JPH07506484A - カルチノーマ関連抗原（ｓｋ１），ｓｋ１に対するモノクローナル抗体，これら抗体を産生する方法及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２、ハイブリドーマがＡＴＣＣＨＢ　１０９０５である、請求項１のハイブリド ーマ。

３．３ＫＩに特異的に結合するモノクローナル抗体。

４、ヒトである、請求項３のモノクローナル抗体。

５、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ　１０９０５により産生されるモノクロ ーナル抗体の特異性を有する、請求項４のモノクローナル抗体。

６、モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１０９０５により 産生される、請求項４のモノクローナル抗体。

７、請求項３の抗体に対する抗イデイオタイプ抗体。

８．３ＫＩを含有すると考えられる供給源を、診断的に有効量の検出できるよう に標識された、ＳＫＩと特異的に結合する抗体又はその断片と接触させ、そして 該抗体が該供給源に結合するかどうかを測定することを含むＳＫＩを検出する方 法。

９、抗体がハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ　１０９０５により産生される、 請求項８の方法。

１０、検出がｉｎ　ｖｉｖｏである、請求項８の方法。

Ｉｌ、検出可能な標識が、放射性同位元素及び常磁性標識からなる群から選ばれ る、請求項１０の方法。

１２、検出がｉｎ　ＶｉｔｒＯである、請求項８の方法。

１３、検出可能な標識が、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド状金属、ケミ ルミネッセンス化合物、バイオルミネッセンス化合物及び酵素からなる群から選 ばれる、請求項１２の方法。

１４、治療的に有効量のモノクローナル抗体又はその断片を動物に投与すること を含む動物の悪性腫瘍疾患を改善する方法であって、前記抗体がＳＫＩに特異的 に結合する方法。

１５、悪性腫瘍疾患がカルチノーマである、請求項１４の方法。

１６、抗体がヒトである、請求項１４の方法。

１７、モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ　１０９０５ により産生されるモノクローナル抗体の特異性を有する、請求項１４の方法。

１８、モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ　１０９０５ により産生される、請求項１４の方法。

１９、投与が非経口である、請求項１４の方法。

２０、非経口投与が、皮下、筋肉内、腹腔内、洞内、経皮、又は静脈内注射によ るものである、請求項１８の方法。

２１、投与が約０．０１　ｍｇ／ｋ　ｇ　〜約２００　ｏｍｇ／ｋｇ／回の投与 量で行われる、請求項１４の方法。

２２、抗体がエフェクター細胞と組み合わせて投与される、請求項１４の方法。

２３、モノクローナル抗体が治療的に標識されている、請求項１４の方法。

２４、治療的標識が、放射性同位元素、薬品、免疫調節剤、生物学的応答修飾剤 、レクチン、及びトキシンからなる群から選ばれる、請求項１４の方法。

２５、抗体が実質的に同時期に治療剤と組み合わせて投与される、請求項１４． ２２及び２３のいずれかの方法。

２６、治療剤が、放射性同位元素、薬品、免疫調節剤、生物学的応答修飾剤、レ クチン、及びトキシンからなる群から選ばれる、請求項２５の方法。

２７、実質的に純粋な形での抗原ＳＫＩ及びその混合物及びその塩。

２８、還元条件下でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に より測定して、４２〜４６ｋＤの分子量を有する、請求項２７のＳＫＩ。

２９、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ　１０９０５により産生されるモノク ローナル抗体の特異性を有するモノクローナル抗体により特異的に結合されるエ ピトープを含む、請求項２７のＳＫＩ。

３０、免疫原として有効な量のＳＫＩで動物を免疫感作することを含む動物の悪 性腫瘍疾患を改善する方法。

３１、免疫原として有効な量の請求項７の抗イデイオタイプ抗体で動物を免疫感 作することを含む動物の悪性腫瘍疾患を改善する方法。

３２、治療的に有効量の請求項３〜７のいずれかのモノクローナル抗体を製剤上 の担体と共に含む医薬組成物。

３３、免疫原として有効な量のＳＫＩを製剤上の担体と共に含む医薬組成物。

明細書 カルチノーマ関連抗原（ＳＫＩ）　、ＳＫＩに対するモノクローナル抗体、これ ら抗体を産生ずる方法及びその使用本発明は、種々の悪性腫瘍に関連する新規な カルチノーマ関連抗原（ＳＫＩ）及びＳＫＩ上のエピトープに特異的なモノクロ ーナル抗体に関する。

２、背景技術の説明 マウスモノクローナル抗体は、　ｉｎ　ＶｉｔｒＯで標的細胞に対し有効な細胞 毒性を媒介することが示されている。しかしながら、１ｎｖｉｖｏでヒトに用い た場合、それらは目立った成果を収めない。

これは、部分的には、（ｉ）ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の発生を招来す る注入されたマウスタンパク質の異物性、及び（ｉｉ）マウス抗体によって十分 に活性化されていないといえるヒトエフェクター機能によるものである。対照的 に、精製したヒトモノクローナル又はポリクローナル抗体で敗血症患者を全身治 療した際に（チーグラー（Ｚｉｅｇｌａｒ）ら、　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ、　Ｊ。

Ｍｅｄ、、　３２４：４２９−４３６．１９９１　；クルツベルグ（Ｋｕｒｔｚ ｂｅｒｇ）ら、　Ａｍ。

Ｊ、　Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　０ｎｃｏ１．、９：２９９−３０ １．１９８７）及びメラノーマの病変内局性療法により認められる劇的な効果は 、ヒトモノクローナル抗体の臨床用途（イリー（Ｉｒｉｅ）ら、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３：８６９４−８６９８．１９８６）がうまくゆくこと を示唆している。かくして、癌治療にヒトＭａｂを使用できる可能性があり魅力 的である。

ＨｕＭＡｂ技術の分野における最近の進歩により、種々の特異性を有する多数の ハイブリドーマを生み出すのが可能になっている（グラッシイ　（Ｇｌａｓｓｙ ）、Ｉｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆＭｏｎｏ ｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｆｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｍａｒｃｅｌ　 Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、、　ＮＹ）。

癌抗原に対するヒト免疫応答を理解する際に得られた知識（リオイド（Ｌｉｏｙ ｄ）ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４９：３４４５−３４５１．１９８９） を組み合わせて、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する幾つかのＨｕＭＡｂが作られ 、その特徴が明らかにされている。ＨｕＭＡｂにより認識される報告された腫瘍 関連抗原には、細胞表面（ヨシカワら。

Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　（Ｇａｎｎ）、　８０：５４６−５ ５３．１９８９；ヤマグチら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４：２４１６−２ ４２０　；　ハスベル（Ｈａｓｐｅｌ）ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４５ ：３９５１−３９６１．１９８５　；　：）−ト（Ｃｏｔｅ）　ら、　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８３：２９５９−２９６３．　１９ ８６；グラッシイ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４７：５１８１−５１８８； ボラップークリステンセン（Ｂｏｒｕｐ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）ら、　Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔ、　Ｐｒｅｖｅｎｔ。

５ｕｐｐ１．、１：２０７−２１５）　、細胞質（ハスペルら、　Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅｓ、、　４５：３９５１−３９６１．　１９８５　；　）−トら、Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３二２９５９−２９６３．　１９ ８６　、グラッシイ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４７：５１８１−５１８８ ゜１９８７　、及びボラップークリステンセンら、　Ｃａ、ｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅ ｃｔ。

Ｐｒｅｖｅｎｔ、　５ｕｐｐ１．、　１：２０７−２１５．１９８７　；カンー ミッチェル（Ｋａｎ−Ｍｉ　ｔｃｈｅｌ　Ｉ）ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、 　４９：４５３６−４５４１．１９８９　；及びヨシカワら、　Ｊｐｎ、　Ｊ、 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　７７：ｌＩ２２−１１３３．１９８６）　、及び 核内抗原（マツフナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）ら、　Ｈｕｍ、　Ａｎｔｉｂｏｄ 、　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ。

１：１２５−１２９．１９９０）が含まれる。

目下、種々の悪性腫瘍の治療には、有効性が限定された方法が存在しているに過 ぎない。投与される薬品は、一般に、それらの使用に伴う激しい副作用を有して いる。従って、悪性腫瘍疾患に関連する抗原を同定及び精製して、この抗原上の エピトープに結合するモノクローナル抗体を作る大きな必要性が存在している。

更に、これら抗体は、ＳＫＩ抗原を発現する悪性腫瘍の診断及び治療に適する物 質である。

発明の要旨 悪性腫瘍を改善する１つの方法は、カルチノーマに関連する抗原を優先的に発現 する細胞を抑制することであろう。この抑制は、例えば、悪性腫瘍細胞内に優先 的に存在する抗原又はその誘導体を用いて有効に免疫感作することによって、又 は該抗原に対する抗体を供給することによる受身免疫感作をすることによって行 うことができよう。

悪性腫瘍疾患を改善する手段を提供するために、本発明は悪性腫瘍細胞により優 先的に発現される実質的に精製された抗原及び該抗原上のエピトープに結合する モノクローナル抗体を提供する。

所望により、これらモノクローナル抗体を治療的又は診断的用途のために標識し てもよい。

本発明の目的は、種々の悪性腫瘍細胞及び組織内で優先的に発現されるカルチノ ーマ関連抗原（ＳＫＩ）を、ＳＫＩに結合する検出できるように標識されたモノ クローナル抗体を用いて、検出する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、ＳＫＩ上に存在するエピトープと反応する検出できるよう に標識されたモノクローナル抗体を用いて、悪性腫瘍をｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉ ｎ　ｖｉｖｏ診断する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、ＳＫＩと反応する未標識又は治療的に標識されたモノクロ ーナル抗体を用いて、動物の悪性腫瘍疾患を改善する方法を提供することである 。

また、本発明は、動物をＳＫＩで免疫感作することにより悪性腫瘍に対する免疫 応答を誘発することによって、動物の悪性腫瘍疾患を改善する方法を提供するこ とである。

かくして、本発明は、ＳＫＩを含有すると考えられる供給源を、診断的に有効量 の検出できるように標識されたモノクローナル抗体又は本発明のモノクローナル 抗体の特異性を有するその断片と接触させ、そして該抗体が該供給源に結合する かどうかを測定することを含むＳＫＩを検出する方法に関する。

本発明は、更に、治療的に有効量の（１）モノクローナル抗体であって本発明の モノクローナル抗体の特異性を有する抗体又はその断片、又は（２）ＳＫＩを動 物に投与することを含む、動物の悪性腫瘍疾患を抑制する方法に関する。

ＳＫＩ及びＳＫＩのエピトープに結合するモノクローナル抗体の治療的及び診断 的用途における主要な利点は、ＳＫＩ抗原が高い頻度で悪性腫瘍細胞内に発生す ることである。従って、正常細胞よりも悪性腫瘍細胞に結合が起こる非常に大き な可能性がある。

この事実の結果として、臨床的に有効であるが正常な宿主細胞には最小限にしか 影響しないか又は全く危険のない濃度で本発明のモノクローナル抗体を用いるこ とが可能である。

発明の詳細な説明 本発明は、悪性腫瘍細胞によって優先的に発現される実質的に精製された抗原（ ＳＫＩ）及びＳＫＩに対するエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体に関 する。これらモノクローナル抗体は、これら悪性腫瘍に関連する抗原のｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ及び１ｎｖｉｖｏ免疫学的検出及びＳＫＩを有する細胞の免疫治療のい ずれにも非常に有用である。

本発明の好ましい態様においては、ＳＫＩ上のエピトープに結合するモノクロー ナル抗体が開示される。この特異性により、モノクローナル抗体、及び類似の特 異性を有する類似のモノクローナル抗体は、ＳＫＩを有する悪性腫瘍細胞の生育 を抑制することができる。結果として、これらモノクローナル抗体は、結腸直腸 力ルチノーマ、胃癌、膵臓癌及びアデノカルチノーマの如き悪性腫瘍疾患を改善 するのに有用である。

ＳＫＩに対するモノクローナル抗体を産生及び特徴付ける方法モノクローナル抗 体を分泌するハイブリドーマの産生に用いる一般的な方法は周知である（コーラ −（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、　Ｎａｔｕｒｅ、 　２５６：４９５．１９７５）　ｏ簡単に説明すると、結腸癌の患者からのリン パ節を結腸切除片から採取して、リンパ球を単離した。次いで、そのリンパ球を 癌胎児抗原でｉｎ　ＶｉｔｒＯで免疫感作した。結腸癌細胞系に結合する抗体の 産生についてハイブリドーマをスクリーニングした。

１つの側面においては、本発明はモノクローナル抗体、及びＳＫｌと反応性のそ れらを産生ずるハイブリドーマに向けられている。本発明はモノクローナル抗体 の反応性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの単離は、興味 の対象であるモノクローナル抗体の基本反応パターンを測定する定型的なスクリ ーニング技術を用いて行うことができる。かくして、試験されるモノクローナル 抗体がＳＫＩと結合するのであれば、試験される抗体と本発明のハイブリドーマ により産生される抗体とは等価である。

また、本発明は新規なＳＫＩ抗原の実質的な精製を教示するので、免疫感作のた めにこの抗原を用いて、ＳＫＩ抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を分泌 するより多くのハイブリドーマをつくることが可能である。このアプローチは、 免疫感作で生ずる抗原決定基の数を制限することにより生成するモノクローナル 抗体のレパートリ−を減少するという追加の利点を有するであろう。そうして産 生じたモノクローナル抗体を、標準的技術、例えば、マイクロタイタープレート にＳＫＩを結合させてＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定法によりモノクローナル抗体の結合を 測定する技術を用いてＳＫＩに対する特異性をスクリーニングすることができる だろう。

ＳＫＩに適用する場合、“実質的に純粋な型”という用語は、ＳＫｌが、全く普 通に結合している他のタンパク質を本質的に含まないことを意味している。

本発明のモノクローナル抗体が１．）ＳＫＩ抗原、又は２）本発明のモノクロー ナル抗体が正常に反応するＳＫＩ抗原を発現する悪性腫瘍細胞に結合するのを、 試験されるモノクローナル抗体が妨害するか否かを測定することにより、それが 本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性を有するか否かを決定して、過度な実 験をしないで、モノクローナル抗体を評価することも可能である。

本発明のモノクローナル抗体による結合が減少するというように、試験されるモ ノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合するのであれば、該２つ のモノクローナル抗体は同じか又は密接に関連するエピトープに結合していると いえる。

あるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するか否か を決定するなお他の方法は、本発明のモノクローナル抗体をそれが正常に反応す るＳＫＩ抗原と共に予備インキュベートすると、試験されるモノクローナル抗体 の該抗原に結合する能力が阻害されるか否かを測定する方法である。もしも試験 されるモノクローナル抗体が阻害されるのであれば、多分、それは本発明のモノ クローナル抗体と同じか又は密接に関連するエピトープ特異性を有している。

異なる宿主受容稚内での異種ドナ一種からのモノクローナル抗体のｉｎ　ｖｉｖ ｏ使用は通常複雑ではないが、浮上するかも知れない潜在的な問題は、ドナー抗 体上に存在する抗原決定基への宿主による副免疫応答の出現である。ある場合に は、この副応答は、該宿主内でのドナー抗体のｉｎ　ｖｉｖｏ使用ができなくな るほど激しいものであるといえる。更に、この副官主反応は、該ドナー抗体の悪 性腫瘍抑制力を遮るように働くかも知れない。宿主内で起こる副免疫応答の可能 性を回避することが可能な１つの方法は、キメラ抗体を用いることによる方法で ある（サン（Ｓｕｎ）ら。

Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、　５　（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１）：Ｓ１７．　１９８ ６　；オイ　（Ｏｌ）ら、　Ｂｉ。

Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　４（３）：２１４．１９８６）　＋ｌキメラ抗体は、 該抗体の重鎮及び軽鎖の種々のドメインが１を越える種からのＤＮＡによりコー ドされる抗体である。典型的には、キメラ抗体は、目的の抗原特異性を有する抗 体を産生ずるドナ一種由来の重鎮（Ｖ８）及び軽鎖（Ｖｔ、）の可変ドメイン、 及び宿主受容種由来の重鎮（ＣＳ）及び軽鎖（ＣＬ）の不変ドメインを含むであ ろう。ドナー抗体ドメイン、特にＣＨ領域内のドメインの抗原決定基への宿主免 疫系の露出度を低くすることによって、受容稚内で起こる副免疫応答の可能性を 低減できるであろう。かくして、例えば、ヒトにおける　ｉｎ　ｖｉｖｏ臨床用 途のために、ＡＴＣＣＨＢ１０９０５の如き本発明のハイブリドーマから単離さ れたＤＮＡによりコードされるマウス■。及び■、ドメイン、及びヒト白血球か ら単離されたＤＮＡでコードされるＣ８及びＣＬドメインを含むキメラ抗体を産 生させることは可能である。

本発明は、この新規なカルチノーマ抗原ＳＫＩを認識する全てのモノクローナル 抗体を包含するが、特に好ましいのは、ヒト起源のモノクローナル抗体である。

かかるヒトモノクローナル抗体として、受託番号ＡＴＣＣＨＢ１０９０５を有す るハイブリドーマにより産生されるＩｇＭ抗体であるＨｕＭＡｂ　（ＳＫＩ）を 例に挙げることができる。

一定の状況下では、それらの診断又は治療効力の点から１アイソタイプのモノク ローナル抗体が他のものよりも好ましいといえる。例えば、抗体媒介細胞溶解に 関する研究から、アイソタイプγ−２ａ及びγ−３の未修飾マウスモノクローナ ル抗体は、一般に、γ−１アイソタイプの抗体よりも標的細胞の溶解においてよ り効果的であることが知られている。この効力の差は、標的細胞の細胞溶解的破 壊により活発に関与するγ−２ａ及びγ−３アイソタイプの能力によるものと考 えられる。モノクローナル抗体の個々のアイソタイプは、初期融合体から選択す ることによって直接に調製することも、クラススイッチ変異体を単離する同胞選 択法を用いることにより異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親 ハイブリドーマから二次的に調製することもできる（ステップレブスキイ　（Ｓ ｔｅｐｌｅｗｓｋｉ）ら、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏ ｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８２：８ ６５３．１９８５　；スピラ（Ｓｐｉｒａ）ら、　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　７４：３０７．１９８４）。

かくして、本発明のモノクローナル抗体は、ＳＫＩ上のエピトープに特異性を有 するクラススイッチ変異体を含むことになる。

本発明のモノクローナル抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を分泌する他 のハイブリドーマの単離も、当業者は、抗イデイオタイプ抗体を産生させること により行うことができる（バーリン（ｌ（ｅｒｌｙｎ）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、 　２３２：１００．１９８６）　、抗イデイオタイプ抗体は、興味の対象である ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体上に存在する特有の決定基 を認識する抗体である。これら決定基は、該抗体の超可庇部に局在している。こ の領域こそが所与のエピトープに結合する領域であり、かくして、該抗体の特異 性の原因となっている。抗イデイオタイプ抗体は、興味の対象であるモノクロー ナル抗体で動物を免疫感作することによって調製することができる。免疫感作さ れた動物は、これらイディオタイプ決定基に対する抗体を産生ずることにより免 疫感作抗体のイディオタイプ決定基を認識してそれに応答する。第２動物を免疫 感作するのに用いた単一ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に 特異的な第２動物の抗イデイオタイプ抗体を用いることによって、免疫感作に用 いたハイブリドーマの抗体と同じイディオタイプを有する他のクローンを同定す ることが今や可能である。

２つのハイブリドーマのモノクローナル抗体間のイディオタイプの同一性が、そ の２つのモノクローナル抗体が、同じエピトープ決定基の認識に関して同じであ ることを証明している。かくして、モノクローナル抗体上のエピトープ決定基に 対する抗体を用いることにより、同じエピトープ特異性のモノクローナル抗体を 発現する他のハイブリドーマを同定することが可能である。

抗イデイオタイプ法を用いて、エピトープを偽装するモノクローナル抗体をつく ることも可能である。例えば、第１モノクローナル抗体に対して作った抗イデイ オタイプモノクローナル抗体は、第１モノクローナル抗体により結合されるエピ トープの“影像”である結合ドメインを超可変部内に有するであろう。かくして 、この場合、抗イデイオタイプモノクローナル抗体結合ドメインが抗原として有 効に機能するので、抗イデイオタイプモノクローナル抗体を免疫感作に用いるこ とができるであろう。

本発明のモノクローナル抗体を、例えば、Ｆａｂ及びＦ　（ａｂ′）２の如き断 片の形で用いる場合、特にこれら断片を治療的に標識する場合、これら状況にお ける悪性腫瘍の改善は、ＳＫＩ抗原を有するそれら細胞の補体媒介細胞溶解性破 壊に依存しないので、あらゆるアイソタイプを用いることができる。

本発明のモノクローナル抗体は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ若しくは１ｎｖｉｖｏ免疫診 断又は免疫治療を施すのが望ましいあらゆる動物に用いることができる。ここで 用いる“動物”という用語は、ヒト並びにヒトではない動物のいずれも含むこと を意味している。

本発明で用いる“抗体”という用語は、無傷分子だけでなく、例えば、Ｆａｂ及 びＦ（ａｂ’）＊の如きエピトープ決定基に結合することのできるそれらの断片 をも含むことを意味している。

診断的使用 本発明のモノクローナル抗体は、例えば、それらを液相で又は固相支持体に結合 させて用いる免疫検定法で用いるのに適している。加えて、これら免疫検定法に おけるモノクローナル抗体を種々の方法で検出できるように標識してもよい。本 発明のモノクローナル抗体を利用できる免疫検定法のタイプの例は、直接又は間 接のいずれかのフォーマットでの競合及び非競合免疫検定法である。かかる免疫 検定法の例は、放射性免疫検定法（ＲＩ　Ａ）及びサンドイッチ（免疫測定法） 検定法である。本発明のモノクローナル抗体を用いる抗原の検出は、生理的サン プルでの免疫組織化学的検定法を含む、順行、逆行又は同時モードのいずれがで 行われる免疫検定法を用いて行うことができる。当業者は、他の免疫検定フォー マットをそれほど実験を行わなくても認知するであろうし、容易に見分けられる であろう。

本発明のモノクローナル抗体は、多くの異なる支持体に結合させてＳＫＩの存在 を検出するのに用いることができる。周知の支持体の例には、ガラス、ポリスチ レン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、 天然の又は変性したセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄鉱が 含まれる。支持体の性質は、本発明の用途により可溶性であっても不溶性であっ てもよい。当業者は、モノクローナル抗体を結合するのに適する他の支持体を定 型的な実験を用いて認知するであろうし、又突き止めることができるであろう。

当業者が知っている多くの異なった標識及び標識法がある。本発明で用いること ができる標識のタイプの例には、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド 状金属、ケミルミネッセンス化合物、及びバイオルミネッセンス化合物が含まれ る。当業者は、モノクローナル抗体に結合するのに適する他の標識を定型的な実 験を用いて認知するであろうし、又突き止めることができるであろう。更に、本 発明のモノクローナル抗体へのこれら標識の結合は、当業者にとって常識である 標準法を用いて行うことができる。

本発明の用途により、ＳＫＩが体液及び組織中に存在しているときに、本発明の モノクローナル抗体によりそれを検出することができる。検出可能な量のＳＫＩ を含有するあらゆるサンプルを用いることができる。サンプルは、尿、唾液、髄 液、血液、血清等の如き液体、又は組織、便等の如き固体又は半固体であっても よく、また、組織論て普通に用いるものの如き固体組織であってもよい。

より大きな感度をもたらすことのできる他の技術は、低分子員ハプテンに抗体を カップリングさせることからなる。次いで、これらハブテンを第２反応によって 特異的に検出できる。例えば、アビジンと反応するビオチン、ジニトロフェニル 、ピリドキサール、及び特殊な抗ハブテン抗体と反応できるフルオレセインの如 きハブテンを用いるのが普通である。

本発明で用いる場合、“エピトープ”という用語は、本発明のモノクローナル抗 体と特異的相互作用をすることができるあらゆる決定基を含むものを意味してい る。エピトープ性決定基は、通常、アミノ酸又は糖側鎖の如き分子の化学的に活 性な表面配置からなり、通常、特有の３次元構造特性並びに特有の電荷特性を有 する。

本発明のモノクローナル抗体を抗原のｉｎ　ｖｉｖｏ検出に用いるには、検出で きるように標識されたモノクローナル抗体を診断的に有効な量で投与する。′診 断的に有効な”という用語は、検出できるように標識されたモノクローナル抗体 を、該モノクローナル抗体が特異的であるＳＫＩ抗原を有する部位の検出が可能 となるのに十分な量で投与することを意味している。

検出できるように標識されたモノクローナル抗体を投与する濃度は、ＳＫＩを有 する細胞への結合がバックグランドに比較して検出可能となる程度に十分である べきである。更に、最良の標的対バックグランドシグナル比が得られるように、 検出できるように標識されたモノクローナル抗体が循環系から速やかに除かれる のが望ましい。

一般に、ｉｎ　ｖｉｖｏ診断についての検出できるように標識されたモノクロー ナル抗体の投与量は、個体の年齢、性別、及び疾患の程度の如き要因に依存して 変動するであろう。モノクローナル抗体の投与量は、約ｏ、０１ｍｇ／ｍ２〜約 ５００ｍｇ／ｍ”　、好ましくはＯ，１ｍｇ／ｍ’　〜約２００　ｍｇ／ｍ”　 、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｍ”〜約１０ｍｇ／ｍ”で変動してもよい。か かる投与量は、例えば、注射を複数回するがどうか、腫瘍の大きさ、及び当業者 に既知の他の要因に依存して変動し得る。

ｉｎ　ｖｉｖｏ診断イメージングについては、利用できる検出装置のタイプが所 与の放射性同位元素を選択する際の主要な要因となる。

選んだ放射性同位元素は、所与のタイプの装置で検出可能なタイプの崩壊をする ものでなければならない。ｔｎ　ｖｉｖｏ診断のために放射性同位元素を選択す る際のなお重要な要因は、放射性同位元素の半減期が、標的による取り込みが最 大である時点でそれがなお検出可能であるように十分に長いが、宿主に関して有 害な放射線が最小限になるように十分に短いことである。理想的には、１ｎｖｉ ｖｏイメージングに用いる放射性同位元素は、粒子放射（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｅ ｍｉｓｓｉｏｎ）を欠くが、慣用のガンマカメラにより容易に検出できる１４０ 〜２５０ｋｅＶの多数の光子を生み出すであろう。

ｉｎ　ｖｉｖｏ診断については、放射性同位元素を、中間官能基を用いることに より直接又は間接のいずれかでイムノグロブリンに結合させることができる。金 属イオンとして存在する放射性同位元素をイムノグロブリンに結合させるのにし ばしば用いられる中間官能基は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ） 及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び類似の分子の如き二価のキレート 剤である。本発明のモノクローナル抗体に結合できる金属イオンの典型的な例は 、Ｉｌｌ　Ｉ　ｎ、”Ｒｕｓ　”Ｇａ、＠＠にａ、７２ＡＳ％　”Ｚｒｓ　”Ｙ 、及び２°’Ｔｌである。

本発明のモノクローナル抗体は、ｉｎ　ｖｉｖｏ診断のために、磁気共鳴イメー ジング（ＭＲＩ）又は電子スピン共鳴（Ｅ　Ｓ　Ｒ）におけるように常磁性同位 元素で標識することもできる。一般に、診断イメージングを可視化するあらゆる 慣用法を用いることができる。通常は、ガンマ及び陽電子放出性放射性同位元素 がカメライメージングに用いられ、常磁性同位元素がＭＲＩに用いられる。

かかる技術に特に有用な元素には、＋５ｉＧｄ、ｓ″Ｍｎ、目！Ｄｙ、”Ｃｒ、 　”Ｆ　ｅ＃”ｌマｔｔ、ル。

本発明のモノクローナル抗体は、動物にお（プる悪性腫瘍の改善の経過をモニタ ーするのに用いることができる。かくして、ＳＫｌを発現する細胞の数の増加若 しくは減少又は種々の体液中に存在するＳＫＩの濃度の変化を測定することによ って、悪性腫瘍の改善に狙いを定めた特定の治療法が有効であるか否かを決定す ることが可能となろう。

治療的用途 “改善する”という用語は、治療を受けている動物の悪性腫瘍の好ましくない影 響を少なくすることを意味している。“治療的に有効な７という用語は、用いた モノクローナル抗体又はＳＫＩの量が悪性腫瘍を改善するのに十分な量であるこ とを意味している。

本発明で用いる“免疫原として有効な量”という用語は、例えば、ＳＫＩエピト ープに結合する抗体の産生を刺激することにより悪性腫瘍に対する改善的免疫応 答を誘発するのに必要なＳＫＩ抗原の量を意味している。

ＳＫＩは、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収により非経口で、及び経口で 投与することができる。非経口投与のための製剤には、無菌の水性又は非水性溶 液剤、懸濁剤、及びエマルジョン剤が含まれる。非水性溶剤の例は、プロピレン グリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油の如き植物油、及びオレイン 酸エチルの如き注射可能な有機エステルである。皮膚浸透性を高めるために及び 抗原吸収を増進するために、閉鎖性包帯剤用支持体を用いてもよい。経口投与用 の液体投与形態は、一般に、該液体投与形態を含有するリポソーム溶液を含む。

リポソームを懸濁するのに適する形態には、精製水の如き当該技術分野で普通に 用いられる不活性希釈剤を含有するエマルジョン剤、懸濁剤、溶液剤、シロップ 剤、及びエリキシル剤が含まれる。不活性希釈剤に加えて、かかる組成物は、ア ジュバント、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、及び甘味料、矯味料及び香料を含ん でもよい。

ＳＫＩを含有する該抗原製剤は、アジュバントを含むこともできる。アジュバン トは、特有の免疫応答を非特異的に増大させるのに用いることができる物質であ る。普通は、アジュバントと抗原を、免疫系に送り込む前に混合するか、又は別 々にではあるが免疫感作される動物の同じ部位に送り込む。アジュバントは、そ れらの組成に基づいて幾つかのグループに大まかに分けることができる。これら グループには、オイルアジュバント（例えば、フロイント完全及び不完全）、無 機塩（例えば、Ａ　Ｉ　Ｋ　（Ｓｏ、）、、Ａ　Ｉ　Ｎａ　（ＳＯ４）２、Ａ　 Ｉ　ＮＨｌ（Ｓｏ、）２、シリカ、ミョウバン、ＡＩ　（ＯＩ（）、、Ｃａｗ（ Ｐｏｔ）２、カオリン、及び炭素）、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣ及び ポリＡＵ酸）、及び一定の天然物質（例えば、結核菌からのワックスＤ、並びに コリネバクテリウム・バルブム、百日咳菌、及びプルセラ属のメンバーに見いだ される物質）が含まれる。

動物を免疫感作するために用いるＳＫＩ抗原の物理形態は、塊状形態であっても 非塊状形態であってもよい。塊状Ｓ　Ｋ　１（ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ　５ＫＩ） は、例えば、グルタルアルデヒド又は他の架橋剤での処理の如き普通の技術によ って、非塊状ＳＫＩから作ることができる。次いで、こうして誘導した塊状ＳＫ Ｉを、活発な免疫反応を誘発するのに有効な悪性腫瘍改善組成物を作るために用 いることができる。

しかしながら、動物が塊状又は非塊状ＳＫＩのいずれで免疫感作されたかに拘ら ず、ＳＫＩのこれら両方の形態は、ＳＫＩに対する抗体の産生を引き起こす筈で ある。かくして、これら抗ＳＫ１抗体を、例えば、検体中のＳＫＩの存在を検出 するためのキットとして診断に用いることが可能である。

本発明のＳＫＩ抗原製剤は、ＳＫＩのエピトープ決定基に結合する抗体の産生を 誘発するのに用いることができる。ＳＫＩに対する抗体の産生を増進するのに特 に有用な方法は、まず、本発明のＳＫＩ抗原製剤で免疫感作し、その後に免疫感 作する方法である。

複数回免疫感作法を用いる場合、免疫感作のタイミングによって多くの異なる技 術が存在する。免疫感作された動物により発現されるイムノグロブリンレパート リ−の発現のレベル及び種類を増やすために、１回を越えて本発明の抗原製剤を 用いることが可能である。典型的には、複数回免疫感作を行う場合、それらは１ 〜２か月の間隔をあけることになろう。

一般に、動物に投与されるＳＫＩの投与量は、年齢、状態、性別及び疾患の程度 、もしあれば、当業者によって調節され得る他の変動要因の如き要因に依存して 変動するであろう。

本発明の抗原ＳＫＩ製剤は、−回投与又は複数回投与のいずれとしても投与する ことができ、−回当たりのＳＫＩ抗原が約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ、より好まし くは一回当たり約５０ｍｇ〜約３００ｍｇ５Ｋ１抗原、最も好ましくは一回当た り約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ５Ｋ１抗原で変動してもよい。

本発明のモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体と反応性のエピト ープを有するＳＫＩ抗原を発現する腫瘍を有する動物に免疫療法を行うのに、単 独で用いてもエフェクター細胞と組み合わせて用いてもよい（トイラード（Ｄｏ ｕｉｌｌａｒｄ）ら。

Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、　５　（Ｓｕｐｐ、　ｌ：５１３９．１９８６）。

免疫療法に用いる場合、本発明のモノクローナル抗体は、治療剤で標識されなく ても標識されてもよい。これら治療剤は、本発明のモノクローナル抗体に直接に カップリングしても間接にカップリングしてもよい。間接カップリングの１例は 、スペーサ一部分の使用によるものである。そして、これらスペーサ一部分は、 不溶性であっても可溶性であってもよく（ディーナ−（Ｄｉｅｎｅｒ）ら、　５ ｃｉｅｎｃｅ、　２３１：１４８．１９８６）　、標的部位でモノクローナル抗 体分子から薬品を放出できるように選択することができる。免疫療法用に本発明 のモノクローナル抗体とカップリングできる治療剤の例は、薬品、放射性同位元 素、レクチン、及びトキシンである。

本発明のモノクローナル抗体と結合させてもよい薬品には、非タンパク質系並び にタンパク質系薬品が含まれる。“非タンパク質系薬品”という用語は、古典的 に薬品と言われる化合物、例えば、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、及びビ ンブラスチンを包含する。

本発明のモノクローナル抗体をそれで標識してもよいタンパク質系薬品には、免 疫調節剤及び他の生物学的応答修飾剤が含まれる。“生物学的応答修飾剤”とい う用語は、本発明のモノクローナル抗体がそれに対して特異性である抗原保有腫 瘍の破壊を増進するようなやり方で免疫応答を修飾するのに関与する物質を包含 することを意味する。免疫応答修飾剤の例には、リンフ才力インの如き化合物が 含まれる。リンフ才力インには、腫瘍壊死因子、インターロイキン−１，２及び ３、リンフォトキシン、マクロファージ活性化因子、遁走阻止因子、コロニー刺 激因子、及びインターフェロンが含まれる。本発明のモノクローナル抗体をそれ で標識できるインターフェロンには、α−インターフェロン、β−インターフェ ロン、及びγ−インターフェロン及びそれらの亜型が含まれる。

免疫療法用に放射性同位元素と結合した本発明のモノクローナル抗体を使用する には、白血球分布並びにアイソトープ安定性及び放射（ｅｍｊｓｓｊｏｎ）の如 き要因に依り、一定のアイソトープが他のものより好ましい。所望により、上記 のｉｎ　ｖｉｖｏ診断法により腫瘍細胞分布を評価することができる。悪性度に 依っては、幾つかの放射体（ｅｍｉ　ｔｔｅｒ）が他のものよりも好ましいとい える。一般に、α及びβ粒子放出性放射性同位元素が免疫療法に好ましい。

例えば、ある動物がカルチノーマにおけるように中実の腫瘍病巣を有している場 合、組織を数ミリメーター透過できるｓｏｙの如き高エネルギーβ放射体が好ま しいといえる。一方、悪性腫瘍が白血病の場合のように単純な標的細胞からなる 場合は、””Ｂ　ｉの如き短いレンジの高エネルギーα放射体が好ましいといえ る。治療目的に本発明のモノクローナル抗体に結合させてもよい放射性同位元素 の例は、１２′Ｉ、１′■、”Ｙｓ　”Ｃｕ、！＋！Ｂｉ、ｔ”Ａｔｓ　””Ｐ ｂｓ　”Ｓ０％　””Ｐｄｓ及び”’Ｒｅである。

レクチンは、通常は植物原料から単離される、特定の糖部分に結合するタンパク 質である。多くのレクチンが、細胞の凝集及びリンパ球の刺激をすることができ る。しかしながら、免疫療法で用いられてきたリシンは毒性のあるレクチンであ る。これは、好ましくは、毒性の原因であるリジンのαペプチド鎖を、毒性作用 の部位特異的送達を可能にする抗体分子に結合することによって行われる。

トキシンは、植物、動物、又は微生物により作られる、十分な量でしばしば死を 招く有毒な物質である。ジフテリアトキシンは、コリネバクテリウム・ジフテリ アにより産生される、治療に用いることのできる物質である。このトキシンは、 適当な条件で分離できるα及びβサブユニットからなる。この有毒Ａ成分は抗体 に結合できるので、本発明のモノクローナル抗体が特異的であるＳＫｌ保有細胞 への部位特異的送達に用いることができる。本発明のモノクローナル抗体にカッ プリングすることのできる他の治療剤は既知であるか、又は当業者が容易に確認 することができる。

本発明の標識又は未標識モノクローナル抗体は、上記の如き治療剤と組み合わせ て用いることもできる。特に好ましいのは、本発明のモノクローナル抗体及び免 疫調節剤及び他の生物学的応答修飾剤を含む治療的組み合わせである。

かくして、例えば、本発明のモノクローナル抗体をα−インターフェロンと組み 合わせて用いることができる。この治療法は、カルチノーマ細胞によるモノクロ ーナル抗体反応性抗原の発現を増加することによって、モノクローナル抗体のカ ルチノーマ指向性を高める（ブレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）ら、　５ｃｉｅｎｃ ｅ、　２３５：８９５゜１９８７）。また、本発明のモノクローナル抗体を、例 えば、γ−インターフェロンと組み合わせて用い、それによって、エフェクター 細胞によりＦｃレセプターの発現を活性化及び増加させることができ、そうすれ ば、該エフェクター細胞へのモノクローナル抗体の結合を高めて標的腫瘍細胞を 殺すことができよう。当業者は、本発明のモノクローナル抗体の効力を高める望 ましいエフェクター機能を生み出すために、種々の生物学的応答修飾剤から選択 できるであろう。

本発明のモノクローナル抗体をここに記載した如き種々の治療剤と組み合わせて 用いる場合、モノクローナル抗体と治療剤の投与は、通常、実質的に同時期に行 う。“実質的に同時期に”という用語は、時期に関してそれほど厳格ではない近 い時期にモノクローナル抗体と治療剤を一緒に投与することを意味している。通 常、モノクローナル抗体より先に治療剤を投与するのが好ましい。

例えば、モノクローナル抗体より１〜６日間先に治療剤を投与してもよい。治療 剤の投与は、例えば、腫瘍の性質、患者の状態及び治療剤の半減期の如き要因に 依り、毎日又は何日かの間隔をおいて行ってもよい。

本発明のモノクローナル抗体を用いれば、ここに記載した全ての特徴を組み合わ せて治療法をデザインすることが可能である。

例えば、所与の状況において、単−若しくは複数の治療剤を、本発明のモノクロ ーナル抗体をエフェクター細胞及び同じ若しくは異なる単独若しくは複数の治療 剤と組み合わせて投与する前に投与するのが望ましいといえる。例えば、まず、 γ−インターフェロンとインターロイキン−２を毎日３〜５日間投与し、５８目 に本発明のモノクローナル抗体をエフェクター細胞並びにγ−インターフェロン 及びインターロイキン−２と組み合わせて投与することにより、悪性腫瘍疾患の 患者を治療するのが望ましいといえる。

ＳＫＩを発現する腫瘍域にリポソームを特異的に送達するために、その膜の中に 本発明のモノクローナル抗体を有するリポソームを用いることも可能である。こ れらリポソームを、それらがモノクローナル抗体に加えて上記の如き免疫療法剤 を含有し、次いで腫瘍部位でそれを放出できるように製造することができる（ウ ォルフ　（Ｗｏｌｆｆ）ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ ｉｃａｌ　Ａｃｔａ、　８０２：２５９、１９８４）。

本発明のモノクローナル抗体を投与する投与量の範囲は、悪性腫瘍疾患の症状が 改善される望ましい効果をもたらすに十分な量の範囲である。該投与量は、望ま しくない交叉反応、アナフィラキシ−反応等の如き副作用を起こすほど多量であ ってはならない。

一般に、投与量は、患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度で変動するであろう が、当業者が決めることができる。投与量は、何らかの合併症がある場合には個 々の医師が調節することができる。

投与量は、１日又は数日間、１回又は２回以上の投与で一日当たり、約０．１ｍ ｇ／ｋｇ〜約２０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０゜１ｍｇ／ｋｇ〜約ｓｏｏｍ ｇ／ｋｇで変動してもよい。一般に、治療剤と結合させた本発明のモノクローナ ル抗体を投与する場合、ｉｎ　ｖｉｖｏ免疫診断イメージングに用いる投与量に 比べてより少ない投与量を用いることができる。

本発明のモノクローナル抗体は、注射により又は時間をかけた漸進的潅流により 非経口的に投与することができる。本発明のモノクローナル抗体は、静脈内、腹 腔内、筋肉内、皮下、洞内、又は経皮で、単独で又はエフェクター細胞と組み合 わせて投与してもよい。

非経口投与用の製剤には、無菌の水性又は非水性溶液剤、懸濁剤、及びエマルジ ョン剤が含まれる。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレング リコール、オリーブ油の如き植物油、及びオレイン酸エチルの如き注射可能な有 機エステルである。水性担体には、食塩水及び緩衝媒質を含む、水、アルコール 性／水性溶液、エマルジョン又は懸濁液が含まれる。非経口用賦形剤には、塩化 ナトリウム溶液、リンガ−デキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、 乳酸角リンガー液、又は固定油（ｆｉｘｅｄ　ｏｉｌ）が含まれる。静脈内用賦 形剤には、流動又は栄養補液、（リンガ−デキストロースを主成分とするものの 如き）電解質補液等が含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び 不活性ガス等の如き保存剤及び他の添加剤が存在してもよい。

本発明は、ＳＫＩ抗原又は本発明のモノクローナル抗体を含む医薬品又は医薬組 成物を調製する方法にも関し、該医薬品は悪性腫瘍障害の治療に用いられる。

以上の開示は本発明を概略的に説明するものである。より完全な理解は、以下の 具体的な実施例を参照することによって得ることができる。これら実施例は、説 明のためにだけ示したものであって、本発明の範囲を限定することを意図したも のではない。

実施例ｌ ５ＫＩに対するモノクローナル抗体を 産生ずるハイブリドーマ細胞系の調製 結腸癌の３患者の７リンパ節の半分を新鮮な結腸切除検体から採取した。残りの 半分を組織病理研究のために付託した。使用するまでそのリンパ球を一７０℃で 凍結保存した。凍結保存前及び保存後の生育能力はそれぞれ約９９％及び９０％ であった。

癌患者からのリンパ球を、２５％（Ｖ／Ｖ）アメリカヤマゴボウマイトジェン刺 激１９２８球の上澄み液（ｓＰＷＭ−Ｔ）又は２５％（Ｖ／Ｖ）混合リンパ球培 養液の上澄み液（ｓＭＬＣ）のいずれかを含む完全培地中で培養しまた。癌胎児 抗原（ＣＥＡ）をｉｎ　ｖｉｔｒｏ免疫感作（ＩＶＩ）に用いた。精製ＣＥＡを 種々の濃度で該刺激したリンパ球に５〜６日の期間添加した。培養終了時、ヒト 細胞系５ＨＦＰ−１との融合前に、リンパ球の生育能力を０゜０５％トリパンブ ルー排除試験によって測定した。平均生育能力は、約７０％であった。

簡単に説明すると、まず、フィコール−ハイバック比重差遠心（ファルマシア、 　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）により末梢血リンパ球を得ることによりｓＰ ＷＭ−Ｔを調製した。次いで、以前に記載されたようにして（ティエーレ（Ｔｈ ｉｅｌｅ）ら＋　Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．、１３４ニア８６゜１９８５）　、該リ ンパ球をＬ−ロイシンメチルエステル２．５ミリモル／Ｌ（シグマ、セントルイ ス、ＭＯ）で処理して、ＩＶＩ阻害性細胞（ナチュラルキラ一様細胞、細胞毒性 Ｔリンパ球、及びＣＤ８゛Ｔ細胞の亜型）を減少させた。Ｌ−ロイシンメチルエ ステル処理リンパ球をヒツジ赤血球（キャペル（Ｃａｐｐｅｌ）、ダーラム。

ＮＣ）とインキュベートすることによって、Ｔヘルパー富化試料を得た。次いで 、ヒツジ赤血球を赤血球溶解溶液（シグマ）で溶解した。アメリカヤマゴボウマ イトジェン（ＧＩＢＣＯ，グランドアイランド、　ＮＹ）のｌ：１００希釈液を 、１０％自己血清を補充した完全ＲＰＭ１１６４０中の４ＸＩＯ９／Ｌの濃度の Ｔ細胞に添加して、４８時間インキュベートした。遠心分離してアメリカヤマゴ ボウマイトジェン刺激Ｔ細胞を除いた後に得られた上澄み液をｓＰＷＭ−Ｔと命 名した。混合リンパ球培養液の上澄み液（ｓＭＬＣ）は、２患者の異種リンパ球 をｔｉｔの比率で混合し、最終濃度を４Ｘ１０’／Ｌとして、７２時間培養する ことによって調製した。使用するまで両方の上澄み液を一２０℃で保存した。

親ＷＩＬ−２細胞由来のヒ）Ｂリンパ芽球様細胞系（グラ・ソシイ、　Ｊ、　Ｔ ｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｅｔｂｏｄｓ、　１２：８５．１９８９）　、 ツまり５ＨＦＰ−１は、ヒト融合パートナ−細胞系であった。結腸癌細胞系ＨＴ −２９及びＣａｃｏ２をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロッ クビル、　ＭＤから得た。ｌＯ％〜２０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩＬ６ ４０培地中でこれら細胞系を培養した。

融合操作においては、リンパ節からのリンパ球１部と５ＲＦＰ−１細胞２部を５ ０％ポリエチレングリコール１５００　（ベーリンガー・マンハイム、ドイツ） で融合した。このノ入イブリ・ノドをヒボキサンチン、アミノプテリン、及びチ ミジンを含有する培地（ベーリンガー・マンハイム）で選択した。酵素結合免疫 吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によるＨＴ−２９細胞に対する反応性、癌胎児抗原に 対する反応性、及びイムノグロブリンのアイソタイプを、目に見える各ハイブリ ドーマの上澄み液について測定した。該反応性クローンを限界希釈法によってサ ブクローン化した（グラ・ソシイ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｖｅｓｔ、、　５：４ ４９．　１９８７）。

イムノグロブリン産生及び腫瘍反応性は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬ　Ｉ　 ＳＡ）によって評価した。ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートは、ウェル当たり５Ｘ１０’ 個のＨＴ−２９又はＣａｃｏ２細胞で該プレートをコーティングすることによっ て調製した。食塩角リン酸緩衝液−０．５％ウシ血清アルブミン溶液でブロック した後、５０μＬの試験用上澄み液を各ウェルに１〜２時間で室温で添加した。

洗浄後、ホースラディツシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトイムノグロブリン （抗ＩｇＭ及び抗ＩｇＧはジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）、ウェストグローブ、 　ＰＡからのものであり、抗ＩｇＡはザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）、サンフランシ スコ、　ＣＡからのものであった）を添加して４５分間インキュベーションした 。基質、っまり０−フェニレンジアミンを発色反応のために添加した。プレート をマイクロプレートリーダー（ＭＲ７００，ダイナチック・ラボラトリーズ社、 シャンティイー、　ＶＡ）で４９２ｎｍで読み取った。食塩角リン酸緩衝液−ウ シ血清アルブミン溶液を試験用上澄み液と置き換えることによってバックグラン ドの光学密度（ＯＤ、）を得たところ、ｏ、　ｏ　ｓ　ｏ又はそれ未満であるこ とが分かった。９６ウ工ル台では、０．２５０より大きいＯＤを有する上澄み液 を陽性とみなした。続いて、殆どのＩｇＭ分泌クローンが該ＥＬＩＳＡプレート に非特異的に結合しなかったので、ＥＬＩＳＡの結果を評価するために新たな規 準を確立した：規準Ａ　：　ΔＯＤ＜１．０００及びＯＤ、−ＯＤ、＞０．２０ ０及び規準Ｂ：ΔＯＤ≧１．０００及びＯＤ、−ＯＤ、＞０．１５０ここで、Δ ０Ｄ＝ＯＤ、−ＯＤ、であって、ＯＤ、（サンプルＯＤ）は、抗原をコーティン グしたＥＬＩ　ＳＡプレートへの上澄み液の特異的結合から得たＯＤを表し、Ｏ Ｄ、（偽ＯＤ）は、抗原コーティングなしのＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートへの上澄み 液の非特異的結合から得たＯＤを表す。

Ｈｕ　Ｍ　Ａ　ｂ　（Ｓ　Ｋ　ｌ　）との反応性について、種々のヒトカルチノ ーマ細胞系を試験した。試験した細胞系は、ＨＴ２９、Ｃａｃｏ２、ＣＯＬ　２ ０５、ＣＯＬ３２０ＤＭ、Ｐａｎｃ−１、ＫＡＴＯＩｌｌ　Ｃａ　１ｕ−Ｌ　Ａ ３７５、及びＨＴＢ６３　（ＡＴＣＣ。

ロックビル、　ＭＤ）及びＰａとＭ２１　（ＵＣＬＡ）であった。

マツクコイズ（ＭｃＣｏｙ’ｓ）　５　Ａ　（Ｕ　ＣＳ　Ｄコア・ファシリティ 。

ラジコラ、　ＣＡ）中でＨＴ２９細胞を生育させたこと、ＤＭＥ−高グルコース 培地（ＵＣ３Ｄコア・ファシリティ、ラジョラ、　ＣＡ）中でＰａｎｃ−１及び Ｃａ１ｕ−１細胞を生育させたことを除いて、全細胞をｌθ〜２０％ＦＣ３（ハ イクローン・ラボ、ローガン、　ＵＴ）及び２ｍＭＬ−グルタミン（ホワイタッ カー、ウォールズビル、　ＭＤ）を補充したＲＰＭ１１６４０培地（ホヮイタッ カー）中に維持した。５ＸＩＯ’／ｍｌの細胞懸濁液２０ｍ１を、無菌ガラスス ライドを含む各ベトリ皿に添加した。いろいろな時間培養した後、該スライドを 採取して、免疫ペルオキシダーゼ（ＩＰ）又は免疫蛍光（ＩＦ）染色のいずれか に用いた。

染色用にスライドを調製する際に、細胞を接種したスライドをＰＢＳ中で洗浄し 、冷アセトンで固定した。間接ＩＰ染色用に、固定した細胞をＨｕＭＡｂ　（Ｓ ＫＩ）上澄み液（ｉｏμｇ／ｍ１）と共にインキュベートし、その後ホースラデ ィツシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト１ｇＭ、続いて０．０１％Ｈ２Ｏ２を 含有するジアミノベンジジン（ＤＡＢ；シグマ）で発色させた。メイヤーのへマ ドキシリンで対比染色した後、該検体を過酸化アンモニウムで澄明にしてアクア ・マウント（ａｑｕａ−ｍｏｕｎ　ｔ）で立ち上がらせた。ＩＦ染色では、ヒト ＩｇＭ（ベーリンガー・マンハイム）に対するＦＩＴＣ結合ヤギ抗体の１：２０ ０希釈液を第２抗体として用い、反応性をニコン蛍光顕微鏡で評価した。コント ロールは、第２抗体と細胞からなるものであった。

ＨＴ２９細胞（結腸癌）では、１日経過培養物及び３日経過コロニーの末梢腫瘍 細胞が強く染色した。これは、該コロニーの中心で認められたとびとびの染色と は対照的であった。５日目に細胞が集密化したときに、ＳＫＩの染色が均等に少 なくなった。時間を関数とする抗原発現の低下が、培養したＣａ１ｕ−１細胞（ 肺癌）にも認められた。該抗原は、培養の初期（１日目）において細胞質内で一 様に検出された。その後、それは核の一端に集まり、核は抗原集結域に向かって しばしば歯状になった。４及び５日目に該抗原は拡散して反応性は弱まり最終的 に７日目までに消失した。類似の免疫細胞化学的所見がＰａｎｃ−１細胞（膵臓 癌）で見られた。このデータは、ＳＫＩの発現が増殖と関係していることを示唆 している。

ＨｕＭＡｂ　（ＳＫＩ）を用いてＳＫＩの膜及び細胞質染色を測定するために、 ＨＴ２９細胞をフロー・サイトメトリにより検査した。Ｃａ”＋及びＭｇｔ“不 含ＰＢＳ中の０．２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）による１日、２日、 及び５日経過組織培養液から、ＨＴ２９細胞を採取した。細胞を１）ＢＡ（１％ アルブミンを含むＰＢＳ）で洗浄した。細胞質染色用に、細胞を０．５％、＜ラ ホルムアミドで３０分間固定し、続いてＨｕＭＡｂ　（ＳＫＩ）（１０〜２５μ ｇ／ｍｌ）を含有する上澄み液と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＦＩ ＴＣ結合ヤギ抗ヒト１ｇＭ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ、イ ンディアナポリス。

ＩＮ）の１　：　５００希釈液を１時間で添加した。全工程は４℃で行った。デ ータ・ジェネラル２１５０コンピユーターとインターフェースした、アルゴンレ ーザーを有するオルソ・サイトフルオログラフ（Ｏｒｔｈｏ　Ｃｙｔｏｆｌｕｏ ｒｏｇｒａｆ）　５０−Ｈを用いて、ＦＩＴＣ及びＰＩ（４８８ｎｍ）について ５，０００〜２０，０００個の細胞を検査した。未染色細胞及び第２抗体コント ロールの自己蛍光が含まれた。未固定生育可能細胞を膜反応性に用い、染色が完 了してすぐに１％ホルマリンで固定した。５　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｚを含む １０ム（ＰＩ、シグマ）でＤＮＡを３０分間染色した。

フロー・サイトメトリ研究により、抗原ＳＫＩは細胞表面上及び細胞質内の両方 にあることが分かった。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養時間を関数とするＳＫＩ陽性細胞 の減少が、ＨｕＭＡｂ　（ＳＫＩ）で細胞表面及び細胞内の両方を染色すること によって認められた（表１）。

（本頁以下余白） 表　１ 非増殖細胞内のＡｇ５Ｋ１の漸減 Ａｇ５Ｋ１陽性細胞（％） ＨＴ２９　８９４４　６６　６　４７　０Ｐａｎｅｌ　８１　７１　６５　５１ 　４６　０増殖ＨＴ２９のＤＮＡ分析と結び付けると、細胞サイクル（Ｇ１から Ｍ）全体を通してＳＫＩが検出された。これは、ＳＫＩが初期の６１段階で合成 されその後も残存することを示唆している。

ＨｕＭＡｂ　（ＳＫＩ）の反応性も、種々の腫瘍組織由来の組織学的検体で試験 した。

表２ 種々の腫瘍組織とのＨｕＭＡｂ（ＳＫＩ）の反応性腫瘍組織　反応性１ 結腸直腸　１０／Ｉ　Ｏ 胃　１／１ 膵臓　１／１ 肺（アデノカルチノーマ）２／２ ＋（＃陽性体／＃被験体）として表した表２から分かるように、ＨｕＭＡｂ　（ ＳＫＩ）は、消化管、膵臓、及び肺の腫瘍と反応性が高いが、乳房、メラノーマ 、及び軟組織サルコーマの検体とは反応しなかった。

抗原ＳＫＩに関する種々の物質の作用を、ＨＴ２９細胞をコーティングしたＥＬ 　Ｉ　ＳＡプレートを用いて評価した。ＥＬＩＳＡプレートを次の条件下で種々 の物質で処理した：０．４５Ｕ／ｍ１ノイラミニダーゼ（タイプＩ１１．　シグ マ）、ｐＨ５，５，３７℃。

−晩；酢酸ナトリウム緩衝液中の過ヨウ素酸（シグマ）５ｍＭ。

ｐＨ４，５，室温で４５分間；　０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ，グランド アイランド、　ＮＹ）　、ｐ）（７，ｓ、３７℃で２０分間；及びｌ。

０℃で２分間の熱処理。ＮＰ−４０に対するＳＫＩの感受性の測定では、ＳＫＩ 陽性細胞をＮＰ−４０と混合してから遠心分離した。次いで、ＳＫ１反応性を、 採取した上澄み液に関してＥＬＩＳＡを用いて試験した。トリプシン及び熱に対 するＳＫＩの感受性を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・プロットにより更に 分析した。表３に纏めたように、ノイラミニダーゼ、トリプシン、過ヨウ素酸塩 、及び熱での標的細胞の処理は、ＨｕＭＡｂ（ＳＫ１）との結合を壊した。これ は、ＳＫ１のシアログリコタンパク質性を示唆するものである。

（本頁以下余白） 表３ 種々の物質に対するＡｇ５Ｋ１の感受性反応’−−−−−＋＋ １処理後のＨｕＭＡｂ　（ＳＫＩ）との反応性種々の細胞系の溶解産物を用いて もＳＫＩを評価した。溶解産物の調製に際して、ＨＴ２９、ｐａｎｃ−１、ＫＡ ＴＯＩＩＩ、及びＣａ１ｕ−１細胞を食塩加トリス緩衝液（ＴＢＳ）で３回洗浄 して、５Ｘ１０’細胞／ｍｌでＴＢＳで懸濁した。細胞溶解産物は、凍結及び解 凍（４回）を繰り返し、３０００Ｘｇで１０分間遠心分離することによって調製 した。その上澄み液を集めて使用するまで一７０℃で保存した。次いで、該細胞 溶解産物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・プロットにより試験した。

電気泳動は、ノペックス・Ｘ細胞・ミニゲル・システム（ノペックス（Ｎｏｖｅ ｘ）、サンディエゴ、　ＣＡ）を用いて行った。プレカースト　（Ｐｒｅｃａｓ ｔ）　８〜１６％トリス−グリシンゲル（ノペックス）を用いて全サンプルを泳 動させた。電気泳動後、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）転写システム（リッチ モンド、　ＣＡ）を用いて、タンパク質をニトロセルロース膜上に移した。同時 にタンパク質スタンダード及び予備染色スタンダード（シグマ）を用いた。ＴＥ Ａ　（ＴＢＳ−１％アルブミン）でブロックした後、膜を洗浄し、乾燥し、そし て２５μｇ／ｍｌのハイブリドーマ上澄み液中でインキュベートした。アルカリ 性ホスファターゼ結合ヤギ抗ヒト■ｇＭ（アメリカン、クアレックス（Ｑｕａｌ ｅｘ）、ラマラダ（ＬａＭａｒａｄａ）、　ＣＡ）を１：３０００に希釈して第 ２抗体として用いた。

プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのプロト・プロット・システムを用いてバンド を発色させた。

これら研究により、ＳＫＩは、還元及び非還元条件下の両方でゲル電気泳動及び ウェスタン・プロットにより４２〜４６ｋＤａと見積もられる分子量を有する二 本鎖構造であることが分かった。

該抗原を、次の細胞の１〜２日経過培養物の細胞溶解産物中で同定した：ＨＴ２ ９、Ｐａｎｃ−１、ＫＡＴＯｌｌｌ０５日経過培養物を用いた場合に、該抗原は かろうじて検出可能であった。上のカルチノーマ細胞とは対照的に、メラノーマ 細胞系ＨＴＢ６３、ＨＴＢ６６、ＨＴＢ７１、ＨＴＢ７２、ＨＴＢ７３、ＵＣＬ ＡＭ２１、及びＵＣＬＡ　Ｍｌ　４は、ウェスタン・プロットを伴うゲル電気泳 動及び細胞免疫ペルオキシダーゼ染色の両方によっても検出可能な抗原ＳＫＩを 有さなかった。

以上、本発明を十分に説明してきたが、本発明の趣旨又は範囲から逸脱すること なく多くの変更及び修飾を行うことができることは、当業者に明らかであろう。

フロントページの続き （５１）　ｆａｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ ＧＯＩＮ　３３１５７４　Ａ　７０５５−２Ｊ３３１５７７　Ｂ　７０５５−２ Ｊ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０２ （Ｃｌ３Ｆ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　グラッシー、マーク　シー。

アメリカ合衆国　９２１２６　カリフォルニア州　サンディエゴ、　パークディ ル　アベニュー　１０２４６ Ｉ （７２）発明者　チャン、ヘレナ　アール。

アメリカ合衆国　０２９０６　ロードアイランド州　プロピデンス、　ハルセイ 　ストリート２６ （７２）発明者　コウダ　ケイジ 千葉県千葉市貝塚１２８８−１６

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．カルチノーマ特異性抗原ＳＫ１に特異的に結合するモノクローナル抗体を分 泌することのできる無限継代固定ハイブリドーマ細胞系。
2. ２．ハイブリドーマがＡＴＣＣＨＢ１０９０５である、請求項１のハイブリドー マ。
3. ３．ＳＫ１に特異的に結合するモノクローナル抗体。
4. ４．ヒトである、請求項３のモノクローナル抗体。
5. ５．ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１０９０５により産生されるモノクロー ナル抗体の特異性を有する、請求項４のモノクローナル抗体。
6. ６．モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１０９０５により 産生される、請求項４のモノクローナル抗体。
7. ７．請求項３の抗体に対する抗イディオタイプ抗体。
8. ８．ＳＫ１を含有すると考えられる供給源を、診断的に有効量の検出できるよう に標識された、ＳＫ１と特異的に結合する抗体又はその断片と接触させ、そして 該抗体が該供給源に結合するかどうかを測定することを含むＳＫ１を検出する方 法。
9. ９．抗体がハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１０９０５により産生される、請 求項８の方法。
10. １０．検出がｉｎｖｉｖｏである、請求項８の方法。
11. １１．検出可能な標識が、放射性同位元素及び常磁性標識からなる群から選ばれ る、請求項１０の方法。
12. １２．検出がｉｎｖｉｔｒｏである、請求項８の方法。
13. １３．検出可能な標識が、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド状金属、ケミ ルミネッセンス化合物、バイオルミネッセンス化合物及び酵素からなる群から選 ばれる、請求項１２の方法。
14. １４．治療的に有効量のモノクローナル抗体又はその断片を動物に投与すること を含む動物の悪性腫瘍疾患を改善する方法であって、前記抗体がＳＫ１に特異的 に結合する方法。
15. １５．悪性腫瘍疾患がカルチノーマである、請求項１４の方法。
16. １６．抗体がヒトである、請求項１４の方法。
17. １７．モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１０９０５に より産生されるモノクローナル抗体の特異性を有する、請求項１４の方法。
18. １８．モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１０９０５に より産生される、請求項１４の方法。
19. １９．投与が非経口である、請求項１４の方法。
20. ２０．非経口投与が、皮下、筋肉内、腹腔内、洞内、経皮、又は静脈内注射によ るものである、請求項１８の方法。
21. ２１．投与が約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０００ｍｇ／ｋｇ／回の投与量で行わ れる、請求項１４の方法。
22. ２２．抗体がエフェクタ−細胞と組み合わせて投与される、請求項１４の方法。
23. ２３．モノクローナル抗体が治療的に標識されている、請求項１４の方法。
24. ２４．治療的標識が、放射性同位元素、薬品、免疫調節剤、生物学的応答修飾剤 、レクチン、及びトキシンからなる群から選ばれる、請求項１４の方法。
25. ２５．抗体が実質的に同時期に治療剤と組み合わせて投与される、請求項１４、 ２２及び２３のいずれかの方法。
26. ２６．治療剤が、放射性同位元素、薬品、免疫調節剤、生物学的応答修飾剤、レ クチン、及びトキシンからなる群から選ばれる、請求項２５の方法。
27. ２７．実質的に純粋な形での抗原ＳＫ１及びその混合物及びその塩。
28. ２８．還元条件下でドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に より測定して、４２〜４６ｋＤの分子量を有する、請求項２７のＳＫ１。
29. ２９．ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ１０９０５により産生されるモノクロ ーナル抗体の特異性を有するモノクローナル抗体により特異的に結合されるエピ トープを含む、請求項２７のＳＫ１。
30. ３０．免疫原として有効な量のＳＫ１で動物を免疫感作することを含む動物の悪 性腫瘍疾患を改善する方法。
31. ３１．免疫原として有効な量の請求項７の抗イディオタイプ抗体で動物を免疫感 作することを含む動物の悪性腫瘍疾患を改善する方法。
32. ３２．治療的に有効量の請求項３〜７のいずれかのモノクローナル抗体を製剤上 の担体と共に含む医薬組成物。
33. ３３．免疫原として有効な量のＳＫ１を製剤上の担体と共に含む医薬組成物。