计算值，1597.8426；实测值，1597.8495。
实施例228.N-(4-((18S，61S，76S)-18-((苄氧基)羰基)-61-((S)-2-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)丙酰胺基)-76-甲基-3，16，21，38，55，62，65，68，71，74-十二氧代-1-苯基-2，25，29，32，35，42，46，49，52-九氧杂-17，22，39，56，63，66，69，72，75-九氧杂七十七烷酰胺基)苄基)-1-((((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓甲酸盐(197)的合成
将化合物196(251mg，0.157mmol)，化合物24(147.8mg，0.157mmol)，EDC(101mg，0.526mmol)和DPEA(0.10mL，0.575mmol)的DMA溶液在室温下搅拌6小时。真空蒸发浓缩混合物，用制备C-18HPLC(含0.5％甲酸的乙腈/水，Φ＝3cm，v＝20mL/min，45分钟，从90％水到30％水)纯化，得到化合物197(235.8mg，62％收率)。ESI-MS m/z：M+C121H171FN17O31计算值：2377.2305；实测值2377.2415。
实施例229.N-(4-((2S，17S，60S)-60，74-二羧基-17-((S)-2-(4-(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)丙酰胺基)-2-甲基-4，7，10，13，16，23，40，57，62-九氧代-26，29，32，36，43，46，49，53-八氧杂-3，6，9，12，15，22，39，56，61-九氮杂七十四烷酰胺基)苄基)-1-((((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-N，N-二甲基哌啶-4-鎓(198)的合成
化合物197(110g，0.0454mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液与TFA(4mL)反应1小时。将反应混合物用甲苯(5mL)和DMF(5mL)稀释，蒸发浓缩，并通过制备C-18HPLC(含0.5％甲酸的乙腈/水，Φ＝3cm，v＝20mL/min，45分钟，从95％水到30％水)纯化，得到化合物198(70.2mg，69％收率)。ESI-MS m/z：M+C107H159FN17O31计算值：2197.1366；实测值2197.1410。
实施例230.(S)-叔丁基(2-(2-(1-(4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)哌啶-4-基)氨基)-2-氧乙基)氨基)-2-氧乙基)胺基)-2-羰基乙基)氨基甲酸酯(199)
向(S)-11-((4-氨基哌啶-1-基)甲基)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮盐酸盐(49)(0.805g，1.478mmol)的DMF(25mL)溶液和0.1M NaH2PO4 pH 7.5(50mL)中，3小时内分四份加入2，5-二氧代吡咯烷-1-基2，2-二甲基-4，7，10-三氧代-3-氧杂-5，8，11-三氮杂十三烷-13-酯(0.855g，2.214mmol)。加入后，将混合物再搅拌2小时，浓缩，用乙酸乙酯/正丁醇(1：1，15mL×3)萃取。将有机层合并，浓缩并在硅胶柱上纯化(二氯甲烷/甲醇＝12∶1至7∶1)，得到标题化合物199(0.841g，73％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C38H47FN7O10计算值，780.3369；实测值，780.3415。
实施例231.(S)-2-氨基-N-(2-(2-(1-(4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14)-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)哌啶-4-基)氨基)-2-氧乙基)氨基)-2-氧乙基)乙酰胺盐酸盐(200)的合成
在4℃下，将化合物199(0.810g，1.039mmol)溶解于二恶烷(25ml)中，并与盐酸(10ml，36％浓盐酸)反应0.5小时。将反应混合物用甲苯(15ml)和DMF(15ml)稀释，在15℃下浓缩，得到标题化合物200粗品(0.744g，100％收率)，无需进一步纯化直接用于下一步。MS-ESI m/z：[M+H]+C33H39FN7O8计算值，680.2845；实测值，680.2895。
实施例232.(2S，10S，11S，19S)-2，19双((S)-18-((苄氧基)羰基)-3，16，21，37，53-五氧基-1-苯基-2，25，28，31，34，41，44，47，50-九氧杂-17，22，38，54-四氮杂五十八烷-58-基)-10，11双(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-4，9，12，17-四氧代-3，8，13，18-四氮杂二十烷-1，20二酸(201)
在0℃，向化合物192(2.78g，2.267mmol)和化合物132(0.951g，1.129mmol)的DMF(40mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(6mL)。将反应混合物在0℃搅拌0.5小时，然后在室温搅拌1小时。将反应混合物浓缩并在硅胶柱上纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇＝10：1至3：1，含0.1％甲酸)，得到化合物201(2.432g，72％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C150H231N16O46计算值，2992.6229；实测值，2992.6295。
实施例233.(15S，56S，64S，65S，73S，114S)-四苄基64，65双(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-56，73双((2-(2-((2-)(1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)-哌啶-4-基)氨基)-2-氧乙基)氨基)-2氧乙基)胺基)-2-(氧乙基)氨甲酰基)-13，18，34，50，58，63，66，71，79，95，111，116-十二烷氧代-22，25，28，31，38，41，44，47，82，85，88，91，98，101，104，107-十六烷氧杂-14，19，35，51，57，62，67，7 72，78，94，110，115-十二氮杂一百二十八烷-1，15，114，128-四羧酸酯(202)的合成
将化合物201(0.150g，0.209mmol)，化合物200(0.312g，0.104mmol)、EDC(0.252g，1.311mmol)的DMF(8mL)溶液搅拌8小时，真空蒸发浓缩并在硅胶柱上纯化(二氯甲烷/甲醇＝10：1至7：1)，得到标题化合物202(0.301g，67％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C216H303F2N30O60计算值，4315.1550；实测值，4315.1685。
实施例234.(15S，56S，64S，65S，73S，114S)-64，65双(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-56，73双((2-(2-((2-)(1-(((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)哌啶-4-基)氨基)-2-氧乙基)氨基)-2氧乙基)胺基)-2-羰基)氨基甲酰基)-13，18，34，50，58，63，66，71，79，95，111，116-十二烷氧代-22，25，28，31，38，41，44，47，82，85，88，91，98，101，104，107-十六烷氧杂-14，19，35，51，57，62，67，72，78，94，110，115-十二氮杂一百二十八烷-1，15，114，128四羧酸(203)
化合物202(105mg，0.0243mmol)的二氯甲烷(2mL)溶液与TFA(4mL)反应1小时。将反应混合物用甲苯(5mL)和DMF(5mL)稀释，浓缩，并通过制备C-18HPLC纯化(含有0.5％甲酸的乙腈/水，Φ＝3cm，v＝20mL/min，45分钟，95％的水到30％的水)，得到化合物203(65.3mg，68％收率)。ESI-MS m/z：[M+H]+C188H279F2N30O60计算值：3954.9672；实测值3954.9785。
实施例235.(11S，19S，20S，28S)-二叔丁基19，20双((苄氧基)-羰基)氨基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38-二酯(204)的合成
向(S)-叔丁基34-(4-氨基丁酰胺)-28，35，38，41-四氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36，39，42-四氧杂四十四烷-44-酯(4.427g，5.01mmol)的DMF(80mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(2.0mL，11.503mmol)和化合物127(2.001g，5.02mmol)。混合物在室温下搅拌过夜，然后加入EDC(3.851g，20.05mmol)。混合物继续搅拌8小时，减压浓缩，硅胶柱层析纯化，洗脱梯度为5-20％甲醇/二氯甲烷，得到标题产物(8.491g，79％收率)。MSESI m/z C98H165N14O38[M+H]+计算值2146.1410，实测值2146.1985。
实施例236.(11S，19S，20S，28S)-二叔丁基19，20-二氨基-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-二氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38二酯(205)的合成
在氢化瓶中，向化合物204(8.450g，3.939mmol)的DMA(100mL)溶液中加入Pd/C(1.00g，10wt％，50％wet)。将混合物与40psi的H2一起振摇过夜，通过硅藻土(助滤剂)过滤，将滤液浓缩，得到浅棕色胶状物(7.2458g，98％收率)，无需进一步纯化即可用于下一步。MS ESI m/z C82H153N14O34[M+H]2+计算值939.5377，实测值939.5485。
实施例237.(11S，19R，20S，28S)-二叔丁基19，20双(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氮杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38二酯(206)的合成
将化合物205(7.201g，3.836mmol)在饱和NaHCO3(90mL)和甲醇(10mL)中的混合物在0℃下冷却，然后加入N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺(3.10g，20.00mmol)。搅拌溶液20分钟后，将反应混合物用水(150mL)稀释并在室温搅拌30分钟。将反应混合物在2-8℃浓缩至～100mL，并用二氯甲烷(4×60mL)萃取。合并有机相，用硫酸镁干燥，过滤，浓缩，用硅胶柱层析纯化，洗脱梯度为5-20％甲醇/二氯甲烷，得到标题产物(8.491g，79％收率)。MS ESI m/zC90H153N14O38[M+H]+计算值2038.0471，实测值2038.0545。
实施例238.(11S，19R，20S，28S)-19，20-双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氮杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38二酸(207)的合成
在冰浴上，向化合物206(8.451g，4.148mmol)的二恶烷(50mL)溶液中加入浓盐酸(12mL)。将混合物在冰浴上搅拌45分钟，用二恶烷(50mL)和甲苯(50mL)稀释，浓缩，并与二恶烷/甲苯(1：1，2×50mL)真空共沸浓缩，得到无色胶状物(7.745g，97％收率)，HPLC纯度为93％，无需进一步纯化即可用于下一步。粗品可通过硅胶柱层析纯化，洗脱梯度为3-10％水/丙酮，得到标题产物(7.141g，84％收率)。MS ESI m/z C82H137N14O38[M+H]+计算值1925.9219，实测值1925.9395。
实施例239.(2R，3S)-2，3-双(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N1，N4双((S)-34-((2-(2-((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-1，2，3，9，10，12，13，15-八氢苯并[de]吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧乙基)氨基)-2氧乙基)氨基)-2-(氧乙基)氨甲酰基)-28，36-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，35-二氮杂三十九烷-39-基)丁二酰胺(208)的合成
向化合物207(0.301g，0.156mmol)，依喜替康盐酸盐(0.151g，0.318mmol)、EDC(0.150g，0.781mmol)的DMA(8mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.080mL，0.460mmol)。然后将混合物在室温下搅拌6小时，减压浓缩，用硅胶柱层析纯化，洗脱梯度为3-18％甲醇/二氯甲烷，得到标题产物(0.207g，72％收率)。MS ESI m/zC130H176F2N20O44[M+H]+计算值2760.2196，实测值2760.2450。
实施例240.(2R，3S)-2，3-双(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N1，N4双((S)-34-((2-(2-((4-(羟甲基)苯基)氨基)-2-氧乙基)氨基)-2-氧乙基)胺基)-2-羰基乙基)氨甲酰基)-28，36-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，35-二氮杂三十九烷-39-基)丁二酰胺(209)的合成
向化合物207(1.008g，0.523mmol)和(4-氨基苯基)甲醇盐酸盐(0.261g，1.635mmol)的DMA(15mL)溶液中加入EDC(0.401g，2.088mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.20mL，1.15mmol)。将混合物搅拌8小时，减压浓缩并通过硅胶柱色谱纯化，5-15％甲醇/二氯甲烷的梯度洗脱，得到标题产物(0.904g，81％收率)。MS ESI m/z计算值C96H150N16O38[M+H]+2136.0376，实测值2136.0520。
实施例241.2-(11S，19R，20S，28S)-19，20双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38二酰基)双(氮杂二基)双(4，1-亚苯基)双(亚甲基)-二氨基甲酸酯(210)的合成
向化合物207(1.001g，0.520mmol)和4-氨基苄基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(0.301g，1.163mmol)的DMA(20mL)溶液中加入EDC(0.401g，2.088mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.20mL，1.15mmol)。将混合物搅拌8小时，减压浓缩并通过硅胶柱色谱法纯化，5-15％甲醇/二氯甲烷的梯度洗脱，得到标题产物(1.007g，83％收率)。MS ESI m/z C106H169N18O40[M+H]+计算值2334.1744，实测值2334.1980。
实施例242.二叔丁基-(((((11S，19R，20S，28S)-19，20双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38二酰基)双(氮杂二烷基))双(4，1-亚苯基)双(亚甲基)双(甲基氨基甲酸酯)(211)的合成
向化合物207(1.001g，0.520mmol)和4-氨基苄基(甲基)氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(0.300g，1.100mmol)的DMA(20mL)溶液中加入EDC(0.401g，2.088mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.20mL，1.15mmol)。将混合物搅拌8小时，减压浓缩并通过硅胶柱色谱法纯化，5-15％甲醇/二氯甲烷的梯度洗脱，得到标题产物(0.988g，81％收率)。MS ESI m/z C108H173N18O40[M+H]+计算值2362.2056，实测值2362.2230。
实施例243.(2R，3S)-N1，N4双((S)-34-((2-(2-((2-)((4-(氨基甲基)苯基)-氨基)-2-氧乙基)氨基)-2-氧乙基)胺基)-2-羰基乙基)氨甲酰基)-28，36-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，35-二氮杂三十九烷-39-基)-2，3-双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁二酰胺(212)的合成
在冰浴上，向化合物210(0.2511g，0.107mmol)的二恶烷(10mL)溶液中加入盐酸(浓2mL)。将混合物在冰浴上搅拌30分钟，用二恶烷(10mL)和甲苯(10mL)稀释，浓缩并与二恶烷/甲苯(1：1，2×10mL)真空共沸蒸发，得到212盐酸盐(0.2373g，100％收率)，HPLC纯度为95％，无需进一步纯化即可用于下一步。MS ESI m/z C96H154N18O36[M+2H]2+计算值1067.5388，实测值1067.5445。
实施例244.(2R，3S)-N1，N4双((S)-34-((2-(2-((2-)(4-(甲基氨基甲基)苯基)-氨基)-2-氧乙基)氨基)-2-氧乙基)胺基)-2-羰基乙基)氨甲酰基)-28，36-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，35-二氮杂三十九烷-39-基)-2，3-双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁二酰胺(213)的合成
在冰浴上，向化合物211(0.2501g，0.106mmol)的二恶烷(10mL)溶液中加入浓盐酸(2mL)。将混合物在冰浴上搅拌30分钟，用二恶烷(10mL)和甲苯(10mL)稀释，浓缩，与二恶烷/甲苯(1：1，2×10mL)真空共沸蒸发，得到213盐酸盐(0.2292g，100％收率)，HPLC纯度为95％，无需进一步纯化即可用于下一步。MS ESI m/z C98H158N18O36[M+2H]2+计算值1082.5622，实测值1082.5815。
实施例245.双((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-9-基)-3-(11S，19R，20S，28S)-19，20双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38二酰基)双(氮杂二基)双(4，1-亚苯基)双(亚甲基)-二氨基甲酸酯(214)的合成
在冰浴中，向(S)-4-乙基-8-氟-4，9-二羟基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮(0.101g，0.264mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中，加入N，N-二异丙基乙胺(0.050mL，0.287mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(0.056g，0.279mmol)。然后将混合物在室温下搅拌2小时，然后加入化合物212(0.288g，0.135mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.060mL，0.345mmol)。将反应混合物继续搅拌过夜，减压浓缩并用硅胶柱层析纯化，5-15％甲醇/二氯甲烷的梯度洗脱，得到标题产物(0.303g，76％收率)。MS ESI m/zC138H178F2N22O48[M+H]+计算值2590.2211，实测值2950.2390。
实施例246.双((S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-9-基)-3-(11S，19R，20S，28S)-19，20双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38二酰基)双(氮杂二基))双(4，1-亚苯基)双(亚甲基)双(氨基甲酸甲酯)(215)的合成
在冰浴中，向(S)-4-乙基-8-氟-4，9-二羟基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮(0.101g，0.264mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中，加入N，N-二异丙基乙胺(0.050mL，0.287mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(0.056g，0.279mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，然后加入化合物213(0.295g，0.136mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.060mL，0.345mmol)。将反应混合物继续搅拌过夜，减压浓缩并用硅胶柱层析纯化，用5-15％甲醇/二氯甲烷梯度纯化，得到标题产物(0.303g，收率76％)。MS ESI m/zC140H184F2N22O48[M+H]+计算值2979.2601，实测值2979.2890。
实施例247.((((11S，19R，20S，28S)-19，20双(2，5)的合成-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38二酰基)双(氮杂二基))双(4，1-亚苯基)双(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-1013-二氧代-1，2，3，9，10，12，13，15-八氢苯并[de]吡喃[3'，4'：6，7]-吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基甲酸酯)(216)的合成
在冰浴上，N2保护下，向化合物209(0.201g，0.094mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中，加入三光气(0.0575g，0.191mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.040mL，0.230mmol)。将混合物在0℃搅拌30分钟，室温下搅拌30min，然后在冰浴上加入依喜替康盐酸盐(0.110g，0.233mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.045mL，0.258mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，减压浓缩，硅胶柱层析纯化，3-18％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，得到标题产物(0.207g，72％收率)。MS ESI m/z C146H190F2N22O48[M+H]+计算值3058.3150，实测值3058.3345。
实施例248.(2R，3S)-2，3-双(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N1，N4双((S)-34-((2-((2-)(((1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-1，2，3，9，10，12，13，15八氢苯并[de]吡喃[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2氧代乙基(氨基甲酰基)-28，36-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，35-二氮杂三十九烷-39-基)丁二酰胺(217)的合成
向(11S，19R，20S，28S)-19，20-双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38-二酸(0.301g，0.156mmol)，2-(氨基甲氧基)-N-(1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10，13-二氧代-1，2，3，3，9，10，12，13，15-八氢苯并[de]吡喃并[3'，4'：6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-1-基)乙酰胺(0.185g，0.354mmol)，EDC(0.150g，0.781mmol)的DMA(8mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.080mL，0.460mmol)。然后将混合物在室温下搅拌6小时，减压浓缩并用硅胶柱层析纯化，3-18％甲醇/二氯甲烷溶液梯度洗脱，得到标题产物(0.308g，收率70％)。MSESI m/z C132H181F2N20O46[M+H]+计算值2820.2408，实测值2820.2635。
实施例249.(2R，3S)-2，3-双(2，5)-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N1，N4双((S)-34-((1-(S)-4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚并[1，2-b]喹啉-11-基)-3，8，11-三氧代-5-氧杂-2，7，10-三氮杂十二烷-12-基)氨基甲酰基)-28，36-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，35-二氮杂三十九烷-39-基)丁二酰胺(218)的合成
向(11S，19R，20S，28S)-19，20-双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38-二氧二酸(0.251g，0.130mmol)，(S)-2-(氨基甲氧基)-N-(4-乙基-8-氟-4-羟基-9-甲氧基-3，14-二氧代-3，4，12，14-四氢-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]加入吲嗪并[1，2-b]喹啉-11-基)甲基)乙酰胺(0.158g，0.308mmol)和EDC(0.150g，0.781mmol)的DMA(8mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.070mL、0.402mmol)。然后将混合物在室温下搅拌6小时，减压浓缩并用硅胶柱层析法纯化，通过3-18％甲醇/二氯甲烷的溶液梯度洗脱，得到标题产物(0.265g，73％收率)。MS ESI m/z C128H177F2N20O48[M+H]+计算值2800.1993，实测值2800.2120。
实施例250.Boc-N-Me-L-Val-OH(219)的合成
在0℃下，向Boc-L-Val-OH(2.00g，9.2mmol)和碘甲烷(5.74mL，92mmol)的无水四氢呋喃(40mL)溶液中加入氢化钠(3.68g，92mmol)。将反应混合物在0℃搅拌1.5小时，然后升温至室温并搅拌24小时。用冰水(50mL)淬灭反应。加入水(100mL)后，反应混合物用乙酸乙酯(3×50mL)洗涤，水溶液酸化至pH 3，然后用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。合并的有机相用硫酸钠干燥并浓缩，得到Boc-N-Me-Val-OH(2.00g，94％收率)，为白色固体。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ4.10(d，J＝10.0Hz，1H)，2.87(s，3H)，2.37–2.13(m，1H)，1.44(d，J＝26.7Hz，9H)，1.02(d，J＝6.5Hz，3H)，0.90(t，J＝8.6Hz，3H)。
实施例251.(S)叔丁基2-((1R，2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-氧代-3-苯基丙基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-羧酸酯(220)的合成
在0℃下，向(2R，3R)-3-(S)-1-(叔丁氧羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(100mL，0.347mmol)和L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(107.8mg，0.500mmol)的DMF(5mL)溶液中加入氰基膦酸二乙酯(75.6μL，0.451mmol)，然后加入Et3N(131μL，0.94mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌2小时，然后升温至室温并搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯(80mL)稀释，用1N硫酸氢钾水溶液(40mL)，水(40mL)，饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)和饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤，用硫酸钠干燥，真空浓缩。残余物用柱层析(15-75％乙酸乙酯/正己烷)纯化，得到标题化合物(130mg，83％收率)，为白色固体。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.28(dd，J＝7.9，6.5Hz，2H)，7.23(t，J＝7.3Hz，1H)，7.16(s，2H)，4.81(s，1H)，3.98–3.56(m，5H)，3.50(s，1H)，3.37(d，J＝2.9Hz，3H)，3.17(dd，J＝13.9，5.4Hz，2H)，3.04(dd，J＝14.0，7.7Hz，1H)，2.34(s，1H)，1.81–1.69(m，2H)，1.65(s，3H)，1.51–1.40(m，9H)，1.16(d，J＝7.0Hz，3H)。
实施例252.用三氟乙酸脱Boc基团的一般步骤
向N-Boc氨基酸(1.0mmol)的二氯甲烷(2.5mL)溶液中加入三氟乙酸(1.0mL)。在室温下搅拌1-3小时后，将反应混合物真空浓缩。与甲苯共沸蒸发得到脱保护产物，其无需进一步纯化即可使用。
实施例253.(S)-甲基2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4S，5S)-4-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-乙氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸酯(221)的合成
在0℃下，向(S)-叔丁基2-((1R，2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-羧酸酯(0.29mmol)的脱Boc保护产物和(3R，4S，5S)-4-((叔丁氧基羰基)(甲基)氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(96.6mg，0.318mmol)的DMF(5mL)溶液中加入氰基膦酸二乙酯(58μL，0.347mmol)，然后加入Et3N(109μL，0.78mmol)。将反应混合物搅拌2小时，然后升温至室温并搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯(80mL)稀释，用1N硫酸氢钾水溶液(40mL)、水(40mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)和饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤，硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(15-75％乙酸乙酯/正己烷)纯化，得到标题化合物(150mg，81％收率)，为白色固体。LC-MS(ESI)m/zC34H55N3O8[M+H]+计算值：634.40，实测值：634.40。
实施例254.(S)-甲基2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4S，5S)-4-(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-N，3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基-3-苯基丙酸酯(222)的合成
在0℃下，向(S)-甲基2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4S，5S)-4-((叔丁氧羰基))(甲基)氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸酯(0.118mmol)的脱Boc保护产物和Boc-Val-OH(51.8mg，0.236mmol))的二氯甲烷(5mL)溶液中加入BroP(70.1mg，0.184mmol)，然后加入二异丙基乙胺(70μL，0.425mmol)。将混合物避光并在0℃搅拌30分钟，然后在室温搅拌2天。将反应混合物用乙酸乙酯(80mL)稀释，用1N硫酸氢钾水溶液(40mL)、水(40mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)和饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤，硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(20-100％乙酸乙酯/正己烷)纯化，得到标题化合物(67mg，77％收率)，为白色固体。LC-MS(ESI)m/zC39H64N4O9[M+H]+计算值：733.47，实测值：733.46。
实施例255.(S)-甲基2-((2R，3R)-3-((S)-1-((6S，9S，12S，13R)-12-((S)-仲丁基)-6，9-二异丙基-13-甲氧基-2，2，5，11-四甲基-4，7，10-三氧代-3-氧杂-5，8，11-三氮杂十五烷-15-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸酯(223)的合成
在0℃下，向(S)-甲基2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4S，5S)-4-((S)-2)-((叔丁氧基羰基)氨基)-N，3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸酯(0.091mmol)的Boc脱保护产物和Boc-N-Me-Val-OH(127mg，0.548mmol)的DMF(5mL)溶液中加入氰基膦酸二乙酯(18.2μL，0.114mmol)，然后加入N-甲基吗啉(59μL，0.548mmol)。将反应混合物在0℃搅拌2小时，然后升温至室温并搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯(80mL)稀释，用1N硫酸氢钾水溶液(40mL)、水(40mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(40mL)和饱和氯化钠水溶液(40mL)洗涤，硫酸钠干燥，真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(20-100％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到标题化合物(30mg，39％收率)，为白色固体。LC-MS(ESI)m/z C45H75N5O10[M+H]+计算值：846.55，实测值：846.56。
实施例256.(S)-2-((2R，3R)-3-((S)-1-((6S，9S，12S，13R)-12-((S)-仲丁基)-6，9-二异丙基-13-甲氧基-2，2，5，11-四甲基-4，7，10-三氧基-3-氧杂-5，8，11-三氮杂戊烷-15-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸(224)的合成
向(S)-甲基2-(2R，3R)-3-(S)-1-((6S，9S，12S，13R)-12-(S)-仲丁基)-6，9-二异丙基-13-甲氧基-2，2，5，11-四甲基-4，7，10-三氧代-3-氧杂-5，8，11-三氮杂十五烷-15-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸酯(30mg，0.035mmol)的四氢呋喃(1.0mL)溶液中加入LiOH(1.0M的水溶液，0.8mL)。混合物在室温下搅拌35min，用0.5M H3PO4中和至pH 6，浓缩，硅胶柱层析(CH3OH/二氯甲烷/HOAc 1：10：0.01)纯化，得到标题化合物(25.0mg，85％收率)。LC-MS(ESI)m/z C44H74N5O10[M+H]+计算值：832.54，实测值：832.60。
实施例257.(S)-2-((2R，3R)-3-(S)-1-((3R，4S，5S)-4-((S)-N，3-二甲基-2-(S)-3-甲基-2-甲基氨基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)-吡咯烷-2-基)-3甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸(MMAF)(225)的合成
将(S)-甲基2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4S，5S)-4-((S)-N，3-二甲基-2-((S))-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺基)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基-庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯基丙酸酯(25mg，0.030mmol)，浓盐酸(0.3mL)和1，4-二恶烷(0.9mL)的混合物在室温下搅拌35分钟。将混合物用乙醇(1.0mL)和甲苯(1.0mL)稀释，浓缩，与乙醇/甲苯(2：1)共沸浓缩，得到标题化合物(22mg，～100％收率)，为白色固体，不经进一步纯化用于下一步。LC-MS(ESI)m/z C39H66N5O8[M+H]+计算值：732.48，实测值：732.60。
实施例258.化合物258的合成
向化合物207(0.101g，0.052mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(0.020g，0.173mmol)，EDC(0.050g，0.260mmol)的DMA(4mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.020mL，0.115mmol)。将混合物在室温下搅拌6小时。然后将混合物加入MMAF(0.095g，0.130mmol)的DMA(1mL)溶液和NaH2PO4(5mL，0.1M，pH 7.5)中。将混合物搅拌4小时，减压浓缩并通过C-18HPLC色谱法纯化(10mL/min，5％-50％甲醇/水梯度洗脱)，冻干后得到标题产物(0.120g，69％收率)。MS ESI m/z C160H263N24O52[M+H]+计算值3352.8674，实测值3352.8935。
实施例259.化合物227的合成
在冰浴上，N2下，向化合物209(0.101g，0.047mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中，加入三光气(0.0285g，0.096mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.020mL，0.115mmol)。将混合物在0℃搅拌30分钟，在室温下搅拌30分钟，然后在冰浴上加入(S)-N-((3R，4S，5R)-1-((S)-2-((1R，2R)-3-(((1S，2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚烷-4-基)-N，3-二甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺基)丁酰胺(MMAE)(0.080g，0.111mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.025mL，0.144mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，减压浓缩，用硅胶柱层析纯化，洗脱梯度为3-18％甲醇/二氯甲烷，得到标题产物(0.124g，73％收率)。MS ESI m/z C176H280N27O54[M+H]+计算值3623.0042，实测值3623.0250。
实施例260.(S)-甲基2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4S，5S)-4-(S)-N，3-二甲基-2-(S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺)丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸酯(228)的合成
向(S)-甲基2-(2R，3R)-3-(S)-1-((6S，9S，12S，13R)-12-(S)-仲丁基)-6，9-二异丙基-13-甲氧基-2，2，5，11-四甲基-4，7，10-三氧代-3-氧杂-5，8，11-三氮杂十五烷-15-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸酯(75.0mg，0.0886mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中，在室温下加入三氟乙酸(2mL)。在室温下搅拌1小时后，将反应混合物真空浓缩。与甲苯共沸蒸发得到去保护的标题产物，其无需进一步纯化即可使用。
实施例261.(S)-甲基2-((2R，3R)-3-((S)-1-((5S，8S，11S，14S，15R)-14-((S)-仲丁基)-8，11-二异丙基-15-甲氧基-5，7，13-三甲基-3，6，9，12-四氧代-1-苯基-2-氧杂-4，7，10，13-四氮杂庚烷-17-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧代-2-甲基丙酰胺)-3-苯基丙酸酯(229)的合成
在0℃，向MMAF-OMe(0.132g，0.178mmol，1.0eq.)和Z-L-丙氨酸(0.119g，0.533mmol，3.0eq.)的无水二氯甲烷(10mL)溶液中依次加入HATU(0.135g，0.356mmol，2.0eq.)和NMM(0.12mL，1.07mmol，6.0eq.)。将反应在0℃搅拌10分钟，然后升温至室温并搅拌过夜。将混合物用二氯甲烷稀释并用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，浓缩并通过硅胶柱色谱法(20：1二氯甲烷/甲醇)纯化，得到标题化合物，为白色泡沫状固体(0.148g，88％收率)。ESIMS m/z：C51H79N6O11[M+H]+计算值951.6，实测值951.6。
实施例262.(S)-甲基2-((2R，3R)-3-((S)-1-((3R，4S，5S)-4-((S)-2-((S)-2-((S)-2-氨基-N-甲基丙酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-N，3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-苯丙酸酯(230)的合成
在氢化瓶中，向(S)-甲基2-((2R，3R，3R)-3-((S)-1-((5S，8S，11S，14S，15R)-14-((S)-仲丁基)-8-11-二异丙基-15-甲氧基-5-甲氧基-5-甲基氧基-7-13-三甲基-3-3-三甲基6，9，12-四氧基-1-苯基-2-氧杂-4，7，10，13-七氮杂十七烷-17-酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-3-甲氧基-2-甲基丙烷氨基)-3-苯基丙酸酯(0.148g，0.156mmol，1.0eq.uiv)的甲醇(5mL)溶液中加入10％Pd/C(0.100g，含水50％)。将混合物振摇5小时，然后通过硅藻土垫过滤。将滤液浓缩，得到标题化合物，为白色泡沫状固体(0.122g，96％收率)。ESIMS m/z：C43H73N6O9[M+H]+计算值817.5，实测值817.5。
实施例263.化合物263的合成
向化合物207(0.101g，0.052mmol)，化合物230(0.106g，0.130mmol)，EDC(0.100g，0.521mmol)的DMA(4mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.040mL，0.230mmol)。然后将混合物在室温下搅拌6小时，减压浓缩，硅胶柱层析纯化，通过3-15％甲醇/二氯甲烷的梯度洗脱，得到标题产物(0.135g，74％收率)。MS ESI m/z C168H277N26O54[M+H]+计算值3522.9729，实测值3522.9980。
实施例264.(5S，12S，13S，20S)-二叔丁基12，13-双(((苄氧基)羰基)氨基)-4，7，11，14，18，21-六氧代-5，20-双(4-(((2，2，2-三氯乙氧基))氨基)-丁基)-3，6，10，15，19，22-六氮杂二十四烷-1，24-二酯(232)的合成
/>
向(S)-叔丁基2-(2-(3-氨基丙酰胺基)-6-((((2，2，2-三氯乙氧基)-羰基)氨基)六酰胺基)乙酸酯(6.05g，12.0mmol)和(2S，3S)-2，3-双(((苄氧基)-羰基)氨基)丁二酸(2.48g，5.96mmol)的DMA(60mL)溶液中加入EDC·HCl(5.01g，26.09mmol)和N，N-二异丙基乙胺(4.7mL，26.4mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后用150mL二氯甲烷稀释并倒入装有100mL水的分液漏斗中。分离有机相，用盐水(2×80mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(10-80％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到标题化合物232(7.03g，85％收率)。ESIMS m/z 1389.50([M+H]+)。
实施例265.(5S，12S，13S，20S)-二叔丁基12，13-二氨基-4，7，11，14，18，21-六氧代-5，20-双(4-((2，2，2-三氯乙氧基)羰基)氨基)丁基)-3，6，10，15，19，22-六氮杂十四烷-1，24-二酸酯(233)的合成
在氢化瓶中，向化合物232(7.01g，5.02mmol)的甲醇(100mL)溶液中加入Pd/C(10wt％，0.80g)。将混合物振荡2小时，通过硅藻土(助滤剂)过滤，将滤液浓缩，得到化合物233(5.57g，99％收率)，为无色油状物。ESIMS m/z 1121.55([M+H]+)。
实施例266.(5S，12S，13S，20S)-二叔丁基12，13-双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，11，14，18，21-六氧代-5，20-双(4-(((2，2，2-三氯乙氧基)羰基)氨基)丁基)-3，6，10，15，19，22-六氮杂二十四烷-1，24-二酸酯(234)
搅拌下向冷却至0℃的化合物233(5.49g，4.90mmol)的饱和NaHCO3(90mL)和甲醇(10mL)溶液中加入N-(甲氧基羰基)马来酰亚胺(3.10g，20.00mmol)。20分钟后，将反应混合物用水(150mL)稀释并在室温搅拌30分钟。将反应混合物在2-8℃浓缩至～100mL并用二氯甲烷(4×60mL)萃取。合并有机层，用硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析纯化，5-10％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，得到标题产物234(4.893g，78％收率)。MS ESI[M+H]+1281.55。
实施例267.(5S，12S，13S，20S)-12，13-双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，11，14，18，21-六氧代-5，20-双(4-(((2，2，2-三氯乙氧基)羰基)氨基)丁基)-3，6，10，15，19，22-六氮杂二十四烷-1，24-二酸(235)
在0℃下，将化合物234(4.88g，3.81mmol)的二恶烷(15mL)的溶液与4N盐酸(5mL)反应30min，用甲苯(10ml)稀释，然后浓缩，并用短硅胶色谱纯化，0-18％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到无色油状物(4.01g，90％收率)。ESIMS m/z 1169.25([M+H]+)。
实施例268.化合物236的合成
236
向化合物235(130.0mg，0.111mmol)和鹅膏毒素衍生物(104.0mg，0.111mmol，WO2020/155017)的DMF(10mL)溶液中，加入TBTU(140.6mg，0.442mmol)，N，N-二异丙基乙胺(40.0μL，0.229mmol)，并将混合物在室温下搅拌4小时。在高真空下去除DMF后，通过制备C-18HPLC纯化残余物(5％-50％乙腈/水，45分钟，d 20×250mm，10ml/min)，得到无色油状物(133.2mg，58％收率)。ESI MS m/z 2066.70([M+H]+)。
实施例269.化合物237的合成
在0℃下，将化合物236(120.0mg，0.058mmol)的四氢呋喃(10mL)溶液与TBAF(1.0M的四氢呋喃溶液，350μL)搅拌30min，然后浓缩并通过C-18制备HPLC纯化(5％-40％乙腈/水，45分钟，d 20×250mm，10ml/min)，得到油状物237(79.2mg，79％收率)。ESIMS m/z1718.85([M+H]+)。
实施例270.14-(苄氧基)-14-氧代十四烷酸(238)的合成
向十四烷二酸(2.06g，8mmol)的DMF(30mL)溶液中加入K2CO3(1.1g，8mmol)和BnBr(1.36g，8mmol)。混合物在室温下搅拌过夜，浓缩，柱层析(乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到标题化合物238(1.2g，45％收率)。ESIMS m/z 349.23([M+H]+)。
实施例271.3-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(239)的合成
向2，2'-乙烷-1，2-二烷基双氧基二乙醇(55.0mL，410.75mmol，3.0eq.)的无水四氢呋喃(200mL)溶液中加入钠(0.1g)。搅拌混合物直至钠消失，然后滴加丙烯酸叔丁酯(20.0mL，137.79mmol，1.0eq.)。将混合物搅拌过夜，然后在0℃用盐酸溶液(20.0mL，1N)淬灭。通过旋转蒸发除去四氢呋喃，加入盐水(300mL)，用乙酸乙酯(3×100mL)萃取所得混合物。有机层用盐水(3×300mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到标题化合物(30.20g，79.0％收率)，为无色油状物，其无需进一步纯化即可使用。MS ESI m/z 278.17([M+H]+)。
实施例272.3-(2-(2-(2-(甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(240)的合成
在0℃下，向3-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(30.20g，108.5mmol，1.0eq.)和TsCl(41.37g，217.0mmol，2.0eq.)的无水二氯甲烷(220mL)溶液中，加入TEA(30.0mL，217.0mmol，2.0eq.)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后用水(3×300mL)和盐水(300mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过硅胶柱色谱(3：1正己烷/乙酸乙酯)纯化，得到无色油状物(39.4g，84.0％收率)。MS ESI m/z 433.28([M+H]+)。
实施例273.3-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(241)的合成
向3-(2-(2-(2-(甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(39.4g，91.1mmol，1.0eq.)的无水DMF(100mL)溶液中加入NaN3(20.67g，316.6mmol，3.5eq.)。将混合物在室温下搅拌过夜。加入水(500mL)并用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。合并的有机层用水(3×900mL)和盐水(900mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过硅胶柱色谱法(5：1正己烷/乙酸乙酯)纯化，得到浅黄色油状物(23.8g，85.53％收率)。MS ESI m/z 326.2([M+Na]+)。
实施例274.3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(242)的合成
用水(3次)和异丙醇(3次)洗涤Raney-Ni(7.5g，悬浮在水中)，然后与化合物241的(5.0g，16.5mmol)异丙醇溶液混合。将混合物在H2气球下于室温搅拌16小时，然后在硅藻土垫上过滤，用异丙醇洗涤滤垫。滤液浓缩，用柱层析纯化(5-25％甲醇/二氯甲烷)，得到淡黄色油状物(2.60g，57％收率)。MS ESI m/z 279.19([M+H]+)。
实施例275.27-苄基1-叔丁基14-氧代-4，7，10-三氧杂-13-氮杂十七烷-1，27-二酸酯(243)的合成
向化合物238(2.60g，9.35mmol)和化合物242(3.91g，11.2mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入EDC·HCl(2.15g，11.2mmol)和N，N-二异丙基乙胺(3.6mL，20.6mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后用50mL二氯甲烷稀释，倒入装有50mL水的分液漏斗中。分离有机相，用盐水(50mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过柱色谱法(0-10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物(4.94g，87％收率)。ESI m/z 608.40([M+H]+)。
实施例276.3，16-二氧代-1-苯基-2，20，23，26-四氧杂-17-氮杂二十九烷-29-酸(244)的合成
向化合物243(4.94g，8.14mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中，加入TFA(20mL)。反应在室温下搅拌1小时，浓缩至干，与二氯甲烷共沸蒸发2次，将残余物置于泵上干燥，得到化合物244(4.50g，粗品)。ESIMS m/z 552.35([M+H]+)。
实施例277.40-苄基1-叔丁基14，27-二氧代-4，7，10，17，20，23-六氧杂-13，26-二氮杂四十烷-1，40-二酸酯(245)的合成
向化合物244(4.50g，粗品，8.14mmol)和化合物242(1.95g，7.00mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入EDC·HCl(1.56g，8.14mmol)和N，N-二异丙基乙胺(2.7mL，15.4mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后用50mL二氯甲烷稀释，倒入装有50mL水的分液漏斗中。分离有机相，用盐水(50mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(0-10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物245(5.22g，92％收率)。ESI m/z 811.52([M+H]+)。
实施例278.3，16，29-三氧代-1-苯基-2，20，23，26，33，36，39-七氧杂-17，30-二氮杂四十二烷-42-酸(246)的合成
向化合物245(5.22g，6.44mmol)的二氯甲烷(20mL)的溶液中加入TFA(5mL)。在室温下搅拌1小时，浓缩至干，与二氯甲烷共沸蒸发2次，将残余物置于泵上干燥，得到化合物246(4.90g，粗品)。ESIMS m/z 755.46([M+H]+)。
实施例279.40-苄基1-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)14，27-二氧代-4，7，10，17，20，23-六氧杂-13，26-二氮杂四十烷-1，40-二酯(247)的合成
向化合物246(4.90g，粗品，6.44mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中加入NHS(0.81g，7.08mmol)，EDC·HCl(1.85g，9.66mmol)，N，N-二异丙基乙胺(2.8mL，16.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后用水(50mL)稀释并用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。合并的有机相用盐水(30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过硅胶柱(10-50％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到无色油状物247(4.90g，90％收率)。ESIMS m/z 852.48([M+H]+)。
实施例280.1-((2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-1，14，27-三氧-4，7，10，17，20，23-六氧杂-13，26-二氮杂四十烷-40-酸(248)
向氢化瓶中的化合物247(4.90g，5.75mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液中，加入Pd/C(10wt％，0.20g)。将混合物在1atm H2下搅拌过夜，通过硅藻土(助滤剂)过滤，将滤液浓缩，得到化合物248(4.50g，>100％收率)。ESIMS m/z 762.44([M+H]+)。
实施例281.化合物249的合成
将化合物237(60.2mg，0.0349mmol)和化合物248(110.2mg，0.146mmol)的四氢呋喃(10mL)溶液和磷酸盐缓冲溶液(10mL，0.2M，pH 7.7)在室温下搅拌过夜，然后浓缩，通过C-18制备HPLC纯化(5％-40％乙腈/水，45分钟，d20×250mm，10ml/min)，得到白色泡沫(80.2mg，76％收率)。ESIMS m/z 3011.65([M+H]+)。
实施例282.4-(苄氧基)-3-甲氧基苯甲酸(250)的合成
向4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(50.0g，297.5mmol)在乙醇(350mL)和NaOH水溶液(2.0M，350mL)的混合物中，加入BnBr(140.0g，823.5mmol)。将混合物在65℃搅拌8小时，浓缩，与水(2×400mL)共沸蒸发并浓缩至～400mL，用6N盐酸酸化至pH 3.0。过滤收集固体，用乙醇结晶，45℃真空干燥，得到标题化合物(63.6g，83％收率)。ESIMS m/z 281.2([M+Na]+)。
实施例283.4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(251)的合成
向4-(苄氧基)-3-甲氧基苯甲酸(63.5g，246.0mmol)的二氯甲烷(400mL)和HOAc(100mL)溶液中加入发烟HNO3(25.0mL，528.5mmol)。将混合物搅拌6小时，浓缩，用乙醇结晶，40℃真空干燥，得到标题化合物(63.3g，85％收率)。ESI MS m/z 326.1([M+Na]+)。
实施例284.(S)-(4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯基)(2-(羟甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-基)甲酮(252)的合成
向4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(2.70g，8.91mmol)和草酰氯(2.0mL，22.50mmol)的无水二氯甲烷(70mL)溶液中加入催化量的DMF(30μl),并将所得混合物在室温搅拌2小时。用旋转蒸发仪除去过量的二氯甲烷和草酰氯。在0℃，N2保护下将乙酰氯重新悬浮在新鲜的二氯甲烷(70mL)中并缓慢加入(S)-(4-亚甲基吡咯烷-2-基)甲醇盐酸盐(1.32g，8.91mmol)和Et3N(6mL)的二氯甲烷溶液。使反应混合物升温至室温，继续搅拌8小时。除去二氯甲烷和Et3N后，将残余物在水和乙酸乙酯(70/70mL)之间分配。用乙酸乙酯(2×60mL)进一步萃取水层。合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，硫酸镁干燥并浓缩。用快速柱色谱法(硅胶，2：8正己烷/乙酸乙酯)纯化残余物，得到标题化合物(2.80g，79％收率)。EIMS m/z 421.2([M+Na]+)。
实施例285.(S)-(4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯基)(2-(((叔丁基二甲基硅基)氧基)甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-基)甲酮(253)的合成
向(S)-(4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯基)(2-(羟甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-基)甲酮(2.78g，8.52mmol)的二氯甲烷(10mL)和吡啶(10mL)溶液中加入叔丁基二甲基氯硅烷(2.50g，16.66mmol)。将混合物搅拌过夜，浓缩并在硅胶柱上纯化，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：6)洗脱，得到标题化合物(3.62g，83％收率，～95％纯度)。MS ESI m/z C27H37N2O6Si[M+H]+计算值513.23，实测值513.65。
实施例286.(S)-(4-羟基-5-甲氧基-2-硝基苯基)(2-(羟甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-基)甲酮(254)的合成
向(S)-(4-(苄氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯基)(2-(羟甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-基)甲酮(2.80g，7.03mmol)在二氯甲烷(30mL)和CH3SO3H(8mL)的混合物中加入PhSCH3(2.00g，14.06mmol)。将混合物搅拌0.5小时，用二氯甲烷(40mL)稀释，小心加入0.1M Na2CO3溶液中和。分离两相并用二氯甲烷(2×10mL)萃取水相。将有机层合并，用硫酸钠干燥，浓缩并在硅胶柱上纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：15至1：6)洗脱，得到标题化合物(1.84g，85％收率，纯度～95％)。MS ESI m/z C14H17N2O6[M+H]+计算值309.10，实测值309.30。
实施例287.(S)-((戊烷-1，5-二(氧基))双(5-甲氧基-2-硝基-4，1-亚苯基))双((S)-2-(羟甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-基)甲酮(255)的合成
向化合物254(0.801g，2.60mmol)的丁酮(10mL)溶液中加入Cs2CO3(2.50g，7.67mmol)，然后加入1，5-二碘戊烷(415mmol，1.28mmol)。将混合物搅拌26小时，浓缩并在硅胶柱上纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：15至1：5)洗脱，得到标题化合物(0.675g，77％收率，～95％纯度)。MS ESI m/z C33H41N4O12[M+H]+计算值685.26，实测值685.60。
实施例288.(S)-((戊烷-1，5-二(氧基))双(2-氨基-5-甲氧基-4，1-亚苯基))双((S)-2-(羟甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-基)甲酮(256)的合成
向化合物255(0.670g，0.98mmol)的CH3OH(10mL)溶液中加入Na2S2O4(1.01g，5.80mmol)的水(8mL)溶液。将混合物在室温搅拌30小时。将反应混合物在高真空下蒸发浓缩，并与DMA(2x 10mL)和乙醇(2x 10mL)共沸蒸发至干，得到含有无机盐的标题化合物(总重量1.63g)，直接用于下一步反应(无需进一步分离)。EIMS m/z 647.32([M+Na]+)。
实施例289.化合物257的合成
在0℃下，向含(3S，6S，39S，42S)-二叔丁基6，39双(4-((叔丁氧基羰基)氨基)丁基)-22，23双(2，5-二氧基-2，5二氢-1H-吡咯-1-基)-3，42双((4-(羟甲基)苯基)氨甲酰基)-5，8，21，24，37，40-六氧代-11，14，17，28，31，34-六氧杂-4，7，20，25，38，41-六氮杂四十四烷-1，44-二甲酸酯(0.840g 0.488mmol)和吡啶(0.100mL，1.24mmol)的四氢呋喃(8mL)溶液中，滴加三光气(0.290mg，0.977mmol)的四氢呋喃(3.0mL)溶液。将反应混合物在0℃搅拌15分钟，然后直接用于下一步。
在0℃下，向化合物256(0.842mg，～0.49mmol，含无机盐)的乙醇(10mL)悬浮液中加入上述制备的氯化物。将混合物在0℃搅拌4小时，然后升温至室温反应1小时，浓缩，并通过反相HPLC(250(L)mm×10(d)mm，C18柱，10-80％乙腈/水，40分钟，v＝8mL/min)纯化，得到标题化合物(561.1mg，三步收率48％)。ESIMS m/z：C117H163N16O38[M+H]+计算值2400.12，实测值2400.90。
实施例290.化合物258的合成
在0℃下，将Dess-Martin高碘烷(138.0mg，0.329mmol)加入到化合物257(132.0mg，0.055mmol)的二氯甲烷(5.0mL)的溶液中。将反应混合物升温至室温并搅拌2小时。然后加入饱和NaHCO3/Na2SO3溶液(5.0mL/5.0mL)，混合物用二氯甲烷(3×25mL)萃取。合并的有机层用NaHCO3/Na2SO3(5.0mL/5.0mL)、盐水(10mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过反相HPLC(250(L)mm×10(d)mm，C18柱，10-80％乙腈/水，40分钟的时间，v＝8mL/min)纯化，得到标题化合物(103.1mg，78％收率)，为泡沫状物。ESIMS m/z：C117H158N16O38[M+H]+计算值2396.09，实测值2396.65。
实施例291.化合物259的合成
将化合物258(55.0mg，0.023mmol)溶解于二氯甲烷(3mL)中，并在4℃加入TFA(3mL)。然后将反应混合物在室温下搅拌1小时，浓缩，与二氯甲烷/甲苯共蒸干，得粗品C-3(48.0mg，100％收率，反相HPLC纯化92％)，再经反相HPLC(250(L)mm×20(d)mm，C18柱，5-60％乙腈/水，40分钟的时间，v＝8mL/min)纯化，得到纯产物C-3(42.1mg，88％收率，96％纯)得到泡沫。ESIMS m/z：C99H126N16O34[M+H]+计算值2083.86，实测值2084.35。
实施例292.化合物260的合成
将化合物259(35.0mg，0.017mmol)溶于四氢呋喃(3mL)和0.1M、NaH2PO4(3mL)、pH7.5和N-琥珀酰亚胺基2，5，8，11，14，17，20，23-十氧杂二十六烷-26-酯(43.0mg，0.084mmol)的混合溶液在2小时内分4份加入。然后在室温下继续搅拌反应混合物4小时，与DMF(10mL)共沸蒸发至干得到粗品，经反相HPLC进一步纯化(250(L)mm×20(d)mm，C18柱，20-60％乙腈/水，40分钟的时间，v＝8mL/min)，得到泡沫状的纯产物260(39.4mg，81％收率，96％纯度)。ESI MS m/z：C135H195N16O52[M+H]+计算值2872.30，实测值2871.65。
实施例293.化合物261的合成
将化合物260(35.0mg，0.012mmol)和2，5，8，11，14，17，20，23-十氧杂二十五烷-25-胺(15.1mg，0.0394mmol)的无水DMA(2mL)的溶液中加入EDC(30.0mg，0.156mmol)。
将反应混合物在室温搅拌14小时，浓缩，(反相HPLC(250(L)mm×20(d)mm，C18柱，20-60％乙腈/水，40分钟的时间，v＝8mL/min)纯化得到纯品261(31.2mg，77％收率，97％纯度通过HPLC)得到泡沫。ESIMS m/z：C161H249N18O62[M+H]+计算值3426.68，实测值3427.21。
实施例294.3-(ω-甲氧基聚乙二醇)丙酸叔丁酯的合成
在N2保护下把钠切成小块，向搅拌中的PEG(1eq.)的无水四氢呋喃(0.1～0.3MPEG)中加入钠(0.1～0.3eq.)。待钠消失后，加入丙烯酸叔丁酯(1.0～1.5eq.)。将混合物搅拌过夜，真空浓缩并用硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：10至100：1)洗脱，得到标题化合物(70％～95％收率)。
实施例295.2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂二十九烷-29-叔丁基酯(262)的合成
在N2保护下把钠切成小块，向搅拌中的2，5，8，11，14，17，20，23-十氧杂二十五烷-25-醇(25.00g，65.06mmol)的无水四氢呋喃(450mL)中加入钠(0.25g，10.86mmol)。待钠消失后，加入丙烯酸叔丁酯(9.21g，71.90mmol)，搅拌过夜。将混合物真空浓缩并用硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：5至1：2)洗脱，得到标题化合物(30.97g，93％收率)。ESIm/z C24H49O11[M+H]+：计算值513.3276，实测值512.3298。
实施例296.2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十二氧杂三十二烷-32-叔丁酯(263)的合成
收率92％，纯度95％(HPLC)。ESI m/z计算值C26H53O12[M+H]+：557.3538，实测值557.3580。
实施例297.2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十六烷-26-叔丁基酯(264)的合成
收率92％，纯度95％(HPLC)。ESI m/z计算值C22H45O10[M+H]+：469.3013，实测值469.3077。
实施例298.2，5，8，11，14，17，20-十七氧杂二十三烷-23-叔丁基酯(265)的合成
收率94％，纯度95％(HPLC)。ESI m/z计算值C20H41O9[M+H]+：425.2771，实测值425.2811.
实施例299.3-(ω-甲氧基聚乙二醇)丙酸的一般合成
向3-(ω-甲氧基聚乙二醇)丙酸叔丁酯的二恶烷(0.1～0.3M)中加入浓盐酸(36％，1/3vol的二恶烷)。混合物在室温下搅拌30分钟，用甲苯(1/4～1/2的二恶烷)稀释，真空浓缩，与乙醇/甲苯(1：1，2×(1/4～1/2vol的二恶烷)共沸蒸发)并经真空泵干燥，得到标题化合物(92％-99％收率)，其直接用于下一步。产物也在短硅胶柱上纯化，用3％-10％CH3CN/水洗脱或用含有1％乙酸的甲醇/二氯甲烷(1：8–1：3)洗脱，得到产物收率75％-90％，纯度95％(HPLC)。
实施例300.2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂二十九烷-29-酸(266)的合成
向2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧代二十九烷-29-酯(10.01g，19.53mmol)的二恶烷(75mL)中加入浓盐酸(25mL，36％)，将混合物在室温下搅拌30分钟，用甲苯(50mL)稀释，真空浓缩，与乙醇/甲苯(1：1，2×50mL)共浓缩，真空泵干燥得到标题化合物(8.55g，96％收率))通过HPLC分析纯度为95％。ESI m/z C20H41O11[M+H]+计算值：457.2650，实测值457.2683。
实施例301.2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十氧杂三十二烷-32-酸(267)的合成
收率95％，纯度94％(HPLC)。ESI m/z计算值C22H45O12[M+H]+：501.2912，实测值501.2935。
实施例302.2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十六烷-酸(268)的合成
收率95％，纯度95％(HPLC)。ESI m/z计算值C18H37O10[M+H]+：413.2387，实测值413.2395。
实施例303.2，5，8，11，14，17，20-十七氧杂二十三烷-23-酸(269)的合成
收率95％，纯度95％(HPLC)。ESI m/z计算值C16H33O9[M+H]+：369.2125，实测值369.2148。
实施例304.3-(聚乙二醇)丙酸叔丁酯的一般合成
在N2保护下把钠切成小块，向搅拌中的PEG(1eq.)的无水四氢呋喃(0.1～0.3MPEG)中加入钠(0.1～0.2eq.)。待钠消失后，加入丙烯酸叔丁酯(1/4eq.)。将混合物搅拌过夜，真空浓缩并用硅胶色谱法纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：8至1：4)洗脱，得到标题化合物(65％～83％收率)。
实施例305.1-羟基-3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂三十烷-30-叔丁基酯(270)的合成
/>
在N2保护下把钠切成小块，向搅拌中的3，6，9，12，15，18，21，24-八氧杂二十六烷-1，26-二醇(40.01g，96.58mmol)的无水四氢呋喃(600mL)中加入钠(0.40g，17.39mmol)。待钠消失后，加入丙烯酸叔丁酯(3.11g，24.28mmol)，搅拌过夜。将混合物真空浓缩并用硅胶色谱法纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：8至1：4)洗脱，得到标题化合物(10.27g，78％收率)。ESIm/z C25H51O12[M+H]+计算值：543.3381，实测值543.3416。
实施例306.1-羟基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧二十七烷-27-叔丁基酯(271)的合成
收率79％。ESI m/z计算值C23H47O11[M+H]+：499.3119，实测值499.3145。
实施例307.1-羟基-3，6，9，12，15，18，21-七氧杂二十四烷-24-叔丁基酯(272)的合成
收率79％。ESI m/z计算值C21H43O10[M+H]+：455.2857，实测值455.2885。
实施例308.1-羟基-3，6，9，12，15，18-六氧杂二十一烷-21-叔丁基酯(273)的合成
收率80％。ESI m/z计算值C19H39O9[M+H]+：411.2595，实测值411.2570。
实施例309.3-(ω-甲苯磺酰基-聚乙二醇)丙酸叔丁酯的合成
在4℃下，向3-(PEGyl)丙酸叔丁酯(1eq.)的无水四氢呋喃/二氯甲烷(1：3)和N，N-二异丙基乙胺(10eq.)的混合物中加入甲苯磺酰氯(1.2～1.5eq.)。然后将混合物升温至室温，搅拌过夜，浓缩并用短硅胶柱纯化，用含有0.2％乙酸的甲醇/二氯甲烷(1：10–1：8)洗脱，得到标题化合物(78～90％收率)。
实施例310.1-(甲苯磺酰氧基)-3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂三十烷-30-叔丁基酯(274)的合成
向1-羟基-3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂三十烷-30-酯(7.82g，14.41mmol)的干燥四氢呋喃/二氯甲烷(1：3，120mL)和N，N-二异丙基乙胺(8mL)的混合物中加入对甲苯磺酰氯(3.57g，18.72mmol)。然后将混合物自然升温至室温，搅拌过夜，浓缩并用短硅胶柱纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：10-1：8)洗脱，得到标题化合物(8.62g，86％收率)。ESI m/zC32H57O14S[M+H]+：计算值697.3480，实测值697.3522。
实施例311.1-(甲苯磺酰氧基)-3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂三十烷-30-叔丁基酯(274)的合成
收率85％。ESI m/z计算值C30H53O13S[M+H]+：653.3208，实测值653.3240。
实施例312.1-(甲苯磺酰氧基)-3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂三十烷-30-叔丁基酯(274)的合成
收率86％。ESI m/z计算值C28H49O12S[M+H]+：609.2945，实测值609.2968。
实施例313 1-(甲苯磺酰氧基)-3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂三十烷-30-甲酸叔丁酯(274)的合成
收率87％。ESI m/z计算值C26H45O11S[M+H]+：565.2683，实测值565.2705。
实施例314.3-(ω-叠氮基-聚乙二醇)丙酸叔丁酯的合成
向搅拌中的NaN3(1.5～3eq.)的DMF(60mL)中加入3-(ω-甲苯磺酰氧基-PEG基)丙酸叔丁酯(1eq.)。将混合物搅拌过夜，浓缩并用短硅胶柱纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：15–1：8)洗脱，得到标题化合物(83％～91％收率)。
实施例315.1-叠氮基-3，6，9，12，15，18，21，24，27-十九氧杂三十烷-30-叔丁基酯(278)的合成
向搅拌中的NaN3(2.00g，30.76mmol)的DMF(60mL)中加入1-(对甲苯磺酰氧基)-3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂三十烷-30-酯(7.51g，10.78mmol)。将混合物搅拌过夜，浓缩并用短硅胶柱纯化，用甲醇/二氯甲烷洗脱(1：15–1：10)得到标题化合物(5.32g，84％收率)。ESI m/z C25H50N3O11[M+H]+：计算值568.3446，实测值568.3467。
实施例316.1-叠氮基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧十七碳-27-甲酸叔丁酯(279)的合成
收率84％。ESI m/z计算值C23H46N3O10[M+H]+：524.3184，实测值524.3205。
实施例317.1-叠氮基-3，6，9，12，15，18，21-七氧杂二十四烷-24-甲酸叔丁酯(280)的合成
收率85％。ESI m/z计算值C21H42N3O9[M+H]+：480.2922，实测值480.2945。
实施例318.1-叠氮基-3，6，9，12，15，18-六氧杂环己烷-21-甲酸叔丁酯(281)的合成
收率85％。ESI m/z计算值C19H38N3O8[M+H]+：436.2660，实测值436.2695。
实施例319.3-(ω-氨基-聚乙二醇)丙酸叔丁酯的一般合成路线
Tert-3-(ω-azido-PEGyl)propanoate(1eq.)in methanol(0.15～0.2M conc.)in ahydrogenation bottle was added Pd/C(10％ Pd，2％～10％by weight of thestarting material).Then the mixture was conducted with H2 at 5～50psi，shaken2～12h，filtrated through Celite，concentrated and dried over vacuum to affordthe title compound(87～95％收率)，which was used for the next step withoutfurther purification.
向叔-3-(ω-叠氮基-聚乙二醇)丙酸酯(1eq.)的甲醇(0.15～0.2M浓度)中加入Pd/C(10％Pd，重量％的原料)。然后将混合物与H2在5～50psi下进行，振荡2～12h，通过硅藻土过滤，浓缩并真空干燥，得到标题化合物(收率为/>)，用于下一步无需进一步纯化。
实施例320.化合物的合成tert-butyl 1-amino-3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂triacontan-30-oate(282)
1-氨基-3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂三十烷-30-甲酸叔丁酯(282)的合成
tert-butyl 1-azido-3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂triacontan-30-oate(3.22g，5.67mmol)was added in metanol(80mL)containing Pd/C(0.20g，10％Pd).Themixture was conducted with hydrogen(25psi)，shaken 6h，filtrated throughCelite，concentrated and dried over vacuum to afford the title compound(90％收率)，which was used for the next step without further purification.
向1-叠氮基-3，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧杂三十烷-30-酯(3.22g，5.67mmol)加入含有Pd/C(0.20g，10％Pd)的元醇(80mL)中。向混合物通入氢气(25psi)，摇动6小时，通过硅藻土过滤，浓缩并在真空中干燥以得到标题化合物(90％收率)，其用于下一步而无需进一步纯化。ESI m/z计算值C25H52NO11[M+H]+：542.3541，实测值542.3575。
实施例321.1-氨基-3，6，9，12，15，18，21，24-八氧十七碳-27-甲酸叔丁酯(283)的合成
收率>90％。ESI m/z计算值C23H48NO10[M+H]+：498.3279，实测值498.3315。
实施例322.1-氨基-3，6，9，12，15，18，21-七氧杂二十四烷-24-甲酸叔丁酯(284)的合成
收率>90％。ESI m/z计算值C21H44NO9[M+H]+：454.3017，实测值454.3035。
实施例323.1-氨基-3，6，9，12，15，18-六氧杂环己烷-21-甲酸叔丁酯(285)的合成
收率>90％。ESI m/z计算值C19H40NO8[M+H]+：410.2755，实测值410.2780。
实施例324.1-氨基-3，6，9，12，15，18-六氧杂环己烷-21-甲酸叔丁酯(285)的一般合成
向3-(ω-氨基PEGyl)丙酸叔丁酯(1eq.)和3-(ω-甲氧基PEGyl)丙酸(1eq.)的DMF(0.1-3.0M起始原料)中加入EDC。将混合物搅拌过夜，真空浓缩并用硅胶层析纯化，用甲醇/二氯甲烷洗脱(1∶8～1∶2)得到标题化合物(收率/> )。
实施例325.23-氧代-2，5，8，11，14，17，20，27，30，33，36，39，42-十三氧杂-24-氮杂十五碳四烯-45-甲酸叔丁酯(286)的合成
2，5，8，11，14，17，20-七氧杂二十三烷-23-酸酯(5.011g，13.60)和叔丁基1-氨基-3，6，9，12，15，18-六氧杂二十一烷-21-酯(5.57g，13.60mmol)的DMF(75mL)中加入EDC(5.25g，27.34mmol)。将混合物搅拌6小时，真空浓缩并用硅胶色谱法纯化，用甲醇/二氯甲烷(1∶8至1∶5)洗脱以得到标题化合物(8.882g，86％收率)。ESI m/z计算值C35H70NO16[M+H]+：760.4695，实测值760.4735，
实施例326.3-(ω-(3'-(ω'-甲氧基聚乙二醇)-丙酰胺基)-聚乙二醇)丙酸的一般合成
/>
向3-(ω-(3'-(ω'-甲氧基PEGyl)-丙酰胺基)-PEGyl)丙酸叔丁酯(0.2-1.0M起始材料浓度)的二恶烷中加入盐酸(浓度为25％v/v二恶烷)。将混合物搅拌0.5小时，用甲苯稀释，真空浓缩，得到标题化合物(90-102％收率)。
实施例327.23-氧代-2，5，8，11，14，17，20，27，30，33，36，39，42-十三氧杂-24-氮杂戊二十四烷-45-酸(287)的合成
向23-氧代-2，5，8，11，14，17，20，27，30，33，36，39，42-十三氧杂-24-氮杂四十五烷-45-叔丁基酯(5.25g，6.91mmol)的二恶烷(20mL)中加入盐酸(浓，5mL)。将混合物搅拌0.5小时，用甲苯稀释，真空浓缩，得到标题化合物(4.85g，99％收率)。ESI m/z计算值C31H62NO16[M+H]+：704.4069，实测值704.4105。
实施例328.2-((R，E)-3-(((S)-叔丁基亚磺酰基)亚氨基)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(288)的合成
在-78℃和N2保护下，向二异丙胺(121mL，0.86mol，4.0eq.)的无水四氢呋喃(300mL)溶液中加入正丁基锂(2.5M，302mL，0.76mol 3.5eq.)。反应混合物在30分钟内升温至0℃，然后冷却回-78°，然后加入(S，E)-2-甲基-N-(3-甲基丁烷-2-亚乙基)丙烷-2-磺酰胺(57g，0.3mol，1.4eq.)的四氢呋喃(200mL)溶液。将反应混合物搅拌1小时，然后滴入ClTi(OiPr)3(168.5g，0.645mol，3.0eq.)的四氢呋喃(350mL)溶液。搅拌1小时后，滴加2-甲酰基噻唑-4-甲酸乙酯(40g，0.215mol，1.0eq.)的四氢呋喃(175mL)溶液的并将所得反应混合物搅拌2小时。TLC分析表明反应完成。用乙酸和四氢呋喃(v/v 1：4，200mL)的混合物淬灭反应，然后倒入冰水中，用乙酸乙酯(4×500mL)萃取。有机相用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(二氯甲烷/乙酸乙酯/PE 2：1：2)纯化，得到标题化合物(60g，74％收率)，为无色油状物。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.13(s，1H)，6.63(d，J＝8.2Hz，1H)，5.20–5.11(m，1H)，4.43(q，J＝7.0Hz，2H)，3.42–3.28(m，2H)，2.89(dt，J＝13.1，6.5Hz，1H)，1.42(t，J＝7.1Hz，3H)，1.33(s，9H)，1.25–1.22(m，6H).ESIMS m/z计算值C16H26NaN2O4S2[M+Na]+397.13，实测值397.11。
实施例329.2-((1R，3R)-3-((S)-1，1-二甲基乙基亚磺酰胺基)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(289)的合成
将2-(R，E)-3-((S)-叔丁基亚磺酰基)亚氨基)-1-羟基-4-甲基戊基噻唑-4-羧酸乙酯(23.5克，62.7mmol)溶解于四氢呋喃(200mL)中冷却至-45℃，缓慢加入Ti(OEt)4(42.9mL，188mmol，3.0eq.)。加入完成后，将混合物搅拌1小时，然后分批加入NaBH4(4.75g，126mmol，2.0eq.)。将反应混合物在-45℃下搅拌3小时，TLC分析显示仍残留一些原料。用HOAc/四氢呋喃(v/v 1：4，25mL)淬灭反应物，然后用乙醇(25mL)淬灭反应。将反应混合物倒入冰中(100g)并加热至室温。在硅藻土上过滤后，分离有机相并用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过柱层析(乙酸乙酯/PE 1：1)纯化，以白色固体的形式提供标题产物(16.7g，71％收率)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.10(s，1H)，5.51(d，J＝5.8Hz，1H)，
5.23–5.15(m，1H)，4.41(q，J＝7.0Hz，2H)，3.48–3.40(m，1H)，3.37(d，J＝8.3Hz，1H)，2.29(t，J＝13.0Hz，1H)，1.95–1.87(m，1H)，1.73–1.67(m，1H)，1.40(t，J＝7.1Hz，3H)，1.29(s，9H)，0.93(d，J＝7.3Hz，3H)，0.90(d，J＝7.2Hz，3H).ESIMS m/z计算值C16H28NaN2O4S2[M+Na]+399.15，实测值399.14。
实施例330.2-((1R，3R)-3-氨基-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯盐酸盐(290)的合成
在0℃下，向2-((1R，3R)-3-(S)-1，1-二甲基乙基亚磺酰胺基)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(6.00g，16.0mmol，1.0eq.)的乙醇(40mL)溶液中，缓慢加入4N盐酸的二恶烷(40mL)中。将反应物加热至室温并搅拌2.5小时，然后浓缩并用石油醚打浆。收集白色固体标题化合物(4.54g，收率92％)并在下一步中使用。
实施例331.2-((1R，3R)-3-((2S，3S)-2-叠氮基-3-甲基戊酰胺基)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(291)的合成
将(2S，3S)-2-叠氮基-3-甲基戊酸(5.03g，28.8mmol，2.0eq.)溶于四氢呋喃(120mL)并冷却至0℃，然后依次加入NMM(6.2mL，56.0mmol，4.0eq.)和氯甲酸异丁酯(3.7mL，28.8mmol，2.0eq.)。将反应物在0℃下搅拌30分钟并在室温下搅拌1.0小时，然后冷却回0℃。然后分批加入2-((1R，3R)-3-氨基-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯盐酸盐(4.54克，14.7mmol，1.0eq.)。在0℃下搅拌30分钟后，将反应物升温至室温并搅拌2小时。在0℃下加入水以淬灭反应，并将所得混合物用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层用1N盐酸、饱和NaHCO3和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩。残余物用柱层析(0-30％乙酸乙酯/PE)纯化，得到白色固体标题化合物(4.55g，收率74％)。
实施例332.2-((1R，3R)-3-((2S，3S)-2-叠氮基-3-甲基戊酰胺基)-4-甲基-1-((三乙基硅基)氧基)戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(292)的合成
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向2-(1R，3R)-3-((2S，3S)-2-叠氮基-3-甲基戊酰胺基)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(5.30克，12.8mmol，1.0eq.)的溶液中加入咪唑(1.75克，25.6mmol，2.0eq.)，然后在0℃下加入氯三乙基硅烷(4.3mL，25.6mmol，2.0eq.)。将反应混合物加热至室温超过1小时，并再搅拌一小时。将盐水加入到反应混合物中，分离有机层并用乙酸乙酯提取水层。将合并的有机相干燥，过滤，减压浓缩，并用柱层析法纯化，用15-35％乙酸乙酯/石油醚梯度纯化，得到标题产物(6.70g，99％收率)为白色固体。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.12(s，1H)，6.75(d，J＝8.0Hz，1H)，5.20–5.12(m，1H)，4.44(q，J＝7.0Hz，2H)，4.06–3.97(m，1H)，3.87(d，J＝3.8Hz，1H)，2.14(d，J＝3.8Hz，1H)，2.01–1.91(m，3H)，1.42(t，J＝7.1Hz，3H)，1.34–1.25(m，2H)，1.06(d，J＝6.8Hz，3H)，1.00–0.93(m，18H)，0.88(dd，J＝19.1，6.8Hz，6H)。ESIMS m/z计算值C24H44N5O4SSi[M+H]+526.28，实测值526.28.
实施例333.2-((1R，3R)-3-((2S，3S)-2-叠氮基-N，3-二甲基戊酰胺基)-4-甲基-1-((三乙基硅基)氧基)戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(293)的合成
向2-((1R，3R)-3-((2S，3S)-2-叠氮基-3-甲基戊酰胺基)-4-甲基-1-((三乙基硅基)氧基)戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(5.20克，9.9mmol，1.0eq.)的四氢呋喃(50mL)中冷却至-45℃，然后加入KHMDS(甲苯1M，23.8mmol，2.4eq.)的溶液。将所得混合物在-45℃下搅拌20分钟，然后加入甲基碘(1.85mL，29.7mmol，3.0eq.)。将反应混合物加热至室温4.5小时，然后用乙醇(10mL)淬灭反应物。用乙酸乙酯(250mL)稀释粗产物并用盐水(100mL)洗涤。用水层用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将有机层干燥，过滤，浓缩并在柱层析中用15-35％乙酸乙酯/石油醚中梯度洗脱，得到淡黄色油状标题产物(3.33g，63％收率)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.09(s，1H)，4.95(d，J＝6.6Hz，1H)，4.41(q，J＝7.1Hz，2H)，3.56(d，J＝9.5Hz，1H)，2.98(s，3H)，2.27–2.06(m，4H)，1.83–1.70(m，2H)，1.41(t，J＝7.2Hz，3H)，1.29(ddd，J＝8.9，6.8，1.6Hz，3H)，1.01(d，J＝6.6Hz，3H)，0.96(dt，J＝8.0，2.9Hz，15H)，0.92(d，J＝6.6Hz，3H)，0.90(d，J＝6.7Hz，3H).ESIMS m/z计算值C25H46N5O4SSi[M+H]+540.30，实测值540.30。
实施例334.乙基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-13，13-二乙基-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂-13-硅十五烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(294)的合成
向干燥的Pd/C(10重量％，300mg)和2-(1R，3R)-3-((2S，3S)-2-叠氮基-N，3-二甲基戊酰胺)-4-甲基-1-((三乙基硅基)氧基)戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(3.33g，6.16mmol)加入五氟苯基2-(二甲基氨基)-2-甲基丙酸酯(～2.75g，1.5eq.)的乙酸乙酯中。将反应混合物在氢气下搅拌27小时，然后通过塞铝榴石过滤，用乙酸乙酯洗涤过滤垫。将合并的有机组分浓缩并通过柱层析纯化，以0-5％乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱得到标题产物(3.24g，84％收率)。ESIMS m/z计算值C31H59N4O5SSi[M+H]+626.39，实测值626.95。
实施例335.2-((1R，3R)-3-((2S，3S)-2-(2-(二甲氨基)-2-甲基丙氨基)-N，3-二甲基戊氨基)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(295)的合成
将2-((6S，9R，11R)-6-(S)-仲丁基)-13，13-二乙基-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂-13-硅十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸乙酯(3.20g，5.11mmol)溶解在脱氧AcOH/水/四氢呋喃(v/v/v 3：1：1，100mL)中，并在室温下搅拌48小时。然后将反应物浓缩并在硅胶柱层析(2∶98至15∶85甲醇/乙酸乙酯)上纯化，得到标题化合物(2.33克，89％收率)。ESIMS m/z计算值C25H45N4O5S[M+H]+512.30，实测值512.45。
实施例336.2-((1R，3R)-3-((2S，3S)-2-(2-(二甲氨基)-2-甲基丙氨基)-N，3-二甲基戊氨基)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸(296)的合成
向LiOH(0.4N，47.7mL，19.1mmol，4.0eq.)的水溶液中加入2-((1R，3R)-3-(2S，3S)-2-(2-(二甲基氨基)-2-甲基丙酰胺基)-N，3-二甲基戊酰胺基)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(2.30g，4.50mmol，1.0eq.)的甲醇(50mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后浓缩。硅胶柱层析纯化(100％二氯甲烷再用二氯甲烷/甲醇/NH4OH 80∶20∶1)得到标题化合物(2.13克，收率98％)为无定形固体。ESIMS m/z计算值C23H41N4O5S[M+H]+485.27，实测值485.55.
实施例337.2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸(297)的合成
向2-((1R，3R)-3-((2S，3S)-2-(2-(二甲基氨基)-2-甲基丙酰胺基)-N，3-二甲基戊酰胺基)-1-羟基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸(2.10g，4.33mmol)的溶液中加入吡啶(50mL)，缓慢加入乙酸酐(2.25mL，24mmol)。将反应混合物加热至室温超过2小时，并在室温下搅拌24小时。浓缩反应物，残余物在反相HPLC(C18柱，50mm×250(mm)，50mL/min，10-90％乙腈/水，45分钟的时间)上纯化，得到标题化合物(1.95g，86％收率)，为无定形白色固体。ESIMS m/z计算值C25H43N4O6S[M+H]+526.28，实测值526.80。
实施例338.2-((1R，3R)-3-((2S，3S)-2-叠氮基-N，3-二甲基戊酰胺)-1-甲氧基-4-甲基戊基)噻唑-4-羧酸乙酯(298)的合成
将化合物291(130g，0.30mol)溶解在无水四氢呋喃(1.6L)中，在冰浴上向其中加入甲基碘(255g，1.80mol)，然后分三份加入NaH(60g，60wt％，0.45mol)。反应自然升温至室温，搅拌过夜。HPLC-MS分析表明，起始原料被完全消耗，有少量单甲基取代的副产物。将反应液倒入2L冰冷却的饱和NH4Cl中，用乙酸乙酯(2L，1L)萃取。有机相用水洗涤两次，盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得到粗品。将粗产物与石油醚一起打浆，得到108g白色固体(78％收率)。
实施例339.乙基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂癸-11-基)噻唑-4-羧酸酯(299)的合成
向化合物298(100g，0.23mol)的200mL乙酸乙酯中的溶液中加入2-(二甲氨基)-2-甲基丙酸五氟苯酯(0.57mol，在1000mL乙酸乙酯中)和Pd/C(10g，5wt％，50％湿)。将混合物在氢气球下搅拌，并在交换氮气数次后，将反应搅拌过夜。HPLC-MS表明原料完全消耗。过滤反应液，滤饼用乙酸乙酯洗涤，收集合并的滤液，浓缩，柱层析(20％-60％乙酸乙酯/PE)纯化，得标题产物(84％收率)。
实施例340.2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂癸-11-基)噻唑-4-羧酸(300)的合成
向化合物299(121g，0.23mol)的1，4-二恶烷(1000mL)和水(100mL)溶液中，缓慢加入LiOH(22g，0.92mol)的水溶液(300mL)。室温搅拌2小时后，HPLC-MS显示反应完成。将反应物浓缩并与200g硅胶混合，上柱，并用50％-100％乙酸乙酯/PE和0％-20％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到标题化合物(94g，84％收率)。
实施例341.(S，Z)-5-(4-(苄氧基)苯基)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲基戊-2-烯酸叔丁酯(301)的合成
将(S)-叔丁基(1-(4-(苄氧基)苯基)-3-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸酯(0.84g，2mmol，1.0eq.)溶于无水二氯甲烷(50mL)中，然后加入2-(三苯基-正膦亚基)丙酸叔丁酯(1.6g，4mmol，2.0eq.)并在室温下搅拌溶液1.5小时，由TLC确定反应完成。通过柱色谱法(10-50％乙酸乙酯/己烷)纯化得到标题化合物(1.16g，98％收率)。
实施例342.(4R)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(4-羟基苯基)-2-甲基戊酸叔丁酯(302)的合成
在室温下，将(S，Z)-叔丁基5-(4-(苄氧基)苯基)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲基戊-2-烯酸酯(467mg，1mmol)和Pd/C催化剂(10重量％，250mg)在甲醇(30mL)的混合物中，在H2气球下搅拌过夜(1atm H2)。过滤掉催化剂，滤液减压浓缩，得到标题化合物(379mg，99％收率)。
实施例343.(4R)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(4-羟基-3-硝基苯基)-2-甲基戊酸叔丁酯(303)的合成
将(4R)-叔丁基4-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(4-羟基苯基)-2-戊酸甲酯(379mg，1mmol，1.0eq.)溶解于四氢呋喃(20mL)中，然后加入了亚硝酸叔丁酯(315mg，3mmol，3.0eq.)的四氢呋喃(2mL)溶液。反应在室温下搅拌3小时然后倒入水中，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取，并用盐水(50mL)洗涤合并的有机相，在无水硫酸钠，过滤和浓缩上干燥。通过色谱柱色谱法(10-50％乙酸乙酯/己烷)纯化得到具有标题化合物(300mg，71％收率)。
实施例344.(4R)-5-(3-氨基-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸叔丁酯(304)的合成
在室温下，将(4R)-叔丁基4-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(4-羟基-3-硝基苯基)-2-甲基戊酸酯(200mg，0.47mmol)，乙酸乙酯(30mL)和Pd/C(10％碳，100mg)混合，在H2(1atm)下搅拌2小时。滤出催化剂，真空除去所有挥发物，得到标题化合物(185mg，99％)。ESIMS m/z计算值C21H35N2O5[M+H]+395.25，实测值395.26.
实施例345.(4R)-5-(3-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰胺基)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸叔丁酯(305)的合成
将HATU(39.9g，105mmol)加入到到4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酸(26.1g，110mmol)的DMF(300mL)溶液中。在室温搅拌后30分钟，将混合物加入到化合物304(39.4g，100mmol)和TEA(20.2g，200mmol)的DMF(300mL)溶液中。将所得混合物在室温搅拌2小时。然后加入水，用乙酸乙酯萃取，有机层用盐水洗涤，硫酸钠干燥。通过柱色谱法纯化(20％-70％乙酸乙酯/PE)，得到标题产物，为白色固体(45g，73％收率)。ESI m/z计算值C33H48N3O8[M+H]+：614.34，实测值614.15。
实施例346.(4R)-5-(3-(4-氨基丁酰胺基)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲基戊酸叔丁酯(306)的合成
在室温下，将化合物305(100g，163mmol)和Pd/C(10wt％，10g)的甲醇(500mL)混合物，催化加氢(1atm H2)，搅拌过夜。滤除催化剂，减压浓缩滤液，得到标题化合物(75.8g，97％收率)，为棕色泡沫状固体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.11(s，1H)，6.83(d，J＝10.3Hz，2H)，5.04–4.52(m，6H)，3.90–3.56(m，1H)，2.81(d，J＝5.3Hz，2H)，2.63(dd，J＝12.5，6.1Hz，2H)，2.54-2.26(dd，J＝14.0，7.6Hz，4H)，1.94-1.64(m，3H)，1.44–1.36(m，18H)，1.08(d，J＝6.9Hz，3H)。ESI m/z计算值C25H42N3O6[M+H]+：480.30，实测值480.59。
实施例347.(4R)-叔丁基5-(3-((S)-37-(((苄氧基)羰基)氨基)-31，38-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十二氧杂-32，39-二氮杂三环四氨基)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸酯(307)的合成
在0℃下，将(S)-37-(((苄氧基)羰基)氨基)-31-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十二氧杂-32-氮杂三十八烷-38-油酸(130g，174mmol，1.1eq.)的DMF(500mL)中的依次加入TEA(66mL，474mmol，3eq.)和HATU(72g，190mmol，1.2eq.)。然后将反应混合物升温至室温并搅拌2小时。在0℃将化合物306(75.8g，158mmol，1.0eq.)的DMF(500mL)溶液中加入到上述溶液中，并在室温下搅拌反应混合物1小时。将反应混合物倒入水(4L)中，水层用乙酸乙酯(3×500mL)萃取，合并有机层，用盐水(2L)洗涤，硫酸钠干燥，浓缩，得到粗标题产物(190g)直接用于下一步。ESIMS m/z：计算值C60H100N5O20[M+H]+：1210.69，实测值1210.69。
实施例348.(4R)-5-(3-((S)-37-氨基-31，38-叔丁基二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十二氧杂-32，39-二氮杂三环四氨基)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸酯(308)的合成
在室温下，将先前反应得到的粗产物307(190g)溶于甲醇(900mL)中，加入和Pd/C(10wt％，19g)，催化加氢(1atm H2)搅拌过夜。将催化剂过滤并在减压浓缩滤液，并用硅胶柱纯化粗化合物，用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，以给出标题产物(105g，在两个步骤中的62％的产物)，为棕色油。ESIMS m/z计算值C52H95N5O18[M+H]+：1077.65，实测值1077.65。
实施例349.(4R)-叔丁基4-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(3-((S)-37-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-31，38-二氧代-2，5，8，11，14，17，
20，23，26，29-十二氧杂-32，39-二氮杂四十三烷酰胺基)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸酯(309)的合成
在室温下，向化合物308(105g，97.1mmol，1.0eq.)的乙醇(5.3L)溶液中加入N-琥珀酰亚胺基4-马来酰亚胺基丁酸酯(54.4g，194.2mmol，2.0eq.)。然后加入0.1M NaH2PO4溶液(1.1L)，将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后在真空下蒸发乙醇并将残余物倒入水(3L)中。水溶液用乙酸乙酯(4×500mL)萃取，合并有机层，用盐水(2L)洗涤，硫酸钠干燥，浓缩，粗品经硅胶柱纯化，同甲醇/二氯甲烷梯度洗脱得到标题化合物(100g，83％收率)，为黄色油状物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.43(s，1H)，7.35(s，1H)，7.23(t，J＝5.1Hz，1H)，7.01(d，J＝4.5Hz，2H)，6.89(s，2H)，6.70(s，2H)，4.56–4.45(m，1H)，4.30(t，J＝9.7Hz，1H)，3.97(s，2H)，3.86-3.74(m，1H)，3.66–3.63(m，36H)，3.58–3.52(m，5H)，3.38(s，3H)，3.33–3.19(m，3H)，2.47(d，J＝6.2Hz，4H)，2.23(dd，J＝11.6，6.1Hz，2H)，1.91(dtd，J＝26.8，13.6，6.5Hz，7H)，1.71(d，J＝7.7Hz，2H)，1.56–1.49(m，2H)，1.42(s，9H)，1.39(s，9H)，1.10(d，J＝6.5Hz，3H).ESI m/z计算值C60H101N6O21[M+H]+：1241.69，实测值1241.69。
实施例350.(2S，4R)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(4-羟基-3-硝基苯基)-2-甲基戊酸(310)的合成
在0℃下，将(2S，4R)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(0.57g，1.76mmol，1.0eq.)的四氢呋喃(10mL)加入t-BuONO(0.63mL，5.28mmol，3.0eq.)。将反应在0℃搅拌1小时，然后在室温搅拌1小时。加入水(50mL)后，反应混合物用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并通过硅胶柱色谱法(2：1己烷/乙酸乙酯，含有1％ HOAc)纯化，得到标题化合物，为黄色固体(0.50g，77％收率)。1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.92(s，1H)，7.47(d，J＝8.3Hz，1H)，7.05(d，J＝8.5Hz，1H)，3.73(s，1H)，2.78(dd，J＝13.6，5.3Hz，1H)，2.69–2.47(m，2H)，1.87(t，J＝11.9Hz，1H)，1.47–1.37(m，1H)，1.32(s，9H)，1.17(d，J＝7.2Hz，3H).ESIMS m/z C17H25N2O7[M+H]+计算值369.15，实测值369.14。
实施例351.(2S，4R)-5-(3-氨基-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲基戊酸(311)的合成
在室温下，将化合物310(0.50g，1.36mmol，1.0eq.)和Pd/C(10wt％，0.02g)的甲醇(10mL)混合物中，催化加氢(1atm H2)反应一小时，然后通过硅藻土(助滤剂)过滤。将滤液浓缩，得到标题化合物，为白色泡沫状物(0.43g，93％收率)。ESIMS m/z计算值C17H27N2O5[M+H]+339.18，实测值339.17。1H NMR(400MHz，MeOD)δ6.60(d，J＝7.9Hz，2H)，6.44(d，J＝7.3Hz，1H)，3.71(d，J＝6.3Hz，1H)，2.62–2.37(m，3H)，1.83(ddd，J＝13.7，9.9，3.7Hz，1H)，1.39(s，9H)，1.13(d，J＝7.1Hz，3H)。
实施例352.(2S，4R)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(3-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35，38-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36，39-三氮杂四十三烷-43-酰胺基)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(313)的合成
在室温下，向化合物311(78.0g，85.0mmol，1.0eq.)和2，5-二氧吡咯烷-1-基-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基丁酰胺基)-28，35，38-三氧-2.5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36，39-三氮杂四十三烷-43-甲酸酯(93.3g，95.8mmol，1.1eq.)的95％乙醇(3.3L)中加入NaH2PO4(0.1M，660mL)。反应在室温下搅拌过夜然后用二氯甲烷稀释并用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(3-10％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物，为黄色油状物(43g，37％收率)。
实施例353.(2S，4R)-4-氨基-5-(3-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35，38-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36，39-三氮杂四十三烷-43-酰胺基)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(314)的合成
/>
在室温下，化合物313(2.25g，1.78mmol)的二恶烷(10mL)与浓盐酸(3mL)反应1小时，浓缩，与甲苯/乙醇蒸发至干得到粗品标题产物(1.97g，100％收率)，直接用于下一步。ESI m/z C53H88N7O20[M+H]+计算值：1142.6085，实测值：1142.6140。
实施例354.(S，Z)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲基-5-苯基戊-2-烯酸叔丁酯(315)的合成
将(S)-叔丁基(1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基甲酸酯(1.01g，4.0mmol)溶解于无水二氯甲烷(50mL)中，然后加入2-(三苯基-亚磷酰亚胺)-叔丁基丙酸酯(3.20g，8mmol)并将溶液在室温下搅拌1.5小时，由TLC分析表明反应完成。通过柱色谱法(10-50％乙酸乙酯/己烷)纯化得到标题化合物(1.38g，96％收率)。ESI m/z计算值C21H31NO4[M+H]+：362.2332，实测值：362.2350。
实施例355.(S，E)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊-2-烯酸叔丁酯(316)和(S，E)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基-5-(2-硝基苯基)戊-2-烯酸叔丁酯(317)的合成
将(S，Z)-叔丁基4-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲基-5-苯基戊-2-烯酸酯(1.320g，3.65mmol)溶于四氢呋喃(45mL)，然后加入亚硝酸叔丁酯(1.151g，10.95mmol)的四氢呋喃(6mL)。反应在室温下搅拌3小时然后倒入水中，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取，合并的有机相用盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过色谱柱色谱法纯化(10-50％乙酸乙酯/正己烷)得到316(907mg，61％收率)ESI m/zC21H31N2O6[M+H]+计算值：407.2183，实测值：407.2230，和317(133mg，9.0％收率)，ESI m/z C21H31N2O6[M+H]+计算值：407.2183，实测值：407.2245。
实施例356.(2S，4R)-5-(4-氨基苯基)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲基戊酸叔丁酯(318)的合成
将(S，E)-叔丁基4-((叔丁氧羰基)氨基)-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊-2-烯酸酯(15.0g，36.9mmol，1.0eq.)，手性螺铱催化剂(1.50g，0.78mmol)(Zhu，S.-F.；等，J.Am.Chem.Soc.2006，128，12886；Song，S.，等，Org.Lett.，2013，15，3722)和Et3N(4.26g，41.0mmol)的150mL甲醇混合物在加氢容器中搅拌并在60℃下充入6atm H2反应20小时。放出氢气后，将混合物浓缩并用C-8柱用水/甲醇(5％甲醇至50％甲醇)洗脱纯化，得到12.8g(92％收率)的标题化合物，直接用于下一步。ESI m/z C21H35N2O4[M+H]+计算值：379.2578，实测值：379.2610。
实施例357.(2S，4R)-叔丁基4-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(4-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十三酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸酯(319)的合成
将(2S，4R)-叔丁基5-(4-氨基苯基)-4-((叔丁氧基-羰基)氨基)-2-甲基戊酸(3.511g，9.28mmol)和(S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯烷-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷-40-酸(7.613g，9.28mmol)的二氯甲烷(75mL)加入EDC(3.50g，18.23mmol)。将混合物搅拌12小时，浓缩，在硅胶柱上纯化，用30％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱，合并组分，用油泵蒸发，得到标题化合物(8.98g，82％收率)。ESI m/z C58H97N6O29[M+H]+计算值：1181.6809，实测值：1181.6880。
实施例358.(2S，4R)-4-氨基-5-(4-((S)-37-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-31，38-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十二氧杂-32，39-二氮杂四十三酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(320)的合成
在室温下，将化合物319(2.01g，1.70mmol)的二恶烷(10mL)的溶液与盐酸(3mL)反应1小时，然后浓缩并与甲苯/乙醇蒸发至干，得到粗标题产物(1.82g，100％收率)，直接用于下一步。ESI m/z C51H85N6O18[M+H]+计算值：1069.5921，实测值：1069.5990。
实施例359.(2S，4R)-叔丁基4-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(4-((S)-37-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-31，38，41-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十二氧杂-32，39，42-三氮杂四十六酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸酯(321)的合成
向(2S，4R)-叔丁基5-(4-氨基苯基)-4-(叔丁氧羰基)氨基-2-甲基戊酸叔丁酯(3.012g，7.96mmol)和(S)-37-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺)-31，38，41-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十二氧杂-32，39，42-三氮杂四十六烷-46-酸(7.346g，9.97mmol)的二氯甲烷(75mL)中加入EDC(3.50g，18.23mmol)。将混合物搅拌12小时，浓缩，在硅胶柱上纯化，用30％乙酸乙酯/二氯甲烷洗脱，合并组分，用油泵蒸发，得到标题化合物(8.672g，收率为85％)。ESI m/zC62H104N7O21[M+H]+计算值：1282.7286，实测值：1282.7365。
实施例360.(2S，4R)-4-氨基-5-(4-((S)-37-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-31，38，41-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十二氧杂-32，39，42-三氮杂四十六酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(322)的合成
在室温下，将化合物321(1.951g，1.52mmol)的二恶烷(10mL)溶液与盐酸(3mL)反应1小时，浓缩，与甲苯/乙醇蒸发至干得到粗品标题产物(1.71g，100％收率)，直接用于下一步。ESI m/z C53H88N7O19[M+H]+计算值：1126.6136，实测值：1126.6265。
实施例361.五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(323)的合成
向2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸(2.210g，4.090mmol)和五氟苯酚(1.00g，5.430mmol)的二氯甲烷(60mL)溶液中加入EDC(1.580g，8.22mmol)。将反应混合物搅拌过夜。减压除去溶剂后，将反应混合物浓缩，硅胶柱层析(1：15至1：4乙酸乙酯/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物(2.455g，85％收率)，使用直接进入下一步。ESIMS m/zC32H44F5N4O6S[M+H]+计算值707.2902，实测值707.2970。
实施例362.五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十三烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(324)的合成
向2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十三烷-11-基)噻唑-4-甲酸(2.285g，4.460mmol)和五氟苯酚(1.00g，5.430mmol)的二氯甲烷(60mL)溶液中加入EDC(1.580g，8.22mmol))。将反应混合物搅拌过夜。减压除去溶剂后，将反应混合物浓缩，通过硅胶柱层析(1：15至1：4乙酸乙酯/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物(2.510g，83％收率)，使用直接进入下一步。ESIMS m/zC31H44F5N4O5S[M+H]+计算值679.2953，实测值679.2995。
实施例363.(2S，4R)-4-(2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(325)的合成
将五氟苯基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧杂-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酸(1.001g，1.444mmol)和化合物320(1.543g，1.442mmol)，以及N，N-二异丙基乙胺(0.6mL)的DMF(30mL)在室温下搅拌过夜。将反应液在高真空下浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC纯化(C18柱，10-90％乙腈/水)，合并含有产物的组分，浓缩并冻干，得到标题化合物(1.437g，65％收率)。ESIMS m/z C74H121N10O22S[M+H]+计算值1533.8378，实测值1533.8470。
实施例364.(2S，4R)-4-(2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-的合成二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十三烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(326)的合成
将五氟苯基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酸(1.011g，1.521mmol)，化合物320(1.550g，1.444mmol)，和N，N-二异丙基乙胺(0.6mL)的DMF(30mL)的混合物在室温下搅拌过夜。将反应液在高真空下浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，合并含有产物的组份，浓缩并冻干，得到标题化合物(1.401g，63％收率)。ESIMSm/z C73H121N10O21S[M+H]+计算值1505.8429，实测值1505.8510。
实施例365.(2S，4R)-4-(2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十三烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(327)的合成
将五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酸(1.015g，1.496mmol)，化合物320(1.545g，1.443mmol)，和N，N-二异丙基乙胺(0.6mL)的DMF(30mL)的混合物在室温下搅拌过夜。将反应液在高真空下浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，合并含有产物的组份，浓缩并冻干，得到标题化合物(1.357g，61％收率)。ESIMS m/z C74H123N10O21S[M+H]+计算值1519.8586，实测值1519.8650。
实施例366.(2S，4R)-4-(2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(328)的合成
将五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酸(1.020g，1.444mmol)和化合物320(1.540g，1.442mmol)，和N，N-二异丙基乙胺(0.6mL)的DMF(30mL)的混合物在室温下搅拌过夜。将反应液在高真空下浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，合并含有产物的组份，浓缩并冻干，得到标题化合物(1.338g，60％收率)。ESIMS m/z C75H123N10O22S[M+H]+计算值1547.8535，实测值1547.8595。
实施例367.(2S，4R)-4-(2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35，38-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36，39-三氮杂四十三酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(329)
将五氟苯基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧杂-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酸(1.003g，1.444mmol)和化合物322(1.535g，1.363mmol)，和N，N-二异丙基乙胺(0.6mL)的DMF(30mL)的混合物在室温下搅拌过夜。将反应液在高真空下浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC纯化(C18柱，10-90％乙腈/水)，合并含有产物的组份，浓缩并冻干，得到标题化合物(1.365g，65％收率)。ESIMS m/z C76H124N11O23S[M+H]+计算值1590.8593，实测值1590.8670。
实施例368.(2S，4R)-4-(2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35，38-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36，39-三氮杂四十三酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(330)的合成
将五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧杂-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酸(1.020g，1.444mmol)和化合物322(1.540g，1.367mmol)，和N，N-二异丙基乙胺(0.6mL)的DMF(30mL)的混合物在室温下搅拌过夜。将反应液在高真空下浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，合并含有产物的组份，浓缩并冻干，得到标题化合物(1.315g，60％收率)。ESIMS m/z C77H126N11O23S[M+H]+计算值1604.8750，实测值1604.8835。
实施例369.(2S，4R)-4-(2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十三烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(3-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十烷酰胺基)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(331)的合成
将五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酸(1.015g，1.496mmol)，化合物314(1.458g，1.401mmol)，和N，N-二异丙基乙胺(0.6mL)的DMF(30mL)的混合物在室温下搅拌过夜。将反应液在高真空下浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，合并含有产物的组份，浓缩并冻干，得到标题化合物(1.338g，62％收率)。ESIMS m/z C74H123N10O22S[M+H]+计算值1535.8535，实测值1535.8655。
实施例370.(2S，4R)-4-(2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(3-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十酰胺基)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(332)的合成
将五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氧杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酸(1.020g，1.444mmol)和(2S，4R)-4-氨基-5-(3-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29、36-二氮杂四十酰胺基)-4-羟基苯)-2-甲基戊酸(1.455g，1.395mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.5mL)的DMF(35mL)的混合物在室温下搅拌过夜。反应在高真空下浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，合并含有产物的组份，浓缩并冻干，得到标题化合物(1.333g，61％收率)。ESI MS m/z C75H123N10O23S[M+H]+计算值1563.8484，实测值1563.8550。
实施例371.(2S，4R)-4-(2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十三烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(3-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35，38-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36，39-三氮杂四十三酰胺基)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(333)的合成
将五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酸(1.015g，1.496mmol)，化合物314(1.523g，1.387mmol)，和N，N-二异丙基乙胺(0.6mL)的DMF(30mL)的的混合物在室温下搅拌过夜。将反应液在高真空下浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC纯化(C18柱，10-90％乙腈/水)，合并含有产物的组份，浓缩并冻干，得到标题化合物(1.326g，60％收率)。ESIMS m/z C76H126N11O23S[M+H]+计算值1592.8750，实测值1592.8845。
实施例372.(2S，4R)-4-(2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(3-((S)-34-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-28，35，38-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36，39-三氮杂四十酰胺基)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(334)的合成
334/>
将五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酸(1.020g，1.444mmol)，化合物314(1.520g，1.384mmol)，和N，N-二异丙基乙胺(0.5mL)的DMF(35mL)的混合物在室温下搅拌过夜。反应在高真空下浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，合并含有产物的组份，浓缩并冻干，得到标题化合物(1.391g，62％收率)。ESIMSm/z C77H126N11O24S[M+H]+计算值1620.8699，实测值1620.8790。
实施例373.(2S，4R)-5-(3-(13-(2’，5’，8’，11’，14’，17’，20’，23’-八氧杂二十五烷-25'-磺酰基)-15-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10-三氧代-3，6，9，13-四氮杂十五酰胺基)-4-羟基苯基)-4-(2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酰胺基)-2-甲基戊酸(335)的合成
在0℃下，向(2S，4R)-5-(3-氨基-4-羟基苯基)-4-(2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氧杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酰胺基)-2-甲基戊酸盐酸盐(Tub-039，R.Zhao，et al，PCT/CN2017/120454；R.Zhao，et al，14th PEGS Boston，Boston，MA，USA，2018年5月3日)(83mg，0.106mmol)和化合物110(122mg，0.134mmol)的DMF(8mL)中加入N，N-二异丙基乙胺(2mL)。将反应混合物在0℃搅拌0.5小时，然后在室温搅拌4小时。然后将反应混合物浓缩，通过制备HPLC(流动相：乙腈/水＝10％至80％，含0.1％甲酸)纯化，得到标题产物(95.5mg，58％收率)。MS-ESI m/z：
[M+H]+C69H112N11O24S计算值，1542.72；实测值，1542.73。
实施例374.3，3’-((2-(2-(双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-氧乙氧基)乙酰基)氮杂二基)二丙酸(336)的合成
向3，3'-氮杂二基二丙酸(1.00g，6.20mmol)的DMA(25mL)和NaH2PO4缓冲液(30mL，100mM，pH 7.0)中加入2，5-二氧吡咯烷-1-基2-(2-(双(2-(2，5-二氧-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-氧乙氧基)乙酸酯(3.00g，6.30mmol)。然后将混合物在室温下搅拌4小时，浓缩，硅胶柱纯化，用水/CH3CN(3％水的CH3CN溶液至5％水的CH3CN溶液)洗脱，得到标题化合物(2.52g，78％收率)。ESIMS m/z C22H27N4O11[M+H]+计算值523.17，实测值523.20。
实施例375.双(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)3，3’-((2-(2-(双(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-氧乙氧基)乙酰基)氮杂二基)二丙酸酯(337)的合成
向化合物336(1.20g，2.30mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.34g，2.95mmol)的无水DMA(30mL)中加入EDC(1.00g，5.23mmol)。将反应混合物搅拌4小时，然后浓缩并通过硅胶柱色谱法(4：1至5：3二氯甲烷/乙酸乙酯)纯化，得到标题化合物(1.26g，77％收率)。ESIMS m/z：C30H33N6O15[M+H]+计算值717.20，实测值717.30。
实施例376.3，3’-((4-(双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰基)氮杂二基)二丙酸(338)
向3，3'-氮杂二基二丙酸(1.00g，6.20mmol)的DMA(25mL)和NaH2PO4缓冲液(30mL，100mM，pH 7.0)中加入2，5-二氧吡咯烷-1-基4-(双(2-(2，5-二氧-2，5二氢-1H-吡咯-1-乙基)氨基)-4-氧代丁酸酯(2.90g，6.30mmol)。然后将混合物在室温下搅拌4小时，浓缩，硅胶柱纯化，用水/CH3CN(3％水的CH3CN溶液至5％水的CH3CN溶液)得到标题化合物(2.51g，80％收率)。ESIMS m/z C22H27N4O10[M+H]+，计算值507.17，实测值507.20。
实施例377.双(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)3，3’-((4-(双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧代丁酰基)氮杂二基)二丙酸酯(339)的合成
向化合物338(1.15g，2.27mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.34g，2.95mmol)的无水DMA(30mL)混合溶液中加入EDC(1.00g，5.23mmol)。将反应混合物搅拌4小时，然后浓缩并通过硅胶柱色谱(4：1至5：3二氯甲烷/乙酸乙酯)纯化，得到标题化合物(1.27g，80％收率)。ESIMS m/z：C30H33N6O14[M+H]+计算值701.20，实测值701.30。
实施例378.(2R，3R)-2，3-双((苄氧基)羰基)氨基)-4-((4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)氨基)-4-氧代丁酸(340)的合成
向二苄基((3R，4S)-2，5-二氧代四氢呋喃-3，4-二基)-二氨基甲酸酯(4.25g，10.68mmol，1.0eq.)和DMAP(13mg，0.11mmol，0.01eq.)的20mL无水二氯甲烷中，加入氨基丁酸叔丁酯(1.78g，11.21mmol，1.05eq.)的10mL无水二氯甲烷的溶液。加完后，原料完全溶解，反应在室温下搅拌过夜。将粗产物装载在硅胶柱上并用3-5％甲醇/二氯甲烷洗脱。合并组份并蒸发，将残余物与石油醚/二氯甲烷(1：1)一起打浆，得到3.3g白色固体(55.9％收率)。ESI m/z C28H36N3O9[M+H]+计算值：558.2，实测值：558.2。
实施例379.2，2-二甲基-4-氧代-3，8，11，15，18-五氧杂-5-氮杂二十一烷-21-酸(341)的合成
在500mL烧瓶中，将H2N-PEG4-CH2CH2CO2H(3.0g，11.3mmol，1.0eq.)和K2CO3(4.7g，33.93mmol，3.0eq.)溶于50mL水中，冰水浴冷却，滴加Boc2O(3.2g，14.7mmol，1.3)的50mL四氢呋喃。使反应升温至室温并搅拌过夜。将反应混合物用1N KHSO4调节至pH 4-5，用二氯甲烷(200mL×1，100mL×3)萃取，用水(500mL×1)和盐水(500mL×1)洗涤，无水硫酸钠干燥，并浓缩。将残余物溶解在少量二氯甲烷中，然后上样到硅胶柱，用2-4％甲醇/二氯甲烷洗脱，合并组份并浓缩，得到3.8g无色油状物(93％收率)。ESI m/z C16H32NO8[M+H]+计算值：366.2，实测值：366.2。
实施例380.2，2-二甲基-4-氧代-3，8，11，15，18-五氧杂-5-氮杂二十一烷-酯(342)的合成
在50mL单颈烧瓶中，将BocHN-PEG4-CH2CH2CO2H(0.81g，2.22mmol，1.0eq.)，K2CO3(0.92g，6.66mmol，3.0eq.)和NaI(0.033g，0.222mmol，0.1eq.))混合在10mL DMF中，冰水浴冷却，滴加BnBr(0.57g，3.33mmol，1.5eq.)，将混合物升温至室温并搅拌过夜。反应混合物用100mL水稀释，用二氯甲烷(100mL×2)萃取，用水(200mL×1)和盐水(200mL×1)洗涤，用无水硫酸钠干燥，浓缩。将残余物溶解在少量二氯甲烷中，上样到硅胶柱，用70-90％ EA/PE洗脱，得到0.69g无色油状物(69％收率)。ESI m/z C23H38NO8[M+H]+：计算值446.3，实测值：446.3。
实施例381.1-氨基-3，6，10，13-四氧杂十六烷-16-酯(343)的合成
将BocHN-PEG4-CH2CH2CO2Bn(0.69g，1.5mmol，1.0eq.)的6mL二氯甲烷和3mL TFA的溶液在室温下搅拌30分钟。除去溶剂，残余物与二氯甲烷共沸蒸发3次，置于高真空泵上。粗品直接用于下一步反应ESI m/z C18H30NO6[M+H]+计算值：356.2，实测值：356.2。
实施例382.2，5-二氧代吡咯烷-1-基1-氨基-3，6，10，13-四氧杂十六烷-16-酯(344)的合成
向BocHN-PEG4-CH2CH2CO2H(3.8g，10.4mmol，1.0eq.)的50mL无水二氯甲烷中加入NHS(1.4g，12.5mmol，1.2eq.)和EDC(10.0g，52.0mmol，5.0eq.)。反应在室温下搅拌过夜，然后用水(50mL×2)、盐水(100mL×1)洗涤，用无水硫酸钠干燥，浓缩。粗产物直接用于下一步。ESI m/z C20H35N2O10[M+H]+计算值：463.2，实测值：463.2。
实施例383.2，2-二甲基-4，20-二氧代-3，8，11，14，17，24，27，30，33-九氧杂-5，21-二氮杂三十六烷-36-酸(345)的合成
在300mL烧瓶中，将H2N-PEG4-CH2CH2CO2H(2.8g，10.4mmol，1.0eq.)和K2CO3(4.3g，31.2mmol，3.0eq.)溶于40mL水中，冰水浴冷却，并滴加上述NHS酯粗品(3.8g，10.4mmol，1.0eq.)的40mL四氢呋喃溶液，将混合物升温至室温并搅拌过夜。使用1N KHSO4将反应混合物的pH值调节至4-5，用二氯甲烷(150mL×1，100mL×2)萃取，用水(200mL×1)和盐水(200mL×1)洗涤，用无水硫酸钠浓缩。将残余物溶解在少量二氯甲烷中，上样到硅胶柱，用4-6％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到无色油状物(5.18g，81％收率)。ESI m/z C27H53N2O13[M+H]+计算值：613.3，实测值：613.3。
实施例384.2，2-二甲基-4，20，36-三氧代-3，8，11，14，17，24，27，30，33，40，43，46，49-十三氧杂-5，21，37-三氮杂五十二烷-52-酯(346)的合成
将H2N-PEG4-CH2CH2CO2Bn(上一步的粗产物)溶解在3mL DMF中的溶液中，在冰/水浴上冷却，加入N，N-二异丙基乙胺(0.78g，6.0mmol，4.0eq.)，然后加入2，2-二甲基-4，20-二氧代-3，8，11，14，17，24，27，30，33-九氧杂-5，21-二氮杂三十六烷-36-酸(0.93g，1.5mmol，1.0eq.)的7mL DMF和HATU(1.72g，4.5mmol，3.0eq.)。反应液在冰浴上搅拌2小时，用100mL水稀释，用二氯甲烷(100mL×3)萃取，用1N KHSO4(200mL×1)、饱和碳酸氢钠(200mL×1)洗涤，和盐水(200mL×1)，用无水硫酸钠干燥，浓缩。将残余物溶解在少量二氯甲烷中，上样到硅胶柱上纯化，用0-5％甲醇/二氯甲烷洗脱。合并组份并浓缩，得到1.0g淡黄色油状物(71％收率)。ESI m/z C45H80N3O18[M+H]+计算值：950.5，实测值：950.5。
实施例385.(50R，51R)-1-苄基57-叔丁基50，51-双((苄氧基)羰基)氨基)-17，33，49，52-四氧代-4，7，10，13，20，23，26，29，36，39，42，45-十二氧杂-16，32，48，53-四氮杂五十七烷-1，57-二酯(347)的合成
将2，2-二甲基-4，20，36-三氧代-3，8，11，14，17，24，27，30，33，40，43，46，49-十三氧杂-5，21，37-三氮杂五十二烷-52-甲酸酯(1.0g，1.03mmol，1.0eq.)的6mL二氯甲烷和3mLTFA在室温下搅拌1h。除去溶剂，残余物与二氯甲烷共沸蒸发3次，置于高真空泵上。
将粗产物重新溶于10mL DMF中，用冰水浴冷却。依次加入N，N-二异丙基乙胺(0.53g，4.12mmol，4.0eq.)、化合物340(0.56g，1.03mmol，1.0eq.)和HATU(1.17g，3.09mmol，3.0eq.)。在冰浴上搅拌1小时后，加入100mL水，沉淀出固体。过滤收集固体并用水洗涤，溶解在二氯甲烷中，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残留物溶解在少量二氯甲烷中，上样到硅胶柱上纯化，用0-10％甲醇/二氯甲烷洗脱。合并组份并浓缩，得到0.93g浅黄色泡沫(收率65％)。ESI m/z C68H107N8O26[M+H]+计算值：1451.7，实测值：1451.7。
实施例386.(52R，53R)-52，53-双((苄氧基)羰基)氨基)-3，19，35，51，54-五氧代-1-苯基-2，6，9，12，15，22，25，28，31，38，41，44，47-十三氧杂-18，34，50，55-四氮杂五十九烷-59-酸(348)的合成
将(50R，51R)-1-苄基57-叔丁基50，51-双((苄氧基)羰基)氨基)-17，33，49，52-四氧代-4，7，10，13，20，23，26，29，36，39，42，45-十二氧杂-16，32，48，53-四氮杂五十七烷-1，57-二酯(0.93g，0.67mmol，1.0eq.)的6mL二氯甲烷与3mL TFA在室温下搅拌1小时(通过LC-MS监测反应的完成)。除去溶剂，残余物与二氯甲烷共沸蒸发3次，置于高真空泵上。将粗品溶于少量二氯甲烷中，上样到硅胶柱上纯化，用15-20％甲醇/二氯甲烷洗脱。合并组份并浓缩，得到0.53g白色泡沫(收率60％)产物。ESI m/z C64H99N8O26[M+H]+计算值：1395.7，实测值：1395.7。
实施例387.(50R，51R)-1-苄基57-(五氟苯基)50，51-双((苄氧基)羰基)氨基)-17，33，49，52-四氧代-4，7，10，13，20，23，26，29，36，39，42，45-十二氧杂-16，32，48，53-四氮杂五十七烷-1，57-二酯(349)的合成
/>
向化合物348(0.53g，0.40mmol，1.0eq.)的10mL二氯甲烷的溶液中加入五氟苯酚(0.081g，0.44mmol，1.1eq.)和EDC(0.38g，2.0mmol，5.0eq.)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后用冷水(5mL×2)和盐水(10mL×1)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。粗产物直接用于下一步。ESI m/z C70H98 F5N6O26[M+H]+计算值：1561.6，实测值：1561.6。
实施例388.(2S，4R)-5-(3-((52S，53S，64S)-52，53-双((苄氧基)羰基)氨基)-3，19，35，51，54，59，62，65-八氧代-64-(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-1-苯基-2，6，9，12，15，22，25，28，31，38，41，44，47-十三氧杂-18，34，50，55，60，63，66-七氮杂七十酰胺基)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸(350)的合成
将上一步的粗品(0.40mmol，1.0eq.)溶解于10mL DMF中，冰水浴冷却，依次加入(2S，4R)-5-(3-((S)-34-(2-氨基乙酰胺)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四氨基)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸(0.420g，0.406mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.15g，1.2mmol)。冰浴搅拌1小时后，浓缩反应液，重新溶解在少量二氯甲烷中，上样到硅胶柱上，用0-20％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到无色油状物(0.531g，56％收率)。ESI m/zC112H179N12O41[M+H]+计算值：2348.2291，实测值：2348.2380。
实施例389.(2S，4R)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(3-((52S，53S，64S)-52，53-二氨基-3，19，35，51，54，59，62，65-八氧代-64-(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-1-苯基-2，6，9，12，15，22，25，28，31，38，41，44，47-十三氧杂-18，34，50，55，60，63，66-七氮杂七十酰胺基)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(351)的合成
将化合物350(0.53g，0.22mmol)和干燥Pd/C(0.1g，10％wt)的10mL甲醇混合物在H2气球下在室温下搅拌过夜。将反应液过滤，滤液浓缩，得粗品0.35g(收率76％)，直接用于下一步反应。ESI m/z C96H167N12O37[M+H]+计算值：2080.1556，实测值：2080.1645。
实施例390.(2S，4R)-5-(3-((52S，53S，64S)-52，53-双(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3，19，35，51，54，59，62，65-八氧代-64-(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-1-苯基-2，6，9，12，15，22，25，28，31，38，41，44，47-十三氧杂-18，34，50，55，60，63，66-七氮杂七十酰胺基)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸(352)的合成
将上一步粗产物(0.350g，0.168mmol)溶解于5mL乙醇和0.5mL的0.1MNaH2PO4混合物中，加入N-琥珀酰亚胺(3-马来酰亚胺)丙酸酯(0.200g，0.751mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后浓缩。将残渣溶于少量水，上C-18凝胶柱，用100-20％水/甲醇洗脱，合并含产物组份，浓缩冷冻干燥得无色油状产品(0.23g，57％收率)。ESI m/z C110H177N14O43[M+H]+计算值：2382，2095，实测值：2382.2190。
实施例391.(34S，45S，46S)-34-((4-((2S，4S)-2-(2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-4-羧基戊基)-2-羟基苯基)氨基)二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-28，36，39，44，47，63，79-七氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26，51，54，57，60，67，70，73，76，83，86，89，92-二十一氧杂-29，35，38，43，48，64，80-七氮杂九十五烷-95-酸(353)的合成
将化合物352(0.131g，0.0546mmol)溶解于2mL的二氯甲烷中，并在室温下与2mL的TFA一起搅拌3小时。除去溶剂，残余物与二氯甲烷共浓缩3次，置于高真空泵上。
将粗产物重新溶解于DMF(1.2mL)中并在冰水浴上冷却。五氟苯基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十一烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(五氟苯酚)(0.048g，0.0690mmol)，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.10g)。将反应在冰浴上搅拌1小时，然后使用甲酸将pH调节至4-5。将混合物浓缩，再溶于少量二氯甲烷，上样到硅胶柱，用甲醇/二氯甲烷(1：10至1：4，均含0.1％甲酸)洗脱。
合并含有产物的级分并浓缩，得到0.112g黄色泡沫(两步收率为75％)。产物通过制备HPLC(15-50％乙腈/水，含有0.1％甲酸)进一步纯化。将组分合并并浓缩，得到无色油状物(0.084g，57％收率)。ESI m/z C123H203N18O46S[M+H]+计算值：2700.3820，实测值：2700.3925。
将化合物29(0.13g，0.0574mmol，1.0eq)溶解在2mL的二氯甲烷中，并在室温下与2mL的TFA一起搅拌3小时。除去溶剂，并将残余物与二氯甲烷共同浓缩3次，置于高真空泵上浓缩。
将粗产物重新溶解在DMF中，并在冰水浴上冷却。加入五氟苯酚(0.048g，0.0690mmol，1.0eq)，N，N-二异丙基乙胺(0.022g，0.172mmol，3.0eq)。将反应在冰浴上搅拌1小时，然后使用甲酸将pH调节至4-5。将混合物浓缩，再溶解于少量二氯甲烷中，并上样到硅胶柱上，并用石油醚/乙酸乙酯和甲醇/二氯甲烷(均含有0.1％的甲酸)洗脱。合并组分，浓缩，得到0.1g黄色泡沫(70％收率)。产物通过制备HPLC(含有0.1％甲酸的45-50％乙腈/水)进一步纯化。合并组分，浓缩，得到无色油状物(0.030g，20％收率)。ESI m/zC123H204N17O45S[M+H]+：计算值2671.4，实测值2671.4。
实施例392.2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-基4-甲基苯磺酸酯(354)的合成
在冰浴上，向mPEG8-OH(10g，26mmol，1.0eq)的100mL无水二氯甲烷中的溶液中，依次加入TEA(10.5g，104mmol，4.0eq)，DMAP(32mg，0.26mmol，0.01eq)和TsCl(14.9g，78mmol，3.0eq)。将反应在0℃下搅拌10分钟，然后升温至室温，搅拌过夜，将反应液用1N盐酸(100mL×1)，水(100mL×1)和盐水(100mL×1)洗，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物溶于少量二氯甲烷中，并上样至硅胶柱，用乙酸乙酯/PE(5-100％)和1-3％甲醇/二氯甲烷洗脱。合并组分并浓缩，得到黄色油状物(11.6g，83％收率)。ESI m/z C24H43O11S[M+H]+：计算值539.2，实测值539.2。
实施例393.N，N-二苄基-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-胺(355)的合成
将化合物31(11.6g，21.5mmol，1.0eq)和二苄基胺(5.5g，27.8mmol，1.5eq)的20mL无水DMF的混合物搅拌加热至100℃。反应用300mL二氯甲烷稀释，用水(300mL×3)和盐水(300mL×1)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物在硅胶柱上纯化(50-100％乙酸乙酯/PE)，得到浅黄色油状物(8.2g，66％收率)。ESI m/z C31H50NO8[M+H]+：计算值564.3，实测值564.3。
实施例394.2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂二十五烷-25-胺(356)的合成
将化合物32(8.6g，15.2mmol，1.0eq)、干燥的Pd/C(0.9g，10wt％)和100mL无水甲醇混合物在H2气球下回流过夜。滤出催化剂并用甲醇洗涤，浓缩滤液，得到5.3g无色油状物(收率90％)。ESI m/z计算值C17H38NO8[M+H]+：计算值384.3，实测值384.3。
实施例395.(28R，29R)-叔丁基28，29-双((苄氧基)羰基)氨基)-27，30-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，31-二氮杂三十五烷-35-酯(357)的合成
向化合物17(1.6g，2.84mmol，1.0eq)和化合物33(1.2g，2.84mmol，1.0eq)的5mL无水DMF溶液中，在冰水浴上依次加入HATU(3.2g，8.52mmol，3.0eq)和N，N-二异丙基乙胺(1.5g，11.36mmol，4.0eq)。将反应在冰浴上搅拌2小时，然后加入150mL水，并用二氯甲烷(150mL×1、100mL×1)萃取。有机相用1N盐酸(200mL×1)，饱和碳酸氢钠(200mL×1)和盐水(200mL×1)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗产物溶于少量二氯甲烷中，并上样至硅胶柱，然后用0-5％甲醇/二氯甲烷洗脱。合并组分并浓缩，得到2.29g白色固体(87％收率)。ESI m/zC45H71N4O16[M+H]++：计算值923.5，实测值923.5。
实施例396.(28R，29R)-28，29-双((苄氧基)羰基)氨基)-27，30-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，31-二氮杂三十五烷-35-酸(358)的合成
将化合物357(2.29g，2.48mmol)的5mL二氯甲烷和5mL TFA混合物在室温下搅拌3小时。除去溶剂，残渣与二氯甲烷共沸蒸发3次，残渣溶于少量二氯甲烷，上样到硅胶柱上，5-8％甲醇/二氯甲烷洗脱。合并组份并浓缩，得到2.09g白色胶状固体(97％收率)。ESI m/zC41H63N4O16[M+H]+计算值：867.4，实测值：867.4。
将化合物34(2.29g，2.48mmol，1.0eq)的5mL二氯甲烷和5mL TFA的混合物在室温搅拌3小时，除去溶剂，并将残余物与二氯甲烷共浓缩3次，将残余物溶于少量二氯甲烷中，并上样至硅胶柱，用5-8％甲醇/二氯甲烷洗脱。合并组分并浓缩，得到2.09g白色胶冻固体(97％收率)。ESI m/z C41H63N4O16[M+H]+：计算值867.4，实测值867.4。
实施例397.(28R，29R)-五氟苯基28，29-双((苄氧基)羰基)氨基)-27，30-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，31-二氮杂三十五烷-35-酯(359)的合成
在冰水浴上，向化合物358(1.5g，1.73mmol，1.0eq.)的10mL二氯甲烷中加入五氟苯酚(0.35g，1.90mmol，1.1eq.)和EDC(1.7g，8.66mmol，5.0eq.)。将反应升温至室温。搅拌5小时，用水(10mL×2)、盐水(20mL×1)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，得粗品1.07g，60％收率。ESI m/z C47H62 F5N4O16[M+H]+计算值：1033.4，实测值：1033.4。
实施例398.(2S，4R)-5-(3-((28S，29S，43S)-28，29-双((苄氧基)羰基)氨基)-27，30，35，38，41，44-六氧代-43-(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，31，36，39，42，45-六氮杂二十九烷氨基)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸(360)的合成
在冰水浴中，向上述粗品(1.07g，1.00mmol)的10mL DMF溶液中，加入(2S，4R)-5-(3-((S)-34-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基))-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十四酰胺)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸(1.091g，1.00mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.39g，
3.0mmol)。将反应在冰水浴中搅拌1小时，并用1N盐酸调节pH 4-5，用乙酸乙酯(100mL)稀释，用水(30mL×5)萃取。浓缩水相，然后重新溶解于少量二氯甲烷中，上样至硅胶柱，用15-18％甲醇/二氯甲烷洗脱。将合并组分并浓缩，得到0.88g无色油状物(51％收率)。ESI m/z C91H148N11O34[M+H]+计算值：1939.0191，实测值：1939.0280。
实施例399.(2S，4R)-4-((叔丁氧羰基)氨基)-5-(3-((28S，29S，43S)-28，29-二氨基-27，30，35，38，41，44-六氧代-43-(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，31，36，39，42，45-六氮杂九十四酰胺基)-4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(361)的合成
将前述化合物(0.921g，0.475mmol)和Pd/C(0.10g，10wt％)的15mL甲醇混合物在H2气球下在室温下搅拌过夜。过滤催化剂，浓缩滤液，得粗品0.780g(97％收率)，直接用于下一步反应。ESI m/z计算值C75H136N11O30[M+H]+：1670.9455，实测值：1670.9560。
实施例400.(2S，4R)-5-(3-((28S，29S，43S)-28，29-双(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-27，30，35，38，41，44-六氧代-43-(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，31，36，39，42，45-六氮杂九十四酰胺基基)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸(362)的合成
将上一步的粗品(0.751g，0.450mmol)溶于8mL乙醇和1.2mL 0.1M NaH2PO4的混合物中，加入N-琥珀酰亚胺(3-马来酰亚胺)丙酸酯(0.202g，0.758mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后浓缩。将残余物溶解在少量水中，上样到C-18凝胶柱上，用0-50％甲醇/水洗脱，得到无色油状物(0.603g，68％收率)。ESI m/zC89H146N13O36[M+H]+计算值：1972.9994，实测值：1973.0090。
实施例401.(2S，4S)-5-(3-((28S，29S，43S)-28，29-双(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-27，30，35，38，41，44-六氧代-43-(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-2，5，8，11，14，17，20，23-八氧杂-26，31，36，39，42，45-六氮杂四十九酰胺基)-4-羟基苯基)-4-(2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酰胺基)-2-甲基戊酸(363)
将化合物362(0.291g，0.147mmol)的3mL二氯甲烷和1mL TFA溶液在室温下搅拌0.5小时。除去溶剂，残余物与二氯甲烷/甲苯共沸蒸发3次，置于高真空泵上。
将粗产物重新溶解在5mL DMF中并在冰水浴上冷却。五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-甲酸酯(0.121g，0.171mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.265g，2.07mmol)。反应在冰浴上搅拌1小时，然后用甲酸酸化至pH 4-5。将混合物浓缩，重新溶解在少量二氯甲烷中，上样到硅胶柱上，用甲醇/二氯甲烷(1：6至1：3，含0.1％甲酸)洗脱。将组份合并并浓缩，得到0.213g黄色泡沫产物(两步收率为61％)。产物通过制备C-18HPLC(25-50％乙腈/水，含有0.1％甲酸)进一步纯化。将组份合并浓缩，冻干得到无色油状物(0.171g，两步收率48％)。ESI m/zC110H180N17O39S[M+H]+计算值：2395.2346，实测值：2395.2440。
实施例402.(6S，13S)-二叔丁基6，13-双(4-氨基丁基)-9，10-双(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-5，8，11，14-四氧代-4，7，12，15-四氮杂十八烷-1，18-二酯(364)的合成
向化合物234(8.50g，6.80mmol)的甲醇(100mL)溶液中加入NH4F(0.80g，21.62mmol)和一滴1.0M盐酸(～0.010mL)。反应在室温下继续搅拌2小时，然后在50℃下搅拌2小时。然后将混合物用DMF(30mL)稀释，真空蒸发并用油真空泵干燥，得到粗产物(8.19g，>100％收率)，无需进一步纯化即可用于下一步。ESIMS m/z 961.53([M+H]+)。
实施例403.(6S，13S)-二叔丁基9，10-双(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-5，8，11，14-四氧代-6，13-双(29-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-30-氮杂三十四烷-34-基)-4，7，12，15-四氮杂十八烷-1，18-二酯(365)的合成
向上述粗化合物(8.19g，～6.80mmol)的DMA(100mL)溶液中加入2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-酸(6.92g，15.17mmol)和EDC·HCl(6.30g，33.15mmol)。将反应混合物在室温搅拌8小时，然后浓缩，用水(50mL)稀释并用乙酸乙酯(3×80mL)萃取。合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，上样到硅胶柱上(10％-30％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到无色油状物(6.51g，两步收率52％)。ESIMS m/z 1839.09[M+H]+。
实施例404.(6S，13S)-9，10-双(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-5，8，11，14-四氧代-6，13-双(29-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-30-氮杂三十四烷-34-基)-4，7，12，15-四氮杂十八烷-1，18-二酸(366)
将上述化合物(6.49g，3.53mmol)的二恶烷(30mL)溶液在0℃下与浓盐酸(10mL)反应30min，然后用甲苯(50mL)稀释，浓缩并上样到短硅胶柱上，用10-25％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到无色油状物(5.47g，90％收率)。ESIMS m/z 1725.88([M+H]+)。
实施例405.(18S，25S)-二叔丁基21，22-双(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-4，7，10，13，17，20，23，26，30，33，36，39-十二氧代-18，25-双(29-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧代-30-氮杂三十四烷-34-基)-3，6，9，12，16，19，24，27，31，34，37，40-十二氮杂四十二烷-1，42-二酯(367)的合成
向化合物366(5.40g，3.13mmol)的DMA(100mL)溶液中加入2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)乙酸叔丁酯(H-Gly-Gly-Gly-Gly-OtBu)
(2.50g，8.27mmol)和EDC·HCl(5.50g，28.94mmol)。将反应混合物在室温搅拌8小时，然后浓缩，用水(50mL)稀释并用乙酸乙酯(3×80mL)萃取。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，用硅胶柱(5％-20％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到无色油状产物(5.95g，83％收率)。ESIMS m/z 2294.52([M+H]+)。
实施例406.(18S，25S)-21，22-双(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-4，7，10，13，17，20，23，26，30，33，36，39-十二氧代-18，25-双(29-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-30-氮杂三十四烷-34-基)-3，6，9，12，16，19，24，27，31，34，37，40-十二氮杂四十二烷-1，42-二酸(368)的合成
在0℃下，将化合物367(5.90g，2.57mmol)的二恶烷(30mL)溶液与浓盐酸(10mL)反应30分钟，然后用甲苯(50mL)稀释，浓缩并上样到硅胶柱上，用10-30％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到无色油状产物(4.60g，82％收率)。ESIMS m/z2182.33([M+H]+).
实施例407.(17S，24S)-双(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)20，21-双(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-4，7，9，12，16，19，22，25，29，32，35，38-十二氧代-17，24-双(29-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-30-氮杂三十四烷-34-基)-3，6，8，11，15，18，23，26，30，33，36，39-十二氮杂四十一烷-1，41-二酯(369)的合成
向化合物368(2.30g，1.05mmol)和NHS(0.270g，2.34mmol)的DMF(25mL)的混合物中加入EDC(0.785g，4.08mmol)。将混合物搅拌6小时，浓缩并在硅胶柱上纯化，用乙酸乙酯/二氯甲烷(1：5-1：1)洗脱，得到标题化合物(1.88g，76％收率)。ESIMS m/z 2362.05([M+H]+)。
实施例408.(2S，2’s，4R，4'R)-5，5'-((((17S，24S)-20，21-双(3-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-4，7，9，12，16，19，22，25，29，32，35，38-十二氧代-17，24-双(29-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-30-氮杂三十四烷-34-基)-3，6，8，11，15，18，23，26，30，33，36，39-十二氮杂四十一烷-1，41-二酰基)双(氮杂二基))双(4-羟基-3，1-亚苯基))双(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸)(370)的合成
向(2S，4R)-5-(3-氨基-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸(201mg，0.594mmol)的DMA(10mL)和0.1M NaH2PO4(pH 7.5，5mL)缓冲液的混合物中在1小时内分四份加入化合物369(712mg，0.301mmol)。将混合物再搅拌2小时，浓缩，在C-18HPLC上纯化，用水/甲醇(从100％水至50％水)洗脱，合并组份并浓缩，并在真空油泵上干燥得到标题化合物(519mg，62％收率)。MS-ESI m/z：
[M+H]+C125H199N22O50计算值，2808.3706；实测值，2808.3790。
实施例409.化合物371的合成
将化合物370(251mg，0.0894mmol)溶解于2mL二恶烷溶液中，加入盐酸(浓0.5mL)。混合物在室温下搅拌45min，用甲苯稀释，浓缩，残渣与DMF(5mL)共浓缩3次，置于高真空泵上。
将粗产物重新溶解在DMF(4mL)中并在冰水浴上冷却。然后加入五氟苯基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十一烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(145mg，0.218mmol)，再加入N，N-二异丙基乙胺(0.4mL)。反应在室温下搅拌1小时，然后浓缩，用DMF(4mL)稀释，用甲酸调节pH至4-5，并通过制备型C-18HPLC纯化(15-50％乙腈/水，含0.1％甲酸)。合并组份浓缩，冻干，得到无色泡沫(193mg，两步收率61％)产物。ESI m/z C163H263N30O54S2[M+H]+计算值：3568.8198，实测值：3588.8320。
实施例410.(2S，5S，8S，9S，12S，15S)-二叔丁基8，9-双((苄氧基)羰基)氨基)-2，5，12，15-四甲基-4，7，10，13-四氧代-3，6，11，14-四氮杂十六烷-1，16-二酯(372)的合成
在约0℃下，向(S)-2-((S)-2-氨基丙酰胺基)丙酸叔丁酯(2.00g，5.0mmol)的DMF(30mL)溶液中加入二苄基((3S，4S)-2，5-二氧代四氢呋喃-3，4-二基)二氨基甲酸酯(127，2.16g，10.0mmol)。将混合物在0℃搅拌30分钟，然后室温搅拌45分钟，然后重新冷却至约0℃，然后加入N，N-二异丙基乙胺(640mg，5.0mmol)和EDC(5.21g，27.1mmol)。将反应混合物升温至室温并搅拌1小时，然后用二氯甲烷(350mL)稀释，用饱和NaHCO3(150mL)、水(100mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物经柱层析(100：0至10：1二氯甲烷/甲醇)纯化，得到标题化合物(2.71g，67％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C40H56N6O12计算值，813.40；实测值，813.40。
实施例411.(2S，5S，8S，9S，12S，15S)-二叔丁基8，9-二氨基-2，5，12，15-四甲基-4，7，10，13-四氧代-3，6，11，14-四氮杂十六烷-1，16-二酯(373)的合成
将化合物372(2.65g，3.21mmol)，10％Pd/C(100mg)和甲醇(60mL)的混合物在氢气下搅拌过夜。滤出固体并浓缩滤液，得到无色油状物(1.762g，100％收率)。ESI m/z：[M+H]+计算值C24H44N6O8，545.32；实测值，545.32。
实施例412.(2S，5S，8S，9S，12S，15S)-二叔丁基8，9-双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基)-2，5，12，15-四甲基-4，7，10，13-四氧代-3，6，11，14-四氮杂十六烷-1，16-二酯(374)的合成
向化合物373(1.76g，3.23mmol)的DMF(50mL)溶液中加入2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸(1.25g，8.06mmol)和EDC(2.82g，14.68mmol)。将反应混合物搅拌过夜，浓缩，通过硅胶柱纯化(二氯甲烷/甲醇＝100：0-10：1)，得到标题化合物(2.21g，78％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C40H58N8O14计算值，875.41；实测值875.41。
实施例413.(2S，5S，8S，9S，12S，15S)-8，9-双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基)-2，5，12，15-四甲基-4，7，10，13-四氧代-3，6，11，14-四氮杂十六烷-1，16-二酸(375)的合成
将化合物374(1.21g，1.38mmol)的二恶烷(20mL)和浓盐酸(5mL)反应0.5小时。将反应混合物用甲苯(10mL)稀释，蒸发并用油真空泵干燥，得到标题产物(1.05g，100％收率)，其无需进一步纯化直接用于下一步。MS-ESI m/z：[M+H]+C32H42N8O14计算值，763.28；实测值，763.28。
实施例414.(2S，2’s，4R，4’R)-二叔丁基5，5’-((((7S，10S，13S，16S，17S，20S，23S，26S)-16，17-双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基)-10，13，20，23-四甲基-6，9，12，15，18，21，24，27-八氧代-7，26-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-5，8，11，14，19，22，25，28-八氮杂三十二烷-1，32-二酰基)双(氮杂二基))双(4-羟基-3，1-亚苯基))双(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸酯)(376)的合成
向上述步骤化合物375(1.001g，1.31mmol)的四氢呋喃(50mL)溶液中加入(2S，4R)-5-(3-((S)-34-氨基-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十四酰胺)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸叔丁酯(2.801g，2.650mmol)、溴代三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBroP)(1.842g，3.951mmol)和DMAP(0.311g，2.536mmol)。将混合物搅拌过夜，蒸发，上样到硅胶柱上纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：10)洗脱，得到标题化合物(2.613g，73％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C128H209N18O46计算值，2734.4569；实测值2734.4675。
实施例415.(2S，2’s，4R，4’R)-5，5’-((((7S，10S，13S，16S，17S，20S，23S，26S)-16，17-双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基)-10，13，20，23-四甲基-6，9，12，15，18，21，24，27-八氧代-7，26-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-5，8，11，14，19，22，25，28-八氮杂三十二烷-1，32-二酰基)双(氮杂二基))双(4-羟基-3，1-亚苯基))双(4-氨基-2-甲基戊酸)盐酸盐(377)的合成
化合物376(2.610g，0.954mmol)的二恶烷(20mL)溶液和盐酸(浓5mL)反应0.5小时。将反应混合物用甲苯(10mL)稀释，蒸发并在油真空泵上干燥，得到标题产物(2.315g，100％收率)，其无需进一步纯化直接用于下一步。MS-ESI m/z：[M+H]+C110H177N18O42计算值，2422.2269；实测值，2422.2375。
实施例416.化合物378的合成
将化合物377(0.521g，0.215mmol)溶解于DMF(8mL)中并在冰水浴上冷却加入五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十一烷-11-基)噻唑-4-甲酸酯(0.362g，0.515mmol)，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.50mL)。然后将反应在室温下搅拌1小时，然后使用甲酸将pH值调节至4-5。将混合物浓缩，重新溶于少量水中，并通过制备C-18HPLC(10-60％乙腈/水，含0.1％甲酸)纯化。合并组份，浓缩并冻干，得到无色泡沫(462mg，62％收率)。ESI m/z C162H261N26O52S2[M+H]+计算值：3466.7979，实测值：3466.8070。
实施例417.化合物379，380和381的合成
将化合物377(200mg，0.0825mmol)溶解于二甲基甲酰胺(5mL)中并在冰水浴上冷却加入五氟苯基2-((6S，9R，11R)-6-((S)仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(0.20mmol)，或五氟苯酚基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(0.20mmol)，或五氟苯酚基2-((6S，9R，11R)-6-((S)仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-二氧代12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基4)噻唑-4-羧酸酯(0.20mmol)，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.40mL)。然后将反应在室温下搅拌1小时，然后使用甲酸将pH值调节至4-5。将混合物浓缩，重新溶于少量水中，并通过制备C-18HPLC(10-60％乙腈/水，含0.1％甲酸)纯化。合并组分浓缩并冻干，得到无色泡沫(60-65％收率)。
379(175mg，62％收率)，ESI m/z C160H257N26O52S2[M+H]+计算值：3438.7707，实测值：3438.7830。
380(168mg，60％收率)，ESI m/z C160H261N26O50S2[M+H]+计算值：3410.8122，实测值：3410.8245。
381(162mg，58％收率)，ESI m/z C158H257N26O50S2[M+H]+计算值：3382.7809，实测值：3382.7940。
实施例418.(2S，2’s，4R，4’R)-5，5’-((((7S，32S)-19，20-双(2-(2，5-二氧代6，9，12，17，22，27，30，33-八氧代-7，32-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-5，8，11，16，19，20，23，28，31，31，34-十氮杂三十八烷-1，38-二酰基)双(氮杂二基))双(4-羟基-3，1-亚苯基))双(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸)(382)的合成
(2S，4R)-5-(3-((S)-34-(2-氨基乙酰胺)-28，35-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36-二氮杂四十四酰胺基)-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸(852mg，0.825mmol)的四氢呋喃(30mL)和0.1MNaH2PO4缓冲液(20mL，pH 7.5)加入双(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)4，4'-((2，
2'-(1，2-双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基)肼-1，2-二基)双(乙酰基))双(氮杂二基))二丁酯(322mg，0.409mmol)。将混合物搅拌过夜，蒸发，在C-18HPLC(250mm(L)×50mm(d))上纯化，用甲醇/水(v＝40mL/min，5％至50％的甲醇在45min)，合并含有产物的组分，浓缩并冻干，得到标题化合物(568mg，53％收率)。MS-ESI m/z：[M+H]+C120H193N18O46计算值，2622.3317；实测值2622.3420。
实施例419.(2S，2’s，4R，4'R)-5，5'-((((7S，32S)-19，20-双(2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基)-6，9，12，17，22，27，30，33-八氧代-7，32-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29-氮杂三十三烷-33-基)-5，8，11，16，19，20，23，28，31，34-十氮杂三十八烷-1，38-二酰基)双(氮杂二基))双(4-羟基-3，1-亚苯基))双(4-氨基-2-甲基戊酸)盐酸盐形成化合物(383)的溶液的合成
化合物382(561mg，0.214mmol)，二恶烷(6mL)的溶液与浓盐酸(2mL)反应0.5小时。将反应混合物用甲苯(10mL)稀释，蒸发并在油真空泵上干燥，得到产物(520mg，101％收率)，其无需进一步纯化直接用于下一步。MS-ESI m/z：[M+H]+C110H177N18O42计算值，2422.2269；实测值，2422.2380。
实施例420.化合物384的合成
将化合物383(0.121g，0.050mmol)溶解在DMF(3mL)中并在冰水浴上冷却的的溶液中加入五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(80.1mg，0.113mmol)，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.15mL)。然后将反应在室温下搅拌2小时，然后使用甲酸调节至pH4-5。将混合物浓缩，重新溶于少量水中，并通过制备C-18HPLC(10-60％乙腈/水，含0.1％甲酸)纯化。合并含有产物的组分，浓缩并冻干，得到无色泡沫(109.1mg，63％收率)。ESI m/z C162H261N26O52S2[M+H]+计算值：3466.8020，实测值：3466.8130。
实施例421.化合物385的合成
将化合物383(0.121g，0.050mmol)溶解于DMF(3mL)中并在冰水浴上冷却，加入五氟苯酚基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲-丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十一烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(83.1mg，0.120mmol)，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.15mL)。然后将反应在室温下搅拌2小时，然后使用甲酸将pH值调节至4-5。将混合物浓缩，重新溶于少量水中，并通过制备C-18HPLC(10-60％乙腈/水，含0.1％甲酸)纯化。合并含有产物的组分，浓缩并冻干，得到无色泡沫(104.7mg，61％收率)。ESI m/zC160H257N26O52S2[M+H]+计算值：3438.7707，实测值：3438.7840。
实施例422.化合物386的合成
将化合物383(121mg，0.050mmol)溶解于DMF(3mL)中并在冰水浴上冷却，加入五氟苯酚2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十三烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(82.0mg，0.121mmol)，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.15mL)。然后将反应在室温下搅拌2小时，然后使用甲酸调节至pH4-5。将混合物浓缩，重新溶于少量水中，并通过制备C-18HPLC(10-60％乙腈/水，含0.1％甲酸)纯化。合并含有产物的组份，浓缩并冻干，得到无色泡沫(110.2mg，65％收率)。ESI m/z计算值C160H261N26O50S2[M+H]+：3410.8122，实测值：3410.8240。
实施例423.化合物387的合成
将化合物383(121mg，0.050mmol)溶解于DMF(3mL)中并在冰水浴上冷却，加入五氟苯基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲-丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(80.0mg，0.120mmol)，然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.15mL)。然后将反应在室温下搅拌2小时，然后使用甲酸将pH值调节至4-5。将混合物浓缩，重新溶于少量水中，并通过制备C-18HPLC(10-60％乙腈/水，含0.1％甲酸)纯化。合并含有产物的组份，浓缩并冻干，得到无色泡沫(106.2mg，63％收率)。ESI m/zC158H257N26O50S2[M+H]+计算值：3382.7809，实测值：3382.7940。
实施例424.化合物388的合成
在0℃，向化合物127(12.4g，22.2mmol)的DMF(100mL)的溶液中加入HATU(16.9g，44.5mmol)和TEA(6.2mL，44.5mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后浓缩，然后用水(200mL)稀释，用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。有机相用水(50mL)、5％ NaHCO3(50mL)、2N盐酸(50mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物用石油和乙酸乙酯重结晶，得到标题化合物，为黄色固体(10.0g，83.3％收率)。ESI-MS m/z：C28H34N3O8[M+H]+计算值：540.23；实测值540.23。
实施例425.化合物389的合成
将化合物388(10.0g，18.5mmol)溶解于甲醇(100mL)，加入10％Pd/C(1.0g)催化加氢搅拌3小时。滤出固体并浓缩滤液，得到无色油状物(4.6g，91％收率)。ESI m/z：C12H22N3O4[M+H]+计算值：272.15；实测值272.15。
实施例426.化合物390的合成
将化合物389(2.8g，10.4mmol)溶解于饱和NaHCO3溶液(40mL)中并冷却至约5℃，在搅拌的溶液中加入N-(甲氧羰基)马来酰亚胺(3.2g，20.8mmol)。将混合物在0℃搅拌2小时并在室温搅拌2小时，然后用冰水(100mL)稀释，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。合并的有机相用水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，通过柱层析纯化(1-70％乙酸乙酯/石油醚)，得到化合物390(750mg，17％收率).ESI m/z：C20H22N3O8[M+H]+计算值：432.13，实测值432.13。
实施例427.化合物391的合成
将化合物390(750mg，1.7mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中，并在室温下与TFA(5mL)反应2个小时。浓缩混合物得到白色固体(652mg，100％收率)。ESI-MS m/z：C16H14N3O8[M+H]+计算值：376.07，实测值376.07。
实施例428.化合物392的合成
向化合物391(400mg，1.07mmol)的二氯甲烷(5mL)中加入EDC(410mg，2.14mmol)和五氟苯酚(394mg，2.14mmol)。将反应混合物搅拌1小时，然后用二氯甲烷(50mL)稀释，用水(10mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到标题化合物(578mg，100％收率)。ESI-MSm/z C22H13F5N3O8[M+H]+计算值542.05，实测值542.05。
实施例429.化合物393的合成
在0℃下，向化合物149(0.91g，1.28mmol)和化合物392(578mg，1.07mmol)的DMF(8mL)溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(373μL，2.14mmol)。将混合物升温至室温。搅拌1小时，然后用二氯甲烷(50mL)稀释，用水(20mL)、2N盐酸(20mL)和水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，通过硅胶柱层析(100：1至10：1二氯甲烷/甲醇)纯化得到标题化合物(0.60g，55％收率)。ESI-MS m/z：C49H77N6O20[M+H]+计算值：1069.51，实测值1069.51。
实施例430.化合物394的合成
将化合物393(0.60g，0.56mmol)溶解于TFA(3mL)和二氯甲烷(3mL)中并在室温下搅拌2小时。将反应混合物浓缩并与甲苯共沸蒸发两次，将残余物置于真空泵上，得到标题化合物(0.32g，57％收率)。ESIMS m/z C45H69N6O20[M+H]+计算值：1013.45，实测值1013.45。
实施例431.化合物395的合成
/>
向化合物394(0.20g，0.197mmol)和(R)-5-(3-氨基-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸叔丁酯(90mg，0.237mmol)的溶液的二氯甲烷(10mL)中加入EDC·HCl(76mg，0.394mmol)。将混合物搅拌1小时，然后用二氯甲烷(50mL)稀释并用水(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并在硅胶柱上纯化，用甲醇/二氯甲烷(1：10)洗脱，得到化合物395(150mg，56％收率)。ESI-MS m/z：C65H99N8O24[M+H]+计算值：1375.67，实测值1375.67。
实施例432.化合物396的合成
将化合物395(0.60g，0.044mmol)溶解于TFA(3mL)和二氯甲烷(3mL)中并在室温下搅拌2小时。将反应混合物浓缩并与甲苯共沸蒸发两次，将残余物置于真空泵上，得到标题化合物(53mg，100％收率)。ESI-MS m/z：计算值C56H83N8O22[M+H]+：1219.55，实测值1219.55。
实施例433.化合物397的合成
化合物396(53mg，0.044mmol)和五氟苯酚基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-的溶液将4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十一烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(30mg，0.044mmol)溶解于DMF(3mL)中并在冰水浴上冷却，加入N，N-二异丙基乙胺(30μL，0.176mmol)。然后将反应在室温下搅拌1小时并通过制备型C-18HPLC(10-60％乙腈/水，含0.1％甲酸)纯化。合并含有产物的组分，浓缩并冻干，得到无色泡沫(35mg，46％收率)。ESI-MS m/zC81H123N12O27S[M+H]+计算值：1727.83，实测值：1727.83。
实施例434.化合物398的合成
向(S)-37-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-31，38，41-三氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十二氧杂-32，39，42-三氮杂四十六烷-46-酸(0.30g，0.30mmol)和(R)-5-(3-氨基-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-戊酸叔丁基酯(0.12g，0.40mmol)的二氯甲烷(20mL)中加入EDC(0.96g，0.50mmol)。将混合物搅拌2小时，用水和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到标题化合物(0.60g，100％收率)。ESI m/z C61H101N7O22[M+H]+计算值：1285.51，实测值：1284.97。
实施例435.化合物399的合成
在室温下，化合物398(0.51g，0.40mmol)的二氯甲烷(10mL)与甲酸(5mL)反应1小时，然后通过反相HPLC(C18柱，10-80％乙腈/水，40min，v＝8mL/min)浓缩纯化，得到标题化合物(0.21g，48％收率)。ESI-MS m/z C52H85N7O20[M+H]+计算值：1129.28，实测值：1128.85。
实施例436.化合物400的合成
在0℃，向五氟苯酚基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十一烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(0.13g，0.19mmol)和化合物399(0.21g，0.19mmol)的DMF(5mL)中加入N，N-二异丙基乙胺(74mg，0.57mmol)。将反应在0℃搅拌1小时，室温搅拌1小时，高真空浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，得到标题化合物(54mg，17％收率)。ESIMS m/zC77H125N11O25S[M+H]+计算值1637.96，实测值1638.40。
实施例437.化合物401a/b的合成
向2，5-二氧代吡咯烷-1-基(S)-(37-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-31，38-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十二氧杂-32，39-三氮杂四十三烷-43-酰基)甘氨酸酯(1.00g，0.98mmol)和叔丁基(R)-5-(3-氨基-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯(0.315g，0.98mmol)或(2S，4R)
-叔丁基5-(3-氨基-4-羟基苯基))-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸酯(0.386g，0.98mmol)的四氢呋喃(15mL)溶液在60℃下加热过夜，然后浓缩，通过柱色谱法纯化(甲醇/二氯甲烷1：10)得到化合物401a(0.75g，59％收率)。ESIMS m/z C61H101N7O22[M+H]+计算值：1283.70，实测值：1284.71；或401b(0.801g，63％收率)。ESIMS m/z C62H103N7O22[M+H]+计算值：1297.72，实测值：1298.85。
实施例438.化合物402a/b的合成
在室温下，化合物401a或401b(0.58mmol)的二氯甲烷(5mL)与TFA(3mL)反应0.5小时，用甲苯稀释，然后浓缩，用油泵干燥，得到标题化合物402a或402b，为黄色油状物(～99％收率)，其无需进一步纯化即可用于下一步。ESI-MS m/zC52H85N7O20[M+H]+计算值：1127.58，实测值：1128.60；402b，ESI-MS m/zC53H87N7O20[M+H]+计算值：1141.59，实测值：1141.61。
实施例439.化合物403a/b的合成
在0℃，向五氟苯酚基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(0.32g，0.47mmol)和化合物402a或402b(0.47mmol)的DMF(5mL)中加入N，N-二异丙基乙胺(120mg，0.94mmoL)。将反应在室温下搅拌1小时，高真空浓缩，溶于少量水，然后通过prep-HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，得到化合物403a或403b(42％～65％收率)。ESIMS m/zC77H125N11O25S[M+H]+计算值1635.86，实测值1636.87；403b ESIMS m/z C78H127N11O25S[M+H]+计算值1649.87，实测值1650.89。
实施例440.化合物的合成404
向2，5-二氧代吡咯烷-1-基(S)-37-(2-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)乙酰胺基)-31，38-二氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26，29-十二氧杂-32，39-二氮杂四十三烷-43-酯(1.56g，1.64mmol)和化合物311(0.67g，1.97mmol)的四氢呋喃(20mL)溶液在60℃下加热过夜，然后浓缩，通过柱色谱法纯化(甲醇/二氯甲烷1：10)，得到标题化合物(1.72g，84％收率)。ESIMS m/zC58H95N7O22[M+H]+计算值：1243.43，实测值：1242.65。
实施例441.化合物405的合成
在室温下，化合物404(1.72g，1.38mmol)的二氯甲烷(10mL)与TFA(5mL)反应0.5h，然后浓缩，得到标题化合物，为黄色油状物(0.62g，>100％收率)。ESI-MS m/z C53H87N7O20[M+H]+计算值：1143.31，实测值：1142.60。
实施例442.化合物的合成406
在0℃，向五氟苯酚基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13--12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(0.45，0.65mol)和上步所得的化合物405(0.57g，0.50mmol)的DMF(5mL)中加入N，N-二异丙基乙胺(260mg，2.0mmol)。将反应物在室温下搅拌1小时，高真空浓缩，溶于少量水，然后通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，得到标题化合物(0.28g，34％的收率)。ESIMS m/z C78H127N11O25S[M+H]+计算值1651.99，实测值1650.87。
实施例443.化合物407a/b/c/d/e/f的合成
在室温下，Boc保护的胺(7.0mmol)的二氯甲烷(10mL)与TFA(10mL)反应2小时浓缩，与甲苯共沸蒸发，分别得到粗品407a、407b、407c、407d、407e或407f，直接用于下一步。
实施例444.化合物408a/b/c/d/e/f的合成
将化合物407a，407b，407c，407d，407e或407f(7.0mmol)分别和五氟苯酚基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧杂-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(5.2g，7.5mmol)溶解于DMA(20mL).然后加入N，N-二异丙基乙胺(4.8mL，28mmol)。将所得混合物在室温搅拌3小时。真空除去溶剂后，将残余物在制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)上纯化，分别得到标题产物408a、408b、408c、408d、408e或408f。408a：9.26g，83％收率，MS ESI m/z C76H124N10O24S[M+H]+计算值：1593.85，实测值：1594.06；408b：9.32g，86％收率，MS ESI m/z计算值C74H120N10O23S[M+H]+：1549.82，实测值：1549.74；408c：8.76g，84％收率，MS ESI m/z C71H114N10O22S[M+H]+计算值：1491.78，实测值：1491.87；408d：8.49g，79％收率，MS ESI m/zC73H118N10O23S[M+H]+计算值：1535.81，实测值：1535.93；408e：8.73g，78％收率，MS ESI m/z计算值C75H122N10O24S[M+H]+：1579.84，实测值：1579.92；408f：8.27g，80％收率，MS ESI m/z计算值C70H112N10O22S[M+H]+：1477.77实测值：1476.82。
实施例445.化合物409a/b/c的合成
在室温下，Boc保护的胺(5.0mmol)的二氯甲烷(5mL)与TFA(5mL)反应2小时后浓缩，与甲苯共沸蒸发得到粗品409a、409b或409c，直接用于下一步。
实施例446.化合物410a/b/c的合成
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化合物409a、409b或409c(1.0mmol)分别和五氟苯酚基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-将4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(4.98g，1.2mmol)溶解于DMF(10mL)中。然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.86mL，5.0mmol)。将所得混合物在室温搅3小时。真空除去溶剂后，将残余物在制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)上纯化，分别得到标题产物410a、410b或410c。410a：1.25g，82％收率，MS ESI m/z C73H120N10O22S[M+H]+计算值：1521.83，实测值：1522.54；410b：1.38g，88％收率，MS ESI m/zC75H124N10O23S[M+H]+计算值：1565.86，实测值：1566.58；410c：1.20g，83％收率，MS ESI m/z C69H112N10O21S[M+H]+计算值：1449.77实测值：1449.45。
实施例447.化合物411a/b/c/d/e/f的合成
在室温下，Boc保护的胺(7.0mmol)的二氯甲烷(20mL)与TFA(5mL)反应0.5h后浓缩，并与甲苯共沸蒸发，分别得到粗品411a、411b、411c、411d、411e或411f，直接用于下一步。
实施例448.化合物412a/412b/412c/412d/412e/412f.的合成
将化合物411a、411b、411c、411d、411e或411f(1.0mmol)分别和化合物五氟苯酚基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧杂-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯或五氟苯酚2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧杂-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)4-羧酸噻唑(1.2mmol)溶解于DMF(5mL)中。然后加入N，N-二异丙基乙胺(0.86mL，5mmol)。将所得混合物在室温搅拌3小时。真空除去溶剂后，将残余物在制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)上纯化，分别得到产物412a、412b、412c、412d、412e或412f。412a：1.27g，82％收率，MSESI m/z C73H117N11O23S[M+H]+计算值：1548.80实测值：1549.35；412b：1.68g，78％收率，MSESI m/z C102H174N12O36S[M+H]+计算值：2176.19实测值：2177.95；412c：1.61g，77％收率，MSESI m/z C99H169N12O34S[M+H]+计算值：2102.16实测值：2104.15；412d：1.17g，73％收率，MSESI m/z C76H124N11O24S[M+H]+计算值：1606.85实测值：1607.95；412e：1.20g，75％收率，MSESI m/z C76H124N11O24S[M+H]+计算值：1606.85实测值：1607.70；412f：1.19g，74％收率，MSESI m/z C76H124N11O24S[M+H]+计算值：1606.85实测值：1607.90。
实施例449.化合物413a/b/c/d的合成
将化合物411a、411b、411c、411d、411e或411f(1.0mmol)分别和五氟苯酚基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯或五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(1.15mmol)溶解在DMF(20mL)中。然后加入N，N-二异丙基乙胺(4.8mL，28mmol)。将所得混合物在室温下搅拌3小时。真空除去溶剂后，将残余物在制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)上纯化，分别得到产物413a、413b、413c、413d、413e或413f。413a：1.20g，78％收率，MS ESIm/z C72H117N11O22S[M+H]+计算值：1520.80实测值：1521.65；412b：1.33g，62％收率，MS ESIm/z C101H174N12O35S[M+H]+计算值：2148.19实测值：2149.95；412c：1.55g，74％收率，MS ESIm/z C98H169N12O33S[M+H]+计算值：2074.16实测值：2075.15；412d：1.14g，72％收率，MS ESIm/z C75H124N11O23S[M+H]+计算值：1578.85实测值：1579.90；412e：1.18g，75％收率，MS ESIm/z C75H124N11O23S[M+H]+计算值：1578.85实测值：1579.55；412f：1.16g，73％收率，MS ESIm/z C75H124N11O23S[M+H]+计算值：1578.85实测值：1579.75。
实施例450.化合物414a/b/c/d的合成
向酸(10.0mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.38g，12.0mmol)和EDC HCl(2.30g，12.0mmol)。将反应混合物在室温搅拌3小时，然后浓缩。将残余物上样至硅胶柱(50％-80％ PE/乙酸乙酯)上纯化，分别得到标题化合物414a、414b、414c或414d。414a：5.47g，88％收率，ESIMS m/z C29H45N5O8S[M+H]+计算值624.28，实测值624.58；414b：4.87g，82％收率，ESIMS m/zC28H45N5O7S[M+H]+计算值596.29，实测值596.25；414c：5.41g，85％收率，ESI MS m/z C30H47N5O8S[M+H]+计算值638.30，实测值638.85；414d：5.17g，85％收率，ESIMS m/z C29H47N5O7S[M+H]+计算值610.30，实测值610.56。
实施例451.化合物415a/b/c/d的合成
在室温下，将(2S，4R)-4-氨基-5-(4-(2-((2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)苯基)-2-甲基戊酸(457mg，1.0mmol)和化合物414a、414b、414c或414d(1.0mmol)分别在0.1M NaH2 PO4(10mL)和乙醇(10mL)中搅拌过夜，然后浓缩，用SiO2柱层析(5％-20％甲醇/二氯甲烷)纯化，分别得到标题化合物415a、415b、415c或415d。415a：733mg，76％收率，ESIMS m/zC49H72N7O11S[M+H]+计算值966.50，实测值966.50.415b：685mg，73％收率，ESI MS m/z C48H72N7O10S[M+H]+计算值938.50，实测值938.50；415c：713mg，72％收率，ESIMS m/z C50H74N7O11S[M+H]+计算值980.51，实测值980.55；415d：667mg，70％收率，ESIMS m/z C49H74N7O10S[M+H]+计算值952.52，实测值952.55。
实施例452.化合物416a/416b/416c/416d的合成
在室温下，将化合物415a、415b、415c或415d(0.20mmol)分别溶解于甲醇(20mL)加入Pd/C(10wt％，20mg)催化加氢(1atm H2)4小时。滤出催化剂，减压浓缩滤液，得到氨基中间体化合物(97％-102％收率)，为棕色泡沫状固体，其无需进一步纯化直接用于下一步。
向制备的氨基化合物和五氟苯基酯(0.23mmol)的DMF(8mL)中中加入Et3N(0.17mL，1.2mmol)。混合物在室温下搅拌6h，高真空浓缩，溶于少量水，在制备HPLC纯化(C-18柱，10-90％乙腈/水)。合并含有产物的组分，浓缩并冻干，分别得到标题化合物416a、416b、416c或416d。416a：197mg，61％收率(two steps)，ESIMS m/z C77H126N11O24S[M+H]+计算值1620.8699，实测值1620.8810；416b：189mg，59％收率(两步)，ESIMS m/z C76H126N11O23S[M+H]+计算值1592.8750，实测值1592.8845；416c：209.1mg，64％收率，ESIMS m/zC78H128N11O24S[M+H]+计算值1634.8855，实测值1634.8980；416d：196mg，61％收率(两步)，ESIMS m/zC77H128N11O23S[M+H]+计算值1606.8906，实测值1606.9035。
实施例453.化合物417a/b的合成
向酸(10.0mmol)的二氯甲烷(40mL)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.38g，12.0mmol)和EDC HCl(2.30g，12.0mmol)。将反应混合物在室温搅拌3h，然后浓缩。将残余物在硅胶柱上(50％-80％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到标题化合物417a或417b。417a：4.60g，86％收率，ESIMS m/z C23H32N6O7S[M+H]+计算值537.19，实测值537.88；417b：4.56g，90％收率，ESIMS m/z C22H32N6O6S[M+H]+计算值509.19，实测值509.56。
实施例454.化合物418a/b的合成
将(2S，4R)-4-氨基-5-(4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(1.78g，8.0mmol)和化合物417a或417b(8.0mmol)的0.1M NaH2PO4(10mL)和乙醇(10mL)混合物和在室温下搅拌过夜，然后浓缩，通过柱色谱法(50％乙酸乙酯/石油醚，0-5％甲醇/二氯甲烷)纯化，得到标题化合物418a或418b。418a：4.13g，80％收率，ESIMS m/z C31H44N6O7S[M+H]+计算值645.30，实测值645.96；418b：4.34g，88％收率，ESI MS m/z C30H44N6O6S[M+H]+计算值617.30，实测值617.52。
实施例455.化合物419a/b的合成
将化合物418a或418b(6.0mol)溶解于甲醇(10mL)中，加入Pd/C(10mg，5wt％)，并将混合物在氢气球(1atm H2)下搅拌过夜，然后过滤。将滤液浓缩得到标题产物(假设100％收率)，无需进一步纯化，可用于下一步。
实施例456.化合物420a/b的合成
将化合物(S)-N-(6-((3-氨基丙基)氨基)-5-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-6-氧代六基)-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂二十八烷-28-酰胺(15.8g，20mmol)，3，3，4-三甲基吗啉-2，6-二酮或3-异丙基-4-甲基吗啉-2，6-二酮(25mmol)的四氢呋喃(100mL)回流2.0h，冷却至室温并集中。通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化残余物，得到标题化合物420a或420b。420a：9.48g，50％收率，ESIMS m/zC43H76N6O17[M+H]+计算值949.53，实测值949.89；420b：11.8g，62％收率，ESIMS m/zC44H78N6O17[M+H]+计算值963.54，实测值963.52。
实施例457.化合物421a/b的合成
向化合物420a或420b(10.0mmol)的二氯甲烷(40mL)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(1.38g，12.0mmol)和EDC HCl(2.30g，12.0mmol)。将反应混合物在室温搅拌3小时，然后浓缩。将残余物在硅胶柱上(50％-80％乙酸乙酯/石油醚)纯化，得到标题化合物421a或421b。421a：9.31g，89％收率，ESIMS m/z C47H79N7O19[M+H]+计算值1046.54，实测值1046.98；421b：9.33g，88％收率，ESIMS m/z C48H81N7O19[M+H]+计算值1060.56，实测值1060.48。
实施例458.化合物422a/b/c/d的合成
将化合物421a或421b(1.00mmol)和化合物419a(0.50g，0.80mmol)或419b(0.47g，0.80mmol)的0.1M NaH2PO4(1.0mL)和乙醇(1.0mL)中的混合物在室温下搅拌过夜，然后浓缩，溶于水并通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，得到标题化合物422a、422b、422c或422d。422a(R6＝Ac)：1.05g，85％收率，ESIMS m/z C74H120N10O23S[M+H]+计算值1549.82，实测值1551.33；422b(R6＝Me)：1.02g，82％收率，ESIMS m/z C73H120N10O22S[M+H]+计算值1521.83，实测值1522.33；422c(R6＝Ac)：0.94g，75％收率，ESIMS m/z C75H122N10O23S[M+H]+计算值1562.84，实测值1562.88；422d(R6＝Me)：0.76g，62％收率，ESIMS m/zC74H122N10O22S[M+H]+计算值1534.85，实测值1536.88。
实施例459.((34S，42S，44R)-34-(4-(2，5-二氧代2，5-二氢1H吡咯-1-基)丁酰胺基)-45-(4-羟基苯基)-42-甲基-28，35，41-三氧杂-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂-29，36，40-三氮杂四十四烷-44-基)氨基叔丁基酯(423)的合成
向(S)-N-(6-((3-氨基丙基)氨基)-5-(4-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酰胺基)-6-氧代六基)-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂二十八烷-28-酰胺(7.91g/，10.0mmol)的四氢呋喃/二氯甲烷(40/40mL)溶液中加入(2S，4R)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(4-羟基苯基)-2-甲基戊酸(3.88g，12.0mmol)和EDC HCl(2.30g，12.0mmol)。将反应混合物在室温搅拌3小时，然后浓缩。残余物经硅胶柱纯化(50％-80％乙酸乙酯/石油醚)，得到标题化合物(6.90g，63％收率)。ESIMS m/z C53H88N6O18[M+H]+计算值1097.62，实测值1098.52。
实施例460.N-((S)-6-((3-((2S，4R)-4-氨基-5-(4-羟基苯基)-2-甲基戊酰胺基)丙基)氨基)-5-(4-(2，5-二氧代2，5-二氢1H吡咯-1-基丁酰胺基)-6-氧代六基)-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂二十八烷-28-酰胺(424)的合成
在室温下，化合物423(0.88g，0.8mmol)的二氯甲烷(2.5mL)与TFA(2.5mL)反应2小时后浓缩，与甲苯共沸蒸发得到粗品424(假设收率100％)，直接用于下一步。
实施例461.化合物425a/b/c/d的合成
将化合物414a、414b、414c或414d(1.0mmol)和化合物424(0.80g，0.8mmol)的0.1MNaH2PO4(2.5mL)和乙醇(5mL)的混合物在室温下搅拌过夜，然后浓缩，溶于水并通过制备HPLC(C18柱，10-90％乙腈/水)纯化，得到标题化合物425a、425b、425c或425d。425a：1.02g，85％收率，ESIMS m/z C73H120N10O21S[M+H]+计算值1505.84，实测值1506.62；425b：0.93g，79％收率，ESIMS m/z C72H120N10O20S[M+H]+计算值1477.84，实测值1477.60；425c：0.85g，70％收率，ESIMS m/zC74H122N10O21S[M+H]+计算值1519.85，实测值1520.20；425d：0.85g，71％收率，ESIMS m/z C73H122N10O20S[M+H]+计算值1491.86，实测值1491.80。
实施例462.(4R，4'R)-二叔丁基5，5'-((((11S，19S，20S，28S)-19，20-双(2，5-二氧代2，5-二氢1H吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38-二酰基)双(氮杂二基))双(4-羟基-3，1-亚苯基))双(4-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸酯)(426)的合成
向化合物207(1.001g，0.520mmol)和(R)-5-(3-氨基-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸叔丁酯(0.401g，1.054mmol)的DMA(40mL)中加入EDC(0.701g，3.651mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.20mL，1.15mmol)。将混合物搅拌8小时，减压浓缩并通过硅胶柱色谱法纯化，使用梯度为5-15％甲醇/二氯甲烷的溶液，得到标题产物(1.033g，75％收率)。MSESI m/z计算值C122H197N18O46[M+H]+2650.3630，实测值2650.3820。
实施例463.(4R，4'R)-5，5'-((((11S，19S，20S，28S)-19，20-双(2，5-二氧代2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38-二酰基)双(氮杂二基))双(4-羟基-3，1-亚苯基))双(4-氨基戊酸)(427)的合成
在室温下，化合物426(1.00g，0.377mmol)的二恶烷(10mL)与浓盐酸(3mL)反应0.5h，用甲苯和二恶烷(10/10ml)稀释并浓缩，得到标题化合物，为黄色油状物(0.891g，>100％收率)。ESI-MS m/z C104H165N18O42[M+H]+计算值：2338.1330，实测值：2318.1560；C104H166N18O42[M+2H]2+：1169.5704，实测值：1169.5785。
实施例464.化合物428a，428b，428c和428d的合成
将化合物427(200mg，0.0856mmol)和五氟苯基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧杂-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(120mg，0.173mmol)，五氟苯基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂-11-基)噻唑-4-羧酸酯(120mg，0.180mmol)，五氟苯酚基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧杂-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(126mg，0.178mmol)，五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十三烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(122mg，0.180mmol)分别溶解于DMA(10mL)中。然后将N，N-二异丙基乙胺(0.1mL，0.575mmol)加入到每个反应中。将所得混合物在室温搅拌3小时。真空除去溶剂后，将残余物在制备HPLC上纯化(C18柱，10-60％乙腈/水，50min，d 20x 250mm，v＝10ml/min)，得到标题产物428a，分别为428b、428c和428d。428a：192.3mg，67％收率，MS ESI m/zC154H245N26O52S2[M+H]+计算值：3354.6768，实测值：3354.6915；428b：193.6mg，69％收率，MS ESI m/z C152H245N26O50S2[M+H]+计算值：3298.6870，实测值：3298.7025；428c：188.6mg，65％收率，MS ESI m/z C156H249N26O52S2[M+H]+计算值：3382.7081，实测值：3382.7140；428d：199.3mg，69％收率，MS ESI m/zC154H249N26O50S2[M+H]+计算值：3326.7183，实测值：3326.7980。
实施例465.(2S，2'S，4R，4'R)-二叔丁基5，5'-((((11S，19S，20S，28S)-19，20-双(2，5-二氧代2，5-二氢1H吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38-二酰基)双(氮杂二基))双(4-羟基-3，1-亚苯基))双(4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸酯)(429)的合成
向化合物207(1.051g，0.546mmol)和(2S，4R)-5-(3-氨基-4-羟基苯基)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基戊酸叔丁酯(0.451g，1.143mmol)的DMA(40mL)中加入EDC(0.851g，4.432mmol)和N，N-二异丙基乙胺(0.30mL，1.725mmol)。将混合物搅拌8小时，减压浓缩并通过硅胶柱色谱法纯化，5-15％甲醇/二氯甲烷梯度梯度洗脱，得到标题产物(1.155g，79％收率)。MS ESI m/z C124H201N18O46[M+H]+计算值2678.3943，实测值2678.4025。
实施例466.(2S，2'S，4R，4'R)-5，5'-((((11S，19S，20S，28S)-19，20-双(2，5-二氧代2，5-二氢1H-吡咯-1-基)-4，7，10，13，18，21，26，29，32，35-十氧代-11，28-双(28-氧代-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧杂29-氮杂三十三烷-33-基)-3，6，9，12，17，22，27，30，33，36-十氮杂三十八烷-1，38-二酰基)双(氮杂二基))双(4-羟基-3，1-亚苯基))双(4-氨基-2-甲基戊酸)(430)的合成
在室温下，化合物429(1.03g，0.384mmol)的二恶烷(10mL)与盐酸(浓3mL)反应0.5h，用甲苯和二恶烷(10/10ml)稀释并浓缩，得到标题化合物，为黄色油状物(0.911g，>100％收率)。ESI-MS m/z C106H169N18O42[M+H]+计算值：2366.1642，实测值：2366.1795；C106H170N18O42[M+2H]2+：1183.5861，实测值：1183.5970。
实施例467.化合物431a，431b，431c和431d的合成
将化合物429(210mg，0.0887mmol)和五氟苯基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7，13-三氧杂-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(130mg，0.187mmol)，五氟苯基2-((6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-9-异丙基-2，3，3，8-四甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂-11-基)噻唑-4-羧酸酯(128mg，0.192mmol)，五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7，13-三氧杂-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十四烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(135mg，0.191mmol)，五氟苯基2-((3S，6S，9R，11R)-6-((S)-仲丁基)-3，9-二异丙基-2，8-二甲基-4，7-二氧代-12-氧杂-2，5，8-三氮杂十三烷-11-基)噻唑-4-羧酸酯(131mg，0.193mmol)分别溶解于DMA(10mL)中。然后将N，N-二异丙基乙胺(0.1mL，0.575mmol)加入到每个反应中。将所得混合物在室温搅拌3小时。真空除去溶剂后，将残余物在制备HPLC上纯化(C18柱，10-60％乙腈/水，50min，d 20x 250mm，v＝10ml/min)，得到标题产物431a，分别为431b、431c和431d。431a：210.2mg，70％收率，MS ESI m/zC156H249N26O52S2[M+H]+计算值：3382.7081，实测值：3382.7210；431b：207.7mg，69％收率，MS ESI m/z C154H249N26O50S2[M+H]+计算值：3326.7183，实测值：3326.7320；431c：206.3mg，68％收率，MS ESI m/z C158H253N26O52S2[M+H]+计算值：3410.7394，实测值：3410.7515；431d：211.5mg，71％收率，MS ESI m/zC156H253N26O50S2[M+H]+计算值：3354.7496，实测值：3354.7665。
实施例468.偶联反应
将锌氨基络合物(在10-60mM中，使用1.0-5.0eq.的抗体)和TCEP(在100mM中，使用2.5-4.5eq.的抗体)依次加入到含有抗体的溶液中(例如BCMA、Her2、EGFR、CD33、Trop2、Steap1、CD56、PSMA和Her3抗体的10-30mg/mL，20mM pH 5.5–7.5PBS缓冲液，2-8℃)。在2-8℃孵育12-16小时(过夜)后，引入有效载荷/连接子复合物(100-200mM，2.0-8.0eq.所用抗体)并在2-8℃再孵育2-4小时。孵育后，加入半胱氨酸(100-200mM，4.0-8.0eq.的抗体)以去除多余的TCEP，加入半胱氨酸(100-200mM，2.0-6.0eq.的抗体)以去除多余的有效载荷，加入EDTA(100-200mM，4.0–6.0eq.的抗体)以收集锌，并加入DHAA(100-200mM，8.0–30.0eq.的抗体)以氧化游离巯基蛋白质中的基团。最后使用脱盐柱(Zeba Spin Desalting Columns，40K MWCO)或UF/DF，或离子交换层析纯化反应混合物，并使用HIC-HPLC或HPLC-MS分析药物/抗体比(DAR)。HIC-HPLC结果如表1和表2所示。
实施例469.DAR分析
DAR采用HIC-HPLC分析，HPLC参数如下：
表1.BCMA-ADC(C-408b)的药物分布通过HIC-HPLC分析，偶联条件是在3.6当量的TCEP与不同当量的锌络合物，pH 7.2，4℃，偶联时间13-16小时：
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表2.BCMA-ADC(C-408b)的药物分布通过HIC-HPLC分析，偶联条件是在3.0-4.0当量的TCEP，2.2或2.4当量的Z-11，Z-16，Z-21，Z-28和Z-32，6.0当量的化合物408b，pH 7.0，4℃，偶联时间15小时：
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实施例470.偶联物制剂的一般偶联方法
在每种偶联物80mg的液体制剂中(使用BCMA、Her2、EGFR、CD33、Trop2、Steap1、CD56、PSMA和Her3抗体)：C-009、C-020、C-025、C-027、C-031、C-037、C-038、C-039、C-043、C-046、C-052、C-056、C-059、C-063、C-066、C-071、C-079、C-084、C-087、C-093、C-096、C-102、C-109、C-111、C-118、C-123、C-133、C-143、C-155、C-168、C-172、C-182、C-186、C-198、C-203、C-208、C-214、C-215、C-216、C-217、C-218、C-226、C-227、C-231、C-237、C-249、C-259、C-260、C-261、C-325、C-326、C-327、C-328、C-329、C-330、C331、C-332、C-333、C-334、C-335、C-353、C-363、C-371、C-378、C-379、C-380、C-381、C-384、C-385、C-386、C-387、C-397、C-400、C-403a、C-403b、C-406、C-408a、C-408b、C-408c、C-408d、C-408e、C-408f、C-410a、C-410b、C-410c、C-412a、C-412b、C-412c、C-412d、C-412e、C-412f、C-413a、C-413b、C-413c、C-413d、C-413e、C-413f、C-416a、C-416b、C-416c、C-416d、C-422a、C-422b、C-422c、C-422d、C-425a、C-425b、C-425c、C-425d、C-428a、C-428b、C-428c、C-428d、C-431a、C-431b、C-431c、C-431d，在含有240mg蔗糖，0.8mg聚山梨酯-80，10mL硼硅酸盐小瓶中，用24mg柠檬酸钠的4mL无菌水用柠檬酸将其调节至pH 6.0。然后将每种络合物溶液在-65℃至0℃然后至室温温度下冻干，并在减压(5～10torr)，得到干燥滤饼。将滤饼络合物储存在2～8℃，然后用4mL无菌水重新配制以备进一步使用。
实施例471.偶联物的体外细胞毒性评价(使用BCMA、Her2、EGFR、Trop2、Steap1、CD56、PSMA和Her3抗体)：C-009、C-020、C-025、C-027、C-031、C-037、C-038、C-039、C-043、C-046、C-052、C-056、C-059、C-063、C-066、C-071、C-079、C-084、C-087、C-093、C-096、C-102、C-109、C-111、C-118、C-123、C-133、C-143、C-155、C-168、C-172、C-182、C-186、C-198、C-203、C-208、C-214、C-215、C-216、C-217、C-218、C-226、C-227、C-231、C-237、C-249、C-259、C-260、C-261、C-325、C-326、C-327、C-328、C-329、C-330、C331、C-332、C-333、C-334、C-335、C-353、C-363、C-371、C-378、C-379、C-380、C-381、C-384、C-385、C-386、C-387、C-397、C-400、C-403a、C-403b、C-406、C-408a、C-408b、C-408c、C-408d、C-408e、C-408f、C-410a、C-410b、C-410c、C-412a、C-412b、C-412c、C-412d、C-412e、C-412f、C-413a、C-413b、C-413c、C-413d、C-413e、C-413f、C-416a、C-416b、C-416c、C-416d、C-422a、C-422b、C-422c、C-422d、C-425a、C-425b、C-425c、C-425d、C-428a、C-428b、C-428c、C-428d、C-431a、C-431b、C-431c、C-431d，与紫杉醇相比。为了评估her2-ADC，选择T-DM1进行比较。
细胞毒性试验中使用的细胞系是(1).骨髓瘤(+)细胞、NCI-H929、MM1S来源于ATCC，8226-2A1细胞为ATCC RPMI-8226经培养、克隆挑选得到的骨髓瘤抗原表达细胞；(2).EGFR(+)细胞：HCC-827为肺癌细胞，LN229、U87MG为人胶质瘤细胞系；(3).MUC-1(+)细胞：Colo205为结肠癌细胞株；(4).Trop2(+)细胞：MDA-MB-468细胞为人三阴性乳腺癌细胞系，Calu-3为人肺腺癌或黏膜下腺细胞系；(5).Her2(+)细胞：BT-474为人乳腺癌细胞系，NCI-N87为人胃癌细胞系(NCI-N87细胞也表达Trop2抗原)；SK-OV-3是人卵巢癌细胞系，A431是人上皮癌细胞系。根据提供者手册培养细胞，例如，在RPMI-1640培养基中用10％胎牛血清培养N87细胞。测定时，将细胞(180μl，6000个细胞)加入到96孔板中的每个孔中，并在37℃和5％ CO2下温育24小时。接下来，在适当的细胞培养基里，用不同浓度的测试化合物(20μL)处理细胞(总体积，0.2mL)。对照孔含有细胞和培养基但无测试化合物。将孔板在37℃和5％CO2下温育120小时，然后向孔中加入MTT(5mg/mL)(20μL)，并将孔板在37℃下孵育1.5小时。小心去除培养基，然后加入DMSO(180μL)，振荡15分钟，在490nm和570nm处测量吸光度，620nm为参考。依照以下公式计算抑制率：抑制率％＝[1-(分析值-空白对照值)/(控制值-空白对照值)]×100。表4列出了BCMA-ADC的MTT结果。
表3.本专利申请的ADC偶联物的结构：
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表4，BCMA抗体偶联物，NCI-H929、MM1S、8226-2A1肿瘤细胞的MTT测定，15000个细胞，96小时孵育：
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实施例472.体内抗肿瘤活性(独立地携带HCC-827，NCI-N87，NCI-H929，BT-474，SK-OV-3，OE-19，Calu-3，HCT-116，Mz-ChA-1，UCC异种移植肿瘤BALB/c裸鼠)。
在人肺腺癌HCC-827细胞系肿瘤异种移植模型中评估了EGFR偶联物C-031、C-038、C-066、C-071、C-093、C-111、C-118、C-208、C-214和C-216的体内疗效。在人胃癌N-87细胞系肿瘤异种移植模型和人多发性骨髓瘤NCI-H929细胞系肿瘤异种移植模型评估了Trop2偶联物C-227、C-403a、C-403b、C-408b、C-412e、C-412f、C-428c、和C-431c。在人多发性骨髓瘤NCI-H929细胞系肿瘤异种移植模型评估了BCMA偶联物C-227,C-403a,C-403b,C-408b,C-412e,C-412f,C-428c,和C-431a。将5周龄雌性BALB/c裸鼠(每组6只动物)在右肩下区域皮下接种0.1-0.2ml无血清培养基中的相应癌细胞(5×10 6个细胞/小鼠)。肿瘤生长6-8天至平均大小150mm3，或8-9天至平均大小18mm3。然后将动物随机分成不同组(每组6只动物)。
第一组小鼠作为对照组，注射磷酸缓冲盐水(PBS)载体。其他组用偶联物静脉注射，剂量6mg/Kg。每3或4天(每周两次)测量肿瘤的三维尺寸，并使用公式：肿瘤体积＝1/2(长×宽×高)计算肿瘤体积。同时还测量动物的体重。当满足以下任何一个标准时，处死小鼠：(1)体重减少超过处理前体重的20％，(2)肿瘤体积大于1500mm 3，(3)病情严重无法进食和水，或(4)皮肤坏死。如果肿瘤无法被感知，则认为小鼠是无肿瘤的。
结果绘制在图25-27中。所有偶联物在6.0mg/Kg的剂量下不引起动物体重减轻。与PBS缓冲液相比，所有偶联物均显示出抗肿瘤活性。
实施例473.通过UPLC-MS分析DAR和偶联位点：
DAR测量：ADC的还原(5mM二硫苏糖醇在37℃下约2小时)，然后进行去糖基化步骤(快速PNGase F在50℃下约15分钟)可以产生六个片段，如图2-4所示。HC和LC存在作为裸露或偶联形式，最多可承载3个有效载荷。使用Acquity UPLC(Waters)，BEH 300C41.7μm2.1×50mm柱与Xevo G2XS Q-TOF质谱仪(Waters)联联，用MS检测对这些片段进行色谱分离。使用流动相B(具有0.1％FA的ACN)的线性梯度从5％至85％在4分钟内以0.25ul/min的流速进行色谱分离。使用MassLynx软件进行数据采集，并使用500Da至4000Da的质量采集范围。使用UNIFI软件(Waters)进行数据分析。以下等式用于常规偶联ADC的平均DAR计算。
平均DAR＝L1/(L0+L1)*2+H1/(H0+H1+H2+H3)*2+H2/(H0+H1+H2+H3)*2+H3/(H0+H1+H2+H3)*2
偶联位点：将ADC样品变性并还原(6M尿素，10mM二硫苏糖醇，56℃约40分钟)，烷基化(约30mM碘乙酰胺，室温黑暗中40分钟)，用50mM NH4HCO3稀释并用胰蛋白酶消化。(1/50酶/底物重量比，4小时，37℃)。使用Acquity UPLC(Waters)，使用BEH C181.7μm2.1×100mm柱与Xevo G2XS Q-TOF质谱仪(Waters)偶联，用MS检测进行肽的色谱分离。使用流动相B(含有0.1％FA的ACN)的线性梯度从1％到40％在95分钟内以0.2ul/min的流速进行色谱分离。使用MassLynx软件进行数据采集，并使用质量采集范围从100Da到2500Da。使用UNIFI软件(Waters)进行数据分析。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.均一偶联的过程包括以下步骤：
(a)在包含有效量的过渡金属阳离子-氨基螯合物和还原剂存在的水基缓冲系统中孵育抗体或类抗体蛋白，选择性地还原抗体或类抗体蛋白的链间二硫键，产生巯基；
(b)加入有效量的带有巯基反应基团的连接子或药物/连接子复合物，与步骤(a)产生的巯基反应；
(c)任选地加入有效量的氧化剂以重新氧化未反应的巯基；且
(d)纯化所得偶联物；
其中任选的步骤(c)可替换为以下步骤：加入有效量的胱氨酸或相关二硫化物化合物以淬灭未反应的还原剂，同时胱氨酸或二硫化物化合物被还原产生半胱氨酸或巯基化合物以淬灭过量的偶联连接子或含有巯基反应性基团的药物/连接子复合物，或可加入有效量的半胱氨酸或相关巯基化合物以淬灭过量的连接子或连接子/有效载荷复合物分子；
其中过渡金属阳离子-氨基螯合物/络合物具有下式M(NR1R2R3)m1 m2+，其中M是Zn2+、Cu2+、Fe2+、Cd2+、Ni2+、Cr2+、Cr3+、Ti2+、Ti3+、Co2+、Mn2+、Mn3+、Ag+、或Hg2+；其中R1、R2和R3独立地选自C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、或杂环烷基；C3-C8的芳基、Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基或杂芳基；m1是1、2、3、4、5、6、7或8；m2是1、2、3、4、5、或6；或N、R1、R2和/或R3本身可以形成杂环、碳环、二杂环或二碳环；且(NR1R2R3)m1可以形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体，这些聚合物在N、R1、R2和/或R3之间共价连接；步骤(a)中使用的过渡金属阳离子-氨基螯合物/络合物M(NR1R2R3)m1 m2+的浓度为0.01mM-1.0mM，或0.5-20蛋白质摩尔当量；
其中还原剂是有机膦，用量为1.0-20蛋白质摩尔当量；
其中步骤(c)中的氧化剂是DHAA、Fe3+、I2、Cu2+、Mn3+、MnO2、或Fe3+/I-的混合物，步骤(c)的反应溶液中使用的氧化剂浓度为0.02mM–1.0mM，或1-100的蛋白质摩尔当量；
其中步骤(b)偶联反应的pH在约5.0至8.0之间；
其中步骤(a)的反应溶液包含入最多30％可与水混合(混溶)的有机溶剂，选自DMA、DMF、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、异丙醇、二恶烷、丙二醇或乙二醇均可作为共溶剂加入水基缓冲溶液中；
其中步骤(b)的偶联反应的温度在约-5℃至40℃之间；步骤(b)的反应时间在约15分钟至约48小时之间；
其中通过在Sephadex G25或Sephacryl S300柱凝胶过滤、吸附色谱、离子(阳离子或阴离子)交换色谱或通过透析(超滤或超过滤(UF)和/或渗滤(DF))来纯化所得偶联物；
其中偶联物的药物/类抗体蛋白(抗体)比率(DAR)通过波长范围为240-380nm的UV、疏水相互作用色谱(HIC-HPLC)、毛细管电泳(CE)、LC-MS、CE-MS或LC-MS/MS来测量。
2.根据权利要求1的方法，其中过渡金属阳离子-氨基螯合物选自Zn(NH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH2CH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH(CH3)2)2 2+、Zn(NH2C(CH3)3)2 2+、Zn(NH2CH2C(CH3)3)2 2+、Zn(NH(CH3)2)2 2+、Zn(NH(CH2CH3)2)2 2+、Zn(NH(CH(CH3)2)2)2 2+、Zn(NH(C(CH3)3)2)2 2+、Zn(NH(CH(CH2CH3)2)2)2 2+、Zn(NH(CH2C(CH3)3)2)2 2+、Zn(NH(CH2C(CH2CH3)3)2)2 2+、Zn(NH(CH2CH2C(CH3)3)2)2 2+、Zn(NH2CH2CH2OH)2 2+、Zn(NH(CH2CH2OH)2)2 2+、Zn(N(CH2CH2OH)3)2 2+、Zn(NH2CH2COOH)2 2+、Zn(NH2CH2CONH2)2 2+、Zn(NH2CH2COOCH3)2 2+、Zn(NH2CH2COOCH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH2COOC(CH3)3)2 2+、Zn(NH2CH2COOCH(CH3)2)2 2+、Zn(NH2CH2CH2COOH)2 2+、Zn(NH(CH2COOH)2)2 2+、Zn(N(CH2CH2COOH)3)2 2+、Zn(NH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH2CH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH(CH3)2)4 2+、Zn(NH2C(CH3)3)4 2+、Zn(NH2CH2C(CH3)3)4 2+、Zn(NH(CH3)2)4 2+、Zn(NH(CH2CH3)2)4 2+、Zn(NH(CH(CH3)2)2)4 2+、Zn(NH(C(CH3)3)2)4 2+、Zn(NH(CH(CH2CH3)2)2)4 2+、Zn(NH(CH2C(CH3)3)2)4 2+、Zn(NH(CH2C(CH2CH3)3)2)4 2+、Zn(NH(CH2CH2C(CH3)3)2)4 2+、Zn(NH2CH2CH2OH)4 2+、Zn(NH(CH2CH2OH)2)4 2+、Zn(N(CH2CH2OH)3)4 2+、Zn(NH2CH2COOH)4 2+、Zn(NH2CH2CONH2)4 2+、Zn(NH2CH2COOCH3)4 2+、Zn(NH2CH2COOCH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH2COOC(CH3)3)4 2+、Zn(NH2CH2COOCH(CH3)2)4 2+、Zn(NH2CH2CH2COOH)4 2+、Zn(NH(CH2COOH)2)4 2+、Zn(N(CH2CH2COOH)3)4 2+、
由任何上述阳离子与选自以下的阴离子Cl-、Br-、I-、SO4 2-、HSO4 -、NO3 -、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -、CO3 2-、HCO3 -、HCOO-、CH3COO-、F3CCOO-、Cl3CCOO-、FCH2COO-、ClCH2COO-、F2CHCOO-、Cl2CHCOO-、BF4 -、SO3 2-、HSO3 -、CH3SO3-、C6H5CH2SO3-、C6H5SO3-、C6H5COO-、C6H5CH2COO-、C6F5O-、C6H4(OH)COO-、C6H2F3O-、C6H4(NO2)O-、和C6H2(NO2)3O-形成的盐；
其中步骤(a)的反应溶液中将过渡金属阳离子-氨基络合物的浓度为0.5～20蛋白质摩尔当量，与水混溶性有机溶剂一起加入到反应溶液中，有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙醇、丙二醇、DMA、DMF、DMSO、THF或CH3CN。
3.根据权利要求1的方法，其中有机膦还原剂选自三(羟丙基)-膦(P(CH2CH2CH2OH)3)、P(CH2CH3)3、P(CH2CH2CH3)3、P(CH2CH2-CH2CH3)3、P(CH(CH3)2)3、P(CH2CH＝CH2)3、P(CH2CH2CN)3、P(CH(CH3)2)2(CH2CH2NH2)、P(CH2CH2CONH2)3、P(CH2CH2CONHCH3)3、P(CH2CH2CH2NHCOCH3)3、NaB(CN)H3、(C6H11)2P(CH2)4P(C6H11)2、(C6H11)2P(CH2)3P-(C6H11)2、二环己基(乙基)膦、双[2-(二叔丁基膦基)乙基]胺、三环己基膦、1，2-乙二基双[二环己基]-膦、双[2-(二环己基膦基)乙基]胺、三[2-(二苯基膦基)乙基]-膦([(C6H5)2PCH2CH2]3P)、三苯基膦、磺酰化三苯基膦(2-(二苯基膦基)苯磺酸(diPPBS)、3-(二苯基膦基)苯磺酸、4-(二苯基膦基)苯磺酸、3，3'，3”-膦三基三苯磺酸)；且步骤(A)的反应溶液中使用的还原剂是2.0-4.0蛋白质摩尔当量。
4.根据权利要求1的方法，其中缓冲系统包括PBS、Mes、Bis-Tris、Bis-Tris Propane、Pipes、Aces、Mopso、Bes、Mops、Hepes、Tes、Pipps、Dipso、Tapso、Heppso、Tris-up、Tris-HCl、Tricine、Hepps、Gly-Gly、Bicine、Taps、Hepee、Acetate、Histi-dine、Citrate、MES、Borate，或上述两种、三种或四种缓冲液组分的组合；缓冲液的pH为4.0-9.0；步骤(A)反应中缓冲液的浓度为0.02–1.0M。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述药物/连接子复合物结构式表示为(I)、(II)或(III)：
其中：Lv1和Lv2是巯基反应基团，独立地选自于：
卤代乙酰基；/>酰卤基；/>马来酰亚胺；单取代马来酰亚胺；/>二取代马来酰亚胺；/>单取代的琥珀酰亚胺；/>二取代琥珀酰亚胺；-CHO醛；/>乙烯磺酰基；/>丙烯酰基；/>2-(甲苯磺酰氧基)乙酰基；2-(甲磺酰氧基)乙酰基；/>2-(硝基苯酚基)乙酰基；/>2-(二硝基苯基)乙酰基；/>2-(氟代苯酚基)-乙酰基；/>2-(二氟苯酚基)-乙酰基；2-((三氟甲基磺酰基)氧基)乙酰基；/>苯乙烯，乙烯基吡啶，/>乙烯基吡嗪，/>乙烯基-1，3，5-三嗪，/>取代的甲磺酰基，/>2-(五氟苯氧基)乙酰基；甲基砜苯基恶二唑(ODA)；/>丙烯酰基，卤代丙烯酰基，/>丙炔酰基，/>2，3-二卤代丙烯酰基，/>芳基钯配合物，/>双(苯磺酰基)-马来酰亚胺，/>双卤代哒嗪二酮，/>双苯硫基哒嗪二酮，2-((甲基磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>2-((烷基或芳基-磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>氰乙炔基，/>乙炔基；/>炔基，/>亚芳基二丙腈(ADPN)，二乙烯基吡啶，/>二乙烯基吡嗪，二乙烯基三嗪，或/>3，4-双(马来酰亚胺)-2，5-二氧代吡咯烷，/>
其中X1’和X2’独立地为F、Cl、Br、I、OTf、OMs、OC6H4(NO2)、OC6H3(NO2)2、OC6F5、OC6HF4、或Lv3；X2是O、NH、N(R1)、或CH2；R3和R5独立地为H、R1、芳基团、杂芳香族或芳香族、其中一个或几个H原子独立地被-R1、-卤素、-OR1、-SR1、-NR1R2、-NO2、-S(O)R1、-S(O)2R1或-COOR1取代；Lv3和Lv3’独立地为离去基团，选自F、Cl、Br、I、硝基苯氧基、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、苯氧基、苯巯基、二硝基苯氧基、五氟苯氧基、四氟苯氧基、二氟苯氧基、单氟苯氧基、五氯苯酚、三氟甲磺酸酯、咪唑、二氯苯氧基、四氯苯氧基、1-羟基苯并三唑、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-乙基-5-苯基异恶唑-3′-磺酸酯，自身形成的酸酐，或与其他酸酐，例如乙酸酐、甲酸酐形成的酸酐；或使用缩合试剂生成的多肽偶联反应中间体或Mitsunobu反应的中间体；
在式(II)和式(III)中，其中独立地选自于：双取代马来酰亚胺；/>单取代琥珀酰亚胺；二取代琥珀酰亚胺/>双苯硫基马来酰亚胺，双卤代哒嗪二酮，/>双苯硫基哒嗪二酮，2-((甲基磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>((烷基或芳基磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>亚芳基二丙腈(ADPN)，or/>二乙烯基吡啶，/>二乙烯基吡嗪，二乙烯基三嗪，/>二乙烯基喹喔啉，3，4-双(马来酰亚胺)-2，5-二氧代吡咯烷，/> />
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其中Lv3，Lv3’，X1’和X2’如前文所述；两个原子中间的连接键“-”表示可以连接两个原子中的任何一个；
其中L1和L2是，相同或不同，独立地选自O、NH、S、NHNH、N(R3)、N(R3)N(R3’)、(OCH2CH2)pOR3、或(OCH2CH(CH3))pOR3、或NH(CH2CH2O)pR3、或NH(CH2CH(CH3)O)pR3、或N[(CH2CH2O)pR3][(CH2CH2O)p’R3’]、或(OCH2CH2)pCOOR3、或CH2CH2(OCH2CH2)pCOOR3的聚乙二醇单元，其中p和p’独立地选自0至约1000的整数；C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；其中R3和R3’独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；或1-8个碳原子的酯、醚或酰胺；或1～8个天然或非天然氨基酸；或结构式为(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙二醇单元，其中p是0至约1000的整数，或上述两个或更多组合；
其中L1或L2独立地可以含有自我毁灭或非自我毁灭的组分、肽单元、腙键、二硫化物、酯、肟、酰胺或硫醚键。自我毁灭单元包括是与对氨基芐基氨甲酰基(PAB)的电子结构相似的芳香化合物，选自2-氨基咪唑-5-甲醇的衍生物、杂环PAB类似物、β-葡糖醛酸苷、以及邻或对氨基芐基缩醛。
其中自我毁灭型连接子组分具有以下结构之一：
其中(*)是另外的间隔体或可断裂的连接子单元，或细胞毒剂、和/或细胞结合分子(CBA)的连接点；X1、Y1、Z2和Z3独立地为NH、O、或S；Z1独立地为H、NH、O或S；v是0或1；U1独立地为H、OH、C1-C6烷基、(OCH2CH2)nF、Cl、Br、I、OR5、SR5、NR5R5’、N＝NR5、N＝R5、NR5R5’、NO2、SOR5R5’、SO2R5、SO3R5、OSO3R5、PR5R5’、POR5R5’、PO2R5R5’、OPO(OR5)(OR5’)、或OCH2PO(OR5(OR5’)，其中R5和R5’如前文所定义；
其中非自我毁灭型连接子组分为以下结构之一：
/>
/>
其中(*)是另外的间隔体R1或可断裂的连接子单元、或细胞毒性分子和/或细胞结合分子的连接点；X1、Y1、U1、R5、R5’如前文所定义；r是0-100；m和n独立地为0-6；
其中L1或L2可独立地由一个或多个连接子组分构成：6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”或“af”)、对氨基芐氧基羰基(“PAB”)、4-硫代戊酰基(“SPP”)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1酰基(“MCC”)、(4-乙酰基)氨基苯酰基(“SIAB”)、4-硫丁酰基(SPDB)、4-硫-2-羟基磺酰基-丁酰基(2-Sulfo-SPDB)，或含有1-8个天然或非天然氨基酸单元的天然或非天然肽；
其中L1和L2独立地是可断裂连接子；
其中可断裂连接子(L1或L2)包括：
-(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-，-(Aa)r-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t-，-(CR5R6)m-(CR7＝CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(CO)(Aa)t-(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m-苯基-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-呋喃-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-恶唑-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-噻唑-CO(Aa)t(CCR7R8)n-，-(CR5R6)t-噻吩-CO(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-imidazolyl-CO-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-morpholino-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-N-甲基哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R)m-(Aa)t苯基-，-(CR5R6)m-(Aa)t呋喃-，-(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-噻唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-噻吩-(Aa)t-，-(CR5R6)m-咪唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-吗啉-(Aa)t-，-(CR5R6)m-哌嗪-(Aa)t-，-(CR5R6)m-N-甲基哌嗪-(Aa)t-，-K(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-K(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-，-K(Aa)r-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-K(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t-，-K(CR5R6)m-(CR7＝CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(CO)(Aa)t-(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K-(CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m-苯基-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K-(CR5R6)m-呋喃-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)m-恶唑-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R6)m-噻唑-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t-噻吩-CO(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t咪唑-CO-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t吗啉-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t-N-甲基哌嗪CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R)m(Aa)t苯基，-K-(CR5R6)m-(Aa)t呋喃-，-K(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-噻唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-噻吩-(Aa)t-，-K(CR5R6)m-咪唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-吗啉(Aa)t-，-K(CR5R6)m-哌嗪-(Aa)tG，-K(CR5R6)mN-甲基哌嗪(Aa)t-；其中m、Aa、m、n、R3、R4、和R5定义如前文所描述；t和r独立地为0–100；R6、R7、和R8独立地选自H、卤化物、C1～C8烷基、芳基、烯基、炔基、醚、酯、胺或酰胺，任选地被一种或多种卤化物，CN、NR1R2、CF3、OR1、Aryl、杂环、S(O)R1、SO2R1、-CO2H、-SO3H、-OR1、-CO2R1、-CONR1、-PO2R1R2、-PO3H或P(O)R1R2R3取代；K是NR1、-SS-、-C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-C＝NH-O-、-C＝N-NH-、-C(＝O)NH-NH-、O、S、Se、B或C3-C6杂芳基；
其中连接子L1和L2的组分的示例结构有：
(包含6-马来酰亚胺己酰基(MC))，/> ((MP)，马来酰亚胺丙酰基)，(p-对氨基芐氧基酰胺基(PAB))，/> />(含缬氨酸-瓜氨酸(VC))，/>(MCC，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯)，((4-乙酰基)氨基苯甲酸酯)，/>(4-硫代-2-羟基磺酰丁酸酯，2-磺基-SPDB)，/>4-硫代戊酸酯(SPP)，/>4-硫代丁酰基(SPDB)，/>4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-酰基(MCC)，/>马来酰亚胺乙氨基(ME)，/>4-硫代-2-羟基磺酰基丁酰基(2-Sulfo-SPDB)，/>芳基巯醚基(PhSS)，(4-乙酰基)氨基苯酰基(SIAB)，/>氧芐基硫醚基，/>氨基苄基硫醚基，/>二氧基苄基硫醚基，二氨基苄基硫醚基，/>氨基氧基苄基硫醚基，烷氧基氨基(AOA)，/>亚乙基氧基(EO)，/>二硫，/>4-甲基-4-二硫代戊酸(MPDP)，/>三唑，/>烷基磺酰基，/>烷基磺胺，
砜基二磺胺，/>磷二酰胺，/>烷基膦酰胺，膦酸，/>N-甲基烷基膦酰胺，/>N，N’-二甲基磷二酰胺，/>N，N’-二甲基膦酰二胺，/> 肼，/>乙脒，/>肟，二乙酰肼，/>氨基乙基胺，/>氨基乙基-氨基乙基-胺，/>/> gly-gly-gly，/>gly-gly，/>gly-gly-gly-gly，/>Lys-gly，/>gly-gly-phe-gly，/>ala-ala，/>glu-gly，glu-lys，/> (ala-phe)，(lys-phe)，及上述两个或多个的组合；其中/>是连接位点；X2、X3、X4、X5、或X6，独立地选自NH、NHNH、N(R12)、N(R12)N(R12’)、O、S、C1-C6烷基、C2-C6杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基、C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、CH2OR12、CH2SR12、CH2NHR12、或1～8氨基酸；其中R12和R12’独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；或1-8个碳原子的酯、醚或酰胺；或结构式为(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙二醇单元，其中p是0至约1000的整数，或两个或多个的组合。/>
其中L1，L2，X1，X2，X3，X1’，X2’和X3’可独立地缺省；
其中E1是连接两个巯基可反应基团Lv1和Lv2的连接基团。E1选自CH、CH2、NH、NHNH、N(R3)、N(R3)N(R3’)、N＝N、N-N、P、P(＝O)、S、Si、C2-C8烷基、杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；含有1～4个氨基酸残基的肽、优选自天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、色氨酸、丙氨酸；或以下结构之一： /> 其中/>是连接位点；
其中D1和D2是细胞毒性药物、或治疗性药物、或免疫治疗性短类抗体蛋白、用于增强或稳定细胞结合类抗体蛋白试剂的功能性分子、细胞表面受体结合剂、抗体片段、siRNA或DNA分子，选自：
1)化疗药物：
a)烷基化剂，氮芥：氯苯那普，氯普那嗪，环磷酰胺，达喀尔巴嗪，雌二醇氮芥，异环磷酰胺，氮芥，盐酸二甲氧胺，氧化二氮芥，盐酸氨氯地平，麦考酚酸，卫矛醇，呱泊溴烷，新氮芥，苯芥胆甾醇，松龙苯芥，噻替呱，曲磷胺对，尿嘧啶；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新、比折来新及其合成类似物)；多卡霉素(包括KW-2189和CBI-TMI、及其合成类似物)；苯并二氮卓二聚体(包括吡咯并苯二氮卓(PBD)或托美霉素，吲哚并苯并二氮卓，咪唑并苯并噻二氮卓或恶唑烷并苯并二氮卓的二聚体)；亚硝基脲(卡莫司汀，洛莫司汀，氯化梭菌素，福莫司汀，尼莫司汀，拉莫司汀)；烷基磺酸酯(白苏芬、树苏芬、磺胺异丙磺胺和皮苏芬)；三氮烯(达喀尔巴嗪)；含铂化合物(卡铂，顺铂，奥沙利铂)；吖丙啶类，苯并二氢吡喃酮，卡洛酮，美妥替派和乌雷多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺，三亚乙基三胺，三乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基甲基胺；
b)植物生物碱：长春花生物碱(长春新碱，长春碱，长春地辛，长春瑞滨，去甲长春碱)；紫杉醇类(紫杉醇，多西紫杉醇及其类似物)；美登素类(DM1、DM2、DM3、DM4、美登素、安沙霉素及其类似物)；cryptophycin(特别是cryptophycin 1和cryptophy-cin 8)；埃博霉素，软珊瑚醇，迪莫利德，草苔虫内酯，海兔毒素，奥瑞他汀，微管毒素，ephalostatin；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑制素；
c)DNA拓扑异构酶抑制剂，依托泊苷替尼(9-氨基喜树碱，喜树碱，克立那托，多拉霉素，依托泊苷，磷酸依托泊苷，伊立替康，米托蒽醌，诺消灵，视黄酸(视黄醇)，替尼泊苷，拓扑替康，9-硝基喜树碱(RFS2000))；丝裂霉素(丝裂霉素C)；
d)抗代谢物，抗叶酸剂，DHFR抑制剂(甲氨蝶呤，曲麦克特，二甲叶酸，蝶罗呤，氨喋呤(4-氨基苯甲酸)或其他叶酸类似物)；IMP脱氢酶抑制剂(麦考酚酸，噻唑呋林，利巴韦林，EICAR)；核糖核苷酸还原酶抑制剂(羟基脲，去铁胺)；嘧啶类似物，尿嘧啶类似物(安西他滨，阿扎胞苷，6-氮尿嘧啶，卡培他滨(希罗达)，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，脱氧氟尿苷，依诺他滨，5-氟尿嘧啶，氟尿苷，ratitrexed(Tomudex)；胞嘧啶类似物(阿糖胞苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷，氟达拉滨)；嘌呤类似物(硫唑嘌呤，氟达拉滨，巯嘌呤，硫胺素，硫鸟嘌呤)；叶酸补充剂，弗洛林酸；
e)激素疗法剂，受体拮抗剂，抗雌激素(甲地孕酮，雷洛昔芬，他莫昔芬)，LHRH兴奋剂(戈斯他林，醋酸亮丙瑞林)；抗雄激素药(比卡鲁胺，氟他胺，卡鲁司酮，丙酸倍他雄酮，表雄甾醇，戈舍瑞林，亮丙瑞林，美替利定，尼鲁米特，睾内酯，曲洛司坦及其他雄激素抑制剂)；维甲类化合物，维生素D3类似物(CB1093，EB1089，KH1060，胆钙化醇，麦角钙化甾醇)；光动力疗法剂(维替泊芬，酞菁，光敏剂Pc4，去甲氧基-竹红菌素A)；细胞因子(干扰素-α，干扰素-γ，肿瘤坏死因子(TNF)，含TNF的人蛋白)；
f)激酶抑制剂，BIBW 2992(抗-EGFR/Erb2)，伊马替尼，吉非替尼，呱加他尼，索拉非尼，达沙替尼，舒尼替尼，厄洛替尼，尼洛替尼，拉帕替尼，阿西替尼，帕唑帕尼，凡德他尼，E7080(抗VEGFR2)，mubritinib，普纳替尼(AP24534)，bafetinib(INNO-406)，bosutinib(SKI-606)，卡博替尼，维莫德吉，iniparib，鲁索利替尼，CYT387，阿西替尼，tivozanib，索拉非尼，贝伐单抗，西妥昔单抗，曲妥珠单抗，雷珠单抗，帕尼单抗，伊斯平斯；
g)抗生素，如烯二炔类抗生素(加利车霉素，特别是加利车霉素γ1，δ1，α1和β1，达因霉素，包括达因霉素A和脱氧米霉素，埃斯培拉霉素，卡塔尔霉素，C-1027，maduropeptin，新卡嗪奥斯汀和相关色蛋白烯二炔抗生素)，aclacinomysins，放线菌素，安曲霉素，重氮丝氨酸，博来霉素，卡诺霉素，卡拉霉素，洋红霉素，嗜癌素，色霉素，达金霉素，柔红霉素，去柔红霉素，6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸，阿霉素，吗啉-阿霉素，氰基吗啉-阿霉素，2-吡咯啉阿霉素和脱氧柔红霉素，表柔比星，阿柔比星，伊达比星，马可霉素，nitomycin，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，Peplomycin，potfiromycin，嘌呤霉素，奎拉霉素，罗道霉素，链黑霉素，链脲霉素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；
i)聚酮化合物(番荔素)，特别是bullatacin和bullatacinone；吉西他滨，环氧酶素(如卡菲偌米布)，硼替佐米，沙利度胺，来那度胺，pomalidomide，tosedostat，zybrestat，PLX4032，STA-9090，Stimuvax，allovectin-7，Xegeva，Provenge，Yervoy，异戊二烯化抑制剂(如洛伐他汀)，多巴胺能神经毒素(如星形孢菌素)，放线菌素(如放线菌素D，更生霉素)，博莱霉素(如博来霉素A2，博莱霉素B2，培洛霉素)，蒽环类抗生素(如柔红霉素)，鹅膏毒素，阿霉素(亚德里亚霉素)，伊达比星，表柔比星，吡柔比星，佐柔比星，米托蒽醌，MDR抑制剂(如维拉帕米)，Ca2+ATP酶抑制剂(如毒胡萝卜素)，组蛋白去乙酰酶抑制剂(伏立诺他，罗米地辛，帕比司他，丙戊酸，Mocetinostat(MGCD0103)，Belinostat，PCI-24781，恩替诺特，SB939，Resminostat，Givinostat，AR-42，CUDC-101，萝卜硫素，曲古抑菌素A)；塞来昔布，格列酮类，表没食子儿茶素没食子酸酯，双硫仑，Salinosporamide A；抗肾上腺药物，氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦，醋葡醛内酯，醛磷酰胺，氨基乙酰丙酸，安吖啶，阿拉伯糖苷，bestrabucil，比生群，edatraxate，defofamine，美可辛，地吖醌，依氟鸟氨酸(DFMO)，elfomithine，依利醋铵，依托格鲁，硝酸镓，胞嘧啶，羟基脲，伊班膦酸盐，香菇多糖，氯尼达明，米托胍腙，米托蒽醌，莫呱达醇，二胺硝吖啶，喷司他丁，蛋氨氮芥，吡柔比星，鬼臼酸，2-乙肼，甲基苄肼；呱嗪二酮丙烷；根霉素；西佐；螺环锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2'，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素，疣孢菌素A，杆孢菌素A和anguidine)，聚氨酯，siRNA，反义药物和核酸分解酶。
2)自身免疫疾病药物选自环孢菌素，环孢菌素A，氨基己酸，硫唑嘌呤，溴隐亭，苯丁酸氮芥，氯喹，环磷酰胺，皮质类固醇(例如安西奈德，倍他米松，布地奈德，氢化可的松，氟尼缩松，丙酸氟替卡松，氟可龙达那唑，地塞米松，曲安奈德，二丙酸倍氯米松)，DHEA，依那西普，羟基氯喹，英夫利昔单抗，美洛昔康，甲氨蝶呤，麦考酚酸酯，泼尼松，西罗莫司，他克莫司。
3)抗感染性疾病药物：
a)氨基糖苷类：阿米卡星，阿司米星，庆大霉素(奈替米星，西索米星，异帕米星)，潮霉素B，卡那霉素(阿米卡星，阿贝卡星，氨基脱氧卡那霉素，地贝卡星，妥布霉素)，新霉素(framycetin，巴龙霉素，核糖霉素)，奈替米星，壮观霉素，链霉素，妥布霉素，甲基姿苏霉素；
b)酰胺醇类：迭氮氯霉素，氯霉素，氟苯尼考，甲砜霉素；
c)安沙霉素：格尔德霉素，除莠霉素；
d)碳青霉烯类：比阿培南，多利培南，厄他培南，亚胺培南/西司他丁，美罗培南，帕尼培南；
e)头孢烯：碳头孢烯(洛拉卡比)，头孢乙腈，氯氨苄青霉素，头孢拉定，头孢羟氨，头孢洛宁，头孢噻啶，头孢噻吩或头孢金素，头孢氨苄，头孢来星，头孢孟多，头孢匹林，羟胺唑头孢菌素，氟唑头孢菌素，孢西酮，唑啉头孢菌素，头孢拉宗，头孢卡品，头孢达肟，头孢吡，头孢克肟，头孢西丁，头孢罗齐，头孢甲氧环烯胺，头孢替唑，头孢呋辛，头孢克肟，头孢地尼，头孢托仑，头孢吡，头孢他美，头孢甲肟，头孢地嗪，头孢尼西，头孢呱酮，头孢雷特，头孢噻肟，噻乙胺唑头孢菌素，头孢唑兰，头孢氨苄，头孢咪唑，头孢匹胺，头孢匹罗，头孢泊肟，头孢罗齐，头孢喹诺，头孢磺啶，头孢他啶，头孢特仑，头孢布腾，头孢噻林，头孢唑肟，头孢吡普，头孢曲松，头孢呋辛，头孢唑南，头霉素(头孢西丁，头孢替坦，头孢氰唑)，氧(碳)头孢烯(氟氧头孢，拉氧头孢)；
f)糖肽：博来霉素，万古霉素(奥利万星，特拉万星)，替考拉宁(达巴万星)，雷莫拉宁；
g)甘氨酰环素：如替加环素；
h)β-内酰胺酶抑制剂：青霉烷(舒巴坦，他唑巴坦)，氧青霉烷(克拉维酸)；
i)林可酰胺：克林霉素，林可霉素；
j)脂肽：达托霉素，A54145，钙依赖性抗生素(CDA)；
k)大环内酯类：阿奇霉素，克霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素，氟雷霉素，交沙霉素，酮内酯(泰利霉素，塞红霉素)，麦迪霉素，米卡霉素，竹桃霉素，利福霉素(异烟肼、利福平，利福布丁，利福喷汀)，罗匹霉素，罗红霉素，大观霉素，螺旋霉素，他克莫司(FK506)，醋竹桃霉素，泰利霉素；
l)单环胺：氨曲南，替吉莫南；
m)恶唑烷酮类：利奈唑胺；
n)青霉素类：阿莫西林，氨苄青霉素(匹氨西林，海洛西林，巴氨西林，氨苄青霉素，阿霉素)，阿替代西林，阿洛西林，苄青霉素，苄星青霉素苄青霉素，苄星青霉素苯氧甲基青霉素，克洛西林，普鲁卡因青霉素(美替西林)，美洛西林，甲氧西林，萘夫西林，苯唑西林，醋甲西林，青霉素，非奈西林，苯氧基甲基青霉素，呱拉西林，氨苄西林，磺苯西林，替莫西林，替卡西林；
o)多肽：杆菌肽，粘菌素，多粘菌素B；
p)喹诺酮类：阿拉曲沙星，巴洛沙星，环丙沙星，克林沙，达氟沙星，二氟沙星，依诺沙星，恩诺沙星，加雷沙星，加替沙星，吉米沙星，格帕沙星，卡诺曲伐沙星，左氧氟沙星，洛美沙星，麻保沙星，莫西沙星，那氟沙星，诺氟沙星，奥比沙星，氧氟沙星，培氟沙星，曲伐沙星，格帕沙星，西他沙星，司帕沙星，替马沙星，托沙星，曲伐沙星；
q)链阳性菌素：普那霉素，奎奴普丁/达福普汀；
r)磺胺类：氨芐磺胺，偶氮磺胺，磺胺嘧啶，磺胺甲异唑、磺胺酰亚胺、磺胺吡啶、磺胺异恶唑、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑(复方磺胺甲恶唑)；
s)类固醇抗菌药物：如夫西地酸；
t)四环素类：强力霉素，金霉素，氯米西环素，地美环素，雷莫昔林，美西环素，美他环素，米诺环素，土霉素，潘美环素，吡咯烷甲基四环素，四环素，甘氨酰环素(如替加环素)；
u)其他类型的抗生素：番荔枝素，胂凡纳明，细菌萜醇抑制剂(杆菌肽)，DANAL/AR抑制剂(环丝氨酸)，dictyostatin，圆皮海绵内酯，软珊瑚醇，埃博霉素，乙胺丁醇，依托泊苷，法罗培南，夫西地酸，呋喃唑酮，异烟肼，laulimalide，甲硝唑，莫匹罗星，NAM合成抑制剂(例如磷霉素)，呋喃妥因，紫杉醇，普兰西霉素，吡嗪酰胺，奎奴普丁/达福普汀，利福平，他唑巴坦替硝唑，乌菊花素；
4)抗病毒药物：
a)侵入/融合抑制剂：阿帕韦洛，马拉韦罗，vicriviroc，gp41(恩夫韦肽)，PRO 140，CD4(艾巴利珠单抗)；
b)整合酶抑制剂：雷特格韦，elvite-gravir，globoidnan A；
c)成熟抑制剂：bevirimat，vivecon；
d)神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦，扎那米韦，帕拉米韦；
e)核苷和核苷酸：阿巴卡韦，阿昔单韦，阿德福韦，阿莫西韦，阿昔单抗，溴夫定，西多福韦，克拉夫定，地塞米松，去羟肌苷(ddI)，elvucitabine，恩曲他滨(FTC)，恩替卡韦，泛昔洛韦，氟拉西林(5-FU)，3’-氟取代的2’，3’-脱氧核苷类似物，如3’-氟-2’，3’-双脱氧胸苷(FLT)和3’-氟-2’，3’-双脱氧鸟苷(FLG)，福米韦生，9-鸟嘌呤，碘苷，拉米夫定(3TC)，1-核苷(例如β-1-胸苷和β-1-2'-脱氧胞苷)，喷昔洛韦，racivir，利巴韦林，迪替丁，司他夫定(d4T)，塔利巴韦林(viramidine)，替比夫定，替诺福韦，三氟尿苷伐昔洛韦，缬更昔洛韦，扎西他滨(ddC)，齐多夫定(AZT)；
f)非核苷类：金刚烷胺，阿替吡啶，卡普韦林，二芳基嘧啶(依曲韦林，rilpi-virine)，地拉夫定，二十二烷醇，乙米韦林，依法韦仑，膦甲酸(磷酰基甲酸)，咪喹莫特，聚乙二醇干扰素，洛韦胺，洛德腺苷，甲吲噻腙，奈韦拉平，NOV-205，长效干扰素α，鬼臼毒素，利福平，金刚乙胺，瑞喹莫德(R-848)，醋胺金刚烷；
g)蛋白酶抑制剂：安普那韦，阿扎那韦，boceprevir，darunavir，福萨那韦，印地那韦，洛匹那韦，奈非那韦，普来可那立，利托那韦，沙奎那韦，telaprevir(VX-950)，替拉那韦；
h)其它类型的抗病毒药物：抗体酶，阿比朵尔，calanolide a，ceragenin，氰维林-n，二芳基嘧啶，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，膦甲酸，格里菲辛，taribavirin(viramidine)，羟基脲，KP-1461，米替福新，普来可那立，混成抑制剂，利巴韦林，seliciclib。
5)放射性同位素(放射性核素)：3H，11C，14C，18F，32P，35S，64Cu，68Ga，86Y，99Tc，111In，123I，124I，125I，131I，133Xe，177Lu，211At，和213Bi；
6)任何上述药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其中在步骤(a)中产生的抗体或类抗体蛋白中的硫醇基团同时或顺序地与式(I)、(II)或(III)的药物/连接子复合物独立地反应，形成如下所示式(V)、(VI)或(VII)的偶联物：
其中n是1–20；n’是1-10；D1、D2、L1、L2和E1如权利要求5所述；S(硫)由抗体或类抗体蛋白质中二硫键被还原而产生；mAb是一种抗体或类抗体蛋白；
其中Lv1’和Lv2’独立地具有以下结构：
其中X2’和R3定义与权利要求5相同；
其中式(VI)和式(VII)中片段 独立地选自：/>
/>
/>
/>
其中R1、R2、X2的定义同前文所述；mAb是抗体或类抗体蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中产生的抗体或类抗体蛋白中的巯基与如下所示的具有结构式(VIII)，(IX)或(X)的缩合化合物同时或依次地反应，并独立地与药物，D1和/或D2，形成式(V)，(VI)或(VII)的偶联物：
其中式(I)，(II)和(III)的L1和L2独立地相同或不同，独立地选自O、NH、S、NHNH、N(R3)、N(R3)N(R3’)、结构式为(OCH2CH2)pOR3、或(OCH2CH(CH3))pOR3、或NH(CH2CH2O)pR3、或NH(CH2CH(CH3)O)pR3、或N[(CH2CH2O)pR3][(CH2CH2O)p’R3’]、或(OCH2CH2)pCOOR3、或CH2CH2(OCH2CH2)pCOOR3的聚乙二醇单元，其中p和p’独立地选自0至约1000的整数、C1-C8烷基；C2-C8杂烷基、烷基环烷基或杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；其中R3和R3’独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；或C1-C8个碳原子的酯、醚或酰胺；或定义中所述的1～8个天然或非天然氨基酸；或结构式为(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙二醇单元，其中p是0至约1000的整数，或两种或多种组合；
其中L1和L2独立地可以含有自我毁灭或非自我毁灭的组分、肽单元、腙键、二硫化物、酯、肟、酰胺或硫醚键。自我毁灭单元是与对氨基芐基氨甲酰基(PAB)的电子结构相似的芳香化合物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇的衍生物、杂环PAB类似物、β-葡糖醛酸苷、以及邻或对氨基芐基缩醛；
其中自我毁灭型连接子组分具有以下结构之一：
其中(*)是另外的间隔体或可断裂的连接子单元，或细胞毒剂、和/或细胞结合分子(CBA)的连接点；X1、Y1、Z2和Z3独立地为NH、O、或S；Z1独立地为H、NH、O或S；v是0或1；U1独立地为H、OH、C1～C6烷基、(OCH2CH2)nF、Cl、Br、I、OR5、SR5、NR5R5’、N＝NR5、N＝R5、NR5R5’、NO2、SOR5R5’、SO2R5、SO3R5、OSO3R5、PR5R5’、POR5R5’、PO2R5R5’、OPO(OR5)(OR5’)、或OCH2PO(OR5(OR5’)其中R5和R5’如前文所定义；
其中非自我毁灭型连接子组分为以下结构之一：
/>
其中(*)是另外的间隔体R1或可断裂的连接子单元、或细胞毒性分子和/或结合分子的连接点；X1、Y1、U1、R5、R5’如前文所定义；r是0-100；m和n独立地为0-6；
其中L1或L2可独立地由一个或多个下列连接子组分构成：6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”或“af”)、对氨基芐氧基羰基(“PAB”)、4-硫代戊酰基(“SPP”)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1酰基(“MCC”)、(4-乙酰基)氨基苯酰基(“SIAB”)、4-硫丁酰基(SPDB)、4-硫-2-羟基磺酰基-丁酰基(2-Sulfo-SPDB)，或含有1-8个天然或非天然氨基酸单元的天然或非天然肽。
其中L1或L2可是可断裂连接子；
其中可断裂连接子(L1或L2)包括：
-(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-，-(Aa)r-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t-，-(CR5R6)m-(CR7＝CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(CO)(Aa)t-(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m-phenyl-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-呋喃-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-恶唑-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-噻唑-CO(Aa)t(CCR7R8)n-，-(CR5R6)t-噻吩-CO(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-咪唑-CO-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-吗啉-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-N-甲基哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R)m-(Aa)tphenyl-，-(CR5R6)m-(Aa)t呋喃-，-(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-噻唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-噻吩-(Aa)t-，-(CR5R6)m-咪唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-吗啉-(Aa)t-，-(CR5R6)m-哌嗪-(Aa)t-，-(CR5R6)m-N-甲基哌嗪-(Aa)t-，-K(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-K(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-，-K(Aa)r-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-K(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t-，-K(CR5R6)m-(CR7＝CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(CO)(Aa)t-(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K-(CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m-phenyl-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K-(CR5R6)m-呋喃-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)m-恶唑-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R6)m-噻唑-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t-噻吩-CO(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t咪唑-CO-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)tmorpholino-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t-N-甲基哌嗪CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R)m(Aa)tphenyl，-K-(CR5R6)m-(Aa)t呋喃-，-K(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-噻唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-噻吩-(Aa)t-，-K(CR5R6)m-咪唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-吗啉(Aa)t-，-K(CR5R6)m-哌嗪-(Aa)tG，-K(CR5R6)mN-甲基哌嗪(Aa)t-；其中m、Aa、m、n、R3、R4、和R5定义如前文所描述；t和r独立地为0–100；R6、R7、和R8独立地选自H；卤化物；C1～C8烷基、芳基、烯基、炔基、醚、酯、胺或酰胺，任选地被一种或多种卤化物取代，CN、NR1R2、CF3、OR1、Aryl、杂环、S(O)R1、SO2R1、-CO2H、-SO3H、-OR1、-CO2R1、-CONR1、-PO2R1R2、-PO3H或P(O)R1R2R3；K是NR1、-SS-、-C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-C＝NH-O-、-C＝N-NH-、-C(＝O)NH-NH-、O、S、Se、B或C3-C6杂芳基；
其中连接子L1和L2的组分的示例结构有：
(包含MC，6-马来酰亚胺己酰基)，/>(MP，马来酰亚胺丙酰基)，/> (PAB，p-对氨基芐氧基酰胺基)，/> (含缬氨酸-瓜氨酸(VC))，/>(MCC，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯)，((4-乙酰基)氨基苯甲酸酯)，/>(4-硫代-2-羟基磺酰丁酸酯，2-磺基-SPDB)，/>4-硫代戊酸酯(SPP)，/>4-硫代丁酰基(SPDB)，/>4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-酰基(MCC)，/>马来酰亚胺乙氨基(ME)，/>4-硫代-2-羟基磺酰基丁酰基(2-Sulfo-SPDB)，/>芳基巯醚基(PhSS)，/>(4-乙酰基)氨基苯酰基(SIAB)，/>氧芐基硫醚基，/>氨基苄基硫醚基，/>二氧基苄基硫醚基，二氨基苄基硫醚基，/>氨基氧基苄基硫醚基，烷氧基氨基(AOA)，/>亚乙基氧基(EO)，/>二硫，4-甲基-4-二硫代戊酸(MPDP)，/>三唑，/>烷基磺酰基，/>烷基磺胺，/>砜基二磺胺，/>磷二酰胺，烷基膦酰胺，/>膦酸，/>N-甲基烷基膦酰胺，N，N’-二甲基磷二酰胺，/>N，N’-二甲基膦二酰胺， 肼，/>乙脒，/>肟，/>二乙酰肼，/>氨基乙基胺，/>氨基乙基-氨基乙基-胺，/> gly-gly-gly，/>gly-gly，gly-gly-gly-gly，/>Lys-gly，/>gly-gly-phe-gly，ala-ala，/>glu-gly，glu-lys， (ala-phe)，/>(lys-phe)，或两个或多个的组合；其中/>是连接位点；X2、X3、X4、X5、或X6，独立地选自NH、NHNH、N(R12)、N(R12)N(R12’)、O、S、C1-C6烷基、C2-C6杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基、C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、CH2OR12、CH2SR12、CH2NHR12、或1～8氨基酸；其中R12和R12’独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；或C1-C8酯、醚或酰胺；或结构式为(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙二醇单元，其中p是0至约1000的整数，或两个或多个的组合；
其中L1、L2、X1、X2、X3、X1’、X2、和X3可独立地缺省；
其中E1是连接两个巯基可反应基团Lv1和Lv2的连接基团。E1选自CH、CH2、NH、NHNH、N(R3)、N(R3)N(R3’)、N＝N、N-N、P、P(＝O)、S、Si、C2-C8烷基、杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；含有1～4个氨基酸残基的肽；或以下结构之一：
/> 其中/>是连接位点；
Lv1和Lv2是巯基反应基团，独立地选自于：
卤代乙酰基；/>酰卤基；/>马来酰亚胺；单取代马来酰亚胺；/>二取代马来酰亚胺；/>单取代的琥珀酰亚胺；/>二取代琥珀酰亚胺；-CHO醛；/>乙烯磺酰基；/>丙烯酰基；/>2-(甲苯磺酰氧基)乙酰基；/>2-(甲磺酰氧基)乙酰基；/>2-(硝基苯酚基)乙酰基；/>2-(二硝基苯基)乙酰基；/>2-(氟代苯酚基)-乙酰基；/>2-(二氟苯酚基)-乙酰基；2-((三氟甲基磺酰基)氧基)乙酰基；/>苯乙烯，乙烯基吡啶，/>乙烯基吡嗪，/>乙烯基-1，3，5-三嗪，/>取代的甲磺酰基，/>2-(五氟苯氧基)乙酰基；甲基砜苯基恶二唑(ODA)；/>丙烯酰基，卤代丙烯酰基，/>丙炔酰基，/>2，3-二卤代丙烯酰基，/>芳基钯配合物，/>双(苯磺酰基)-马来酰亚胺，/>双卤代哒嗪二酮，/>双苯硫基哒嗪二酮，2-((甲基磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>2-((烷基或芳基-磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>氰乙炔基，/>乙炔基；/>炔基，/>亚芳基二丙腈(ADPN)，二乙烯基吡啶，/>二乙烯基吡嗪，二乙烯基三嗪，/>3，4--双(马来酰亚胺)-2，5-二氧代吡咯烷，/> />
/>
其中X1’和X2’独立地为F、Cl、Br、I、OTf、OMs、OC6H4(NO2)、OC6H3(NO2)2、OC6F5、OC6HF4、或Lv3；X2是O、NH、N(R1)、或CH2；R3和R5独立地为H、R1、芳基团、杂芳香族或芳香族、其中一个或几个H原子独立地被-R1、-卤素、-OR1、-SR1、-NR1R2、-NO2、-S(O)R1、-S(O)2R1或-COOR1取代；Lv3和Lv3’独立地为离去基团，选自F、Cl、Br、I、硝基苯氧基、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、苯氧基、苯巯基、二硝基苯氧基、五氟苯氧基、四氟苯氧基、二氟苯氧基、单氟苯氧基、五氯苯酚、三氟甲磺酸酯、咪唑、二氯苯氧基、四氯苯氧基、1-羟基苯并三唑、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-乙基-5-苯基异恶唑-3′-磺酸酯，自身形成的酸酐，或与其他酸酐，乙酸酐、甲酸酐形成的酸酐；或使用缩合试剂生成的多肽偶联反应中间体或Mitsunobu反应的中间体；
其中式(VIII)、(IX)或(X)与药物D1或/和D2的缩合反应可以在分离的反应罐中进行；
其中Lv5和Lv6独立地选自：
其中X1’是F、Cl、Br、I、OTs(甲苯磺酸酯)、OTf(三氟甲磺酸酯)、OMs(甲磺酸酯)、OC6H4(NO2)、OC6H3(NO2)2、OC6F5、OC6HF4或Lv3；X2’是O、NH、N(R1)或CH2；R3和R5独立地为H、R1、芳香基、杂芳基或其中一个或多个H原子独立地被-R1、-卤素、-OR1、-SR1、-NR1R2、-NO2、-S(O)R1、-S(O)2R1、或-COOR1取代的芳香基团；Lv3和Lv3’为离去基团，独立地选自F、Cl、Br、I、硝基苯氧基、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、苯氧基、苯巯基、二硝基苯氧基、五氟苯氧基、四氟苯氧基、二氟苯氧基、一氟苯氧基、五氯苯氧基、三氟甲磺酸酯、咪唑、二氯苯氧基、四氯苯氧基、1-羟基苯并三唑、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、2-乙基-5-苯基异恶唑鎓-3'-磺酸酯，自身形成的酸酐，或与其他酸酐形成的酸酐，或肽偶联反应或与Mitsunobu反应的缩合试剂反应产生的中间分子；其中官能团Lv5和/或Lv6也可以与细胞毒性药物中的巯基反应，只要其反应速率比Lv1或Lv2与类抗体蛋白中的巯基基团之间的反应快或慢至少一倍。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗体或类抗体蛋白中的巯基同时或依次独立地与式(VIII)、(IX)或(X)反应，形成下文所示的式(XI)、(XII)或(XIII)，然后独立地与药物D1或D2反应，形成式(V)、(VI)或(VII)的偶联物：
其中Lv5、Lv6、L1、L2、E1、Lv1’Lv2’、mAb、n和n’定义如权利要求7所述。
9.根据权利要求6所述的方法，其中药物D1和D2发色分子可以吸收紫外光，荧光，红外光，近红外光或可见光；发色分子包括黄色素，红细胞，虹彩色素，白细胞，黑色素和蓝绿色素的一类或一个亚类；荧光分子的一类或一个亚类，其是一种荧光化学物质；视觉光转导分子的一类或一个亚类；光子分子的一类或一个亚类，冷光分子的一类或一个亚类或荧光素化合物的一类或一个亚类；
发色分子可选自非蛋白质有机荧光团，氧杂蒽衍生物(包括荧光素，罗丹明，俄勒冈绿，伊红和德克萨斯红)；花青衍生物(包括花青，吲哚羰花青，氧杂花青，硫代花青和部花青)；方酸衍生物和环取代的方酸，包括Seta，SeTau和Square染料；萘衍生物(包括丹酰和氟硅酸钠衍生物)；香豆素衍生物；恶二唑衍生物(吡啶基恶唑，硝基苯并恶唑和苯并恶二唑)；蒽衍生物(蒽醌类，包括DRAQ5，DRAQ7和CyTRAK橙)；芘衍生物(包括级联蓝)；恶嗪衍生物(包括尼罗红，尼罗蓝，甲酚紫，恶嗪170)；吖啶衍生物(包括黄醇黄素，吖啶橙，吖啶黄)；芳基甲胺衍生物(包括金胺，结晶紫，孔雀石绿)和四吡咯衍生物(包括卟吩，酞菁，胆红素)；
生色分子选自以下荧光化合物的任何类似物和衍生物：CF染料，DRAQ和CyTRAK探针，BODIPY，Alexa Fluor，DyLight Fluor，Atto和Tracy(Sigma Aldrich)，FluoProbes，Abberior染料，DY和MegaStokes染料，Sulfo Cy染料，HiLyte Fluor，Seta，SeTau和Square染料，SureLight染料(APC，RPEPerCP，Phycobilisomes)，APC，APCXL，RPE，BPE，别藻蓝蛋白(APC)，氨基胭脂蛋白，APC-Cy7偶联物，BODIPY-FL，Cascade Blue，Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy3B，Cy5，Cy5.5，Cy7，荧光素，FluorX，羟基香豆素，丽丝胺罗丹明B，萤光黄，Me-甲氧基香豆素，NBD，Pacific Blue，Pacific Orange，PE-Cy5偶联物，PE-R-藻红蛋白(PE)，Red 613，Seta-555-Azide，Seta-555-DBCO，Seta-555-NHS，Seta-580-NHS，Seta-680-NHS，Seta-APC-780，Seta-PerCP-680，Seta-R-PE-670，SeTau-380-NHS，SeTau-405-马来酰亚胺，SeTau-405-NHS，SeTau-425-NHS，SeTau-647-NHS，Texas Red，TRITC，TruRed，X-Rhodamine，7-AAD(7-氨基放线菌素D，CG-选择性的)，吖啶橙，色霉素A3，CyTRAK橙(Biostatus)，DAPI，DRAQ5，DRAQ7，溴化乙锭，Hoechst33258，Hoechst33342，LDS 751，光辉霉素，碘化丙啶(PI)，SYTOX蓝，SYTOX绿，SYTOX橙，噻唑橙，TO-PRO，菁染料单体，TOTO-1，TO-PRO-1，TOTO-3，TO-PRO-3，YOSeta-1，YOYO-1，DCFH(2'，7'-二氯二氢荧光素，氧化形式)，DHR(二氢罗丹明123，氧化形式，光催化氧化)，Fluo-3(AM酯，pH>6)，Fluo-4(AM酯，pH7.2)，Indo-1(AM酯，低/高钙(Ca 2+))，SNARF(pH 6/9)。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述药物D1和D2独立地为聚亚烷基二醇选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物；聚亚烷基二醇的分子量为约10道尔顿至约200kDa。
11.根据权利要求6所述的方法，其中药物D1和D2选自：
tubulysin及其类似物、美登素及其类似物、紫杉烷(taxane)及其类似物、CC-1065及其类似物、柔红霉素或多柔比星及他们的类似物、鹅膏毒素及其类似物、苯并二氮卓二聚体(例如吡咯并苯二氮卓(PBD)、托美霉素、氨茴霉素、吲哚并苯并二氮卓、咪唑并苯并噻二氮卓或恶唑烷并苯并二氮卓的二聚体)及其类似物、加利车霉素类和烯二炔类抗生素类似物、放线菌素及其类似物、氮丝菌素及其类似物、博来霉素及其类似物、表柔比星及其类似物、他莫昔芬及其类似物、伊达比星及其类似物、多拉司他汀及其类似物、澳瑞他汀(包括单甲基澳瑞他汀(MMAE)、MMAF、澳瑞他汀PYE、澳瑞他汀TP、澳瑞他汀2-AQ、6-AQ、EB(AEB)、和EFP(AEFP))及其类似物、康普瑞汀、多卡霉素及其类似物、喜树碱、格尔德霉素及其类似物、甲氨喋呤及其类似物、噻替派及其类似物、长春地辛及其类似物、长春新碱及其类似物、半米塔林及其类似物、nazumamide及其类似物、spliceostatin、a pladienolide、微晶蛋白及其类似物、放射敏素及其类似物、altero-bactin及其类似物、a microsclerodermin及其类似物、theonellamide及其类似物、esperam-icin及其类似物、PNU-159682及其类似物、蛋白激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂、烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)抑制剂、免疫毒素、一种，两种或更多种DNA、RNA、mRNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和PIWI相互作用RNA(piRNA)及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物作为药物，
其中：
(a)Tubulysin及其类似物具有式(IV)的结构：
或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或多晶结构；或其旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中是独立地连接到L1和/或L2的连接位点；
其中R1、R2、R3、和R4独立地为H、C1～C8烷基、C2～C8杂烷基或杂环、C3～C8芳基、芳基烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂烷基环烷基、碳环或烷基羰基；或R1和R2、R1和R3、R2和R3、R3和R4、R5和R6、R11和R12或R13和R14形成的3～7元碳环、环烷基、杂环、杂环烷基、芳基或杂芳基环体系；当独立或同时连接到L1或L2时，R1和R2可以独立地缺省，Y1是N或CH；
其中R5、R6、R8、R10和R11独立地为H、或C1～C4烷基或杂烷基；
其中R7独立地为H、R14、-R14C(＝O)X1R15；或-R14X1R15；X1是O、S、S-S、NH、CH2或NR14；
其中R9为H、OH、-O-、＝O、-OR14、-OC(＝O)R14、-OC(＝O)NHR14-、-OC(＝O)R14SSR15-、OP(＝O)(OR14)-、-OC(＝O)NR14R15、OP(＝O)(OR14)、或OR14OP(＝O)(OR15)；
其中R11独立地为H、R1、-R14C(＝O)R16、-R1X2R2、-R1C(＝O)X2、其中X2是-O-、-S-、-NH-、-N(R2)-、-O-R1-、-S-R1-、-S(＝O)-R1-、或–NHR2；
其中R12为R1、-OH、-SH、-NH2、NH、NHNH2、-NH(R15)、-OR15、-R15COR16、-R15COOR16、-R15C(O)NH2、-R15C(O)NHR17、-SR16、R15S(＝O)R16、-R15P(＝O)(OR17)2、-R15OP(＝O)(OR17)2、-CH2OP(＝O)(OR17)2、-R15SO2R17、-R15X2R16、-R15C(＝O)X2，其中X2是-O-、OH、SH、-S-、NH2、-NH-、-N(R15)-、-O-R15-、-S-R15-、-S(＝O)-R15-、CH2或-NHR15-；
R13和R14独立地为H、O、S、NH、N(R15)、NHNH、-OH、-SH、-NH2、NH、NHNH2、-NH(R15)、-OR15、CO、-COX2、-COX2R16、R17、F、Cl、Br、I、SR16、NR16R17、N＝NR16、N＝R16、NO2、SOR16R17、SO2R16、SO3R16、OSO3R16、PR16R17、POR16R17、PO2R16R17、OP(O)(OR17)2、OCH2OP(O)(OR17)2、OC(O)R17、OC(O)OP(O)(OR17)2、PO(OR16)(OR17)、OP(O)(OR17)OP(O)(OR17)2、OC(O)NHR17；-O-(C4-C12糖苷)、-N-(C4-C12糖苷)、C1～C8烷基、杂烷基、C2-C8烯基、炔基、杂烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、或2-8个碳原子的酯、醚或酰胺；或包含1-8个氨基酸的肽(NH(Aa)1～8或CO(Aa)1～8、N-端或C-端1-8个相同或不同的氨基酸)，或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯基单元，其中p是0至约1000的整数，或上述基团的组合；X2是O、S、S-S、NH、CH2、OH、SH、NH2、CHR14或NR14；
R15、R16和R17独立地为H、C1～C8烷基、或杂烷基；C2-C8烯基、炔基、杂烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、烷基羰基、或Na+、K+、Cs+、Li+、Ca2+、Mg+、Zn2+、N+(R1)(R2)(R3)(R4)、HN+(C2H5OH)3的盐；
Y1和Y2独立地为N或CH；q是0或1；当q＝0，Y3不存在，Y4、Y5、Y6和Y7独立地为CH、N、NH、O、S、或N(R1)，所以Y2、Y4、Y5、Y6和Y7形成呋喃、吡咯噻吩、噻唑、噁唑和咪唑、吡唑、三唑、四唑、噻二唑杂芳环；当q＝1、Y3、Y4、Y5、Y6和Y7独立地为CH或N时，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6和Y7形成苯、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、四嗪、五嗪的芳环；
Tubulysin类似物的结构实例如下所示：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
其中R20是H、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基、C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基、C3-C8芳基、芳烷基、杂环基、碳环基、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基的直链或支链；碳酸酯(-C(O)OR17)，氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；或C1-C8羧酸盐、酯、醚或酰胺；或1～8个氨基酸；或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙烯氧基单元，其中p是0至约1000的整数；或R20缺省且氧与碳形成酮，或两种或者更多基团的组合；
Z3和Z3独立地为H、OH、NH2、O、NH、COOH、COO、C(O)、C(O)、C(O)NH、C(O)NH2、R18、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、OPO(OR18)2、NHPO(OR18)2、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC(O)R18、OC(O)NHR18、OSO2(OR18)、O-(C4-C12-糖苷)、直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳烷基、杂环基、碳环基、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基的直链或支链；碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R17和R18独立地为H、直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；
R19是H、OH、NH2、OSO2(OR18)、XCH2OP(O)(OR18)2、XPO(OR18)2、XC(O)OP(O)(OR18)2、XC(O)R18、XC(O)NHR18、C1～C8烷基或羧酸酯；C2～C8烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3～C8芳基或烷基羰基；或药用盐；
X是O，S，NH，NHNH，或CH2；
R7定义同上；其中连接位点在式IV-01-IV-79中，与根据式(IV)中所示相同；
(b)加利车霉素及其相关的烯二炔抗生素具有下式结构：
或元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或多晶结构；或其旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中是与L1或L2连接的位点；
(c)美登素或其衍生物美登素类化合物具有以下结构：
其中是与L1或L2连接的位点；
(d)喜树碱(CPTs)及其衍生物具有以下结构：
或一种或多种元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或多晶结构；或其旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中R1，R2和R4独立地选自H、F、Cl、Br、CN、NO2、C1-C8烷基；O-C1-C8烷基、NH-C1-C8烷基；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；C2-C8酯、醚、酰胺、碳酸酯、尿素或氨基甲酸酯；
R3为H、OH、NH2、C1-C8烷基、O-C1-C8烷基、NH-C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C2-C8酯、醚、酰胺、碳酸酯、尿素或氨基甲酸酯；或R1和R2、R2和R3和R3和R4独立形成元碳环、杂环、杂环烷基、芳基或杂芳基环系统。其中/>是分子中与L1或L2连接的位点。/>
喜树碱(CPTs)及其衍生物具有以下结构：
/>
/>
/>
或一种或多种元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中是连接到L1或L2的位点；P1是H、OH、NH2、COOH、C(O)NH2、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、OPO(OR18)2、NHPO(OR18)2、OC(O)R18、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC(O)NHR18、OC(O)N(C2H4)2NCH3、OSO2(OR18)、O-(C4-C12-糖苷)、OC(O)N(C2H4)2CH2N(C2H4)2CH3、O-(C1-C8支链或支链的烷基)、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基、C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R17和R18独立地为H、直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)R1和R2独立地为H；O-C1～C8烷基；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基或芳烷基；
(e)the Combretastatins包含下式化合物：
是分子上连接到L1或L2的位点；
(f)紫杉烷具有下式结构：
/>
其中是连接到L1或L2的位点；Ar和Ar’独立地是芳基或杂芳基。
(g)蒽环类药物具有下式结构：
/>
/> Amrubicin类似物，
其中是与L1或L2连接的位点；
(h)长春花生物碱选自长春碱，长春新碱，长春地辛，环氧长春碱，长春瑞滨，长春质碱，长春花碱，长春胺醇，维尼丁，米诺维辛，甲氧基米诺维辛，长春花草碱，脱氧长春氨醇，长春蔓晶，长春胺，长春西汀，长春布宁，具有下式：
/>
其中是连接到L1或L2位点；
(i)海兔毒素(Dolastatins)及其肽类似物和衍生物选自海兔毒素10、澳瑞他汀E(AE)、澳瑞他汀EB(AEB)、澳瑞他汀EFP(AEFP)、MMAD(单甲基澳瑞他汀D或单甲基海兔毒素10)、MMAF(单甲基澳瑞他汀F或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-苯丙氨酸)、MMAE(单甲基澳瑞他汀E或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-norephedrine)、5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)，澳瑞他汀F苯二胺(AFP)且具有下式：
/>
或一种或多种元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中R1、R2、R3、R4和R5独立地为H、C1-C8直链或支链烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酯、醚、酰胺、胺、杂环烷基或酰氧基胺；或包含1-8个氨基酸的肽，或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯基单元，其中p为1至约5000的整数。两个Rs：R1和R2、R2和R3、R1和R3或R3和R4可以形成烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或烷基环烷基的3～8元环状；
X3是H、CH3或X1’R1’，其中X1’是NH、N(CH3)、NHNH、O、或S、且R1’是H或C1-C8直链或支链烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基或酰氧基胺；
R3’是H或C1-C6直链或支链烷基；
Z3’是H、COOR1、NH2、NHR1、OR1、CONHR1、NHCOR1、OCOR1、OP(O)(OM1)(OM2)、OCH2OP(O)(OM1)(OM2)、OSO3M1、R1、或O-糖苷(葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、葡糖醛酸苷/葡糖醛酸、阿洛糖苷、果糖苷等)、NH-糖苷、S-糖苷或CH2-糖苷；M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4或NR1R2R3；
Y1和Y2独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1当连接到位点时，(独立地与L1和/或L2连接)；或OH、NH2、NHNH2、NHR5、SH、C(O)OH、C(O)NH2、OC(O)NH2、OC(O)OH、NHC(O)NH2、NHC(O)SH、OC(O)NH(R1)、N(R1)C(O)NH(R2)、C(O)NHNHC(O)OH或C(O)NHR1“当未连接到位点/>时；
R12是OH、NH2、NHR1、NHNH2、NHNHCOOH、O-R1-COOH、NH-R1-COOH、NH-(Aa)nCOOH、O(CH2CH2O)pCH2CH2OH、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NR1R1’、NHOH、NHOR1、O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH-Ar-COOH、NH-Ar-NH2、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH-SO3H、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H、R1-NHSO3H、NH-R1-NHSO3H、O(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2、OR1、R1-NHPO3H2、R1-OPO3H2、O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2、OR1-NHPO3H2、NH-R1-NHPO3H2、NH(CH2CH2NH)pCH2-CH2NH2、NH(CH2CH2S)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2NH)pCH2CH2OH、NH(CH2CH2S)pCH2-CH2OH、NH-R1-NH2、或NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2，其中Aa是1-8个相同或者不同的氨基酸；p是1-5000；R1、R2、R3、R4、R5、R5’、Z1、Z2和n的定义同前文。
(j)Hemiasterlin及其类似物具有以下结构：
其中R1、R2、R3、R4和R5独立地为H；C1-C8直链或支链烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酯、醚、酰胺、胺、杂环烷基或酰氧基胺；或含有1-8个氨基酸的肽、或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯单元、其中p是1至约5000的整数；R2和R3可以形成3～8个环的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或烷基环烷基。
(k)艾日布林(Eribulin)具有以下结构：
其中是独立地连接到L1和/或L2的位点；
(l)烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂(NAMPT)具有以下结构NP01、NP02、NP03、NP04、NP05、NP06、NP07、NP08、和NP09：
或一种或多种元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；其中与前文相同；X5是F、Cl、Br、I、OH、OR1、R1、OPO3H2、OSO3H、NHR1、OCOR1、NHCOR1。
(m)苯二氮卓二聚体及其类似物具有以下结构，PB01、PB02、PB03、PB04、PB05、PB06、PB07、PB08、PB09、PB10、PB11、PB12、PB13、PB14、PB15、和PB16：
/>
/>
或一种或多种元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中X1、X2、Y1和Y2独立地为O、N、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；
R1、R2、R3、R1’、R2’、和R3’独立地为H、F、Cl、＝O、＝S、OH、SH、C1-C8直链或支链的苄基、芳基、烯基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酯(COOR5或–OC(O)R5)、醚(OR5)、酰胺(CONR5)、氨基甲酸酯(OCONR5)、胺类(NHR5、NR5R5’)、杂环烷基、或酰氧基胺(-C(O)NHOH、-ONHC(O)R5)、或含有1-20个天然或非天然氨基酸的肽、或结构式如(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯基单元、其中p是1至1000的整数。两个R基团：R1和R2、R2和R3、R1和R3、R1’和R2’、R2’和R3’或R1’和R3’可以独立地形成3～8元环的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或烷基环烷基；
X3和Y3独立地为N、NH、CH或CR1、或X3和Y3之一可以缺省；
R4、R5、R6、R12和R12’独立地为H、OH、NH2、NH(CH3)、NHNH2、COOH、SH、OZ3、SZ3、F、Cl，或C1-C8直链或支链烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺；
X6是CH、C(O)、N、P(O)NH、P(O)NR1、CHC(O)NH、C1-C8直链或支链烷基，或杂烷基；C3-C8芳基、杂芳基、烷基环烷基、酰氧基、烷基芳基、烷基芳氧基或烷基芳氨基，或Aa(氨基酸)；
Z3是H、OP(O)(OM1)(OM2)、OCH2OP(O)(OM1)(OM2)、OSO3M1、或O-糖苷(葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、葡糖醛酸苷/葡糖醛酸、阿洛糖苷、果糖苷等)、NH-糖苷、S-糖苷或CH2-糖苷；M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4或NR1R2R3；
的定义如前所述；
(n)CC-1065类似物和多卡霉素类似物具有以下结构、CC01、CC02、CC03、CC04、CC05、CC06和CC07：
/>
其中当连接到位点时，X1、X2、Y1和Y2独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；或者当未连接到连接位点/>时，为OH、NH2、NHNH2、NHR1、SH、C(O)OH、C(O)NH2、OC(O)NH2、OC(O)OH、NHC(O)NH2、NHC(O)SH、OC(O)NH(R1)、N(R1)C(O)NH(R2)、C(O)NHNHC(O)OH或C(O)NHR1；
Z3是H、PO(OM1)(OM2)、SO3M1、CH2PO(OM1)(OM2)、CH3N(CH2CH2)2NC(O)-、O(CH2CH2)2NC(O)-、R1、或糖苷；其中R1、R2、R3、M1、M2、和n的定义同前文所述；
(o)毒伞肽及其类似物具有以下结构，Am01、Am02、和Am03：
或一种或多种化学元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中X1，和Y1独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH2、CHNH、CH2O、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；R7、R8、和R9独立地为为H、OH、OR1、NH2、NHR1、C1-C6烷基、或缺省；Y2是O、O2、NR1、NH、或缺省；R10是CH2、O、NH、NR1、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O、OC(O)O、C(O)、OC(O)、OC(O)(NR1)、(NR1)C(O)(NR1)、C(O)R1或缺省；R11是OH、NH2、NHR1、NHNH2、NHNHCOOH、O-R1-COOH、NH-R1-COOH、NH-(Aa)rCOOH、O(CH2CH2O)pCH2CH2OH、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NR1R2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-COOH、NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH-Ar-COOH、NH-Ar-NH2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-NHSO3H、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H、R1-NHSO3H、NH-R1-NHSO3H、O(CH2CH2O)p-CH2CH2NHPO3H2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2、OR1、R1-NHPO3H2、R1-OPO3H2、O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2、OR1-NHPO3H2、NH-R1-NHPO3H2、或NH(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2，其中(Aa)r指1-8个氨基酸；n和m1独立地为1-20；p是1-1000；R1、R2和Ar的定义在本专利申请中前后相同；的定义如前文所述。
(p)Spliceostatins和pladienolides是spliceostatin A，FR901464，和(2S，3Z)-5-{[(2R，3R，5S，6S)-6-{(2E，4E)-5-[(3R，4R，5R，7S)-7-(2-肼基-2-氧乙基)-4-羟基-1，6-二氧杂吡啶[2.5]辛-5-基]-3-五甲基-2，4-二烯-1-基-l}-2，5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧基-3-烯-2-基醋酸酯，Pladienolide B，Pladienolide D，和E7107具有Sp-01母核结构：
(q)蛋白激酶抑制剂选自Adavosertib、阿法替尼、阿昔替尼、巴非替尼、博舒替尼、柯美替尼、克唑替尼、卡波替尼、达沙替尼、恩曲替尼、厄达非替尼、厄洛替尼、福他替尼、吉非替尼、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、莫比替尼、尼洛替尼、帕唑帕尼、帕那替尼、波纳替尼、Rebastinib、瑞戈非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、SU6656、托法替尼、凡德替尼、维罗非尼、恩曲替尼、帕博西、Ribociclib、阿贝西利、达可替尼、来那替尼、(CO-1686)、奥希替尼、AZD3759、纳扎替尼(EGF816)，具有下示结构，PK01-PK40：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
其中Z5和Z5’独立地选自O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；R1和R2的定义如上；
(r)MEK抑制剂选自PD0325901，塞鲁替尼(AZD6244)，cobimetinib(XL518)，瑞法替尼，曲美替尼(GSK1120212)，pimasertib，比美替尼(MEK162)，AZD8330，RO4987655，RO5126766，WX-554，E6201，GDC-0623，PD-325901和TAK-733，具有下式结构：
其中Z5选自O，NH，NHNH，NR5，S，C(O)O，C(O)NH，OC(O)NH，OC(O)O，NHC(O)O，NHC(O)NH，NHC(O)S，OC(O)N(R1)，N(R1)C(O)N(R2)，C(O)NHNHC(O)和C(O)NR1；R1和R2的定义如上；
(s)蛋白酶抑制剂选自卡非佐米、克林霉素、瑞他莫林、Indibulin具有下式结构：
(t)免疫毒素选自白喉毒素(DT)、霍乱毒素(CT)、天花粉蛋白(TCS)、淀粉酶、假单胞菌外毒素A(ETA)、红原毒素、白喉毒素、AB毒素、III型外毒素、前溶血素和顶溶血素；
(u)细胞受体激动剂或细胞刺激分子选自：叶酸衍生物、谷氨酸脲衍生物、生长抑素及其类似物(选自奥曲肽(Sandostatin)和兰瑞肽(Somatuline))、芳基磺胺、垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)(PAC1)、血管活性肠肽(VIP/PACAP)(VPAC1，VPAC2)、黑色素细胞刺激激素(α-MSH)、胆囊收缩素(CCK)/胃泌素受体激动剂、铃蟾素(选自Pyr-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)/胃泌素释放肽(GRP)。神经降压素受体配体(NTR1，NTR2，NTR3)；物质P(NK1受体)配体；神经肽Y(Y1–Y6)；归巢肽包括RGD(Arg-Gly-Asp)，NGR(Asn-Gly-Arg)，二聚体和多聚体环状RGD肽(选自cRGDfV)，TAASGVRSMH和LTLRWVGLMS(硫酸软骨素蛋白聚糖NG2受体配体)和F3肽；细胞穿透肽(CPPs)；肽激素选自促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂和拮抗剂，以及促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂选自布舍瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OtBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt)，戈那瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，戈舍瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OtBu)-Leu-Arg-Pro-AzGly-NH2)，组氨瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(N-benzyl)-Leu-Arg-Pro-NHEt)，亮丙瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt)，那法瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-2Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，曲普瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，纳法瑞林、地洛林、阿贝瑞林(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-(N-Me)Tyr-D-Asn-Leu-异丙基Lys-Pro-DAla-NH2)，西曲瑞克(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2)，地加瑞克(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-4-aminoPhe(L-hydroorotyl)-D-4-aminoPhe(carba-moyl)-Leu-异丙基Lys-Pro-D-Ala-NH2)，和地加瑞克(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-Tyr-D-(N9，N10-diethyl)-homoArg-Leu-(N9，N10-diethyl)-homoArg-Pro-D-Ala-NH2)；模式识别受体(PRRs)，选自类Toll受体(TLRs)配体，C型凝集素和结节状的受体(NLRs)配体；降钙素受体激动剂；整合素受体及其受体子类(选自αVβ1、αVβ3、αVβ5、αVβ6、α6β4、α7β1、αLβ2、αIIbβ3)激动剂(选自GRGDSPK，cyclo(RGDfV)(L1)及其衍生物[环状(-N(Me)R-GDfV)，环状(R-Sar-DfV)，环状(RG-N(Me)D-fV)，环状(RGD-N(Me)f-V)，环状(RGDf-N(Me)V-)(西仑吉肽)]；Anticalin(脂质运载蛋白的衍生物)；Adnectins(10个FN3(纤连蛋白))；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)；Avimers；EGF受体，或VEGF受体激动剂；
细胞受体激动剂选自以下：LB01(叶酸)、LB02(PMSA配体)、LB03(PMSA配体)、LB04(PMSA配体)、LB05(生长抑制素)、LB06(生长抑制素)、LB07(奥曲肽、生长抑制素类似物)、LB08(兰瑞肽、生长抑制素类似物)、LB09(伐普肽(Sanvar)、生长抑制素类似物)、LB10(CAIX配体)、LB11(CAIX配体)、LB12(胃泌素释放肽受体(GRPr)、MBA)、LB13(促黄体激素释放激素(LH-RH)和GnRH配体)、LB14(促黄体激素释放激素(LH-RH)和GnRH配体)、LB15(GnRH拮抗剂、Abarelix)、LB16(钴胺素、维生素B12类似物)、LB17(钴胺素、维生素B12类似物)、LB18(用于αvβ3整联蛋白受体、环状RGD五肽)、LB19(VEGF受体的异二价肽配体)、LB20(神经髓质素B)、LB21(蛙皮素，作用于G蛋白偶联受体)、LB22(TLR2，作用于类Toll受体)、LB23(作用于雄性激素受体)、LB24(西仑吉肽或环(-RGDfV-)αv整合素受体、LB23(氟可的松)、LB25(利福布汀类似物)、LB26(利福布汀类似物)、LB27(利福布汀类似物)、LB28(氟氢可的松)、LB29(地塞米松)、LB30(丙酸氟替卡松)、LB31(丙酸倍氯米松)、LB32(醋酸曲安奈德)、LB33(泼尼松龙)、LB34(泼尼松龙)、LB35(甲基强的松龙)、LB36(倍他米松)、LB37(伊立替康类似物)、LB38(克唑替尼类似物)、LB39(硼替佐米类似物)、LB40(卡菲佐米类似物)、LB41(卡非佐米类似物)、LB42(亮丙瑞林类似物)、LB43(曲普瑞林类似物)、LB44(克林霉素)、LB45(利拉鲁肽类似物)、LB46(半长春新碱类似物)、LB47(瑞他帕林类似物)、LB48(丁布尔类似物)、LB49(长春碱类似物)、LB50(利西森肽类似物)、LB51(奥西丁尼类似物)、LB52(核苷类似物)、LB53(厄洛替尼类似物)和LB54(拉帕替尼类似物)具有下式结构：
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其中X4、和Y1独立地为O、NH、NHNH、NR1、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH2、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；
(v)一种，两种或更多种DNA、RNA、mRNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和PIWI相互作用RNA(piRNA)具有下式：
其中是连接本专利的支链连接子的位点；/>是单链或双链的DNA、RNA、mRNA、siRNA、miRNA、或piRNA；X1、和Y独立地为O、NH、NHNH、NR1、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH2、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或类抗体蛋白选自：
(A)：由前体、纳米抗体、肽、聚合物胶束、脂质体、基于脂蛋白的药物载体、纳米颗粒药物载体、树枝状聚合物和以及包被或连接有类抗体蛋白(抗体)的上述颗粒，或上述两种或多种的组合；
(B)：组合包括全长抗体(多克隆抗体、单克隆抗体、二聚体、多聚体)、多特异性抗体(选自双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体))、单链抗体、结合靶细胞的抗体片段、单克隆抗体、单链单克隆抗体、结合靶细胞的单克隆抗体片段、嵌合抗体、结合靶细胞的嵌合抗体片段、结构域抗体、结合靶细胞的结构域抗体片段、表面重塑抗体、表面重塑单链抗体、或结合靶细胞的表面重塑抗体片段、人源化抗体或表面重塑抗体，人源化单链抗体或与靶细胞结合的人源化抗体片段、抗独特型(抗-Id)抗体、CDR's、双抗体、三抗体、四抗体、小抗体、前抗体、前抗体片段、小免疫类抗体蛋白(SIP)、淋巴因子类抗体蛋白、激素型类抗体蛋白、生长因子类抗体蛋白、集落刺激因子类抗体蛋白、营养转运类抗体蛋白、大分子量类抗体蛋白、融合类抗体蛋白、激酶抑制剂类抗体蛋白、基因靶向类抗体蛋白，包被在纳米颗粒上的类抗体蛋白，或抗体或大分子量类抗体蛋白修饰的高分子；或
(C)：组合包括IgG抗体能够结合肿瘤细胞、病毒感染细胞、微生物感染细胞、寄生虫感染细胞、自身免疫疾病细胞、活化肿瘤细胞、髓样细胞、活化的T细胞、受影响的B细胞或黑素细胞、或抗以下抗原或受体中任一种的异常细胞：CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD12w、CD14、CD15、CD16、CD16a、CD16b、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD32a、CD32b、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD49c、CD49d、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD67、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75s、CD76、CD77、CD78、CD79、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD85a、CD85b、CD85c、CD85d、CD85e、CD85f、CD85g、CD85g、CD85i、CD85j、CD85k、CD85m、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120、CD120a、CD120b、CD121、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD123a、CD124、CD125、CD126、CD127、CD128、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CDw145、CD146、CD147、CD148、CD149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD156a、CD156b、CD156c、CD156d、CD157、CD158、CD158a、CD158b1、CD158b2、CD158c、CD158d、CD158e1、CD158e2、CD158f2、CD158g、CD158h、CD158i、CD158j、CD158k、CD159、CD159a、CD159b、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167、CD167a、CD167b、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CDw186、CD187、CD188、CD189、CD190、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CD198、CD199、CDw198、CDw199、CD200、CD201、CD202、CD202(a、b)、CD203、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CDw210a、CDw210b、CD211、CD212、CD213、CD213a1、CD213a2、CD214、CD215、CD216、CD217、CD218、CD218a、CD218、CD21b9、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235、CD235a、CD235b、CD236、CD237、CD238、CD239、CD240、CD240ce、CD240d、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD250、CD251、CD252、CD253、CD254、CD255、CD256、CD257、CD258、CD259、CD260、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD281、CD282、CD283、CD284、CD285、CD286、CD287、CD288、CD289、CD290、CD291、CD292、CD293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300、CD300a、CD300b、CD300c、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD307f、CD308、CD309、CD310、CD311、CD312、CD313、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD323、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD330、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD341、CD342、CD343、CD344、CD345、CD346、CD347、CD348、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD356、CD357、CD358、CD359、CD360、CD361、CD362、CD363、CD364、CD365、CD366、CD367、CD368、CD369、CD370、CD371、CD372、CD373、CD374、CD375、CD376、CD377、CD378、CD379、CD381、CD382、CD383、CD384、CD385、CD386、CD387、CD388、CD389、CRIPTO、CRIPTO、CR、CR1、CRGF、CRIPTO、CXCR5、LY64、TDGF1、4-1BB、APO2、ASLG659、BMPR1B、4-1BB、5AC，5T4(Trophoblast糖蛋白、TPBG、WNT-活化抑制因子1或WAIF1)、腺癌抗原、AGS-5、AGS-22M6、启动素受体激酶1、AFP、AKAP-4、ALK、α整合素、αvβ6、氨基肽酶N、淀粉样蛋白β、雄激素受体、促血管新生蛋白因子2、促血管新生蛋白因子3、膜联蛋白A1、炭疽毒素保护性抗原、抗转移蛋白受体、AOC3(VAP-1)、B7-H3、炭疽杆菌、BAFF(B细胞启动因子)、BCMA、B淋巴瘤细胞、bcr-abl、蛙皮素、BORIS、C5、C242抗原、CA125(糖抗原125、MUC16)、CA-IX(或CAIX、碳酸酐酶9)、CALLA、CanAg、犬红斑狼疮IL31、碳酸酐酶IX、心肌肌凝蛋白、CCL11(C-C片段趋化因子11)、CCR4(C-C趋化因子受体4)、CCR5、CD3E(ε)、CEA(癌胚抗原)、CEACAM3、CEACAM5(癌胚抗原)、CFD(因子D)、Ch4D5、胆囊收缩素2(CCK2R)、CLDN18(Claudin-18)、丛生因子A、cMet、CRIPTO、FCSF1R(集落刺激因子1受体)、CSF2(集落刺激因子2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、CTAA16.88肿瘤抗原、CXCR4、C-X-C趋化因子受体4、环状ADP核糖核酸酶、细胞周期蛋白B1、CYP1B1、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、Dabigatran、DLL3(类Δ配体3)、DLL4(类Δ配体4)、DPP4(双肽-肽酶4)、DR5(死亡受体5)、大肠杆菌shiga毒素类型-1、大肠杆菌shiga毒素类型-2、ED-B、EGFL7(类EGF结构域蛋白7)、EGFR、EGFRII、EGFRvIII、内皮因子、内皮素B受体、内毒素、EpCAM(上皮细胞粘附分子)、EphA2、Episialin、ERBB2(表皮生长因子受体2)、ERBB3、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、大肠杆菌、ETV6-AML、FAP(成纤维细胞活化蛋白α)、FCGR1、甲胎蛋白、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白额外结构域-B、FOLR(叶酸受体)、叶酸受体α、叶酸水解酶、Fos相关抗原1、呼吸道合胞病毒的F蛋白、卷曲受体、岩藻糖GM1、GD2神经节苷脂、G-28(细胞表面抗原糖脂)、GD3独特型、GloboH、Glypican 3、N-羟乙酰神经氨酸、GM3、GMCSF受体α链、生长分化因子8、GP100、GPNMB(跨膜糖蛋白NMB)、GUCY2C(鸟苷酸环化酶2C)、鸟苷酸环化酶C(GC-C)、肠鸟苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶C受体、热稳定肠毒素受体(hSTAR)、热休克蛋白、血凝素、乙肝表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1(人类表皮生长因子受体1)、HER2、HER2/neu、HER3(ERBB-3)、IgG4、HGF/SF(肝细胞生长因子/分散因子)、HHGFR、HIV-1、组蛋白络合物、HLA-DR(人类白细胞抗原)、HLA-DR10、HLA-DRB、HMWMAA、人类绒毛膜促性腺激素、HNGF、人类分散因子受体激酶、HPV E6/E7、Hsp90、hTERT、ICAM-1(细胞间粘附分子1)、独特型、IGF1R(IGF–1、类胰岛素生长因子1受体)、IGHE、IFN-γ、流感血凝素、IgE、IgE Fc区、IGHE、白介素(包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-17A、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、或IL-28)、IL31RA、ILGF2(类胰岛素生长因子2)、整合蛋白(α4、αIIbβ3、αvβ3、α4β7、α5β1、α6β4、α7β7、αllβ3、α5β5、αvβ5)、干扰素γ诱导蛋白质、ITGA2、ITGB2、KIR2D、Kappa Ig、LCK、Le、Legumain、Lewis-Y抗原、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原1、CD11a)、LHRH、LINGO-1、脂磷壁酸、LIV1A、LMP2、LTA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE A1、MAGE A3、MAGE 4、MART1、MCP-1、MIF(巨噬细胞迁移抑制因子、或糖基抑制因子(GIF))、MS4A1(跨膜4结构域亚家族A成员1)、MSLN(间皮素)、MUC1(粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)或多态性上皮粘蛋白(PEM))、MUC1-KLH、MUC16(CA125)、MCP1(单核细胞趋化蛋白1)、MelanA/MART1、ML-IAP、MPG、MS4A1、MYCN、髓磷脂相关糖蛋白、Myostatin、NA17、NARP-1、NCA-90(粒细胞抗原)、Nectin-4(ASG-22ME)、NGF、神经细胞凋亡调控蛋白酶1、NOGO-A、Notch受体、核仁素、Neu致癌基因产物、NY-BR-1、NY-ESO-1、OX-40、OxLDL(氧化低密度脂蛋白)、OY-TES1、P21、p53非突变体、P97、PAP、抗(N-羟乙酰神经氨酸)抗体结合部位、PAX3、PAX5、PCSK9、PDCD1(PD-1、程序性细胞死亡蛋白1)、PDGF-Rα(α血小板源生长因子受体)、PDGFR-β、PDL-1、PLAC1、类PLAP睾丸碱性磷酸酶、血小板衍生生长因子受体β、磷酸钠联合转运体、PMEL 17、聚唾液酸、蛋白酶3(PR1)、前列腺癌、PS(磷脂酰丝氨酸)、前列腺癌细胞、铜绿假单胞菌、PSMA、PSA、PSCA、狂犬病病毒糖蛋白、RHD(Rh多肽1(RhPI))、Rhesus因子、RANKL、RhoC、Ras突变、RGS5、ROBO4、呼吸道合胞病毒、RON、ROR1、肉瘤易位断点、SART3、Sclerostin、SLAMF7(SLAM成员7)、Selectin P、SDC1(多配体蛋白聚糖1)、系统性红斑狼疮(a)、生长调节素C、SIP(1-磷酸鞘氨醇)、生长激素抑制素、精子蛋白17、SSX2、STEAP1(6-跨膜上皮前列腺抗原1)、STEAP2、STn、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白)、存活素、T细胞受体、T细胞跨膜蛋白、TEM1(肿瘤血管内皮标记1)、TENB2、Tenascin C(TN-C)、TGF-α、TGF-β(转化生长因子β)、TGF-β1、TGF-β2(转化生长因子2)、Tie(CD202b)、Tie2、TIM-1(CDX-014)、Tn、TNF、TNF-α、TNFRSF8、TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B)、TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B)、TPBG(滋养细胞糖蛋白)、TRAIL-R1(TNF相关坏死诱导配体受体1)、TRAILR2(死亡受体5(DR5))、肿瘤相关的钙信号传感子2、肿瘤特异糖基化的MUC1、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、TRP-1(Trop1)、TRP-2(Trop2)、酪氨酸酶、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-2、VEGFR-1、VEGFR-2、vimentin、WT1、XAGE 1、表达胰岛素生长因子受体的细胞、或表达表皮生长因子受体的细胞。
13.根据权利要求6所述的方法，其中所述偶联物具有a001-a233、C-009、C-020、C-025、C-027、C-031、C-037、C-038、C-039、C-043、C-046、C-052、C-056、C-059、C-063、C-066、C-071、C-079、C-084、C-087、C-093、C-096、C-102、C-109、C-111、C-118、C-123、C-133、C-143、C-155、C-168、C-172、C-182、C-186、C-198、C-203、C-208、C-214、C-215、C-216、C-217、C-218、C-226、C-227、C-231、C-237、C-249、C-259、C-260、C-261、C-325、C-326、C-327、C-328、C-329、C-330、C331、C-332、C-333、C-334、C-335、C-353、C-363、C-371、C-378、C-379、C-380、C-381、C-384、C-385、C-386、C-387、C-397、C-400、C-403、C-406、C-408a、C-408b、C-408c、C-408d、C-408e、C-408f、C-410a、C-410b、C-410c、C-412a、C-412b、C-412c、C-413a、C-413b、C-413c、C-413d、C-416a、C-416b、C-416c、C-416d、C-422a、C-422b、C-422c、C-422d、C-425a、C-425b、C-425c、C-425d、C-428a、C-428b、C-428c、C-428d、C-431a、C-431b、C-431c、C-431d的结构之一，其中所述药物与抗体的重链-轻链之间的二硫化物结合位点偶联：
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或一种或多种元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中p、p1、p2、和p3独立地为0-100；m、m1、和m2独立地为0-20；n是1-10；
P1是H、OH、NH2、COOH、C(O)NH2、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、OPO(OR18)2、NHPO(OR18)2、OC(O)R18、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC(O)NHR18、OC(O)N(C2H4)2NCH3、OSO2(OR18)、O-(C4-C12-糖苷)、OC(O)N(C2H4)2CH2N(C2H4)2CH3、O-(C1-C8直链或支链烷基)、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸脂(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R17和R18独立地为H、链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；
R1、R2、R3、R1’、R2’、R3’、和R4独立地为H、C1～C8烷基；C2～C8杂烷基、或杂环；C3～C8芳基、芳基烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂烷基环烷基、碳环或烷基羰基；或R1和R2、R1和R3、R2和R3、R3和R4、R1’和R2’、R1’和R3’、或R2’和R3’形成3～7元碳环、环烷基、杂环、杂环烷基、芳香基或杂芳香基环系；
R4、R5、R5’、和R6，独立地为H、C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺、或(Ar)r、r＝1-6(氨基酸或具有相同或不同氨基酸序列的肽)；
R7、R8、和R9独立地为H、OH、OR1、NH2、NHR1、C1-C6烷基、或缺省；
R10是CH2、O、NH、NR1、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O、OC(O)O、C(O)、OC(O)、OC(O)(NR1)、(NR1)C(O)(NR1)、C(O)R1或缺省；
R11是OH、NH2、NHR1、NHNH2、NHNHCOOH、O-R1-COOH、NH-R1-COOH、NH-(Aa)rCOOH、O(CH2CH2O)pCH2CH2OH、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NR1R2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-COOH、NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH-Ar-COOH、NH-Ar-NH2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-NHSO3H、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H、R1-NHSO3H、NH-R1-NHSO3H、O(CH2CH2O)p-CH2CH2NHPO3H2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2、OR1、R1-NHPO3H2、R1-OPO3H2、O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2、OR1-NHPO3H2、NH-R1-NHPO3H2、或NH(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2，其中(Aa)r是1-8个氨基酸；n和m1独立地为1-20；p是1-1000；R1、R2和Ar，的定义如本申请中前文所述；定义同上；
R12和R12’独立地为H、＝O、OR1、NH2、NH(CH3)、NHNH2、COOH、SH、OZ3、SZ3、F、Cl、或C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺；
R25、R26和R25’独立地为H、Ac、R1、C(O)NHR1、C(O)R1、R1COOH、R1COOR2、R1OR2、R1CONHR2、CH2OAc、CH2NHAc、R1NH2、NR1R2、N+R1R2R3、CH2CONH(CH2)q1COOH、CH2CONH(CH2)q1COOR1、CH2CONH(CH2)q1N+R1R2R3、或(Aa)r；
X1、X2、X4、Y1和Y2，当与位点连接，独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、CH2、CHNH、CH2O、C(O)NHNHC(O)、OCH2C6H4NH、NHCH2C6H4NH、SCH2C6H4NH和C(O)NR1；当未与/>位点连接，为OH、NH2、NHNH2、NHR1、SH、C(O)OH、C(O)NH2、OC(O)NH2、OC(O)OH、NHC(O)NH2、NHC(O)SH、OC(O)NH(R1)、N(R1)C(O)NH(R2)、C(O)NHNHC(O)OH和C(O)NHR1；另外，当与S连接时Y2可以是O、O2、NR1、NH、或缺省；
X3和Y3独立地为N、NH、CH、CH2或CR1，或X3和Y3之一可以缺省；其中R1是C1-C8直链或支链烷基、杂烷基；C3-C8芳基、杂芳基、烷基环烷基、酰氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、烷基芳基氨基、烷基芳基巯基；(Ar)r、r＝1-6(氨基酸或具有相同或不同氨基酸序列的肽)；
X3是H、CH3或X1’R1’、其中X1’是NH、N(CH3)、NHNH、O、或S；且R1’是H、C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺；
Z3’是H，COOR1，NH2，NHR1，OR1，CONHR1，NHCOR1，OCOR1，OP(O)(OM1)(OM2)，OCH2OP(O)(OM1)(OM2)，OSO3M1，R1，或O-糖苷(葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、葡糖醛酸苷/葡糖苷酸、阿洛苷、果糖苷等)、NH-糖苷、S-糖苷或CH2-糖苷；M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4、NR1R2R3；
X5是F、Cl、Br、I、OH、OR1、R1、OPO3H2、OSO3H、NHR1、OCOR1、NHCOR1、CN或OCH2OP(O)(OM1)(OM2)；
Y5是NH、NHNH、NR1、O、OCH2C6H4NH、NHCH2C6H4NH、SCH2C6H4NH、R1、(Ar)r，r＝1-6(具有相同或不同氨基酸序列的氨基酸或肽)；
X6和Y6独立地为CH、C(O)、N、P(O)NH、P(O)NR1、CHC(O)NH、C1-C8直链或支链烷基、或杂烷基；C3-C8芳基、杂芳基、烷基环烷基、酰氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、烷基芳基氨基或Aa(氨基酸)；
Z5和Z5’独立地选自O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；
X8是O、S、NH、NHNH、NHR1、SR12、SSR12、SSCH(CH3)R1、SSC(CH3)2R1、或R1；
其中R1、R2和R3独立地是H、C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基或酰氧基胺，除非它们在结构式中定义；
Lv1是同前文定义的离去基团；
M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4、或NR1R2R3。
14.根据权利要求1的方法，其中所述药物/连接子复合物具有以下结构之一：
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或一种或多种元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中m、m1、m2、n、P1、R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12、R12’、R25、R26、R25’、X1、X2、X3、X5、X6、Y1、Y2、Y6、Z3、Z5、p、p1、p2、p3、q1、q2、Lv1、Aa、(Aa)r、Ar且mAb的定义如权利要求1所述。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述肿瘤细胞选自淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、肾细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞状癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、睾丸癌细胞、恶性细胞以及以不受调节的、加速生长和分裂以导致癌症的细胞。
16.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求6、13或22的偶联物及其药学上可接受的盐、载体、稀释剂或辅料，或两种或多种偶联物的组合，以治疗或预防癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其为液体制剂或配制的冻干固体/粉末，重量占比：0.01％-99％的权利要求6、13或22的一种或多种偶联物；0.0％-20.0％的一种或多种多元醇；0.0％-2.0％的一种或多种表面活性剂；0.0％-5.0％的一种或多种防腐剂；0.0％-30％的一种或多种氨基酸；0.0％-5.0％的一种或多种抗氧化剂；0.0％-0.3％的一种或多种金属螯合剂；0.0％-30.0％的一种或多种缓冲盐，用于将组合物的pH调节至pH 4.5-7.5；和0.0％-30.0％的一种或多种等渗剂，用于在被重构以施用给患者时将渗透压调节在约250-350mOsm之间；
其中多元醇选自组合包括果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松解糖、棉子糖、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、赤藓糖醇、赤藓糖醇山梨糖醇、甘油或L-葡萄糖酸盐及其金属盐；
表面活性剂可选自组合包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、或聚山梨醇酯85、泊洛沙姆、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)、聚丙二醇-丙二醇、Triton、十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸钠、辛基糖苷钠、十二烷基、肉荳蔻酰基、亚油基或硬脂基磺基甜菜碱、十二烷基、肉荳蔻酰基、亚油基或硬脂基肌氨酸、亚油酸、肉荳蔻基或十六烷基甜菜碱、月桂酰氨基丙基、椰油酰胺丙基、亚油酰胺丙基、肉荳蔻酰基丙基、棕榈酰基丙基或异硬脂酰氨基丙基-甜菜碱(月桂酰胺丙基)、肉荳蔻酰胺丙基、棕榈酰丙基或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺、甲基椰油酰基钠或甲基油基牛磺酸二钠、十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲基氧化胺、椰油酰胺丙基甜菜碱和可可两性甘氨酸酯；或异硬脂基乙基亚胺鎓乙基硫酸盐；聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物；
其中防腐剂选自组合包括苄醇、十八烷基二甲基芐基氯化铵、六甲基氯化铵、苯扎氯铵和芐索氯铵、苯酚、丁醇和苯甲醇，对羟基苯甲酸烷基酯例(如甲酯或丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；
其中氨基酸选自组合包括精氨酸、胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；
其中抗氧化剂选自抗坏血酸、谷胱甘肽、胱氨酸或和蛋氨酸；
其中螯合剂是EDTA或EDTA；
其中缓冲盐选自组合包括柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的钠盐、钾盐、铵盐或三羟乙基氨基盐；氨基丁三醇盐酸盐、磷酸盐或硫酸盐；精氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸或组氨酸的乙酸盐、氯化物、磷酸盐、硫酸盐或琥珀酸盐；
其中等渗剂选自组合包括甘露醇、山梨糖醇、乙酸钠、氯化钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸三钠或氯化钠。
18.根据权利要求16所述的药物组合物以液体或冻干固体的形式保持在小瓶，瓶，预填充注射器，预填充自动注射器。
19.一种用于协同治疗或预防癌症、自身免疫性疾病或传染病的方法，包括施用权利要求16的药物组合物，同时施用化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、自身免疫性疾病剂、抗感染剂或另一种偶联物的协同剂。
20.根据权利要求20所述的方法，其中所述增效剂是选自以下药物中的一种或多种：阿巴西普、阿贝西比利、醋酸阿比特龙、Abraxane、对乙酰氨基酚/氢可酮、Acalabrutinib、Aducanumab、Adalimumab、ADXS31-142、ADXS-HER2、阿法替尼双马来酸酯、Aldesleukinalectinib、Alemtuzumab、Alitretinoin、ado-trastuzumab emtansine、安非他命/右旋苯丙胺、阿那曲唑、阿立哌唑、蒽环类药物、阿立哌唑、阿扎那韦、阿妥唑单抗、阿托伐他汀、阿韦拉单抗、阿昔布西汀、Brentuximab vedotin、Brigatinib、Budesonide、Budesonide/福莫特罗、Bupre-norphine、Cabazitaxel、Cabozantinib、Capmatinib、Capecitabine、carfilzomib、嵌合抗原受体工程T(CAR-T)细胞、Celecoxib、Ceritinib、Cetuxib、Cetuxi-mab、克唑替尼、克比美替尼、科森蒂斯、克唑替尼、CTL019、达比加群、达布拉非尼、达卡巴嗪、达克珠单抗、达科替尼、达托霉素、达拉他珠单抗、达比波锡阿尔法、达鲁那韦、达沙替尼、地尼洛芬、地诺单抗、Depakote、地兰索拉唑、地塞哌甲酯、地塞米松、Dinutuximab、多西环素、度洛西汀、Duvelisib、Durvalumab、依洛珠单抗、/埃洛珠单抗/艾美洛韦、依诺肝素、恩沙替尼、恩扎鲁胺、依泊汀阿尔法、厄洛替尼、埃索美拉唑、依佐匹克隆、依那西普、依维莫司、依西美坦、依维莫司、艾塞那肽ER、依泽替米贝、依泽替米贝/辛伐他汀、非诺贝特、非格拉斯汀、芬戈利莫德、丙酸氟替卡松、氟替卡松/沙美特罗、Fulvestrant、Gazyva、吉非替尼、Glatiramer、醋酸高斯瑞林、伊克替尼、伊马替尼、伊布替尼、伊布替尼、依德利西布、异环磷酰胺、英夫利昔单抗、咪喹莫特、ImmuCyst、ImmunoBCG、伊尼帕里、阿斯巴肽胰岛素、地塞米尔胰岛素、甘精胰岛素、利斯普洛胰岛素、α-干扰素、α-1b干扰素、α-2a干扰素、α-2b干扰素、β-干扰素、β-1a干扰素、β-1b干扰素、γ-1a干扰素、拉帕蒂尼、伊普利单抗、异丙托品溴铵/沙丁胺醇、异唑MIB、卡努马、醋酸兰诺肽、利奈多明、利奈酰胺、甲磺酸利奈替尼、来曲唑、左旋甲状腺素、左旋甲状腺素、利多卡因、利奈唑胺、利拉鲁肽、利地塞米松、LN-144氯雷替尼、美金刚、甲基哌啶酮、美托洛尔、Mekinist、美西他滨/利吡韦林/替诺福韦、莫达非尼、莫米松、Mycidac-C、尼西妥单抗、Neratinib、尼洛替尼、尼拉帕利布、尼古拉单抗、Ofatumumab、奥比妥珠单抗、奥拉帕尼、奥美沙坦、奥美沙坦/氢氯噻嗪、奥马珠单抗、Omega-3脂肪酸乙酯、Oncorine、Oselta-mivir、Osimertinib、羟考酮、Palbociclib、帕利珠单抗、帕尼单抗、Panobinostat、帕唑帕尼、Pembrolizumab、PD-1抗体、PD-L1抗体、培美曲塞、帕妥珠单抗、肺炎球菌结合疫苗、泊马利度胺、普瑞巴林、ProscaVax、普萘洛尔、喹硫平、雷贝拉唑、普鲁巴新223氯化镭、雷洛昔芬、雷洛昔韦、雷莫昔单抗、雷珠单抗、雷戈非尼、利妥昔单抗、利伐沙班、罗米地辛、瑞舒伐他汀、鲁索替尼磷酸盐、沙丁胺醇、Savolitinib、Semaglutide、Seve-lamer、西地那非、Siltuximab、Sipuleucel-T、西他列汀、西他列汀/二甲双胍、Solifenacin、Solanezumab、Sonidegib、索拉非尼、舒尼替尼、Tacrolimus、Tacrimus、塔帕西拉非、Tac-rimus tataparal、他唑帕尼、替莫唑胺、替西罗莫司、替诺福韦/恩曲他滨、替诺福韦二吡呋酯富马酸酯、睾丸激素凝胶、沙利度胺、TICE BCG、碘托溴铵、替沙吉林、托瑞米芬、曲美替尼、曲妥珠单抗、曲贝汀(Ecteinascidin 743)、曲美替尼、曲美单抗、三氟吡啶/替吡西酯、维甲酸、Uro-BCG、Ustekinumab、Valsartan、Veliparib、Vandetanib、Vemurafenib、Venetoclax、Vorinostat、Ziv-aflibercept、Zostavax及其类似物、衍生物、药学上可接受的盐、载体、稀释剂或辅料，或两种或多种化合物的组合。
21.式(V)、(VI)或(VII)偶联物如下所示：
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其中n是1–20；n’是1-10；mAb是抗体或类抗体蛋白；
其中L1和L2是，相同或不同，独立地选自O、NH、S、NHNH、N(R3)、N(R3)N(R3’)、(OCH2CH2)pOR3、(OCH2CH(CH3))pOR3、NH(CH2CH2O)pR3、或NH(CH2CH(CH3)O)pR3、N[(CH2CH2O)pR3][(CH2CH2O)p’R3’]、(OCH2CH2)pCOOR3、CH2CH2(OCH2CH2)pCOOR的聚乙二醇单元3，其中p和p’独立地选自0至约1000的整数；C1-C8烷基；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；其中R3和R3’独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基、C3-C8芳基、Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；或1-8个碳原子的酯、醚或酰胺；或定义中所述的1～8个天然或非天然氨基酸；或结构式为(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙二醇单元、其中p是0至约1000的整数、或以上一种或两种的组合；
其中L1或L2独立地可以含有自我毁灭或非自我毁灭的组分、肽单元、腙键、二硫化物、酯、肟、酰胺或硫醚键。自我毁灭单元包括但不限于，与对氨基芐基氨甲酰基(PAB)的电子结构相似的芳香化合物选自2-氨基咪唑-5-甲醇的衍生物、杂环PAB类似物、β-葡糖苷酸、以及邻或对氨基芐基缩；
其中自我毁灭型连接子组分具有以下结构之一：
其中(*)是另外的间隔体或可断裂的连接子单元，或细胞毒剂、和/或细胞结合分子(CBA)的连接点；X1、Y1、Z2和Z3独立地为NH、O、或S；Z1独立地为H、NH、O或S；v是0或1；U1独立地为H、OH、C1-C6烷基、(OCH2CH2)nF、Cl、Br、I、OR5、SR5、NR5R5’、N＝NR5、N＝R5、NR5R5’、NO2、SOR5R5’、SO2R5、SO3R5、OSO3R5、PR5R5’、POR5R5’、PO2R5R5’、OPO(OR5)(OR5’)，或OCH2PO(OR5(OR5’)，其中R5和R5’如前文所定义；
非自我毁灭型连接子组分为以下结构之一：
/>
其中(*)是另外的间隔体R1或可断裂的连接子单元、或细胞毒性分子和/或细胞结合分子的连接点；X1、Y1、U1、R5、R5’如前文所定义；r是0-100；m和n独立地为0-6；
其中L1或L2可独立地由一个或多个下列连接子组分构成：6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”或“af”)、对氨基芐氧基羰基(“PAB”)、4-硫代戊酰基(“SPP”)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1酰基(“MCC”)、(4-乙酰基)氨基苯酰基(“SIAB”)、4-硫丁酰基(SPDB)、4-硫-2-羟基磺酰基-丁酰基(2-Sulfo-SPDB)，或含有1-8个天然或非天然氨基酸单元的天然或非天然肽；
其中L1和L2独立地是可断裂连接子；
其中可断裂连接子(L1或L2)包括：
-(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-，-(Aa)r-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t-，-(CR5R6)m-(CR7＝CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(CO)(Aa)t-(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m-phenyl-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-呋喃-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-恶唑-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-噻唑-CO(Aa)t(CCR7R8)n-，-(CR5R6)t-噻吩-CO(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-咪唑-CO-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-吗啉-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-N-甲基哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R)m-(Aa)tphenyl-，-(CR5R6)m-(Aa)t呋喃-，-(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-噻唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-噻吩-(Aa)t-，-(CR5R6)m-咪唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-吗啉-(Aa)t-，-(CR5R6)m-哌嗪-(Aa)t-，-(CR5R6)m-N-甲基哌嗪-(Aa)t-，-K(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-K(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-，-K(Aa)r-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-K(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t-，-K(CR5R6)m-(CR7＝CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(CO)(Aa)t-(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K-(CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m-phenyl-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K-(CR5R6)m-呋喃-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)m-恶唑-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R6)m-噻唑-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t-噻吩-CO(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t咪唑-CO-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)tmorpholino-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t-N-甲基哌嗪CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R)m(Aa)tphenyl，-K-(CR5R6)m-(Aa)t呋喃-，-K(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-噻唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-噻吩-(Aa)t-，-K(CR5R6)m-咪唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-morpholino(Aa)t-，-K(CR5R6)m-哌嗪-(Aa)tG，-K(CR5R6)mN-甲基哌嗪(Aa)t-；其中m、Aa、m、n、R3、R4、和R5定义如前文所描述；t和r独立地为0–100；R6、R7、和R8独立地选自H；卤化物；C1～C8烷基、芳基、烯基、炔基、醚、酯、胺或酰胺，任选地被一种或多种卤化物取代，CN、NR1R2、CF3、OR1、Aryl、杂环、S(O)R1、SO2R1、-CO2H、-SO3H、-OR1、-CO2R1、-CONR1、-PO2R1R2、-PO3H或P(O)R1R2R3；K是NR1、-SS-、-C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-C＝NH-O-、-C＝N-NH-、-C(＝O)NH-NH-、O、S、Se、B或C3-C6杂芳基；
连接子L1和L2的组分的示例结构有：
(包含MC，6-马来酰亚胺己酰基)，/>(MP，马来酰亚胺丙酰基)，/> (PAB，p-对氨基芐氧基酰胺基)，/> (含缬氨酸-瓜氨酸(VC))，/>(MCC，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯)，((4-乙酰基)氨基苯甲酸酯)，/>(4-硫代-2-羟基磺酰丁酸酯，2-磺基-SPDB)，/>4-硫代戊酸酯(SPP)，/>4-硫代丁酰基(SPDB)，/>4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-酰基(MCC)，/>马来酰亚胺乙氨基(ME)，/>4-硫代-2-羟基磺酰基丁酰基(2-Sulfo-SPDB)，/>芳基巯醚基(PhSS)，(4-乙酰基)氨基苯酰基(SIAB)，/>氧芐基硫醚基，/>氨基苄基硫醚基，/>二氧基苄基硫醚基，二氨基苄基硫醚基，/>氨基氧基苄基硫醚基，烷氧基氨基(AOA)，/>亚乙基氧基(EO)，/>二硫，4-甲基-4-二硫代戊酸(MPDP)，/>三唑，/>烷基磺酰基，/>烷基磺胺，/>砜基二磺胺，/>磷二酰胺，烷基膦酰胺，/>膦酸，/>N-甲基烷基膦酰胺，N，N’-二甲基磷二酰胺，/>N，N’-烷基膦二酰胺，/> 肼，/>乙脒，/>肟，二乙酰肼，/>氨基乙基胺，/>氨基乙基-氨基乙基-胺，/>/> gly-gly-gly，/>gly-gly，/>gly-gly-gly-gly，/>Lys-gly，/>gly-gly-phe-gly，/>ala-ala，/>glu-gly，/>glu-lys，/>(VC)， (ala-phe)，(lys-phe)，或两个或多个的组合；其中/>是连接位点；X2、X3、X4、X5、或X6、独立地选自NH、NHNH、N(R12)、N(R12)N(R12’)、O、S、C1-C6烷基、C2-C6杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基、C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、CH2OR12、CH2SR12、CH2NHR12、或1～8氨基酸；其中R12和R12’独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；或C1-C8酯、醚或酰胺；或结构式为(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙二醇单元，其中p是0至约1000的整数，或两个或多个的组合。
其中L1、L2、X1、X2、X3、X1’、X2’和X3’可独立地缺省；
其中E1是连接两个巯基可反应基团Lv1和Lv2的连接基团，E1选自CH、CH2、NH、NHNH、N(R3)、N(R3)N(R3’)、N＝N、N-N、P、P(＝O)、S、Si、C2-C8烷基、杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；含有1～4个氨基酸残基的肽；或以下结构之一：
/> 其中/>是连接位点；
其中D1和D2是细胞毒性药物、或治疗性药物、或免疫治疗性短类抗体蛋白、用于增强或稳定细胞结合类抗体蛋白试剂的功能性分子、细胞表面受体结合剂、抗体片段、siRNA或DNA分子，选自：
1)化疗药物：
a)烷基化剂，氮芥：氯苯那普、氯普那嗪、环磷酰胺、达喀尔巴嗪、雌二醇氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸二甲氧胺、氧化二氮芥、盐酸氨氯地平、麦考酚酸、卫矛醇、呱泊溴烷、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、噻替呱、曲磷胺对、尿嘧啶；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新、比折来新及其合成类似物)；多卡霉素(包括KW-2189和CBI-TMI、及其合成类似物)；苯并二氮卓二聚体(包括吡咯并苯二氮卓(PBD)或托美霉素、吲哚并苯并二氮卓、咪唑并苯并噻二氮卓或恶唑烷并苯并二氮卓的二聚体)；亚硝基脲(卡莫司汀、洛莫司汀、氯化梭菌素、福莫司汀、尼莫司汀、拉莫司汀)；烷基磺酸酯(白苏芬、树苏芬、磺胺异丙磺胺和皮苏芬)；三氮烯(达喀尔巴嗪)；含铂化合物(卡铂、顺铂、奥沙利铂)；吖丙啶类、苯并二氢吡喃酮、卡洛酮、美妥替派和乌雷多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺、包括六甲蜜胺、三亚乙基三胺、三乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基甲基胺；
b)植物生物碱：长春花生物碱(长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、去甲长春碱)；紫杉醇类(紫杉醇、多西紫杉醇及其类似物)；美登素类(DM1、DM2、DM3、DM4、美登素、安沙霉素及其类似物)；cryptophycin(特别是cryptophycin 1和cryptophy-cin 8)；埃博霉素、软珊瑚醇、迪莫利德、草苔虫内酯、海兔毒素、奥瑞他汀、微管毒素、ephalostatin；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑制素；
c)DNA拓扑异构酶抑制剂、依托泊苷替尼(9-氨基喜树碱、喜树碱、克立那托、多拉霉素、依托泊苷、磷酸依托泊苷、伊立替康、米托蒽醌、诺消灵、视黄酸(视黄醇)、替尼泊苷、拓扑替康、9-硝基喜树碱(RFS2000))；丝裂霉素(丝裂霉素C)；
d)抗代谢物、抗叶酸剂、DHFR抑制剂(甲氨蝶呤、曲麦克特、二甲叶酸、蝶罗呤、氨喋呤(4-氨基苯甲酸)或其他叶酸类似物)；IMP脱氢酶抑制剂(麦考酚酸、噻唑呋林、利巴韦林、EICAR)；核糖核苷酸还原酶抑制剂(羟基脲、去铁胺)；嘧啶类似物、尿嘧啶类似物(安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿嘧啶、卡培他滨(希罗达)、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、ratitrexed(Tomudex)；胞嘧啶类似物(阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟达拉滨)；嘌呤类似物(硫唑嘌呤、氟达拉滨、巯嘌呤、硫胺素、硫鸟嘌呤)；叶酸补充剂、弗洛林酸；
e)激素疗法剂、受体拮抗剂：[抗雌激素(甲地孕酮、雷洛昔芬、他莫昔芬)、LHRH兴奋剂(戈斯他林、醋酸亮丙瑞林)；抗雄激素药(比卡鲁胺、氟他胺、卡鲁司酮、丙酸倍他雄酮、表雄甾醇、戈舍瑞林、亮丙瑞林、美替利定、尼鲁米特、睾内酯、曲洛司坦及其他雄激素抑制剂)；维甲类化合物、维生素D3类似物(CB1093、EB1089、KH1060、胆钙化醇、麦角钙化甾醇)；光动力疗法剂(维替泊芬、酞菁、光敏剂Pc4、去甲氧基-竹红菌素A)；细胞因子(干扰素-α、干扰素-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、含TNF的人蛋白)]；
f)激酶抑制剂、BIBW 2992(抗-EGFR/Erb2)、伊马替尼、吉非替尼、呱加他尼、索拉非尼、达沙替尼、舒尼替尼、厄洛替尼、尼洛替尼、拉帕替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、凡德他尼、E7080(抗VEGFR2)、mubritinib、普纳替尼(AP24534)、bafetinib(INNO-406)、bosutinib(SKI-606)、卡博替尼、维莫德吉、iniparib、鲁索利替尼、CYT387、阿西替尼、tivozanib、索拉非尼、贝伐单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、雷珠单抗、帕尼单抗、伊斯平斯；g)抗生素、如烯二炔类抗生素(加利车霉素、特别是加利车霉素γ1、δ1、α1和β1、达因霉素、包括达因霉素A和脱氧米霉素、埃斯培拉霉素、卡塔尔霉素、C-1027、maduropeptin、新卡嗪奥斯汀和相关色蛋白烯二炔抗生素)、aclacinomysins、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、卡诺霉素、卡拉霉素、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、达金霉素、柔红霉素、去柔红霉素、6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸、阿霉素、吗啉-阿霉素、氰基吗啉-阿霉素、2-吡咯啉阿霉素和脱氧柔红霉素、表柔比星、阿柔比星、伊达比星、马可霉素、nitomycin、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、Peplomycin、potfiromycin、嘌呤霉素、奎拉霉素、罗道霉素、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；
f)聚酮化合物(番荔素)，特别是bullatacin和bullatacinone、吉西他滨、环氧酶素(如卡菲偌米布)、硼替佐米、沙利度胺、来那度胺、pomalidomide、tosedostat、zybrestat、PLX4032、STA-9090、Stimuvax、allovectin-7、Xegeva、Provenge、Yervoy、异戊二烯化抑制剂(如洛伐他汀)、多巴胺能神经毒素(如星形孢菌素)、放线菌素(如放线菌素D、更生霉素)、博莱霉素(如博来霉素A2、博莱霉素B2、培洛霉素)、蒽环类抗生素(如柔红霉素)、鹅膏毒素、阿霉素(亚德里亚霉素)、伊达比星、表柔比星、吡柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、MDR抑制剂(如维拉帕米)、Ca2+ATP酶抑制剂(如毒胡萝卜素)、组蛋白去乙酰酶抑制剂(伏立诺他、罗米地辛、帕比司他、丙戊酸、Mocetinostat(MGCD0103)、Belinostat、PCI-24781、恩替诺特、SB939、Resminostat、Givinostat、AR-42、CUDC-101、萝卜硫素、曲古抑菌素A)；塞来昔布、格列酮类、表没食子儿茶素没食子酸酯、双硫仑、Salinosporamide A；抗肾上腺药物、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、醋葡醛内酯、醛磷酰胺、氨基乙酰丙酸、安吖啶、阿拉伯糖苷、bestrabucil、比生群、edatraxate、defofamine、美可辛、地吖醌、依氟鸟氨酸(DFMO)、elfomithine、依利醋铵、依托格鲁、硝酸镓、胞嘧啶、羟基脲、伊班膦酸盐、香菇多糖、氯尼达明、米托胍腙、米托蒽醌、莫呱达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、鬼臼酸、2-乙肼、甲基苄肼；呱嗪二酮丙烷；根霉素；西佐；螺环锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2、2'、2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和an-guidine)、聚氨酯、siRNA、反义药物和核酸分解酶；
2)自身免疫疾病药物选自环孢菌素、环孢菌素A、氨基己酸、硫唑嘌呤、溴隐亭、苯丁酸氮芥、氯喹、环磷酰胺、皮质类固醇(例如安西奈德、倍他米松、布地奈德、氢化可的松、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、氟可龙达那唑、地塞米松、曲安奈德、二丙酸倍氯米松)、DHEA、依那西普、羟基氯喹、英夫利昔单抗、美洛昔康、甲氨蝶呤、麦考酚酸酯、泼尼松、西罗莫司、他克莫司。
3)抗感染性疾病药物：
a)氨基糖苷类：阿米卡星、阿司米星、庆大霉素(奈替米星、西索米星、异帕米星)、潮霉素B、卡那霉素(阿米卡星、阿贝卡星、氨基脱氧卡那霉素、地贝卡星、妥布霉素)、新霉素(framycetin、巴龙霉素、核糖霉素)、奈替米星、壮观霉素、链霉素、妥布霉素、甲基姿苏霉素；
b)酰胺醇类：迭氮氯霉素、氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素；
c)安沙霉素：格尔德霉素、除莠霉素；
d)碳青霉烯类：比阿培南、多利培南、厄他培南、亚胺培南/西司他丁、美罗培南、帕尼培南；
e)头孢烯：碳头孢烯(洛拉卡比)、头孢乙腈、氯氨苄青霉素、头孢拉定、头孢羟氨、头孢洛宁、头孢噻啶、头孢噻吩或头孢金素、头孢氨苄、头孢来星、头孢孟多、头孢匹林、羟胺唑头孢菌素、氟唑头孢菌素、孢西酮、唑啉头孢菌素、头孢拉宗、头孢卡品、头孢达肟、头孢吡、头孢克肟、头孢西丁、头孢罗齐、头孢甲氧环烯胺、头孢替唑、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢吡、头孢他美、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢尼西、头孢呱酮、头孢雷特、头孢噻肟、噻乙胺唑头孢菌素、头孢唑兰、头孢氨苄、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢匹罗、头孢泊肟、头孢罗齐、头孢喹诺、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢布腾、头孢噻林、头孢唑肟、头孢吡普、头孢曲松、头孢呋辛、头孢唑南、头霉素(头孢西丁、头孢替坦、头孢氰唑)、氧(碳)头孢烯(氟氧头孢、拉氧头孢)；
f)糖肽：博来霉素、万古霉素(奥利万星、特拉万星)、替考拉宁(达巴万星)、雷莫拉宁；
g)甘氨酰环素：如替加环素；
h)β-内酰胺酶抑制剂：青霉烷(舒巴坦、他唑巴坦)，氧青霉烷(克拉维酸)；
h)β-内酰胺酶抑制剂：青霉烷(舒巴坦，他唑巴坦)，氧青霉烷(克拉维酸)；
j)脂肽：达托霉素，A54145，钙依赖性抗生素(CDA)；
k)大环内酯类：阿奇霉素、克霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、氟雷霉素、交沙霉素、酮内酯(泰利霉素、塞红霉素)、麦迪霉素、米卡霉素、竹桃霉素、利福霉素(异烟肼、利福平、利福布丁、利福喷汀)、罗匹霉素、罗红霉素、大观霉素、螺旋霉素、他克莫司(FK506)、醋竹桃霉素、泰利霉素；
l)单环胺：氨曲南、替吉莫南；
m)恶唑烷酮类：利奈唑胺；
n)青霉素类：阿莫西林、氨苄青霉素(匹氨西林、海洛西林、巴氨西林、氨苄青霉素、阿霉素)、阿替代西林、阿洛西林、苄青霉素、苄星青霉素苄青霉素、苄星青霉素苯氧甲基青霉素、克洛西林、普鲁卡因青霉素(美替西林)、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、醋甲西林、青霉素、非奈西林、苯氧基甲基青霉素、呱拉西林、氨苄西林、磺苯西林、替莫西林、替卡西林；
o)多肽：杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B；
p)喹诺酮类：阿拉曲沙星、巴洛沙星、环丙沙星、克林沙、达氟沙星、二氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、加雷沙星、加替沙星、吉米沙星、格帕沙星、卡诺曲伐沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、麻保沙星、莫西沙星、那氟沙星、诺氟沙星、奥比沙星、氧氟沙星、培氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、西他沙星、司帕沙星、替马沙星、托沙星、曲伐沙星；
q)链阳性菌素：普那霉素、奎奴普丁/达福普汀；
r)磺胺类：氨芐磺胺、偶氮磺胺、磺胺嘧啶、磺胺甲异唑、磺胺酰亚胺、磺胺吡啶、磺胺异恶唑、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑(复方磺胺甲恶唑)；
s)类固醇抗菌药物；
t)四环素类：强力霉素、金霉素、氯米西环素、地美环素、雷莫昔林、美西环素、美他环素、米诺环素、土霉素、潘美环素、吡咯烷甲基四环素、四环素、甘氨酰环素(如替加环素)；
u)其他类型的抗生素：番荔枝素、胂凡纳明、细菌萜醇抑制剂(杆菌肽)、DANAL/AR抑制剂(环丝氨酸)、dictyostatin、圆皮海绵内酯、软珊瑚醇、埃博霉素、乙胺丁醇、依托泊苷、法罗培南、夫西地酸、呋喃唑酮、异烟肼、laulimalide、甲硝唑、莫匹罗星、NAM合成抑制剂(例如磷霉素)、呋喃妥因、紫杉醇、普兰西霉素、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普汀、利福平、他唑巴坦替硝唑、乌菊花素；
4)抗病毒药物：
a)侵入/融合抑制剂：阿帕韦洛、马拉韦罗、vicriviroc、gp41(恩夫韦肽)、PRO 140、CD4(艾巴利珠单抗)；
b)整合酶抑制剂：雷特格韦、elvite-gravir、globoidnan A；
c)成熟抑制剂：bevirimat、vivecon；
d)神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦；
e)核苷和核苷酸：阿巴卡韦、阿昔单韦、阿德福韦、阿莫西韦、阿昔单抗、溴夫定、西多福韦、克拉夫定、地塞米松、去羟肌苷(ddI)、elvucitabine、恩曲他滨(FTC)、恩替卡韦、泛昔洛韦、氟拉西林(5-FU)、3’-氟取代的2’、3’-脱氧核苷类似物、如3’-氟-2’、3’-双脱氧胸苷(FLT)和3’-氟-2’、3’-双脱氧鸟苷(FLG)、福米韦生、9-鸟嘌呤、碘苷、拉米夫定(3TC)、1-核苷(例如β-1-胸苷和β-1-2'-脱氧胞苷)、喷昔洛韦、racivir、利巴韦林、迪替丁、司他夫定(d4T)、塔利巴韦林(viramidine)、替比夫定、替诺福韦、三氟尿苷伐昔洛韦、缬更昔洛韦、扎西他滨(ddC)、齐多夫定(AZT)；
f)非核苷类：金刚烷胺、阿替吡啶、卡普韦林、二芳基嘧啶(依曲韦林、rilpi-virine)、地拉夫定、二十二烷醇、乙米韦林、依法韦仑、膦甲酸(磷酰基甲酸)、咪喹莫特、聚乙二醇干扰素、洛韦胺、洛德腺苷、甲吲噻腙、奈韦拉平、NOV-205、长效干扰素α、鬼臼毒素、利福平、金刚乙胺、瑞喹莫德(R-848)、醋胺金刚烷；
g)蛋白酶抑制剂：安普那韦、阿扎那韦、boceprevir、darunavir、福萨那韦、印地那韦、洛匹那韦、奈非那韦、普来可那立、利托那韦、沙奎那韦、telaprevir(VX-950)、替拉那韦；
h)其它类型的抗病毒药物：抗体酶、阿比朵尔、calanolide a、ceragenin、氰维林-n、二芳基嘧啶、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、膦甲酸、格里菲辛、taribavirin(viramidine)、羟基脲、KP-1461、米替福新、普来可那立、混成抑制剂、利巴韦林、seliciclib。
5)放射性同位素(放射性核素)：3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At、和213Bi；
6)任何上述药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物；
其中Lv1’和Lv2’独立具有以下结构之一：
其中X2’和R3与权利要求5所述相同；
其中在式(VI)和式(VII)中，
独立地选自：/>
/>
/>
/>
/> 其中R1、R2、X2和mAb与前文所述相同。
22.根据权利要求6、13或21所述的偶联物，其具有体外、体内或离体细胞杀伤活性。

Claims (21)

1.均一偶联的过程包括以下步骤：
(a)在包含有效量的过渡金属阳离子-氨基螯合物/复合物(M(NR1R2R3)m1 m2+)和还原剂存在的缓冲系统中孵育抗体或类抗体蛋白，特别是，IgG抗体，选择性地还原抗体或类抗体蛋白的链间二硫键，产生巯基；
(b)加入有效量的带有巯基反应基团的连接子或载体/连接子复合物，与步骤(a)产生的巯基反应；且
(c)任选地加入有效量的氧化剂(例如，脱氢抗坏血酸)以重新氧化未反应的巯基；且
(d)纯化所得偶联物；
(e.)其中任选的步骤(c)可替换为以下步骤：加入有效量的胱氨酸以淬灭未反应的还原剂，同时胱氨酸或二硫化物化合物被还原产生半胱氨酸以淬灭过量的偶联连接子或含有巯基反应性基团的药物/连接子复合物，或可加入有效量的半胱氨酸或相关巯基化合物以淬灭过量的连接子或连接子/有效载荷复合物分子；
其中过渡金属阳离子-氨基螯合物/络合物具有下式M(NR1R2R3)m1 m2+，其中M选自Zn2+、Cu2 +、Fe2+、Cd2+、Ni2+、Cr2+、Cr3+、Ti2+、Ti3+、Co2+、Mn2+、Mn3+、Ag+、或Hg2+；其中R1、R2和R3独立地选自C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、或杂环烷基；C3-C8的芳基、Ar-烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基或杂芳基；m1是1、2、3、4、5、6、7或8；m2是1、2、3、4、5、或6；或N、R1、R2和/或R3本身可以形成杂环、碳环、二杂环或二碳环；且(NR1R2R3)m1可以形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体，这些聚合物在N、R1、R2和/或R3之间共价连接；
其中还原剂是有机膦，用量为1.0-20蛋白质摩尔当量；
其中步骤(c)中的氧化剂是DHAA、Fe3+、I2、Cu2+、Mn3+、MnO2、或Fe3+/I-的混合物，步骤(c)的反应溶液中使用的氧化剂浓度为0.02mM-1.0mM，或1-100的蛋白质摩尔当量；步骤(a)中使用的过渡金属阳离子-氨基螯合物/络合物M(NR1R2R3)m1 m2+的浓度为0.01mM-1.0mM，或0.5-20蛋白质摩尔当量；
其中步骤(b)偶联反应的pH在约5.0至8.0之间；优选大约5.5到7.5。
最多30％可与水混合(混溶)的有机溶剂，选自DMA、DMF、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、异丙醇、二恶烷、丙二醇或乙二醇均可作为共溶剂加入水基缓冲溶液中；
其中偶联反应的温度在约-5℃至40℃之间，优选0到37℃；更有选2至8℃；步骤(b)的反应时间在约15分钟至约48小时之间，优选为30分钟到16小时；
其中通过在Sephadex G25或Sephacryl S300柱凝胶过滤、吸附色谱、离子(阳离子或阴离子)交换色谱或通过透析(超滤或超过滤(UF)和/或渗滤(DF))来纯化所得偶联物；
其中偶联物的药物/类抗体蛋白(抗体)比率(DAR)通过波长范围为240-380nm的UV、疏水相互作用色谱(HIC-HPLC)、毛细管电泳(CE)、LC-MS、CE-MS或LC-MS/MS来测量。
2.根据权利要求1所述的过渡金属阳离子氨基螯合物，选自Zn(NH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH2CH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH(CH3)2)2 2+、Zn(NH2C(CH3)3)2 2+、Zn(NH2CH2C(CH3)3)2 2+、Zn(NH(CH3)2)2 2+、Zn(NH(CH2CH3)2)2 2+、Zn(NH(CH(CH3)2)2)2 2+、Zn(NH(C(CH3)3)2)2 2+、Zn(NH(CH(CH2CH3)2)2)2 2+、Zn(NH(CH2C(CH3)3)2)2 2+、Zn(NH(CH2C(CH2CH3)3)2)2 2+、Zn(NH(CH2CH2C(CH3)3)2)2 2+、Zn(NH2CH2CH2OH)2 2+、Zn(NH(CH2CH2OH)2)2 2+、Zn(N(CH2CH2OH)3)2 2+、Zn(NH2CH2COOH)2 2+、Zn(NH2CH2CONH2)2 2+、Zn(NH2CH2COOCH3)2 2+、Zn(NH2CH2COOCH2CH3)2 2+、Zn(NH2CH2COOC(CH3)3)2 2+、Zn(NH2CH2COOCH(CH3)2)2 2+、Zn(NH2CH2CH2COOH)2 2+、Zn(NH(CH2COOH)2)2 2+、Zn(N(CH2CH2COOH)3)2 2+、Zn(NH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH2CH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH(CH3)2)4 2+、Zn(NH2C(CH3)3)4 2+、Zn(NH2CH2C(CH3)3)4 2+、Zn(NH(CH3)2)4 2+、Zn(NH(CH2CH3)2)4 2+、Zn(NH(CH(CH3)2)2)4 2+、Zn(NH(C(CH3)3)2)4 2+、Zn(NH(CH(CH2CH3)2)2)4 2+、Zn(NH(CH2C(CH3)3)2)4 2+、Zn(NH(CH2C(CH2CH3)3)2)4 2+、Zn(NH(CH2CH2C(CH3)3)2)4 2+、Zn(NH2CH2CH2OH)4 2+、Zn(NH(CH2CH2OH)2)4 2+、Zn(N(CH2CH2OH)3)4 2+、Zn(NH2CH2COOH)4 2+、Zn(NH2CH2CONH2)4 2+、Zn(NH2CH2COOCH3)4 2+、Zn(NH2CH2COOCH2CH3)4 2+、Zn(NH2CH2COOC(CH3)3)4 2+、Zn(NH2CH2COOCH(CH3)2)4 2+、Zn(NH2CH2CH2COOH)4 2+、Zn(NH(CH2COOH)2)4 2+、Zn(N(CH2CH2COOH)3)4 2+、
由任何上述阳离子与选自以下的阴离子Cl-、Br-、I-、SO4 2-、HSO4 -、NO3 -、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -、CO3 2-、HCO3 -、HCOO-、CH3COO-、F3CCOO-、Cl3CCOO-、FCH2COO-、ClCH2COO-、F2CHCOO-、Cl2CHCOO-、BF4 -、SO3 2-、HSO3 -、CH3SO3-、C6H5CH2SO3-、C6H5SO3-、C6H5COO-、C6H5CH2COO-、C6F5O-、C6H4(OH)COO-、C6H2F3O-、C6H4(NO2)O-、和C6H2(NO2)3O-形成的盐；
其中的反应溶液中将过渡金属阳离子-氨基络合物的浓度为0.5～20蛋白质摩尔当量，与水混溶性有机溶剂一起加入到反应溶液中，有机溶剂选自乙醇、甲醇、丙醇、丙二醇、DMA、DMF、DMSO、THF或CH3CN。
3.根据权利要求所述1的方法，其中有机膦还原剂选自三(羟丙基)-膦(P(CH2CH2CH2OH)3)、P(CH2CH3)3、P(CH2CH2CH3)3、P(CH2CH2-CH2CH3)3、P(CH(CH3)2)3、P(CH2CH＝CH2)3、P(CH2CH2CN)3、P(CH(CH3)2)2(CH2CH2NH2)、P(CH2CH2CONH2)3、P(CH2CH2CONHCH3)3、P(CH2CH2CH2NHCOCH3)3、NaB(CN)H3、(C6H11)2P(CH2)4P(C6H11)2、(C6H11)2P(CH2)3P-(C6H11)2、二环己基(乙基)膦、双[2-(二叔丁基膦基)乙基]胺、三环己基膦、1，2-乙二基双[二环己基]-膦、双[2-(二环己基膦基)乙基]胺、三[2-(二苯基膦基)乙基]-膦([(C6H5)2PCH2CH2]3P)、三苯基膦、磺酰化三苯基膦(2-(二苯基膦基)苯磺酸(diPPBS)、3-(二苯基膦基)苯磺酸、4-(二苯基膦基)苯磺酸、3，3′，3″-膦三基三苯磺酸)；优选地，还原剂选自TECP或P(CH2CH2CH2OH)3，更优选地，该还原剂选自TECP。且步骤(A)的反应溶液中使用的还原剂是2.0-4.0蛋白质摩尔当量当量。反应溶液中使用的还原剂浓度为0.02mM-1.0mM，或反应中使用的蛋白质摩尔数为1.0-20.0。
4.根据权利要求1所述的用于进行选择性还原的最佳缓冲剂选自PBS、Mes、Bis-Tris、Bis-Tris Propane、Pipes、Aces、Mopso、Bes、Mops、Hepes、Tes、Pipps、Dipso、Tapso、Heppso、Tris-up、Tris-HCl、Tricine、Hepps、Gly-Gly、Bicine、Taps、Hepee、Acetate、Histidine、Citrate、MES、Borate，或上述两种、三种或四种缓冲液组分的组合；缓冲液的pH为4.0-9.0；步骤(A)反应中缓冲液的浓度为0.02-1.0M。缓冲液的pH选择为4.0-9.0，优选5.0-7.5，更优选5.5-7.5。缓冲液在反应中的浓度为0.02-1.0M，优选为20-100mM；并且可以在基于水的缓冲溶液中添加高达30％的水可混合(混溶)的有机溶剂作为共溶剂，所述有机溶剂选自DMA、DMF、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、THF、异丙醇、二恶烷、丙二醇或乙二醇。
5.根据，其中所述药物/连接子复合物结构式表示为(I)、(II)或(III)：
其中：Lv1和Lv2是巯基反应基团，独立地选自于：
卤代乙酰基；/>酰卤基；/>马来酰亚胺；单取代马来酰亚胺；/>二取代马来酰亚胺；单取代的琥珀酰亚胺；/>二取代琥珀酰亚胺；-CHO醛；乙烯磺酰基；/>丙烯酰基；/>2-(甲苯磺酰氧基)乙酰基；/>2-(甲磺酰氧基)乙酰基；/>2-(硝基苯酚基)乙酰基；/>2-(二硝基苯基)乙酰基；2-(氟代苯酚基)-乙酰基；/>2-(二氟苯酚基)-乙酰基；/>2-((三氟甲基磺酰基)氧基)乙酰基；/>苯乙烯，/>乙烯基吡啶，/>乙烯基吡嗪，/>乙烯基-1，3，5-三嗪，/>取代的甲磺酰基，/>2-(五氟苯氧基)乙酰基；/>甲基砜苯基恶二唑(ODA)；/>丙烯酰基，卤代丙烯酰基，/>丙炔酰基，/>2，3-二卤代丙烯酰基，/>芳基钯配合物，/>双(苯磺酰基)-马来酰亚胺，/>双卤代哒嗪二酮，/>双苯硫基哒嗪二酮，2-((甲基磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>2-((烷基或芳基-磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>氰乙炔基，/>乙炔基；/>炔基，/>亚芳基二丙腈(ADPN)，/>或二乙烯基吡啶，/>二乙烯基吡嗪，/>二乙烯基三嗪，或/>3，4-双(马来酰亚胺)-2，5-二氧代吡咯烷，
其中X1’和X2’独立地为F、Cl、Br、I、OTf、OMs、OC6H4(NO2)、OC6H3(NO2)2、OC6F5、OC6HF4、或Lv3；X2是O、NH、N(R1)、或CH2；R3和R5独立地为H、R1、芳基团、杂芳香族或芳香族、其中一个或几个H原子独立地被-R1、-卤素、-OR1、-SR1、-NR1R2、-NO2、-S(O)R1、-S(O)2R1或-COOR1取代；Lv3和Lv3’独立地为离去基团，选自F、Cl、Br、I、硝基苯氧基、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、苯氧基、苯巯基、二硝基苯氧基、五氟苯氧基、四氟苯氧基、二氟苯氧基、单氟苯氧基、五氯苯酚、三氟甲磺酸酯、咪唑、二氯苯氧基、四氯苯氧基、1-羟基苯并三唑、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-乙基-5-苯基异恶唑-3′-磺酸酯，自身形成的酸酐，或与其他酸酐，例如乙酸酐、甲酸酐形成的酸酐；或使用缩合试剂生成的多肽偶联反应中间体或Mitsunobu反应的中间体；
在式(II)和式(III)中，其中和/>独立地选自于：双取代马来酰亚胺；/>单取代琥珀酰亚胺；二取代琥珀酰亚胺；/>双苯硫基马来酰亚胺，双卤代哒嗪二酮，/>双苯硫基哒嗪二酮，2-((甲基磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>2-((烷基或芳基磺酰基)甲基)丙烯酰基，/>亚芳基二丙腈(ADPN)，二乙烯基吡啶，/>乙烯基吡嗪，二乙烯基三嗪，/>二乙烯基喹喔啉，3，4-双(马来酰亚胺)-2，5-二氧代吡咯烷，/> />
/>
/>
其中Lv3，Lv3’，X1’和X2’如前文所述；两个原子中间的连接键“-”表示可以连接两个原子中的任何一个；
其中L1和L2是，相同或不同，独立地选自O、NH、S、NHNH、N(R3)、N(R3)N(R3’)、(OCH2CH2)pOR3、或(OCH2CH(CH3))pOR3、或NH(CH2CH2O)pR3、或NH(CH2CH(CH3)O)pR3、或N[(CH2CH2O)pR3][(CH2CH2O)p’R3’]、或(OCH2CH2)pCOOR3、或CH2CH2(OCH2CH2)pCOOR3的聚乙二醇单元，其中p和p’独立地选自0至约1000的整数；C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；其中R3和R3’独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；或1-8个碳原子的酯、醚或酰胺；或1～8个天然或非天然氨基酸；或结构式为(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙二醇单元，其中p是0至约1000的整数，或上述两个或更多组合；
其中L1或L2独立地可以含有自我毁灭或非自我毁灭的组分、肽单元、腙键、二硫化物、酯、肟、酰胺或硫醚键。自我毁灭单元包括是与对氨基苄基氨甲酰基(PAB)的电子结构相似的芳香化合物，选自2-氨基咪唑-5-甲醇的衍生物、杂环PAB类似物、β-葡糖醛酸苷、以及邻或对氨基苄基缩醛。
其中自我毁灭型连接子组分具有以下结构之一：
其中(*)是另外的间隔体或可断裂的连接子单元，或细胞毒剂、和/或细胞结合分子(CBA)的连接点；X1、Y1、Z2和Z3独立地为NH、O、或S；Z1独立地为H、NH、O或S；v是0或1；U1独立地为H、OH、C1-C6烷基、(OCH2CH2)nF、Cl、Br、I、OR5、SR5、NR5R5’、N＝NR5、N＝R5、NR5R5’、NO2、SOR5R5’、SO2R5、SO3R5、OSO3R5、PR5R5’、POR5R5’、PO2R5R5’、OPO(OR5)(OR5’)、或OCH2PO(OR5(OR5’)，其中R5和R5’如前文所定义；优选R5和R5，独立地选自H、C1～C8烷基；C2～C8烯基、炔基、杂烷基；C3～C8芳基、杂环、碳环、环烷基、杂环烷基、杂芳烷基、烷基羰基；或药用阳离子盐；
其中非自我毁灭型连接子组分为以下结构之一：
/>
/>
其中(*)是另外的间隔体R1或可断裂的连接子单元、或细胞毒性分子和/或细胞结合分子的连接点；X1、Y1、U1、R5、R5’如前文所定义；r是0-100；m和n独立地为0-6；
其中L1或L2可独立地由一个或多个连接子组分构成：6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”或“af”)、对氨基苄氧基羰基(“PAB”)、4-硫代戊酰基(“SPP”)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1酰基(“MCC”)、(4-乙酰基)氨基苯酰基(“SIAB”)、4-硫丁酰基(SPDB)、4-硫-2-羟基磺酰基-丁酰基(2-Sulfo-SPDB)，或含有1-8个天然或非天然氨基酸单元的天然或非天然肽；
其中L1和L2独立地是可断裂连接子；术语可释放连接体是指包括至少一种在生理条件下可被破坏的键的连接体，所述生理条件例如pH不稳定、酸不稳定、碱不稳定、氧化不稳定、代谢不稳定、生化不稳定或酶不稳定键。应当理解，导致键断裂的这种生理条件不一定包括生物或代谢过程，而是可以包括标准化学反应，例如水解或取代反应，例如具有比胞质pH更低的pH的内体，和/或与细胞内硫醇的二硫键交换反应，例如肿瘤细胞内丰富的谷胱甘肽的毫摩尔范围；
其中可断裂连接子(L1或L2)包括：-(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-，-(Aa)r-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t-，-(CR5R6)m-(CR7＝CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(CO)(Aa)t-(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-(CR5R6)m-苯基-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-呋喃-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-恶唑-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-(CR5R6)m-噻唑-CO(Aa)t(CCR7R8)n-，-(CR5R6)t-噻吩-CO(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-imidazolyl-CO-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-morpholino-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R6)t-N-甲基哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-(CR5R)m-(Aa)t苯基-，-(CR5R6)m-(Aa)t呋喃-，-(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-噻唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-噻吩-(Aa)t-，-(CR5R6)m-咪唑(Aa)t-，-(CR5R6)m-吗啉-(Aa)t-，-(CR5R6)m-哌嗪-(Aa)t-，-(CR5R6)m-N-甲基哌嗪-(Aa)t-，-K(CR5R6)m(Aa)r(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-K(CR5R6)m(CR7R8)n(Aa)r(OCH2CH2)t-，-K(Aa)r-(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)t-，-K(CR5R6)m(CR7R8)n(OCH2CH2)r(Aa)t-，-K(CR5R6)m-(CR7＝CR8)(CR9R10)n(Aa)t(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(Aa)t(NR11CO)(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCO)(Aa)t(CR9R10)n-(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(CO)(Aa)t-(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(NR11CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m-(OCO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m(OCNR7)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K-(CR5R6)m(CO)(Aa)t(CR9R10)n(OCH2CH2)r-，-K(CR5R6)m-苯基-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K-(CR5R6)m-呋喃-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)m-恶唑-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R6)m-噻唑-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t-噻吩-CO(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t咪唑-CO-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t吗啉-CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t哌嗪-CO(Aa)t-(CR7R8)n-，-K(CR5R6)t-N-甲基哌嗪CO(Aa)t(CR7R8)n-，-K(CR5R)m(Aa)t苯基，-K-(CR5R6)m-(Aa)t呋喃-，-K(CR5R6)m-恶唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-噻唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-噻吩-(Aa)t-，-K(CR5R6)m-咪唑(Aa)t-，-K(CR5R6)m-吗啉(Aa)t-，-K(CR5R6)m-哌嗪-(Aa)tG，-K(CR5R6)mN-甲基哌嗪(Aa)t-；其中m、Aa、m、n、R3、R4、和R5定义如前文所描述；t和r独立地为0-100；R6、R7、和R8独立地选自H、卤化物、C1～C8烷基、芳基、烯基、炔基、醚、酯、胺或酰胺，任选地被一种或多种卤化物，CN、NR1R2、CF3、OR1、Aryl、杂环、S(O)R1、SO2R1、-CO2H、-SO3H、-OR1、-CO2R1、-CONR1、-PO2R1R2、-PO3H或P(O)R1R2R3取代；K是NR1、-SS-、-C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)O-、-C＝NH-O-、-C＝N-NH-、-C(＝O)NH-NH-、O、S、Se、B或C3-C6杂芳基；
其中连接子L1和L2的组分的示例结构有：
(包含6-马来酰亚胺己酰基(MC))，/> ((MP)，马来酰亚胺丙酰基)，/>(p-对氨基苄氧基酰胺基(PAB))，/> />(含缬氨酸-瓜氨酸(VC))，/>(MCC，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯)，((4-乙酰基)氨基苯甲酸酯)，/>(4-硫代-2-羟基磺酰丁酸酯，2-磺基-SPDB)，/>4-硫代戊酸酯(SPP)，/>4-硫代丁酰基(SPDB)，/>4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-酰基(MCC)，/>马来酰亚胺乙氨基(ME)，/>4-硫代-2-羟基磺酰基丁酰基(2-Sulfo-SPDB)，/>芳基巯醚基(PhSS)，(4-乙酰基)氨基苯酰基(SIAB)，/>氧苄基硫醚基，/>氨基苄基硫醚基，/>二氧基苄基硫醚基，/>二氨基苄基硫醚基，/>氨基氧基苄基硫醚基，烷氧基氨基(AOA)，/>亚乙基氧基(EO)，/>二硫，4-甲基-4-二硫代戊酸(MPDP)，/>三唑，/>烷基磺酰基，/>烷基磺胺，/>砜基二磺胺，/>磷二酰胺，烷基膦酰胺，/>膦酸，/>N-甲基烷基膦酰胺，N，N’-二甲基磷二酰胺，/>N，N’-二甲基膦酰二胺， 肼，/>乙脒，/>肟，二乙酰肼，/>氨基乙基胺，/>氨基乙基-氨基乙基-胺，/> />
/> 及上述两个或多个的组合；其中/>是连接位点；X2、X3、X4、X5、或X6，独立地选自NH、NHNH、N(R12)、N(R12)N(R12’)、O、S、C1-C6烷基、C2-C6杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基、C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、CH2OR12、CH2SR12、CH2NHR12、或1～8氨基酸；其中R12和R12’独立地为H、C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；或1-8个碳原子的酯、醚或酰胺；或结构式为(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙二醇单元，其中p是0至约1000的整数。
其中L1，L2，X1，X2，X3，X1’，X2’和X3’可独立地缺省；
其中E1是连接两个巯基可反应基团Lv1和Lv2的连接基团。E1选自CH、CH2、NH、NHNH、N(R3)、N(R3)N(R3，)、N＝N、N-N、P、P(＝O)、S、Si、C2-C8烷基、杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；含有1～4个氨基酸残基的肽、优选自天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、色氨酸、丙氨酸；或以下结构之一： /> 其中/>是连接位点；
其中D1和D2是细胞毒性药物、或治疗性药物、或免疫治疗性短类抗体蛋白、用于增强或稳定细胞结合类抗体蛋白试剂的功能性分子、细胞表面受体结合剂、抗体片段、siRNA或DNA分子，优选自：
1)化疗药物：
a)烷基化剂，例如氮芥：氯苯那普，氯普那嗪，环磷酰胺，达喀尔巴嗪，雌二醇氮芥，异环磷酰胺，氮芥，盐酸二甲氧胺，氧化二氮芥，盐酸氨氯地平，麦考酚酸，卫矛醇，呱泊溴烷，新氮芥，苯芥胆甾醇，松龙苯芥，噻替呱，曲磷胺对，尿嘧啶；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新、比折来新及其合成类似物)；多卡霉素(包括KW-2189和CBI-TMI、及其合成类似物)；苯并二氮卓二聚体(包括吡咯并苯二氮卓(PBD)或托美霉素，吲哚并苯并二氮卓，咪唑并苯并噻二氮卓或恶唑烷并苯并二氮卓的二聚体)；亚硝基脲(卡莫司汀，洛莫司汀，氯化梭菌素，福莫司汀，尼莫司汀，拉莫司汀)；烷基磺酸酯(白苏芬、树苏芬、磺胺异丙磺胺和皮苏芬)；三氮烯(达喀尔巴嗪)；含铂化合物(卡铂，顺铂，奥沙利铂)；吖丙啶类，苯并二氢吡喃酮，卡洛酮，美妥替派和乌雷多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺，三亚乙基三胺，三乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基甲基胺；
b)例如植物生物碱：长春花生物碱(长春新碱，长春碱，长春地辛，长春瑞滨，去甲长春碱)；紫杉醇类(紫杉醇，多西紫杉醇及其类似物)；美登素类(DM1、DM2、DM3、DM4、美登素、安沙霉素及其类似物)；cryptophycin(特别是cryptophycin 1和cryptophy-cin 8)；埃博霉素，软珊瑚醇，迪莫利德，草苔虫内酯，海兔毒素，奥瑞他汀，微管毒素，ephalostatin；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑制素；
c)DNA拓扑异构酶抑制剂，依托泊苷替尼(9-氨基喜树碱，喜树碱，克立那托，多拉霉素，依托泊苷，磷酸依托泊苷，伊立替康，米托蒽醌，诺消灵，视黄酸(视黄醇)，替尼泊苷，拓扑替康，9-硝基喜树碱(RFS2000))；丝裂霉素(丝裂霉素C)；
d)抗代谢物，例如{[抗叶酸剂，DHFR抑制剂(甲氨蝶呤，曲麦克特，二甲叶酸，蝶罗呤，氨喋呤(4-氨基苯甲酸)或其他叶酸类似物)；IMP脱氢酶抑制剂(麦考酚酸，噻唑呋林，利巴韦林，EICAR)；核糖核苷酸还原酶抑制剂(羟基脲，去铁胺)；嘧啶类似物，尿嘧啶类似物(安西他滨，阿扎胞苷，6-氮尿嘧啶，卡培他滨(希罗达)，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，脱氧氟尿苷，依诺他滨，5-氟尿嘧啶，氟尿苷，ratitrexed(Tomudex)；胞嘧啶类似物(阿糖胞苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷，氟达拉滨)；嘌呤类似物(硫唑嘌呤，氟达拉滨，巯嘌呤，硫胺素，硫鸟嘌呤)；叶酸补充剂，例如弗洛林酸}；
e)激素疗法剂，例如{受体拮抗剂，抗雌激素(甲地孕酮，雷洛昔芬，他莫昔芬)，LHRH兴奋剂(戈斯他林，醋酸亮丙瑞林)；抗雄激素药(比卡鲁胺，氟他胺，卡鲁司酮，丙酸倍他雄酮，表雄甾醇，戈舍瑞林，亮丙瑞林，美替利定，尼鲁米特，睾内酯，曲洛司坦及其他雄激素抑制剂)；维甲类化合物，维生素D3类似物(CB1093，EB1089，KH1060，胆钙化醇，麦角钙化甾醇)；光动力疗法剂(维替泊芬，酞菁，光敏剂Pc4，去甲氧基-竹红菌素A)；细胞因子(干扰素-α，干扰素-γ，肿瘤坏死因子(TNF)，含TNF的人蛋白)}；
f)激酶抑制剂，例如BIBW 2992(抗-EGFR/Erb2)，伊马替尼，吉非替尼，呱加他尼，索拉非尼，达沙替尼，舒尼替尼，厄洛替尼，尼洛替尼，拉帕替尼，阿西替尼，帕唑帕尼，凡德他尼，E7080(抗VEGFR2)，mubritinib，普纳替尼(AP24534)，bafetinib(INNO-406)，bosutinib(SKI-606)，卡博替尼，维莫德吉，iniparib，鲁索利替尼，CYT387，阿西替尼，tivozanib，索拉非尼，贝伐单抗，西妥昔单抗，曲妥珠单抗，雷珠单抗，帕尼单抗，伊斯平斯；
g)抗生素，例如烯二炔类抗生素(加利车霉素，特别是加利车霉素γ1，δ1，α1和β1，达因霉素，包括达因霉素A和脱氧米霉素，埃斯培拉霉素，卡塔尔霉素，C-1027，maduropeptin，新卡嗪奥斯汀和相关色蛋白烯二炔抗生素)，aclacinomysins，放线菌素，安曲霉素，重氮丝氨酸，博来霉素，卡诺霉素，卡拉霉素，洋红霉素，嗜癌素，色霉素，达金霉素，柔红霉素，去柔红霉素，6-重氮-5-氧代-L-去甲亮氨酸，阿霉素，吗啉-阿霉素，氰基吗啉-阿霉素，2-吡咯啉阿霉素和脱氧柔红霉素，表柔比星，阿柔比星，伊达比星，马可霉素，nitomycin，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，Peplomycin，potfiromycin，嘌呤霉素，奎拉霉素，罗道霉素，链黑霉素，链脲霉素，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；
i)聚酮化合物(番荔素)，特别是bullatacin和bullatacinone；吉西他滨，环氧酶素(如卡菲偌米布)，硼替佐米，沙利度胺，来那度胺，pomalidomide，tosedostat，zybrestat，PLX4032，STA-9090，Stimuvax，allovectin-7，Xegeva，Provenge，Yervoy，异戊二烯化抑制剂(如洛伐他汀)，多巴胺能神经毒素(如星形孢菌素)，放线菌素(如放线菌素D，更生霉素)，博莱霉素(如博来霉素A2，博莱霉素B2，培洛霉素)，蒽环类抗生素(如柔红霉素)，鹅膏毒素，阿霉素(亚德里亚霉素)，伊达比星，表柔比星，吡柔比星，佐柔比星，米托蒽醌，MDR抑制剂(如维拉帕米)，Ca2+ATP酶抑制剂(如毒胡萝卜素)，组蛋白去乙酰酶抑制剂(伏立诺他，罗米地辛，帕比司他，丙戊酸，Mocetinostat(MGCD0103)，Belinostat，PCI-24781，恩替诺特，SB939，Resminostat，Givinostat，AR-42，CUDC-101，萝卜硫素，曲古抑菌素A)；塞来昔布，格列酮类，表没食子儿茶素没食子酸酯，双硫仑，Salinosporamide A；抗肾上腺药物，氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦，醋葡醛内酯，醛磷酰胺，氨基乙酰丙酸，安吖啶，阿拉伯糖苷，bestrabucil，比生群，edatraxate，defofamine，美可辛，地吖醌，依氟鸟氨酸(DFMO)，elfomithine，依利醋铵，依托格鲁，硝酸镓，胞嘧啶，羟基脲，伊班膦酸盐，香菇多糖，氯尼达明，米托胍腙，米托蒽醌，莫呱达醇，二胺硝吖啶，喷司他丁，蛋氨氮芥，吡柔比星，鬼臼酸，2-乙肼，甲基苄肼；呱嗪二酮丙烷；根霉素；西佐；螺环锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素，疣孢菌素A，杆孢菌素A和anguidine)，聚氨酯，siRNA，反义药物和核酸分解酶。
2)自身免疫疾病药物包括但不限于环孢菌素，环孢菌素A，氨基己酸，硫唑嘌呤，溴隐亭，苯丁酸氮芥，氯喹，环磷酰胺，皮质类固醇(例如安西奈德，倍他米松，布地奈德，氢化可的松，氟尼缩松，丙酸氟替卡松，氟可龙达那唑，地塞米松，曲安奈德，二丙酸倍氯米松)，DHEA，依那西普，羟基氯喹，英夫利昔单抗，美洛昔康，甲氨蝶呤，麦考酚酸酯，泼尼松，西罗莫司，他克莫司。
3)抗感染性疾病药物包括但不限于：
a)氨基糖苷类：阿米卡星，阿司米星，庆大霉素(奈替米星，西索米星，异帕米星)，潮霉素B，卡那霉素(阿米卡星，阿贝卡星，氨基脱氧卡那霉素，地贝卡星，妥布霉素)，新霉素(framycetin，巴龙霉素，核糖霉素)，奈替米星，壮观霉素，链霉素，妥布霉素，甲基姿苏霉素；
b)酰胺醇类：迭氮氯霉素，氯霉素，氟苯尼考，甲砜霉素；
c)安沙霉素：格尔德霉素，除莠霉素；
d)碳青霉烯类：比阿培南，多利培南，厄他培南，亚胺培南/西司他丁，美罗培南，帕尼培南；
e)头孢烯：碳头孢烯(洛拉卡比)，头孢乙腈，氯氨苄青霉素，头孢拉定，头孢羟氨，头孢洛宁，头孢噻啶，头孢噻吩或头孢金素，头孢氨苄，头孢来星，头孢孟多，头孢匹林，羟胺唑头孢菌素，氟唑头孢菌素，孢西酮，唑啉头孢菌素，头孢拉宗，头孢卡品，头孢达肟，头孢吡，头孢克肟，头孢西丁，头孢罗齐，头孢甲氧环烯胺，头孢替唑，头孢呋辛，头孢克肟，头孢地尼，头孢托仑，头孢吡，头孢他美，头孢甲肟，头孢地嗪，头孢尼西，头孢呱酮，头孢雷特，头孢噻肟，噻乙胺唑头孢菌素，头孢唑兰，头孢氨苄，头孢咪唑，头孢匹胺，头孢匹罗，头孢泊肟，头孢罗齐，头孢喹诺，头孢磺啶，头孢他啶，头孢特仑，头孢布腾，头孢噻林，头孢唑肟，头孢吡普，头孢曲松，头孢呋辛，头孢唑南，头霉素(头孢西丁，头孢替坦，头孢氰唑)，氧(碳)头孢烯(氟氧头孢，拉氧头孢)；
f)糖肽：博来霉素，万古霉素(奥利万星，特拉万星)，替考拉宁(达巴万星)，雷莫拉宁；
g)甘氨酰环素：如替加环素；
h)β-内酰胺酶抑制剂：青霉烷(舒巴坦，他唑巴坦)，氧青霉烷(克拉维酸)；
i)林可酰胺：克林霉素，林可霉素；
j)脂肽：达托霉素，A54145，钙依赖性抗生素(CDA)；
k)大环内酯类：阿奇霉素，克霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素，氟雷霉素，交沙霉素，酮内酯(泰利霉素，塞红霉素)，麦迪霉素，米卡霉素，竹桃霉素，利福霉素(异烟肼、利福平，利福布丁，利福喷汀)，罗匹霉素，罗红霉素，大观霉素，螺旋霉素，他克莫司(FK506)，醋竹桃霉素，泰利霉素；
l)单环胺：氨曲南，替吉莫南；
m)恶唑烷酮类：利奈唑胺；
n)青霉素类：阿莫西林，氨苄青霉素(匹氨西林，海洛西林，巴氨西林，氨苄青霉素，阿霉素)，阿替代西林，阿洛西林，苄青霉素，苄星青霉素苄青霉素，苄星青霉素苯氧甲基青霉素，克洛西林，普鲁卡因青霉素(美替西林)，美洛西林，甲氧西林，萘夫西林，苯唑西林，醋甲西林，青霉素，非奈西林，苯氧基甲基青霉素，呱拉西林，氨苄西林，磺苯西林，替莫西林，替卡西林；
o)多肽：杆菌肽，粘菌素，多粘菌素B；
p)喹诺酮类：阿拉曲沙星，巴洛沙星，环丙沙星，克林沙，达氟沙星，二氟沙星，依诺沙星，恩诺沙星，加雷沙星，加替沙星，吉米沙星，格帕沙星，卡诺曲伐沙星，左氧氟沙星，洛美沙星，麻保沙星，莫西沙星，那氟沙星，诺氟沙星，奥比沙星，氧氟沙星，培氟沙星，曲伐沙星，格帕沙星，西他沙星，司帕沙星，替马沙星，托沙星，曲伐沙星；
q)链阳性菌素：普那霉素，奎奴普丁/达福普汀；
r)磺胺类：氨苄磺胺，偶氮磺胺，磺胺嘧啶，磺胺甲异唑、磺胺酰亚胺、磺胺吡啶、磺胺异恶唑、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑(复方磺胺甲恶唑)；
s)类固醇抗菌药物：如夫西地酸；
t)四环素类：强力霉素，金霉素，氯米西环素，地美环素，雷莫昔林，美西环素，美他环素，米诺环素，土霉素，潘美环素，吡咯烷甲基四环素，四环素，甘氨酰环素(如替加环素)；
u)其他类型的抗生素：番荔枝素，胂凡纳明，细菌萜醇抑制剂(杆菌肽)，DANAL/AR抑制剂(环丝氨酸)，dictyostatin，圆皮海绵内酯，软珊瑚醇，埃博霉素，乙胺丁醇，依托泊苷，法罗培南，夫西地酸，呋喃唑酮，异烟肼，laulimalide，甲硝唑，莫匹罗星，NAM合成抑制剂(例如磷霉素)，呋喃妥因，紫杉醇，普兰西霉素，吡嗪酰胺，奎奴普丁/达福普汀，利福平，他唑巴坦替硝唑，乌菊花素；
4)抗病毒药物：
a)侵入/融合抑制剂：阿帕韦洛，马拉韦罗，vicriviroc，gp41(恩夫韦肽)，PRO140，CD4(艾巴利珠单抗)；
b)整合酶抑制剂：雷特格韦，elvite-gravir，globoidnan A；
c)成熟抑制剂：bevirimat，vivecon；
d)神经氨酸酶抑制剂：奥司他韦，扎那米韦，帕拉米韦；
e)核苷和核苷酸：阿巴卡韦，阿昔单韦，阿德福韦，阿莫西韦，阿昔单抗，溴夫定，西多福韦，克拉夫定，地塞米松，去羟肌苷(ddI)，elvucitabine，恩曲他滨(FTC)，恩替卡韦，泛昔洛韦，氟拉西林(5-FU)，3’-氟取代的2’，3’-脱氧核苷类似物，如3’-氟-2’，3’-双脱氧胸苷(FLT)和3’-氟-2’，3’-双脱氧鸟苷(FLG)，福米韦生，9-鸟嘌呤，碘苷，拉米夫定(3TC)，1-核苷(例如β-1-胸苷和β-1-2′-脱氧胞苷)，喷昔洛韦，racivir，利巴韦林，迪替丁，司他夫定(d4T)，塔利巴韦林(viramidine)，替比夫定，替诺福韦，三氟尿苷伐昔洛韦，缬更昔洛韦，扎西他滨(ddC)，齐多夫定(AZT)；
f)非核苷类：金刚烷胺，阿替吡啶，卡普韦林，二芳基嘧啶(依曲韦林，rilpi-virine)，地拉夫定，二十二烷醇，乙米韦林，依法韦仑，膦甲酸(磷酰基甲酸)，咪喹莫特，聚乙二醇干扰素，洛韦胺，洛德腺苷，甲吲噻腙，奈韦拉平，NOV-205，长效干扰素α，鬼臼毒素，利福平，金刚乙胺，瑞喹莫德(R-848)，醋胺金刚烷；
g)蛋白酶抑制剂：安普那韦，阿扎那韦，boceprevir，darunavir，福萨那韦，印地那韦，洛匹那韦，奈非那韦，普来可那立，利托那韦，沙奎那韦，telaprevir(VX-950)，替拉那韦；
h)其它类型的抗病毒药物：抗体酶，阿比朵尔，calanolide a，ceragenin，氰维林-n，二芳基嘧啶，表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，膦甲酸，格里菲辛，taribavirin(viramidine)，羟基脲，KP-1461，米替福新，普来可那立，混成抑制剂，利巴韦林，seliciclib。
5)用于本发明制备的偶联物的药物还包括放射性同位素。放射性同位素(放射性核素)：3H，11C，14C，18F，32P，35S，64Cu，68Ga，86Y，99Tc，111In，123I，1241，125I，131I，133Xe，177Lu，211At，和213Bi；
6)任何上述药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中产生的抗体或类抗体蛋白中的硫醇基团同时或顺序地与式(I)、(II)或(III)的药物/连接子复合物独立地反应，形成如下所示式(V)、(VI)或(VII)的偶联物：
其中n是1-20；n’是1-10；n′为1-10；优选n为1-8，n’为1-4；更优选n为2-4，n’为1-2；D1、D2、L1、L2和E1如权利要求5所述；S(硫)由抗体或类抗体蛋白质中二硫键被还原而产生；mAb是一种抗体或类抗体蛋白；其中Lv1’和Lv2’是由结构如权利要求5所述的Lv1和Lv2与mAb中的硫醇反应产生的基团；
其中Lv1’和Lv2’独立地具有以下结构：
/>
其中X2’和R3定义与权利要求5相同；
其中式(VI)和式(VII)中片段和/>独立地选自：
/>
/>
/>
其中R1、R2、X2的定义同前文所述；mAb是抗体或类抗体蛋白。并且优选缀合物与抗体的重轻链之间的硫醇特异性连接。
7.根据所述的方法，其中根据权利要求1所属的方法中产生的抗体或类抗体蛋白中的巯基与如下所示的具有结构式(VIII)，(IX)或(X)的缩合化合物同时或依次地反应，并独立地与药物，D1和/或D2，形成式(V)，(VI)或(VII)的偶联物：
其中式(I)，(II)和(III)的L1，L2，E1，Lv1，和Lv2独立地相同或不同；
其中式(VIII)、(IX)或(X)与药物D1或/和D2的缩合反应可以在分离的反应罐中进行；
其中Lv5和Lv6独立地选自：
/> 其中X1’是F、Cl、Br、I、OTs(甲苯磺酸酯)、OTf(三氟甲磺酸酯)、OMs(甲磺酸酯)、OC6H4(NO2)、OC6H3(NO2)2、OC6F5、OC6HF4或Lv3；X2’是O、NH、N(R1)或CH2；R3和R5独立地为H、R1、芳香基、杂芳基或其中一个或多个H原子独立地被-R1、-卤素、-OR1、-SR1、-NR1R2、-NO2、-S(O)R1、-S(O)2R1、或-COOR1取代的芳香基团；Lv3和Lv3’为离去基团，独立地选自F、Cl、Br、I、硝基苯氧基、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、苯氧基、苯巯基、二硝基苯氧基、五氟苯氧基、四氟苯氧基、二氟苯氧基、一氟苯氧基、五氯苯氧基、三氟甲磺酸酯、咪唑、二氯苯氧基、四氯苯氧基、1-羟基苯并三唑、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、2-乙基-5-苯基异恶唑鎓-3′-磺酸酯，自身形成的酸酐，或与其他酸酐形成的酸酐，或肽偶联反应或与Mitsunobu反应的缩合试剂反应产生的中间分子；其中官能团Lv5和/或Lv6也可以与细胞毒性药物中的巯基反应，只要其反应速率比Lv1或Lv2与类抗体蛋白中的巯基基团之间的反应快或慢至少一倍。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或类抗体蛋白中的巯基同时或依次独立地与式(VIII)、(IX)或(X)如权利要求7中所示的反应，形成下文所示的式(XI)、(XII)或(XIII)，然后独立地与药物D1或D2反应，形成式(V)、(VI)或(VII)的偶联物：
其中Lv5、Lv6、L1、L2、E1、Lv1’Lv2’、mAb、n和n’定义如权利要求7所述。
9.根据权利要求6，7和8所述的方法，其中药物D1和D2发色分子可以吸收紫外光，荧光，红外光，近红外光或可见光；发色分子包括黄色素，红细胞，虹彩色素，白细胞，黑色素和蓝绿色素的一类或一个亚类；荧光分子的一类或一个亚类，其是一种荧光化学物质；视觉光转导分子的一类或一个亚类；光子分子的一类或一个亚类，冷光分子的一类或一个亚类或荧光素化合物的一类或一个亚类；因此，偶联物可用于检测、监测或研究细胞结合分子与靶细胞的相互作用
发色分子可选自非蛋白质有机荧光团，氧杂蒽衍生物(包括荧光素，罗丹明，俄勒冈绿，伊红和德克萨斯红)；花青衍生物(包括花青，吲哚羰花青，氧杂花青，硫代花青和部花青)；方酸衍生物和环取代的方酸，包括Seta，SeTau和Square染料；萘衍生物(包括丹酰和氟硅酸钠衍生物)；香豆素衍生物；恶二唑衍生物(吡啶基恶唑，硝基苯并恶唑和苯并恶二唑)；蒽衍生物(蒽醌类，包括DRAQ5，DRAQ7和CyTRAK橙)；芘衍生物(包括级联蓝)；恶嗪衍生物(包括尼罗红，尼罗蓝，甲酚紫，恶嗪170)；吖啶衍生物(包括黄醇黄素，吖啶橙，吖啶黄)；芳基甲胺衍生物(包括金胺，结晶紫，孔雀石绿)和四吡咯衍生物(包括卟吩，酞菁，胆红素)；
生色分子选自以下荧光化合物的任何类似物和衍生物：CF染料，DRAQ和CyTRAK探针，BODIPY，Alexa Fluor，DyLight Fluor，Atto和Tracy(Sigma Aldrich)，FluoProbes，Abberior染料，DY和MegaStokes染料，Sulfo Cy染料，HiLyte Fluor，Seta，SeTau和Square染料，SureLight染料(APC，RPEPerCP，Phycobilisomes)，APC，APCXL，RPE，BPE，别藻蓝蛋白(APC)，氨基胭脂蛋白，APC-Cy7偶联物，BODIPY-FL，Cascade Blue，Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy3B，Cy5，Cy5.5，Cy7，荧光素，FluorX，羟基香豆素，丽丝胺罗丹明B，萤光黄，Me-甲氧基香豆素，NBD，Pacific Blue，Pacific Orange，PE-Cy5偶联物，PE-R-藻红蛋白(PE)，Red 613，Seta-555-Azide，Seta-555-DBCO，Seta-555-NHS，Seta-580-NHS，Seta-680-NHS，Seta-APC-780，Seta-PerCP-680，Seta-R-PE-670，Se-Tau-380-NHS，SeTau-405-马来酰亚胺，SeTau-405-NHS，SeTau-425-NHS，SeTau-647-NHS，Texas Red，TRITC，TruRed，X-Rhodamine，7-AAD(7-氨基放线菌素D，CG-选择性的)，吖啶橙，色霉素A3，CyTRAK橙(Biostatus)，DAPI，DRAQ5，DRAQ7，溴化乙锭，Hoechst33258，Hoechst33342，LDS 751，光辉霉素，碘化丙啶(PI)，SYTOX蓝，SYTOX绿，SYTOX橙，噻唑橙，TO-PRO，菁染料单体，TOTO-1，TO-PRO-1，TOTO-3，TO-PRO-3，YOSeta-1，可与本发明的用于研究细胞的连接体连接的荧光团化合物选自以下化合物或其衍生物：YOYO-1，DCFH(2′，7′-二氯二氢荧光素，氧化形式)，DHR(二氢罗丹明123，氧化形式，光催化氧化)，Fluo-3(AM酯，pH>6)，Fluo-4(AM酯，pH7.2)，Indo-1(AM酯，低/高钙(Ca2+))，SNARF(pH 6/9)。T可与本发明的用于研究蛋白质/抗体的连接体连接的优选荧光团化合物选自以下化合物或其衍生物：别藻蓝蛋白(APC)、AmCyan1(四聚体)、AsRed2(四聚物，Clontech)、Azami Green(单体，MBL)、Azurite、B-藻红蛋白(BPE)、Cerulean、CyPet、DsRed单体、DsRed2(“RFP”)、EBFP、EBFP2、ECFP，EGFP(弱二聚体)、Emerald(弱二聚体)、EYFP(单体)，mKO，mOrange，mPlum，复盆子、mRFP1(单体)、mStrawberry、mTFP1、mTurquoise2、P3(藻胆复合体)、Peridinin Chloro-phyll(PerCP)，R-藻红蛋白(RPE)、T-Sapphire、TagCFP(二聚体)、TagGFP(二聚体)、TagRFP(二聚体)、TagYFP(二聚体)、tdTomato(串联二聚体)、Topaz、TurboFP602(二聚体)、TurboFP635(二聚体)、TurboGFP(二聚体)、TurboRFP(二聚体)、TurboYFP(二聚体)、Venus、野生型GFP、YPet、ZsGreen1(四聚体)、ZsYellow1(四聚体)。
10.所述药物D1和D2独立地为聚亚烷基二醇选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物；特别优选的是PEG，更特别优选的是单功能活化的羟基PEG(例如，在单末端活化的羟基PEG，包括羟基PEG单羧酸、羟基PEG单醛、羟基PEG单胺类、羟基PEG双酰肼、羟基PEG一卡巴肼、羟基聚乙二醇一碘乙酰胺、羟基PEG二马来酰亚胺、羟基PEG正吡啶二硫化物、羟基PEG肟、羟基PEG碳酸单苯酯、羟基PEG苯基乙二醛、羟基-PEG-单噻唑烷-2-硫酮、羟基-PEG单硫酯、羟基-PPEG单硫醇、羟基-PEG-单三嗪和羟基-PEG-单乙烯基砜)。聚亚烷基二醇的分子量为约10道尔顿至约200kDa及其偶联物可用于延长抗体或抗体样蛋白质分子在给药于哺乳动物时的半衰期。
11.根据权利要求6，7和8药物D1和D2选自：
tubulysin及其类似物、美登素及其类似物、紫杉烷(taxane)及其类似物、CC-1065及其类似物、柔红霉素或多柔比星及他们的类似物、鹅膏毒素及其类似物、苯并二氮卓二聚体(例如吡咯并苯二氮卓(PBD)、托美霉素、氨茴霉素、吲哚并苯并二氮卓、咪唑并苯并噻二氮卓或恶唑烷并苯并二氮卓的二聚体)及其类似物、加利车霉素类和烯二炔类抗生素类似物、放线菌素及其类似物、氮丝菌素及其类似物、博来霉素及其类似物、表柔比星及其类似物、他莫昔芬及其类似物、伊达比星及其类似物、多拉司他汀及其类似物、澳瑞他汀(包括单甲基澳瑞他汀(MMAE)、MMAF、澳瑞他汀PYE、澳瑞他汀TP、澳瑞他汀2-AQ、6-AQ、EB(AEB)、和EFP(AEFP))及其类似物、康普瑞汀、多卡霉素及其类似物、喜树碱、格尔德霉素及其类似物、甲氨喋呤及其类似物、噻替派及其类似物、长春地辛及其类似物、长春新碱及其类似物、半米塔林及其类似物、nazumamide及其类似物、spliceostatin、a pladienolide、微晶蛋白及其类似物、放射敏素及其类似物、altero-bactin及其类似物、a microsclerodermin及其类似物、theonellamide及其类似物、esperam-icin及其类似物、PNU-159682及其类似物、蛋白激酶抑制剂、MEK抑制剂、KSP抑制剂、烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)抑制剂、免疫毒素、一种，两种或更多种DNA、RNA、mRNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和PIWI相互作用RNA(piRNA)及其立体异构体、电子等排体、类似物或衍生物作为药物，
其中：
(a)Tubulysin及其类似物具有式(IV)的结构：
或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或多晶结构；或其旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中是独立地连接到L1和/或L2的连接位点；
其中R1、R2、R3、和R4独立地为H、C1～C8烷基、C2～C8杂烷基或杂环、C3～C8芳基、芳基烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂烷基环烷基、碳环或烷基羰基；或R1R2、R1R3、R2R3、R3R4、R5R6、R11R12或R13R14形成的3～7元碳环、环烷基、杂环、杂环烷基、芳基或杂芳基环体系；当独立或同时连接到L1或L2时，R1和R2可以独立地缺省，Y1是N或CH；
其中R5、R6、R8、R10和R11独立地为H、或C1～C4烷基或杂烷基；
其中R7独立地为H、R14、-R14C(＝O)X1R15；或-R14X1R15；X1是O、S、S-S、NH、CH2或NR14；
其中R9为H、OH、-O-、＝O、-OR14、-OC(＝O)R14、-OC(＝O)NHR14-、-OC(＝O)R14SSR15-、OP(＝O)(OR14)-、-OC(＝O)NR14R15、OP(＝O)(OR14)、或OR14OP(＝O)(OR15)；
其中R11独立地为H、R1、-R14C(＝O)R16、-R1X2R2、-R1C(＝O)X2、其中X2是-O-、-S-、-NH-、-N(R2)-、-O-R1-、-S-R1-、-S(＝O)-R1-、或-NHR2；
其中R12为R1、-OH、-SH、-NH2、NH、NHNH2、-NH(R15)、-OR15、-R15COR16、-R15COOR16、-R15C(O)NH2、-R15C(O)NHR17、-SR16、R15S(＝O)R16、-R15P(＝O)(OR17)2、-R15OP(＝O)(OR17)2、-CH2OP(＝O)(OR17)2、-R15SO2R17、-R15X2R16、-R15C(＝O)X2，其中X2是-O-、OH、SH、-S-、NH2、-NH-、-N(R15)-、-O-R15-、-S-R15-、-S(＝O)-R15-、CH2或-NHR15-；
R13和R14独立地为H、O、S、NH、N(R15)、NHNH、-OH、-SH、-NH2、NH、NHNH2、-NH(R15)、-OR15、CO、-COX2、-COX2R16、R17、F、Cl、Br、I、SR16、NR16R17、N＝NR16、N＝R16、NO2、SOR16R17、SO2R16、SO3R16、OSO3R16、PR16R17、POR16R17、PO2R16R17、OP(O)(OR17)2、OCH2OP(O)(OR17)2、OC(O)R17、OC(O)OP(O)(OR17)2、PO(OR16)(OR17)、OP(O)(OR17)OP(O)(OR17)2、OC(O)NHR17；-O-(C4-C12糖苷)、-N-(C4-C12糖苷)、C1～C8烷基、杂烷基、C2-C8烯基、炔基、杂烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、或2-8个碳原子的酯、醚或酰胺；或包含1-8个氨基酸的肽(NH(Aa)1～8或CO(Aa)1～8、N-端或C-端1-8个相同或不同的氨基酸)，或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯基单元，其中p是0至约1000的整数，或上述基团的组合；X2是O、S、S-S、NH、CH2、OH、SH、NH2、CHR14或NR14；
R15、R16和R17独立地为H、C1～C8烷基、或杂烷基；C2-C8烯基、炔基、杂烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、烷基羰基、或Na+、K+、Cs+、Li+、Ca2+、Mg+、Zn2+、N+(R1)(R2)(R3)(R4)、HN+(C2H5OH)3的盐；
Y1和Y2独立地为N或CH；q是0或1；当q＝0，Y3不存在，Y4、Y5、Y6和Y7独立地为CH、N、NH、O、S、或N(R1)，所以Y2、Y4、Y5、Y6和Y7形成呋喃、吡咯噻吩、噻唑、噁唑和咪唑、吡唑、三唑、四唑、噻二唑杂芳环；当q＝1、Y3、Y4、Y5、Y6和Y7独立地为CH或N时，Y2、Y3、Y4、Y5、Y6和Y7形成苯、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、四嗪、五嗪的芳环；
Tubulysin类似物的结构实例如下所示：
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
其中R20是H、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基、C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基、C3-C8芳基、芳烷基、杂环基、碳环基、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基的直链或支链；碳酸酯(-C(O)OR17)，氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；或C1-C8羧酸盐、酯、醚或酰胺；或1～8个氨基酸；或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚乙烯氧基单元，其中p是0至约1000的整数；或R20缺省且氧与碳形成酮，或两种或者更多基团的组合；
Z3和Z3独立地为H、OH、NH2、O、NH、COOH、COO、C(O)、C(O)、C(O)NH、C(O)NH2、R18、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、OPO(OR18)2、NHPO(OR18)2、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC(O)R18、OC(O)NHR18、OSO2(OR18)、O-(C4-C12-糖苷)、直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳烷基、杂环基、碳环基、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基的直链或支链；碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R17和R18独立地为H、直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；
R19是H、OH、NH2、OSO2(OR18)、XCH2OP(O)(OR18)2、XPO(OR18)2、XC(O)OP(O)(OR18)2、XC(O)R18、XC(O)NHR18、C1～C8烷基或羧酸酯；C2～C8烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3～C8芳基或烷基羰基；或药用盐；
X是O，S，NH，NHNH，或CH2；
R7定义同上；其中连接位点在式IV-01-IV-79中，与根据式(IV)中所示相同；
(b)加利车霉素及其相关的烯二炔抗生素具有下式结构：
或元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或多晶结构；或其旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中是与L1或L2连接的位点；
(c)美登素或其衍生物美登素类化合物具有以下结构：
其中是与L1或L2连接的位点；
(d)喜树碱(CPTs)及其衍生物具有以下结构：
或一种或多种元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或多晶结构；或其旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中R1，R2和R4独立地选自H、F、Cl、Br、CN、NO2、C1-C8烷基；O-C1-C8烷基、NH-C1-C8烷基；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；2-8个碳原子C2-C8酯、醚、酰胺、碳酸酯、尿素或氨基甲酸酯；
R3为H、OH、NH2、C1-C8烷基、O-C1-C8烷基、NH-C1-C8烷基、C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；2-8个碳原子C2-C8酯、醚、酰胺、碳酸酯、尿素或氨基甲酸酯；或R1和R2、R2和R3和R3和R4独立形成元碳环、杂环、杂环烷基、芳基或杂芳基环系统。其中/>是分子中与L1或L2连接的位点。
喜树碱(CPTs)及其衍生物特别的具有以下结构：
拓扑替康类似物，
伊立替康类似物，
伊立替康类似物，/>
西利替康，
科西特康
依喜替康，
GI-149893类似物，/>
Gimatecan类似物，
贝洛替康类似物，
鲁比替康或IDEC-132类似物，
BN-80927类似物，
BN-80927类似物，
或一种或多种元素同位素取代物一种或多种化学元素，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中是连接到L1或L2的位点；P1是H、OH、NH2、COOH、C(O)NH2、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、OPO(OR18)2、NHPO(OR18)2、OC(O)R18、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC(O)NHR18、OC(O)N(C2H4)2NCH3、OSO2(OR18)、O-(C4-C12-糖苷)、OC(O)N(C2H4)2CH2N(C2H4)2CH3、O-(C1-C8支链或支链的烷基)、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基、C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R17和R18独立地为H、直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基、碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)R1和R2独立地选自H；O-C1～C8烷基；C2-C8杂烷基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8芳基或芳烷基；
(e)the Combretastatins包含下式化合物：
是分子上连接到L1或L2的位点；
(f)紫杉烷具有下式结构：
其中是连接到L1或L2的位点；Ar和Ar’独立地是芳基或杂芳基。
(g)蒽环类药物具有下式结构：
柔红霉素类似物，/>
柔红霉素类似物，
多柔比星类似物，
表柔比星类似物，
伊达比星类似物，
米托蒽醌类似物，
Pixantrone类似物，/>
Losoxantrone类似物，
Amrubicin类似物，
其中是与L1或L2连接的位点；
(h)长春花生物碱选自长春碱，长春新碱，长春地辛，环氧长春碱，长春瑞滨，长春质碱，长春花碱，长春胺醇，维尼丁，米诺维辛，甲氧基米诺维辛，长春花草碱，脱氧长春氨醇，长春蔓晶，长春胺，长春西汀，长春布宁，具有下式：
长春新碱(leurocristine)，/>
长春新碱(leurocristine)，
长春碱，
长春碱；
利福布汀类似物，/>
利福布汀类似物，
其中是连接到L1或L2位点；
(i)海兔毒素(Dolastatins)及其肽类似物和衍生物选自海兔毒素10、澳瑞他汀E(AE)、澳瑞他汀EB(AEB)、澳瑞他汀EFP(AEFP)、MMAD(单甲基澳瑞他汀D或单甲基海兔毒素10)、MMAF(单甲基澳瑞他汀F或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-苯丙氨酸)、MMAE(单甲基澳瑞他汀E或N-甲基缬氨酸-缬氨酸-dolaisoleuine-dolaproine-norephedrine)、5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)，澳瑞他汀F苯二胺(AFP)且具有下式：
/>
或一种或多种元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中R1、R2、R3、R4和R5独立地为H、C1-C8直链或支链烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酯、醚、酰胺、胺、杂环烷基或酰氧基胺；或包含1-8个氨基酸的肽，或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯基单元，其中p为1至约5000的整数。两个Rs：R1和R2、R2和R3、R1和R3或R3和R4可以形成烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或烷基环烷基的3～8元环状；
X3是H、CH3或X1’R1’，其中X1’是NH、N(CH3)、NHNH、O、或S、且R1’是H或C1-C8直链或支链烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基或酰氧基胺；
R3’是H或C1-C6直链或支链烷基；
Z3’是H、COOR1、NH2、NHR1、OR1、CONHR1、NHCOR1、OCOR1、OP(O)(OM1)(OM2)、OCH2OP(O)(OM1)(OM2)、OSO3M1、R1、或O-糖苷(葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、葡糖醛酸苷/葡糖醛酸、阿洛糖苷、果糖苷等)、NH-糖苷、S-糖苷或CH2-糖苷；M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4或NR1R2R3；
Y1和Y2独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1当连接到位点时，(独立地与L1和/或L2连接)；或OH、NH2、NHNH2、NHR5、SH、C(O)OH、C(O)NH2、OC(O)NH2、OC(O)OH、NHC(O)NH2、NHC(O)SH、OC(O)NH(R1)、N(R1)C(O)NH(R2)、C(O)NHNHC(O)OH或C(O)NHR1“当未连接到位点/>时；
R12是OH、NH2、NHR1、NHNH2、NHNHCOOH、O-R1-COOH、NH-R1-COOH、NH-(Aa)nCOOH、O(CH2CH2O)pCH2CH2OH、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NR1R1’、NHOH、NHOR1、O(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH-Ar-COOH、NH-Ar-NH2、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH-SO3H、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H、R1-NHSO3H、NH-R1-NHSO3H、O(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2、OR1、R1-NHPO3H2、R1-OPO3H2、O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2、OR1-NHPO3H2、NH-R1-NHPO3H2、NH(CH2CH2NH)pCH2-CH2NH2、NH(CH2CH2S)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2NH)pCH2CH2OH、NH(CH2CH2S)pCH2-CH2OH、NH-R1-NH2、或NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2，其中Aa是1-8个相同或者不同的氨基酸；p是1-5000；R1、R2、R3、R4、R5、R5’、Z1、Z2和n的定义同前文。
(j)Hemiasterlin及其类似物具有以下结构：
其中R1、R2、R3、R4和R5独立地为H；C1-C8直链或支链烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酯、醚、酰胺、胺、杂环烷基或酰氧基胺；或含有1-8个氨基酸的肽、或具有式(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯单元、其中p是1至约5000的整数；R2和R3可以形成3～8个环的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或烷基环烷基。
(k)艾日布林(Eribulin)具有以下结构：
其中是独立地连接到L1和/或L2的位点；
(l)烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂(NAMPT)具有以下结构NP01、NP02、NP03、NP04、NP05、NP06、NP07、NP08、和NP09：
或一种或多种元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；其中与前文相同；X5是F、Cl、Br、I、OH、OR1、R1、OPO3H2、OSO3H、NHR1、OCOR1、NHCOR1。
(m)苯二氮卓二聚体及其类似物具有以下结构，PB01、PB02、PB03、PB04、PB05、PB06、PB07、PB08、PB09、PB10、PB11、PB12、PB13、PB14、PB15、和PB16：
/>
/>
或一种或多种元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中X1、X2、Y1和Y2独立地为O、N、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；
R1、R2、R3、R1’、R2’、和R3’独立地为H、F、Cl、＝O、＝S、OH、SH、C1-C8直链或支链的苄基、芳基、烯基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酯(COOR5或-OC(O)R5)、醚(OR5)、酰胺(CONR5)、氨基甲酸酯(OCONR5)、胺类(NHR5、NR5R5’)、杂环烷基、或酰氧基胺(-C(O)NHOH、-ONHC(O)R5)、或含有1-20个天然或非天然氨基酸的肽、或结构式如(OCH2CH2)p或(OCH2CH(CH3))p的聚氧乙烯基单元、其中p是1至1000的整数。两个R基团：R1和R2、R2和R3、R1和R3、R1’和R2’、R2’和R3’或R1’和R3’可以独立地形成3～8元环的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或烷基环烷基；
X3和Y3独立地为N、NH、CH或CR1、或X3和Y3之一可以缺省；
R4、R5、R6、R12和R12’独立地为H、OH、NH2、NH(CH3)、NHNH2、COOH、SH、OZ3、SZ3、F、Cl，或C1-C8直链或支链烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺；
X6是CH、C(O)、N、P(O)NH、P(O)NR1、CHC(O)NH、C1-C8直链或支链烷基，或杂烷基；C3-C8芳基、杂芳基、烷基环烷基、酰氧基、烷基芳基、烷基芳氧基或烷基芳氨基，或Aa(氨基酸，优选选自Lys、Phe、Asp、Glu、Ser、Thr、His、Cys、Tyr、Trp、Gln、Asn、Arg)；
Z3是H、OP(O)(OM1)(OM2)、OCH2OP(O)(OM1)(OM2)、OSO3M1、或O-糖苷(葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、葡糖醛酸苷/葡糖醛酸、阿洛糖苷、果糖苷等)、NH-糖苷、S-糖苷或CH2-糖苷；M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4或NR1R2R3；
的定义如前所述；
(n)CC-1065类似物和多卡霉素类似物具有以下结构、CC01、CC02、CC03、CC04、CC05、CC06和CC07：
/>
其中当连接到位点时，X1、X2、Y1和Y2独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；或者当未连接到连接位点/>时，为OH、NH2、NHNH2、NHR1、SH、C(O)OH、C(O)NH2、OC(O)NH2、OC(O)OH、NHC(O)NH2、NHC(O)SH、OC(O)NH(R1)、N(R1)C(O)NH(R2)、C(O)NHNHC(O)OH或C(O)NHR1；
Z3是H、PO(OM1)(OM2)、SO3M1、CH2PO(OM1)(OM2)、CH3N(CH2CH2)2NC(O)-、O(CH2CH2)2NC(O)-、R1、或糖苷；其中R1、R2、R3、M1、M2、和n的定义同前文所述；
(o)毒伞肽及其类似物具有以下结构，Am01、Am02、和Am03：
或一种或多种化学元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中X1，和Y1独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH2、CHNH、CH2O、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；R7、R8、和R9独立地为为H、OH、OR1、NH2、NHR1、C1-C6烷基、或缺省；Y2是O、O2、NR1、NH、或缺省；R10是CH2、O、NH、NR1、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O、OC(O)O、C(O)、OC(O)、OC(O)(NR1)、(NR1)C(O)(NR1)、C(O)R1或缺省；R11是OH、NH2、NHR1、NHNH2、NHNHCOOH、O-R1-COOH、NH-R1-COOH、NH-(Aa)rCOOH、O(CH2CH2O)pCH2CH2OH、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NR1R2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-COOH、NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH-Ar-COOH、NH-Ar-NH2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-NHSO3H、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H、R1-NHSO3H、NH-R1-NHSO3H、O(CH2CH2O)p-CH2CH2NHPO3H2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2、OR1、R1-NHPO3H2、R1-OPO3H2、O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2、OR1-NHPO3H2、NH-R1-NHPO3H2、或NH(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2，其中(Aa)r指1-8个氨基酸；n和m1独立地为1-20；p是1-1000；R1、R2和Ar的定义在本专利申请中前后相同；的定义如前文所述。
(p)Spliceostatins和pladienolides是spliceostatin A，FR901464，和(2S，3Z)-5-{[(2R，3R，5S，6S)-6-{(2E，4E)-5-[(3R，4R，5R，7S)-7-(2-肼基-2-氧乙基)-4-羟基-1，6-二氧杂吡啶[2.5]辛-5-基]-3-五甲基-2，4-二烯-1-基-1}-2，5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧基-3-烯-2-基醋酸酯，Pladienolide B，Pladienolide D，和E7107具有Sp-01母核结构：
(q)蛋白激酶抑制剂选自Adavosertib、阿法替尼、阿昔替尼、巴非替尼、博舒替尼、柯美替尼、克唑替尼、卡波替尼、达沙替尼、恩曲替尼、厄达非替尼、厄洛替尼、福他替尼、吉非替尼、依鲁替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、莫比替尼、尼洛替尼、帕唑帕尼、帕那替尼、波纳替尼、Rebastinib、瑞戈非尼、鲁索替尼、索拉非尼、舒尼替尼、SU6656、托法替尼、凡德替尼、维罗非尼、恩曲替尼、帕博西、Ribociclib、阿贝西利、达可替尼、来那替尼、(CO-1686)、奥希替尼、AZD3759、纳扎替尼(EGF816)，具有下示结构，PK01-PK40：
阿法替尼，
阿昔替尼，/>
巴非替尼
博舒替尼，
柯美替尼，
克唑替尼，
达沙替尼，
恩曲替尼，/>
厄达非替尼，
厄洛替尼，
福他替尼，
吉非替尼，
吉非替尼，
吉非替尼，/>
吉非替尼，
伊马替尼，
拉帕替尼，
乐伐替尼，
莫比替尼，
尼洛替尼，/>
帕唑帕尼，
帕那替尼，
鲁索替尼，
索拉非尼，
舒尼替尼，
托法替尼，/>
凡德替尼，
维罗非尼；
恩曲替尼；
帕博西尼，
阿贝西利，/>
达可替尼，
来那替尼，
奥希替尼，
纳扎替尼(EGF816)，/>
其中Z5和Z5’独立地选自O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；R1和R2的定义如上；
(r)MEK抑制剂选自PD0325901，塞鲁替尼(AZD6244)，cobimetinib(XL518)，瑞法替尼，曲美替尼(GSK1120212)，pimasertib，比美替尼(MEK162)，AZD8330，RO4987655，RO5126766，WX-554，E6201，GDC-0623，PD-325901和TAK-733，优选具有下式结构：
曲美替尼，
卡比替尼，
比美替尼，
司美替尼，
其中Z5选自O，NH，NHNH，NR5，S，C(O)O，C(O)NH，OC(O)NH，OC(O)O，NHC(O)O，NHC(O)NH，NHC(O)S，OC(O)N(R1)，N(R1)C(O)N(R2)，C(O)NHNHC(O)和C(O)NR1；R1和R2的定义如上；
(s)蛋白酶抑制剂选自卡非佐米、克林霉素、瑞他莫林、Indibulin优选具有下式结构：
卡非佐米，
克林霉素，
Carmaphycin类似物；
(t)免疫毒素选自白喉毒素(DT)、霍乱毒素(CT)、天花粉蛋白(TCS)、淀粉酶、假单胞菌外毒素A(ETA)、红原毒素、白喉毒素、AB毒素、III型外毒素、前溶血素和顶溶血素；
(u)细胞受体激动剂或细胞刺激分子选自：叶酸衍生物、谷氨酸脲衍生物、生长抑素及其类似物(选自奥曲肽(Sandostatin)和兰瑞肽(Somatuline))、芳基磺胺、垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)(PAC1)、血管活性肠肽(VIP/PACAP)(VPAC1，VPAC2)、黑色素细胞刺激激素(α-MSH)、胆囊收缩素(CCK)/胃泌素受体激动剂、铃蟾素(选自Pyr-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2)/胃泌素释放肽(GRP)。神经降压素受体配体(NTR1，NTR2，NTR3)；物质P(NK1受体)配体；神经肽Y(Y1-Y6)；归巢肽包括RGD(Arg-Gly-Asp)，NGR(Asn-Gly-Arg)，二聚体和多聚体环状RGD肽(选自cRGDfV)，TAASGVRSMH和LTLRWVGLMS(硫酸软骨素蛋白聚糖NG2受体配体)和F3肽；细胞穿透肽(CPPs)；肽激素选自促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂和拮抗剂，以及促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂，通过靶向卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)以及睾酮产生发挥作用，选自布舍瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OtBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt)，戈那瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，戈舍瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(OtBu)-Leu-Arg-Pro-AzGly-NH2)，组氨瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-His(N-benzyl)-Leu-Arg-Pro-NHEt)，亮丙瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt)，那法瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-2Nal-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，曲普瑞林(Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，纳法瑞林、地洛林、阿贝瑞林(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-(N-Me)Tyr-D-Asn-Leu-异丙基Lys-Pro-DAla-NH2)，西曲瑞克(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2)，地加瑞克(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-4-aminoPhe(L-hydroorotyl)-D-4-aminoPhe(carba-moyl)-Leu-异丙基Lys-Pro-D-Ala-NH2)，和地加瑞克(Ac-D-2Nal-D-4-chloroPhe-D-3-(3-pyridyl)Ala-Ser-Tyr-D-(N9，N10-diethyl)-homoArg-Leu-(N9，N10-diethyl)-homoArg-Pro-D-Ala-NH2)；模式识别受体(PRRs)，选自类Toll受体(TLRs)配体，C型凝集素和结节状的受体(NLRs)配体；降钙素受体激动剂；整合素受体及其受体子类(选自αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α6β4、α7β1、αLβ2、αIIIbβ3)激动剂(选自GRGDSPK，cyclo(RGDfV)(L1)及其衍生物[环状(-N(Me)R-GDfV)，环状(R-Sar-DfV)，环状(RG-N(Me)D-fV)，环状(RGD-N(Me)f-V)，环状(RGDf-N(Me)V-)(西仑吉肽)]；Anticalin(脂质运载蛋白的衍生物)；Adnectins(10个FN3(纤连蛋白))；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)；Avimers；EGF受体，或VEGF受体激动剂；
细胞受体的特定小分子激动剂选自以下：LB01(叶酸)、LB02(PMSA配体)、LB03(PMSA配体)、LB04(PMSA配体)、LB05(生长抑制素)、LB06(生长抑制素)、LB07(奥曲肽、生长抑制素类似物)、LB08(兰瑞肽、生长抑制素类似物)、LB09(伐普肽(Sanvar)、生长抑制素类似物)、LB10(CAIX配体)、LB11(CAIX配体)、LB12(胃泌素释放肽受体(GRPr)、MBA)、LB13(促黄体激素释放激素(LH-RH)和GnRH配体)、LB14(促黄体激素释放激素(LH-RH)和GnRH配体)、LB15(GnRH拮抗剂、Abarelix)、LB16(钴胺素、维生素B12类似物)、LB17(钴胺素、维生素B12类似物)、LB18(用于αvβ3整联蛋白受体、环状RGD五肽)、LB19(VEGF受体的异二价肽配体)、LB20(神经髓质素B)、LB21(蛙皮素，作用于G蛋白偶联受体)、LB22(TLR2，作用于类Toll受体)、LB23(作用于雄性激素受体)、LB24(西仑吉肽或环(-RGDfV-)αv整合素受体、LB23(氟可的松)、LB25(利福布汀类似物)、LB26(利福布汀类似物)、LB27(利福布汀类似物)、LB28(氟氢可的松)、LB29(地塞米松)、LB30(丙酸氟替卡松)、LB31(丙酸倍氯米松)、LB32(醋酸曲安奈德)、LB33(泼尼松龙)、LB34(泼尼松龙)、LB35(甲基强的松龙)、LB36(倍他米松)、LB37(伊立替康类似物)、LB38(克唑替尼类似物)、LB39(硼替佐米类似物)、LB40(卡菲佐米类似物)、LB41(卡非佐米类似物)、LB42(亮丙瑞林类似物)、LB43(曲普瑞林类似物)、LB44(克林霉素)、LB45(利拉鲁肽类似物)、LB46(半长春新碱类似物)、LB47(瑞他帕林类似物)、LB48(丁布尔类似物)、LB49(长春碱类似物)、LB50(利西森肽类似物)、LB51(奥西丁尼类似物)、LB52(核苷类似物)、LB53(厄洛替尼类似物)和LB54(拉帕替尼类似物)具有下式结构：
(叶酸)，
(PMSA配体偶联物)，
(PMSA配体偶联物)，/>
(PMSA配体)，
(Octreotide，生长抑制素类似物)，
(Lanreotide，生长抑制素类似物)，/>
(氨肽(Sanvar)，生长抑制素类似物)，
(CAIX配体)，
(CAIX配体)，
LB12(胃泌素释放肽受体(GRPr)，MBA)，
LB13(促黄体激素释放激素(LH-RH)和促性腺激素释放激素GnRH配体)，
LB14(促黄体激素释放激素(LH-RH)和促性腺激素释放激素GnRH配体)，
LB15(GnRH拮抗物、阿巴瑞克)，
R19是5’脱氧腺苷、Me、OH、CN；
LB16(钴胺素，维生素B12类似物)，
R19是5’脱氧腺苷、Me、OH、CN；LB17(钴胺素，维生素B12类似物)，
LB18(环RGD五肽，作用于αvβ3整联蛋白受体)，
LB19(异源二价肽配体偶联物，作用于血管内皮生长因子VEGF受体)，
(神经髓质素B)，
LB21(蛙皮素偶联物，作用于G蛋白偶联受体)，
(TLR2偶联物，作用于类Toll受体)，
(雄激素受体)，
LB24(西伦吉肽/环(-RGDfV-)偶联物，作用于αv整合素受体)
(利福布汀类似物)，
(利福布汀类似物)，
(利福布汀类似物)，
(氟氢可的松)，
(地塞米松)，/>
(丙酸氟替卡松)，
(倍氯米松丙酸酯)，
(曲安奈德)，
(泼尼松)，
(泼尼松龙)，
(甲基强的松龙)，/>
(倍氟美松)，
(伊立替康类似物)，
(克唑替尼类似物)，
(硼替佐米类似物，其中Y5是N、CH、C(Cl)、C(CH3)或C(COOR1)；R1是H、C1-C6烷基、C3-C8 Ar；
(卡菲佐米类似物)，
(卡菲佐米类似物)，/>
(亮丙瑞利类似物)，
(曲普瑞林类似物)，
(克林霉素)，
(利拉鲁肽类似物)，
(索马鲁肽类似物)，
(瑞他帕林类似物)，/>
(丁布尔类似物)，
(长春碱类似物)，
(利西森肽类似物)，
(奥西丁尼类似物)，
(核苷类似物)，
(埃罗替尼类似物)，/>
(拉帕替尼类似物)；
其中X4、和Y1独立地为O、NH、NHNH、NR1、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH2、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；
(v)一种，两种或更多种DNA、RNA、mRNA、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和PIWI相互作用RNA(piRNA)通过本发明的方法与抗体或抗体样蛋白偶联，具有下式：
其中是连接本专利的支链连接子的位点；/>是单链或双链的DNA、RNA、mRNA、siRNA、miRNA、或piRNA；X1、和Y独立地为O、NH、NHNH、NR1、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R1)、CH2、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1。
12.根据权利要求1，6或8所述的抗体或类抗体蛋白选自：
(A)：由前体、纳米抗体、肽、聚合物胶束、脂质体、基于脂蛋白的药物载体、纳米颗粒药物载体、树枝状聚合物和以及包被或连接有类抗体蛋白(抗体)的上述颗粒，或上述组合；
(B)：组合包括全长抗体(多克隆抗体、单克隆抗体、二聚体、多聚体)、多特异性抗体(选自双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体))、单链抗体、结合靶细胞的抗体片段、单克隆抗体、单链单克隆抗体、结合靶细胞的单克隆抗体片段、嵌合抗体、结合靶细胞的嵌合抗体片段、结构域抗体、结合靶细胞的结构域抗体片段、表面重塑抗体、表面重塑单链抗体、或结合靶细胞的表面重塑抗体片段、人源化抗体或表面重塑抗体，人源化单链抗体或与靶细胞结合的人源化抗体片段、抗独特型(抗-Id)抗体、CDR′s、双抗体、三抗体、四抗体、小抗体、前抗体、前抗体片段、小免疫类抗体蛋白(SIP)、淋巴因子类抗体蛋白、激素型类抗体蛋白、生长因子类抗体蛋白、集落刺激因子类抗体蛋白、营养转运类抗体蛋白、大分子量类抗体蛋白、融合类抗体蛋白、激酶抑制剂类抗体蛋白、基因靶向类抗体蛋白，包被在纳米颗粒上的类抗体蛋白，或抗体或大分子量类抗体蛋白修饰的高分子；
(C)：组合包括IgG抗体能够结合肿瘤细胞、病毒感染细胞、微生物感染细胞、寄生虫感染细胞、自身免疫疾病细胞、活化肿瘤细胞、髓样细胞、活化的T细胞、受影响的B细胞或黑素细胞、或抗以下抗原或受体中任一种的异常细胞：CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD8a、CD8b、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD12w、CD14、CD15、CD16、CD16a、CD16b、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD32a、CD32b、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD49c、CD49d、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CD60、CD60a、CD60b、CD60c、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD67、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD75s、CD76、CD77、CD78、CD79、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD85a、CD85b、CD85c、CD85d、CD85e、CD85f、CD85g、CD85g、CD85i、CD85j、CD85k、CD85m、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CD92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107、CD107a、CD107b、CD108、CD109、CD110、CD111、CD112、CD113、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120、CD120a、CD120b、CD121、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CD123a、CD124、CD125、CD126、CD127、CD128、CD129、CD130、CD131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CD137、CD138、CD139、CD140、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CDw145、CD146、CD147、CD148、CD149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD156a、CD156b、CD156c、CD156d、CD157、CD158、CD158a、CD158b1、CD158b2、CD158c、CD158d、CD158e1、CD158e2、CD158f2、CD158g、CD158h、CD158i、CD158j、CD158k、CD159、CD159a、CD159b、CD159c、CD160、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、CD167、CD167a、CD167b、CD168、CD169、CD170、CD171、CD172、CD172a、CD172b、CD172g、CD173、CD174、CD175、CD175s、CD176、CD177、CD178、CD179、CD179a、CD179b、CD180、CD181、CD182、CD183、CD184、CD185、CD186、CDw186、CD187、CD188、CD189、CD190、CD191、CD192、CD193、CD194、CD195、CD196、CD197、CD198、CD199、CDw198、CDw199、CD200、CD201、CD202、CD202(a、b)、CD203、CD203c、CD204、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD210、CDw210a、CDw210b、CD211、CD212、CD213、CD213a1、CD213a2、CD214、CD215、CD216、CD217、CD218、CD218a、CD218、CD21b9、CD220、CD221、CD222、CD223、CD224、CD225、CD226、CD227、CD228、CD229、CD230、CD231、CD232、CD233、CD234、CD235、CD235a、CD235b、CD236、CD237、CD238、CD239、CD240、CD240ce、CD240d、CD241、CD242、CD243、CD244、CD245、CD246、CD247、CD248、CD249、CD250、CD251、CD252、CD253、CD254、CD255、CD256、CD257、CD258、CD259、CD260、CD261、CD262、CD263、CD264、CD265、CD266、CD267、CD268、CD269、CD270、CD271、CD272、CD273、CD274、CD275、CD276、CD277、CD278、CD279、CD281、CD282、CD283、CD284、CD285、CD286、CD287、CD288、CD289、CD290、CD291、CD292、CD293、CD294、CD295、CD296、CD297、CD298、CD299、CD300、CD300a、CD300b、CD300c、CD301、CD302、CD303、CD304、CD305、CD306、CD307、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD307f、CD308、CD309、CD310、CD311、CD312、CD313、CD314、CD315、CD316、CD317、CD318、CD319、CD320、CD321、CD322、CD323、CD324、CD325、CD326、CD327、CD328、CD329、CD330、CD331、CD332、CD333、CD334、CD335、CD336、CD337、CD338、CD339、CD340、CD341、CD342、CD343、CD344、CD345、CD346、CD347、CD348、CD349、CD350、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD356、CD357、CD358、CD359、CD360、CD361、CD362、CD363、CD364、CD365、CD366、CD367、CD368、CD369、CD370、CD371、CD372、CD373、CD374、CD375、CD376、CD377、CD378、CD379、CD381、CD382、CD383、CD384、CD385、CD386、CD387、CD388、CD389、CRIPTO、CRIPTO、CR、CR1、CRGF、CRIPTO、CXCR5、LY64、TDGF1、4-1BB、APO2、ASLG659、BMPR1B、4-1BB、5AC，5T4(Trophoblast糖蛋白、TPBG、WNT-活化抑制因子1或WAIF1)、腺癌抗原、AGS-5、AGS-22M6、启动素受体激酶1、AFP、AKAP-4、ALK、α整合素、αvβ6、氨基肽酶N、淀粉样蛋白β、雄激素受体、促血管新生蛋白因子2、促血管新生蛋白因子3、膜联蛋白A1、炭疽毒素保护性抗原、抗转移蛋白受体、AOC3(VAP-1)、B7-H3、炭疽杆菌、BAFF(B细胞启动因子)、BCMA、B淋巴瘤细胞、bcr-abl、蛙皮素、BORIS、C5、C242抗原、CA125(糖抗原125、MUC16)、CA-IX(或CAIX、碳酸酐酶9)、CALLA、CanAg、犬红斑狼疮IL31、碳酸酐酶IX、心肌肌凝蛋白、CCL11(C-C片段趋化因子11)、CCR4(C-C趋化因子受体4)、CCR5、CD3E(ε)、CEA(癌胚抗原)、CEACAM3、CEACAM5(癌胚抗原)、CFD(因子D)、Ch4D5、胆囊收缩素2(CCK2R)、CLDN18(Claudin-18)、丛生因子A、cMet、CRIPTO、FCSF1R(集落刺激因子1受体)、CSF2(集落刺激因子2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、CTAA16.88肿瘤抗原、CXCR4、C-X-C趋化因子受体4、环状ADP核糖核酸酶、细胞周期蛋白B1、CYP1B1、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、Dabigatran、DLL3(类Δ配体3)、DLL4(类Δ配体4)、DPP4(双肽-肽酶4)、DR5(死亡受体5)、大肠杆菌shiga毒素类型-1、大肠杆菌shiga毒素类型-2、ED-B、EGFL7(类EGF结构域蛋白7)、EGFR、EGFRII、EGFRvIII、内皮因子、内皮素B受体、内毒素、EpCAM(上皮细胞粘附分子)、EphA2、Episialin、ERBB2(表皮生长因子受体2)、ERBB3、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、大肠杆菌、ETV6-AML、FAP(成纤维细胞活化蛋白α)、FCGR1、甲胎蛋白、纤维蛋白IIβ链、纤连蛋白额外结构域-B、FOLR(叶酸受体)、叶酸受体α、叶酸水解酶、Fos相关抗原1、呼吸道合胞病毒的F蛋白、卷曲受体、岩藻糖GM1、GD2神经节苷脂、G-28(细胞表面抗原糖脂)、GD3独特型、GloboH、Glypican 3、N-羟乙酰神经氨酸、GM3、GMCSF受体α链、生长分化因子8、GP100、GPNMB(跨膜糖蛋白NMB)、GUCY2C(鸟苷酸环化酶2C)、鸟苷酸环化酶C(GC-C)、肠鸟苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶C受体、热稳定肠毒素受体(hSTAR)、热休克蛋白、血凝素、乙肝表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1(人类表皮生长因子受体1)、HER2、HER2/neu、HER3(ERBB-3)、IgG4、HGF/SF(肝细胞生长因子/分散因子)、HHGFR、HIV-1、组蛋白络合物、HLA-DR(人类白细胞抗原)、HLA-DR10、HLA-DRB、HMWMAA、人类绒毛膜促性腺激素、HNGF、人类分散因子受体激酶、HPVE6/E7、Hsp90、hTERT、ICAM-1(细胞间粘附分子1)、独特型、IGF1R(IGF-1、类胰岛素生长因子1受体)、IGHE、IFN-γ、流感血凝素、IgE、IgE Fc区、IGHE、白介素(包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6R、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-17A、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、或IL-28)、IL31RA、ILGF2(类胰岛素生长因子2)、整合蛋白(α4、αIIbβ3、αvβ3、α4β7、α5β1、α6β4、α7β7、αllβ3、α5β5、αvβ5)、干扰素γ诱导蛋白质、ITGA2、ITGB2、KIR2D、Kappa Ig、LCK、Le、Legumain、Lewis-Y抗原、LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原1、CD11a)、LHRH、LINGO-1、脂磷壁酸、LIV1A、LMP2、LTA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE A1、MAGE A3、MAGE 4、MART1、MCP-1、MIF(巨噬细胞迁移抑制因子、或糖基抑制因子(GIF))、MS4A1(跨膜4结构域亚家族A成员1)、MSLN(间皮素)、MUC1(粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)或多态性上皮粘蛋白(PEM))、MUC1-KLH、MUC16(CA125)、MCP1(单核细胞趋化蛋白1)、MelanA/MART1、ML-IAP、MPG、MS4A1、MYCN、髓磷脂相关糖蛋白、Myostatin、NA17、NARP-1、NCA-90(粒细胞抗原)、Nectin-4(ASG-22ME)、NGF、神经细胞凋亡调控蛋白酶1、NOGO-A、Notch受体、核仁素、Neu致癌基因产物、NY-BR-1、NY-ESO-1、OX-40、OxLDL(氧化低密度脂蛋白)、OY-TES1、P21、p53非突变体、P97、PAP、抗(N-羟乙酰神经氨酸)抗体结合部位、PAX3、PAX5、PCSK9、PDCD1(PD-1、程序性细胞死亡蛋白1)、PDGF-Rα(α血小板源生长因子受体)、PDGFR-β、PDL-1、PLAC1、类PLAP睾丸碱性磷酸酶、血小板衍生生长因子受体β、磷酸钠联合转运体、PMEL 17、聚唾液酸、蛋白酶3(PR1)、前列腺癌、PS(磷脂酰丝氨酸)、前列腺癌细胞、铜绿假单胞菌、PSMA、PSA、PSCA、狂犬病病毒糖蛋白、RHD(Rh多肽1(RhPI))、Rhesus因子、RANKL、RhoC、Ras突变、RGS5、ROBO4、呼吸道合胞病毒、RON、ROR1、肉瘤易位断点、SART3、Sclerostin、SLAMF7(SLAM成员7)、SelectinP、SDC1(多配体蛋白聚糖1)、系统性红斑狼疮(a)、生长调节素C、SIP(1-磷酸鞘氨醇)、生长激素抑制素、精子蛋白17、SSX2、STEAP1(6-跨膜上皮前列腺抗原1)、STEAP2、STn、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白)、存活素、T细胞受体、T细胞跨膜蛋白、TEM1(肿瘤血管内皮标记1)、TENB2、TenascinC(TN-C)、TGF-α、TGF-β(转化生长因子β)、TGF-β1、TGF-β2(转化生长因子2)、Tie(CD202b)、Tie2、TIM-1(CDX-014)、Tn、TNF、TNF-α、TNFRSF8、TNFRSF10B(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B)、TNFRSF13B(肿瘤坏死因子受体超家族成员13B)、TPBG(滋养细胞糖蛋白)、TRAIL-R1(TNF相关坏死诱导配体受体1)、TRAILR2(死亡受体5(DR5))、肿瘤相关的钙信号传感子2、肿瘤特异糖基化的MUC1、TWEAK受体、TYRP1(糖蛋白75)、TRP-1(Trop1)、TRP-2(Trop2)、酪氨酸酶、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-2、VEGFR-1、VEGFR-2、vimentin、WT1、XAGE 1、表达胰岛素生长因子受体的细胞、或表达表皮生长因子受体的细胞。
13.根据权利要求6所述的偶联物，其中超过75％的药物特异性偶联到抗体的重轻链之间的二硫键位点，所述偶联物具有以下结构a001-a233、C-009、C-020、C-025、C-027、C-031、C-037、C-038、C-039、C-043、C-046、C-052、C-056、C-059、C-063、C-066、C-071、C-079、C-084、C-087、C-093、C-096、C-102、C-109、C-111、C-118、C-123、C-133、C-143、C-155、C-168、C-172、C-182、C-186、C-198、C-203、C-208、C-214、C-215、C-216、C-217、C-218、C-226、C-227、C-231、C-237、C-249、C-259、C-260、C-261、C-325、C-326、C-327、C-328、C-329、C-330、C331、C-332、C-333、C-334、C-335、C-353、C-363、C-371、C-378、C-379、C-380、C-381、C-384、C-385、C-386、C-387、C-397、C-400、C-403、C-406、C-408a、C-408b、C-408c、C-408d、C-408e、C-408f、C-410a、C-410b、C-410c、C-412a、C-412b、C-412c、C-413a、C-413b、C-413c、C-413d、C-416a、C-416b、C-416c、C-416d、C-422a、C-422b、C-422c、C-422d、C-425a、C-425b、C-425c、C-425d、C-428a、C-428b、C-428c、C-428d、C-431a、C-431b、C-431c、C-431d的结构之一，其中所述药物与抗体的重链-轻链之间的二硫化物结合位点偶联：
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或一种或多种化学元素元素的同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中p、p1、p2、和p3独立地为0-100；m、m1、和m2独立地为0-20；n是1-10；
P1是H、OH、NH2、COOH、C(O)NH2、OCH2OP(O)(OR18)2、OC(O)OP(O)(OR18)2、OPO(OR18)2、NHPO(OR18)2、OC(O)R18、OP(O)(OR18)OP(O)(OR18)2、OC(O)NHR18、OC(O)N(C2H4)2NCH3、OSO2(OR18)、O-(C4-C12-糖苷)、OC(O)N(C2H4)2CH2N(C2H4)2CH3、O-(C1-C8直链或支链烷基)、C1-C8直链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸脂(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；R17和R18独立地为H、链或支链烷基或杂烷基；C2-C8直链或支链烯基、炔基、烷基环烷基、杂环烷基；C3-C8直链或支链的芳基、芳基烷基、杂环、碳环、环烷基、杂烷基环烷基、烷基羰基、杂芳基；碳酸酯(-C(O)OR17)、氨基甲酸酯(-C(O)NR17R18)；
R1、R2、R3、R1’、R2’、R3’、和R4独立地为H、C1～C8烷基；C2～C8杂烷基、或杂环；C3～C8芳基、芳基烷基、环烷基、烷基环烷基、杂环烷基、杂烷基环烷基、碳环或烷基羰基；或R1和R2、R1和R3、R2和R3、R3和R4、R1’和R2’、R1’和R3’、或R2’和R3’形成3～7元碳环、环烷基、杂环、杂环烷基、芳香基或杂芳香基环系；
R4、R5、R5’、和R6，独立地为H、C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺、或(Ar)r、r＝1-6(氨基酸或具有相同或不同氨基酸序列的肽)；
R7、R8、和R9独立地为H、OH、OR1、NH2、NHR1、C1-C6烷基、或缺省；
R10是CH2、O、NH、NR1、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O、OC(O)O、C(O)、OC(O)、OC(O)(NR1)、(NR1)C(O)(NR1)、C(O)R1或缺省；
R11是OH、NH2、NHR1、NHNH2、NHNHCOOH、O-R1-COOH、NH-R1-COOH、NH-(Aa)rCOOH、O(CH2CH2O)pCH2CH2OH、O(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NH2、NR1R2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-COOH、NH(CH2CH2O)pCH2CH2COOH、NH-Ar-COOH、NH-Ar-NH2、O(CH2CH2O)pCH2CH2-NHSO3H、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHSO3H、R1-NHSO3H、NH-R1-NHSO3H、O(CH2CH2O)p-CH2CH2NHPO3H2、NH(CH2CH2O)pCH2CH2NHPO3H2、OR1、R1-NHPO3H2、R1-OPO3H2、O(CH2CH2O)pCH2CH2OPO3H2、OR1-NHPO3H2、NH-R1-NHPO3H2、或NH(CH2CH2O)pCH2-CH2NHPO3H2，其中(Aa)r是1-8个氨基酸；n和m1独立地为1-20；p是1-1000；R1、R2和Ar，的定义如本申请中前文所述；定义同上；
R12和R12’独立地为H、＝O、OR1、NH2、NH(CH3)、NHNH2、COOH、SH、OZ3、SZ3、F、Cl、或C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺；
R25、R26和R25’独立地为H、Ac、R1、C(O)NHR1、C(O)R1、R1COOH、R1COOR2、R1OR2、R1CONHR2、CH2OAc、CH2NHAc、R1NH2、NR1R2、N+R1R2R3、CH2CONH(CH2)q1COOH、CH2CONH(CH2)q1COOR1、CH2CONH(CH2)q1N+R1R2R3、或(Aa)r；
X1、X2、X4、Y1和Y2，当与位点连接，独立地为O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、CH2、CHNH、CH2O、C(O)NHNHC(O)、OCH2C6H4NH、NHCH2C6H4NH、SCH2C6H4NH和C(O)NR1；当未与/>位点连接，为OH、NH2、NHNH2、NHR1、SH、C(O)OH、C(O)NH2、OC(O)NH2、OC(O)OH、NHC(O)NH2、NHC(O)SH、OC(O)NH(R1)、N(R1)C(O)NH(R2)、C(O)NHNHC(O)OH和C(O)NHR1；另外，当与S连接时Y2可以是O、O2、NR1、NH、或缺省；
X3和Y3独立地为N、NH、CH、CH2或CR1，或X3和Y3之一可以缺省；其中R1是C1-C8直链或支链烷基、杂烷基；C3-C8芳基、杂芳基、烷基环烷基、酰氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、烷基芳基氨基、烷基芳基巯基；(Ar)r、r＝1-6(氨基酸或具有相同或不同氨基酸序列的肽)；
X3是H、CH3或X1’R1’、其中X1’是NH、N(CH3)、NHNH、O、或S；且R1’是H、C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基、酰氧基胺；
Z3’是H，COOR1，NH2，NHR1，OR1，CONHR1，NHCOR1，OCOR1，OP(O)(OM1)(OM2)，OCH2OP(O)(OM1)(OM2)，OSO3M1，R1，或O-糖苷(葡萄糖苷、半乳糖苷、甘露糖苷、葡糖醛酸苷/葡糖苷酸、阿洛苷、果糖苷等)、NH-糖苷、S-糖苷或CH2-糖苷；M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4、NR1R2R3；
X5是F、Cl、Br、I、OH、OR1、R1、OPO3H2、OSO3H、NHR1、OCOR1、NHCOR1、CN或OCH2OP(O)(OM1)(OM2)；
Y5是NH、NHNH、NR1、O、OCH2C6H4NH、NHCH2C6H4NH、SCH2C6H4NH、R1、(Ar)r，r＝1-6(具有相同或不同氨基酸序列的氨基酸或肽)；
X6和Y6独立地为CH、C(O)、N、P(O)NH、P(O)NR1、CHC(O)NH、C1-C8直链或支链烷基、或杂烷基；C3-C8芳基、杂芳基、烷基环烷基、酰氧基、烷基芳基、烷基芳氧基、烷基芳基氨基或Aa(氨基酸)；
Z5和Z5’独立地选自O、NH、NHNH、NR5、S、C(O)O、C(O)NH、OC(O)NH、OC(O)O、NHC(O)O、NHC(O)NH、NHC(O)S、OC(O)N(R1)、N(R1)C(O)N(R2)、C(O)NHNHC(O)或C(O)NR1；
X8是O、S、NH、NHNH、NHR1、SR12、SSR12、SSCH(CH3)R1、SSC(CH3)2R1、或R1；
其中R1、R2和R3独立地是H、C1-C8直链或支链烷基、C3-C8芳基、杂芳基、杂烷基、烷基环烷基或酰氧基胺，除非它们在结构式中定义；
Lv1是同前文定义的离去基团；
M1和M2独立地为H、Na、K、Ca、Mg、NH4、或NR1R2R3。
14.根据权利要求1或5所述的药物/连接子复合物，其中超过75％的药物特异性结合到具有以下结构的抗体的重轻链之间的二硫键位点：
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或一种或多种元素同位素取代物，或药学上可接受的盐，水合物或水合盐；或这些化合物的多晶结构；或旋光异构体，外消旋体，非对映异构体或对映异构体；
其中m、m1、m2、n、P1、R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R12、R12’、R25、R26、R25’、X1、X2、X3、X5、X6、Y1、Y2、Y6、Z3、Z5、p、p1、p2、p3、q1、q2、Lv1、Aa、(Aa)r、Ar且mAb的定义如权利要求13所述。
15.根据权利要求12所述的肿瘤细胞，其中所述肿瘤细胞选自淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、肾细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞状癌细胞、小细胞肺癌细胞、非小细胞肺癌细胞、睾丸癌细胞、恶性细胞以及以不受调节的、加速生长和分裂以导致癌症的细胞。
16.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求6或13的偶联物及其药学上可接受的盐、载体、稀释剂或辅料，偶联物的组合，以治疗或预防癌症、自身免疫性疾病或感染性疾病。
17.一种药物组合物，其为液体制剂或配制的冻干固体/粉末，重量占比：0.01％-99％的权利要求6或13的一种或多种偶联物；0.0％-20.0％的一种或多种多元醇；0.0％-2.0％的一种或多种表面活性剂；0.0％-5.0％的一种或多种防腐剂；0.0％-30％的一种或多种氨基酸；0.0％-5.0％的一种或多种抗氧化剂；0.0％-0.3％的一种或多种金属螯合剂；0.0％-30.0％的一种或多种缓冲盐，用于将组合物的pH调节至pH 4.5-7.5；和0.0％-30.0％的一种或多种等渗剂，用于在被重构以施用给患者时将渗透压调节在约250-350mOsm之间；
其中多元醇选自组合包括果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖、松解糖、棉子糖、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、赤藓糖醇、赤藓糖醇山梨糖醇、甘油或L-葡萄糖酸盐及其金属盐；
表面活性剂可选自组合包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81、或聚山梨醇酯85、泊洛沙姆、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)、聚丙二醇-丙二醇、Triton、十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸钠、辛基糖苷钠、十二烷基、肉荳蔻酰基、亚油基或硬脂基磺基甜菜碱、十二烷基、肉荳蔻酰基、亚油基或硬脂基肌氨酸、亚油酸、肉荳蔻基或十六烷基甜菜碱、月桂酰氨基丙基、椰油酰胺丙基、亚油酰胺丙基、肉荳蔻酰基丙基、棕榈酰基丙基或异硬脂酰氨基丙基-甜菜碱(月桂酰胺丙基)、肉荳蔻酰胺丙基、棕榈酰丙基或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺、甲基椰油酰基钠或甲基油基牛磺酸二钠、十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲基氧化胺、椰油酰胺丙基甜菜碱和可可两性甘氨酸酯；或异硬脂基乙基亚胺鎓乙基硫酸盐；聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物；
其中防腐剂选自组合包括苄醇、十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲基氯化铵、苯扎氯铵和苄索氯铵、苯酚、丁醇和苯甲醇，对羟基苯甲酸烷基酯例(如甲酯或丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；
其中氨基酸选自组合包括精氨酸、胱氨酸、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；
其中抗氧化剂选自抗坏血酸、谷胱甘肽、胱氨酸或和蛋氨酸；
其中螯合剂是EDTA或EDTA；
其中缓冲盐选自组合包括柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的钠盐、钾盐、铵盐或三羟乙基氨基盐；氨基丁三醇盐酸盐、磷酸盐或硫酸盐；精氨酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸或组氨酸的乙酸盐、氯化物、磷酸盐、硫酸盐或琥珀酸盐；
其中等渗剂选自组合包括甘露醇、山梨糖醇、乙酸钠、氯化钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸三钠或氯化钠。
18.根据权利要求16或17所述的药物组合物以液体或冻干固体的形式保持在小瓶，瓶，预填充注射器，预填充自动注射器。
19.权利要求6、13的特异性偶联物，或权利要求16或17的药物组合物形式，具有体外、体内或离体细胞杀伤活性。
20.权利要求16或17的所述的药物组合物，同时施用化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、自身免疫性疾病剂、抗感染剂或另一种偶联物的协同剂协同治疗或预防癌症、自身免疫性疾病或传染病。
21.根据权利要求20所述的协同剂，其中所述的协同剂选自以下药物中的一种或多种：阿巴西普、阿贝西比利、醋酸阿比特龙、Abraxane、对乙酰氨基酚/氢可酮、Acalabrutinib、Aducanumab、Adalimumab、ADXS31-142、ADXS-HER2、阿法替尼双马来酸酯、Aldesleukinalectinib、Alemtuzumab、Alitretinoin、ado-trasmzumab emtansine、安非他命/右旋苯丙胺、阿那曲唑、阿立哌唑、蒽环类药物、阿立哌唑、阿扎那韦、阿妥唑单抗、阿托伐他汀、阿韦拉单抗、阿昔布西汀、Brentuximab vedotin、Brigatinib、Budesonide、Budesonide/福莫特罗、Bupre-norphine、Cabazitaxel、Cabozantinib、Capmatinib、Capecitabine、carfilzomib、嵌合抗原受体工程T(CAR-T)细胞、Celecoxib、Ceritinib、Cetuxib、Cetuxi-mab、克唑替尼、克比美替尼、科森蒂斯、克唑替尼、CTL019、达比加群、达布拉非尼、达卡巴嗪、达克珠单抗、达科替尼、达托霉素、达拉他珠单抗、达比波锡阿尔法、达鲁那韦、达沙替尼、地尼洛芬、地诺单抗、Depakote、地兰索拉唑、地塞哌甲酯、地塞米松、Dinutuximab、多西环素、度洛西汀、Duvelisib、Durvalumab、依洛珠单抗、/埃洛珠单抗/艾美洛韦、依诺肝素、恩沙替尼、恩扎鲁胺、依泊汀阿尔法、厄洛替尼、埃索美拉唑、依佐匹克隆、依那西普、依维莫司、依西美坦、依维莫司、艾塞那肽ER、依泽替米贝、依泽替米贝/辛伐他汀、非诺贝特、非格拉斯汀、芬戈利莫德、丙酸氟替卡松、氟替卡松/沙美特罗、Fulvestrant、Gazyva、吉非替尼、Glatiramer、醋酸高斯瑞林、伊克替尼、伊马替尼、伊布替尼、伊布替尼、依德利西布、异环磷酰胺、英夫利昔单抗、咪喹莫特、ImmuCyst、Immuno BCG、伊尼帕里、阿斯巴肽胰岛素、地塞米尔胰岛素、甘精胰岛素、利斯普洛胰岛素、α-干扰素、α-1b干扰素、α-2a干扰素、α-2b干扰素、β-干扰素、β-1a干扰素、β-1b干扰素、γ-1a干扰素、拉帕蒂尼、伊普利单抗、异丙托品溴铵/沙丁胺醇、异唑MIB、卡努马、醋酸兰诺肽、利奈多明、利奈酰胺、甲磺酸利奈替尼、来曲唑、左旋甲状腺素、左旋甲状腺素、利多卡因、利奈唑胺、利拉鲁肽、利地塞米松、LN-144氯雷替尼、美金刚、甲基哌啶酮、美托洛尔、Mekinist、美西他滨/利吡韦林/替诺福韦、莫达非尼、莫米松、Mycidac-C、尼西妥单抗、Neratinib、尼洛替尼、尼拉帕利布、尼古拉单抗、Ofatumumab、奥比妥珠单抗、奥拉帕尼、奥美沙坦、奥美沙坦/氢氯噻嗪、奥马珠单抗、Omega-3脂肪酸乙酯、Oncorine、Oselta-mivir、Osimertinib、羟考酮、Palbociclib、帕利珠单抗、帕尼单抗、Panobinostat、帕唑帕尼、Pembrolizumab、PD-1抗体、PD-L1抗体、培美曲塞、帕妥珠单抗、肺炎球菌结合疫苗、泊马利度胺、普瑞巴林、ProscaVax、普萘洛尔、喹硫平、雷贝拉唑、普鲁巴新223氯化镭、雷洛昔芬、雷洛昔韦、雷莫昔单抗、雷珠单抗、雷戈非尼、利妥昔单抗、利伐沙班、罗米地辛、瑞舒伐他汀、鲁索替尼磷酸盐、沙丁胺醇、Savolitinib、Semaglutide、Seve-lamer、西地那非、Siltuximab、Sipuleucel-T、西他列汀、西他列汀/二甲双胍、Solifenacin、Solanezumab、Sonidegib、索拉非尼、舒尼替尼、Tacrolimus、Tacrimus、塔帕西拉非、Tac-rimus tataparal、他唑帕尼、替莫唑胺、替西罗莫司、替诺福韦/恩曲他滨、替诺福韦二吡呋酯富马酸酯、睾丸激素凝胶、沙利度胺、TICE BCG、碘托溴铵、替沙吉林、托瑞米芬、曲美替尼、曲妥珠单抗、曲贝汀(Ecteinascidin 743)、曲美替尼、曲美单抗、三氟吡啶/替吡西酯、维甲酸、Uro-BCG、Ustekinumab、Valsartan、Veliparib、Vandetanib、Vemurafenib、Venetoclax、Vorinostat、Ziv-aflibercept、Zostavax及其类似物、衍生物、药学上可接受的盐、载体、稀释剂或辅料，或两种或多种化合物的组合。
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