NO165945B - Anvendelse av monoklonalt fukosebindende antistoff (ggf) for fremstilling av et termisk denaturert glykosidisk bindingsrelatert antigen (gra). - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et

monoklonalt fukosebindende antistoff (GGF) som reagerer med III^V^Fuc2nLc5 og III-^V^VII^Fuc3nLC8, men ikke reagerer med III^FucnLc4, for fremstilling av et termisk denaturert cancercelleavledet glykosidisk bindingsrelatert antigen

(GRA), ved trinnene:

a) homogenisering av humane cancerceller i fysiologisk saltløsning eller i en egnet bufferoppløsning og samling

av bunnfall ved sentrifugering,

b) solubilisering av bunnfallet i fysiologisk saltløsning eller i en bufferoppløsning i nærvær av et solubiliserende middel og samling av den resulterende supernatant

ved sentrifugering,

c) supernatanten omsettes ved kromatografering med det nevnte antistoff under utnyttelse av dets evne til å

binde til en terminal fukoseglukosidisk bindingsstruktur, d) det bundne glykoprotein samles ved en utvekslingsreaksjon, glykoproteinet frigis og isoleres, og tilslutt e) oppvarmes glykoproteinet i vann, fysiologisk saltløsning eller en fosforsyre-bufferoppløsning under betingelser

slik at proteindelen av glykoproteinet denatureres mens den glykosidiske bindingsdel av glykoproteinet ikke denatureres, for eksempel 60-120°C i 5-60 min.

Disse trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravet.

Som beskrevet i GB 2.106.935A tilsvarende japansk publisert patentansøkning nr. 1420/84 er det kjent at GRA er en komponent av membranen av en cancercelle som kan binde et lektin som kan binde til terminal galaktose og/eller terminal N-acetyl-galaktosamin, vikker som et immunogen for verten og har en høy immunogenisitet som bevirker en immunorespons spesifikk for cancercellene og at dette utgjør en utmerket virkning ved terapi og profylakse av cancer. (Det gjøres her oppmerksom på at dette gjelder et ikke-denaturert GRA i motsetning til den foreliggende oppfinnelse som vedrører oppnåelse av et termisk denaturert GRA).

Det .er utført omfattende forskningsarbeider på dette område og som et resultat er det funnet at en epitop som kan gjenkjennes av et monoklonalt antistoff GGF beskrevet i det følgende foreligger i den spesifikke glykosidiske bindingsstruktur av det ovenfor beskrevne GRA og det er også funnet at GRA kan oppnås effektivt under anvendelse av midler for isolasjon som gjør bruk av affiniteten til den nevnte terminale fukose-glykosidiske bindingsstruktur.

Den foreliggende oppfinnelse muliggjør således fremstilling av et termisk denaturert GRA fra en cancercelle-membrankomponent under anvendelse av affinitet til en terminal fukose-glykosidisk binding, med etterfølgende samling av glykoproteinet, med etterfølgende frigivelse og isolering av dette for den avsluttende denaturering. Det vises for dette til den etterfølgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen.

Ved oppfinnelsen utnyttes'en teknikk som gjør bruk av

affiniteten til en terminal fukose-glykosidisk binding, ved å behandle en cancercelle-membrankomponent med en substans som har affiniteten til en terminal fukose-glykosidisk bindingsstruktur slik at GRA bindes dertil og deretter frigis GRA

derfra. Ved bindingen anvendes affinitets-kromatografering.

Cancercelle-membrankomponenter som anvendes som råmaterialer ved den foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset og hvilke som helst eller hvilken som helst kan anvendes, fremstilt i henhold til konvensjonelle metoder fra humane eller animalske cancerceller som f.eks. dyrkede cancerceller, transplanterte cancerceller, spontane cancerceller, kjemiske eller virus-induserte cancerceller og cancerceller avledet

fra opererte vev. Separering av cancercelle-membrankomponen-ten gjennomføres ved hjelp av den kjente metode som omfatter

homogenisering av cancerceller i fysiologisk saltløsning eller i en egnet bufferoppløsning, separering av det dannede bunnfall ved hjelp av sentrifugerende separering, etc, solubilisering av bunnfallet i fysiologisk saltløsning eller i en bufferoppløsning i nærvær av et solubiliserende middel og samling av supernatanten ved hjelp av sentrifugering, etc. Forskjellige overflateaktive midler som er kjent å solubilis-ere cellemembraner kan anvendes som solubiliserende middel. Eksempler på dette inkluderer ikke-ioniske overflateaktive midler som "Triton X-100" (fremstilt av Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), "NP-40" (fremstilt av Shell Co.), digitonin eller urea, etc og anioniske overflateaktive midler som natrium-dodecyl-sulfat (SDS), etc.

Oppfinnelsen skal nå forklares mer detaljert i det følgende, ved hjelp av et eksempel på trinnet med affinitets-kromatografering.

En kolonnebærer som anvendes ved den nevnte kromatografering kan lett oppnås ved å fiksere et antistoff som kan binde en terminal fukose på en uoppløselig bærer. De nevnte antistoffer som kan binde en terminal fukose er fukosebindende monoklonale antistoffer som har en affinitet til en glykosidisk bindingsstruktur som Ill<3>V<3>FuC2nLc6 beskrevet i Biochem. Biophys. Res. Commun., 109 (1) sidene 3 6-44 (19 82))

(difukosyl-glykosidisk bindingsstruktur). Det GGF-antistoff som fremstilles i henhold til det referanseeksempel som er gitt i det følgende er et monoklonalt antistoff som er karakterisert ved sin reaktivitet til III<3>V<3>Fuc2nLcg og llI<3>V3viI3Fuc3nLc3, men ikke til HI<3>FucnLc4. Antistoffet med slik enestående aktivitet til glykosidisk binding er nytt og er blitt fremstilt i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse for første gang.

Fikseringen (immobiliseringen) av det ovennevnte terminale fukosebindende antistoff på den uoppløselige bærer kan gjennomføres ved hjelp av de kjente metoder for fiksering av levende stoff.. Blant disse metoder foretrekkes det å anvende fiksering- ved hjelp av en metode som anvender et polysakkarid aktivert med cyanbromid og en fremgangsmåte under anvendelse av N-hydroksysuccinimidester. Metoden som anvender et polysakkarid aktivert med cyanbromid omfatter behandling av en uoppløselig bærer med cyanbromid og kobling av de resulterende aktiverte materialer med den terminale fukosebindende substans under milde betingelser for å fiksere substansen til bæreren. Ved gjennomføring av behandlingen av den uoppløselige bærer med cyanbromid kan bæreren behandles i vann eller aceto-nitril ved romtemperatur idet pH holdes ved 7,5 til 12 med en bas isk forbindelse som f.eks. natriumhydroksyd eller natriumhydrogenkarbonat, etc. eller i en bufferoppløsning med pH 7,5 til 12 som f.eks. 0,IM natriumhydrogenkarbonat-oppløsning med pH omtrent 8,7 eller en 0,01M fosforsyre-buf f eroppløsning med "pH omtrent 7,7, etc, i omtrent 1 til 12 min. Mengden av cyanbromid som anvendes er generelt nær den samme vekt som vekten av den uoppløselige bærer. Som uoppløselig bærer er det mulig å anvende hvilke som helst kjente uoppløselige bærere som viser en lav ikke-spesifikk adsorbsjon til levende stoff generelt og har en høy porøsitet, som har en funksjonell gruppe som kan fiksere det levende stoff under milde betingelser og er tilstrekkelig stabilisert kjemisk og mekanisk. Eksempler på uoppløselige bærere inkluderer cellulosebærere som f.eks. aminoetyl-cellulose, karboksymetyl-cellulose, bromacetyl-cellulose eller p-anilin-cellulose, etc, fornettede dekstranbærere som f.eks. "Sephadex" eller "CM-Sephadex"

(fremstilt av Pharmacia Co.), etc. og agarosebaerere som f.eks. "Sepharose 2B", "Sepharose 4B" eller "Sepharose 6B"

(fremstilt av Pharmacia Co.), etc. I tilfellet med gjennomføring av koblingen av den resulterende bærer aktivert med cyanbromid med det terminale fukose-bindende

antistoff, anvendes bæreren aktivert med cyanbromid i en mengde på 30 til 80 ganger vekten av den nevnte substans, og reaksjonen gjennomføres generelt ved 0 til 40°C, foretrukket 2 til 8°C i omtrent 10 til 20 timer i et passende løsnings-middel, f.eks. en 0,IM vandig oppløsning av natriumhydrogenkarbonat (inneholdende 0,5M natriumklorid pH 8,4). Bæreren for affinitets-kromatografering inneholdende det terminale fukose-bindende antistoff kan således fremstilles på denne måte.

Ved den kromatografering som anvender den ovenfor beskrevne bærer for affinitetskromatografering inneholdende det terminale fukose-bindende antistoff, kan det ønskede GRA fanges på kolonnen ved binding til det terminale fukose-bindende antistoff på den ovenfor beskrevne bærer. Deretter samles GRA ved å gjennomføre en utvekslingsreaksjon ved å føre en substans som kan binde det terminale fukose-bindende antistoff gjennom kolonnen eller ved å føre et adsorberende separasjonsmiddel (elueringsmiddel) som f.eks. en salt-oppløsning med en høy konsentrasjon, en vandig oppløsning av kaliumtiocyanat, en borsyrebufferoppløsning eller en saltsye-glycin-oppløsning (pH 2,7), etc. gjennom kolonnen for å separere GRA.

Substanser som kan binde det terminale fukose-bindende antistoff som anvendes i den ovenfor nevnte utbytnings-reaksjon inkluderer f.eks. fukose og terminale fukoseholdige disakkarider og oligosakkarider.

GRA oppnådd som beskrevet i det foregående inneholder glykoproteiner med en terminal fukose-glykosidisk bindingsstruktur. Dette GRA kan ytterligere renses ved hjelp av en konvensjonell metode.

Som nevnt ovenfor har et GRA oppnådd på denne måte en meget høy immunogenisitet som bevirker en immunrespons spesifikk for cancerceller og fremviser en utmerket virkning ved behandling og forhindring av cancer. Den foreliggende oppfinnelse tar imidlertid sikte på fremstilling av et termisk denaturert antigen oppnådd ved varmebehandling av det nevnte GRA (i det-følgende benevnt "termisk denaturert GRA"), hvor det derved oppnådde termisk denaturerte GRA har en egenskap som kan forhindre forekomst av humoral immunitet av cancer-bærende verter (lav antistoff-produktivitet) og kan medføre sterk cellemediert immunitet som er spesifikk for cancerceller.

Det har generelt vært kjent at ettersom immunreaksjonen mot cancer (tumor-avstøtning) hovedsakelig er basert på cellemediert immunitet, mens humoral immunitet, som bevirkes av et antistoff mot et cancer-assosiert antigen ved maskering av antigenet, og ved å virke som en inhiberende faktor for immunreaksjonen (blokkerende antistoff) i seg selv eller ved å danne et immunkompleks, eller ved å endre fordelingen av antigenet (antigenisk modulasjon), enkelte ganger resulterer ikke bare i destruksjon av den immunologiske overvåknings-mekanisme i den levende kropp, men også aksellerasjon av veksten av tumorer og medfører en uheldig virkning for verten. Derfor er det termisk denaturerte GRA som har de ovennevnte egenskaper sterkt foretrukket som et preventiv eller middel mot cancer. I tillegg kan det anvendes for terapi og profylakse for cancer innen vide doseringsområder da dets virkning er lite avhengig av konsentrasjonen.

Termisk behandling av GRA gjennomføres under slike oppvarmingsbetingelser som denaturerer protein-komponenten deri, men ikke den glykosidiske bindingsdel deri. F.eks. gjennomføres den ved oppvarming av GRA i et løsningsmiddel som vann, fysiologisk saltløsning eller en fosforsyre-bufferoppløsning ved 60 til 120°C, foretrukket 90 til 110°C i 5 til 60 min., foretrukket 10 til 20 min.

Det termisk denaturerte GRA oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse er et glykoprotein sammensatt av en ikke-denaturert glykosidisk bindingsstruktur-del og en termisk denaturert protein-del.

Når lymfocytter sensitiveres med det termisk denaturerte GRA opnådd ved den foreliggende oppfinnelse frembringes såkalte "killer"-celler..

De lymfocytter som anvendes for dette er ikke spesielt

begrenset, og hvilke som helst av normale eller cancerbærende lymfocytter av human eller animalsk opprinnelse kan anvendes. Eksempler på disse inkluderer dem som er avledet fra perifert blod, benmarg, lymfeknuter, milt, mandler og thymuskjertier

etc. Disse lymfocytter kan isoleres f.eks. ved hjelp av en fysikalsk eller kjemisk prosess eller en overf late.-membran-prosess og de kan anvendes for fremgangsmåten for fremstilling av de nevnte "killer"-celler.

Sensitivering av lymfocytter med termisk denaturert GRA kan gjennomfares ved å dyrke lymfocyttene i det medium inneholdende termisk denaturert GRA i flere timer til 10 døgn, foretrukket 1 til 5 døgn.

Forskjellige typer av medium som konvensjonelt anvendes for inkubasjon av denne type av celler kan anvendes. Det foretrekkes f.eks. å anvende medium RPMI-1640 og medium Eagle MEM hvortil humanserum, kalvefoster-kvegserum (FCS), kalveserum eller hesteserum etc. tilsettes. Termisk denaturert GRA som tilsettes til mediet er foretrukket i en mengde på 0,1 til 2.000 ng/ml, foretrukket 1 til 1.000 ng/ml som et protein basert på 1 x 10^ lymfocytter/ml.

Inkubasjonen gjennomføres f.eks. ved en temperatur på 37°C og pH 7,2 eller lignende i samsvar med den konvensjonelle metode.

Resulterende killer-celler kan således formere seg uten noen restriksjon i det ovenfor beskrevne medium inneholdende T-celle-vekstfaktor (TCGF, IL-2). I dette tilfelle kan selektiv inkubasjon av kloning av killer-celler gjennomføres ved hjelp av konvensjonell begrensende fortynningsmetode. Killer-cellene kan stabilt konserveres i lengre tids-perioder hvis de konserveres i f.eks. flytende nitrogen.

De resulterende killer-celler er hovedsakelig normale lymfocytter som er karakterisert ved at de har en cytotoksisk aktivitet spesifikt for GRA.

Det termisk denaturerte GRA oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse som beskrevet i det foregående er nyttige som et anti-cancermiddel. Det termisk denaturerte GRA kan anvendes alene eller som en aktiv bestanddel eller det kan anvendes sammen med andre antimikromidler og/eller anti-cancerceller. Anti-cancermidlet inneholdende det termisk denaturerte GRA oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse som en aktiv bestanddel kan ha en hvilken som helst form hvis det inneholder en effektiv mengde termisk denaturert GRA

som et hovedmiddel. Generelt tilføres det ved intravenøs injeksjon, subkutan injeksjon eller intramuskulær injeksjon som en liposom-inklusjon, en oppløsning, en suspensjon eller emulsjon, etc. Spesielt foretrekkes en liposom-inklusjon. Dennf.- kan tilveiebringes i tørr tilstand som kan flytendegjøres ved å tilsette en passende bærer før bruk. Slike flytende midler kan inneholde suspensjonsmidler som f.eks. metyl-cellulose, emulgerings-midler som lecitin, antiseptiske midler som metyl-p-hydroksy-benzoat og stabiliseringsmidler eller buffere som ikke har noen skadelig innvirkning på en immunfunksjon i mennesker og dyr, etc. Det er mulig å anvende fysiologisk salt-løsning som et vandig medium og vegetabilske oljer som sesamolje, etc., mineraloljer som parafin, etc., vegetabilske og animalske oljer som skvalen, etc. og propylenglykol, etc. som et ikke-vandig medium. Videre kan et slikt flytende medium inneholde passende tilsetnings-midler for å fremme immunitet, som f.eks. Freund's fullstendige tilsetningsmiddel, saponin for dyr og aluminium-hydroksyd for mennesker, etc.

Det ovenfor beskrevne anticancermiddel kan tilføres cancerpasienter en eller flere ganger over en lengre tidsperiode for å helbrede og kan tilføres personer som står i fare for å utvikle en cancer for å hindre utvikling av cancer.

Da termisk denaturert GRA har en lav giftighet slik at LD50 (mus, interperitoneal tilførsel) er 500 mg/kg eller mer som sakkarid, kan det tilføres i en mengde som kan variere sterkt. Følgelig er mengden av termisk denaturert GRA i anti-cancermidlet ikke spesifikt begrenset, og er generelt foretrukket å være i dmrådet 0,001 til 100 ug/ml som sakkarid. Mengden av tilførsel avhenger av sykdomstilstanden, alder og kjønn, og det er foretrukket å tilføre midlet en til flere ganger i en mengde på 0,001 -

1.000 ug/kg/døgn.

Videre er killer-celler oppnådd som beskrevet i det foregående også nyttige som et anti-cancermiddel. Et slikt anticancermiddel foretrekkes anvendt som en injeksjon sammen med bæreren anvendt for denne type av blodmiddel. Bæreren er ikke spesifikt begrenset og det foretrekkes å anvende bærere som er isotoniske overfor tølodet, foretrukket fysiologisk saltløsning. Ved gjennomføring av fremstillingen av midlet foretrekkes det at etter at killer-cellene er vasket tilstrekkelig med fysiologisk saltløsning for å fjerne det ovenfor beskrevne medium, suspenderes de i en bærer.

Konsentrasjonen av killer-celler i det ovenfor beskrevne middel er ikke spesielt begrenset og er generelt foretrukket i-området 10 5 til 10 9 celler/ml. Videre iakttas ikke giftighet av killer-celler når de tilføres i en mengde på 10®" celler/mus (intraperitonealt). Mengden av tilførsel avhenger av sykdomstilstanden, alder og kjønn,

men det er foretrukket å foreta tilførsel en til flere ganger i en mengde på 10 5 til 10 12- celler/kg/dcgn.

I det etterfølgende er oppfinnelsen illustrert ved hjelp av eksemplifisering, omfattende undereksempeler på fremstilling av utgangs- og sammenligningssubstanser, hovedeksempel og testing.

Cancercellene anvendt i det følgende er alle kjente og er oppnådd fra Laboratory og Niigata University (Dr. Suzuki, assistant professor) og fra Japan Immunoresearch Laboratories Co., Ltd.

UNDER- BKSEMPEL 1

Under anvendelse av GRA 2 beskrevet i GB patentskrift nr. 2. 106.9 35A i en mengde på 5 jig som protein sammen med Freund's fullstendige tilsetningsmiddel ble en Balb/c mus underkastet immunisering ved subkutan tilførsel i en takt på 1 gang i løpet av 2 uker. Etter 3 døgn fra den tredje immunisering ble milten tatt ut og miltcellene vasket 3 ganger med RPMI-1640 medium. Muse-myelom-celle-linje SP2 (det refereres til "Rinsho Meneki", bind 13, nr. 11, sidene 912-919, 1981) ble vasket analogt og SP2-celler (1 x IO<7 >celler) og de ovennevnte miltceller (4 x 10 7 celler) ble anbragt i et sentrifugalrør og blandet deri. Etter sentrifugering (200 x g, 5 min.) ble supernatanten fjernet ved hjelp av enPasteur-pipette. I ml av en RPMI-1640 oppløsning inneholdende 45 vekt/volum* polyetylenglykol 4000 (fremstilt av Sigma Co.) og som ble holdt varm ved 37°C ble tilsatt dråpevis dertil og forsiktig blandet i 2 min. 1 ml av en RPMI-1640 inneholdende 15* FCS og ImM pyruvat (i det følgende benevnt "fullstendig RPMI-1640") og som ble holdt varm ved 37°C ble tilsatt dråpevis dertil og forsiktig omrørt i 1 min. og deretter ble den samme mengde av fullstendig RPMI-1640 og deretter 8 ml derav ytterligere tilsatt dråpevis dertil og hver forsiktig omrørt i henhv. 1 og 2 min. Etter at den resulterende blanding var underkastet sentrifugering (200 x g, 5 min.) ble supernatanten fjernet og det resterende innhold ble suspendert i fullstendig RPMI-1640 holdt varmt ved 37°C i en mengde på 1 x 10 7celler/ml. Hver 100 pl av den oppnådde suspensjon ble podet i en mikrotest-II-plate (fremstilt av Falcon Co.) og dyrket i en inkubator inneholdende 5% CO^ ved 37°C.

Etter 24 timer ble 100 ul av det ovennevnte fullstendige

4 -7 RPMI-1640 inneholdende 1,0 x 10 M hypoxantin, 4,0 x 10 M aminopterin og 1,6 x"10~^M tymidin (i det følgende benevnt "HAT-medium") tilsatt til hver brønn. Deretter ble en halvpart av supernatanten i hver brønn ombyttet med et friskt HAT-medium hvert annet, tredje, femte, åttende og ellevte døgn og i det fjortende døgn ble en halvdel av supernatanten på analog måte ombyttet med fullstendig

-4 -5 RPMI-1640 inneholdende 1,0 x 10 M hypoxantin og 1,6 x 10 M tymidin (i det følgende benevnt "HT-medium"). På samme måte ble en halvdel av supernatanten ombyttet for et friskt HT-medium hvert 18., 22., 25. og 27. døgn og i det 28. døgn ble en halvdel av supernatanten ombyttet med en frisk fullstendig RPMI-1640. Deretter ble formeringen opprettholdt i denne fullstendige RPMI-1640. Således oppnådd hybridom ble klonet ved hjelp av en begrensende fortynnings-dyrkingsmetode. Mer detaljert ble fullstendig RPMI-1640 medium innstilt til å inneholde hybridomer i mengde på

3 celler/ml og Balb/c mus tymus-celler i en mengde på

7

1 x 10 celler/ml, og dette ble implantert i en plate med

96 brønner med 0,2 ml/brønn og dyrket deri. Formert hybridom ble ytterligere klonet på analog måte. For kontroll av klonet som kan fremstille det ønskede antistoff ble anvendt en 96-brønns plate fremstilt av Dynatech Laboratory Co., belagt med 10 ng/brønn av" renset HI<3>FucnLc4, IIl<3>V<3>Fuc2nLc6 eller III<3>V<3>Vll<3>Fuc3nLc8, 30 ng/brønn av kolestrol og 50 ng/brønn av lecitin i en fastfase-metode under anvendelse av et kanin-anti-mus-immunoglobulin (fremstilt av Kappel Co.) og <125>I-protein A (fremstilt av Sigma Co.). På denne måte ble det ønskede hybridom representert ved klon nr. GGF oppnådd. (2) Hybridomet av klon nr. GGF som oppnådd i det foregående under (1) ble dyrket i et fullstendig RPMI-1640 medium anbragt i en inkubator inneholdende 5% CG^ ved 37°C i 48 timer. Den dyrkede oppløsning ble underkastet sentrifugal-separasjon (3000 omdr. pr. min., 10 min.) til å gi en dyrket supernatant inneholdende et monoklonal antistoff (i det følgende omtalt som "GGF"). (3) lx 10^ hybridom-celler av klon nr. GGF som oppnådd under (1) ovenfor ble suspendert i 0,5 ml RPMI-1640 medium og intraperitonealt tilført til Balb/c mus. Etter 2 til 3 uker ble akkumulert askites tatt ut og således ble 2 til 5 ml/mus av en askites inneholdende et antistoff GGF oppnådd. Antistoff-konsentrasjonen var omtrent 0,5 mg/ml.

(4) Immunoglobulin-klasse

Klassifiseringen ble gjennomført ved hjelp av metoden til Yeh et al, under anvendelse av et kanin-antistoff til den tilsvarende type av muse-immunoglobulin-klasse (Litton. Bionetico. Inc. Kensington, MD 20795) og <125>I-merket protein A (Ming-Yang Yeh et al. Proe. Nati. Acad. Sei., USA bind 76, nr. 6, sidene 2927-2931, 1979). Til slutt ble GGF påvist å høre til en IgG 3 under-klasse.

(5) Reaktivitet av antistoff GGF

overfor forskjellige typer av glykolipid-antigener

(a) Som et renset antigen ble anvendt III FucnLc.,

3 3 3 3 3 4 III V Fuc2nLc6 eller III V VII Fuc3nLc8 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 109, (1), sidene 36-44, 1982). Antistoffet oppnådd ovenfor under (2) (og trinnvis fortynnede prøver derav) ble omsatt med det nevnte antigen i 10 ng/ brønn av en vinylstrimmel (fremstilt av Coster Co.) belagt med kolesterol (30 ng/ brønn) . og leeitin (50 ng/ brønn)

(fremstilt av'Coster Co.).

Etter at brønnen var vasket med PBS ble antistoffet bundet til det rensede antigen målt under anvendelse av et kanin-anti-muse-immunoglobulin som et annet antistoff og deretter <125>i-protein A. Bindingsforholdet ble beregnet på basis av strålingsbestemmelsen. Til slutt ble antistoffet GGF påvist å ha en reaktivitet med III<3>V3Fuc2<n>Lc6 og III<3>V3VIl3Fuc3nLc8, men ikke med III<3>FucnLc4. (b) Innvirkning av tilsetning av monosakkarid på den første reaksjon med lektin-GGF bindingsassay.

Ved hjelp av en metode som forklart i det følgende ble en innvirkning på den første reaksjon (reaksjonen av monoklonalt antistoff og GRA 2) ved et lektin-GGF bindingsforsøk i det tilfelle at et monosakkarid var tilsatt dertil, undersøkt. Resultatet er gitt i fig. 1. I denne forbindelse ble det bemerket at bindingen ble inhibert i hvert tilfelle hvor III3V3Fuc2nLc6 eller III3V3VII3Fuc3nLc8 ble anvendt i stedet for monosakkaridet.

Målemetode:

(1) Hver av polystyrenkuler belagt med det monoklonale antistoff GGF ble anbragt i hvert prøverør. (2) 0,1 ml GRA 2 oppløsning og sakkarid<*> (se det følgende) ble anbragt i hvert prøverør.

Sakkaridkonsentrasjon: fukose (600 ug) og galaktose

(6 mg).

(3) I tillegg ble 0,6 ml 10 mM fosforsyre-buffer (pH 7,0) inneholdende 1 mM-MgCl2, 0,1% HSA og 0., 1 M-NaCl tilsatt dertil. (4) Etter blanding ble disse inkubert ved romtemperatur i 3 timer og deretter ved 4°C i 24 timer. (5) Hver kule ble vasket fem ganger med en vaskebuffer innholdende:

0,05 M tris-HCl-buffer (pH 7,2)

.2 mM-CaCl2

2 mM-MgCl2

0,85% NaCl

(6) Deretter ble 0,5 ml av vaskebufferen og 0,1 ml av PNA-POX-oppløsning tilsatt hvert prøverør og blandet deri. (7) Disse ble inkubert ved romtemperatur i 2 timer dg deretter ved 4°C i 18 timer. (8) Disse ble vasket fem ganger med 0,85% vanlig saltoppløsning. (9) Hver kule ble overført til et nytt prøverør og 2ml 0,85% vanlig saltoppløsning og 0,5 ml 3 mg/ml orto-fenylen-diamin-oppløsning (oppløst i sitronsyrebuffer ved pH 5,8) inneholdende 0,03% (endelig konsentrasjon) hydrogenperoksyd ble tilsatt dertil. (10) Etter blanding ble disse inkubert ved romtemperatur i 30 min. (11) 1 ml 3N-HC1 ble tilsatt og reaksjonen ble avsluttet. (12) Under anvendelse av et spektrometer ble adsorpsjon med bølgelengde 492 nm i hver prøve målt.

(c) Reaktivitet overfor forskjellige typer av human-celler-

Celler fiksert på en plate ble behandlet med 5% bovin-serum-albumin-holdig fosforsyrebuffer-saltoppløsning (pH 7,4) i 1 time og deretter ble antistoff GGF (100 ganger-fortynnet antistoff oppnådd som nevnt ovenfor under (3)) tilsatt dertil og inkubert i 18 timer. Deretter ble cellene på platen behandlet med et FITC-merket kanin-antistoff (fremstilt åv JIMRO C,.) som kan reagere med et muse IgG 3, som et annet antistoff, idet antistoffet var fortynnet 1.000 ganger.

Resultatene er gitt i det følgende tabell 1, hvor "positivitet" er en prosentandel av fargede celler.

UNDER- EKSEMPEL 2

(1) Etter at 3 g av CNBr-aktivert "Sepharose 4B>"

(fremstilt av Pharmacia Co.) var tilstrekkelig vasket med 1 mM-HCl, ble den suspendert i 200 ml 0,1 M natrium-hydrogen-karbonat (pH =8,5). 5 ml av en 0,01 M fosfat-buffer-oppløsning (pH = 7.7) inneholdende 20 mg Lotus tetragonolobus lektin tilsatt dertil og reaksjonen ble gjennomført ved 25°C i 2 timer under leilighetsvis omrøring for å oppnå uoppløseliggjort lektin (Lotus tetragonolobus lektin)-Sepharose. (2) Til 2 ml antistoff GGF oppnådd i under-eksempel l-(2), ble en 0,1 M vandig oppløsning av natrium-hydrogen-karbonat inneholdene 5 g/i5 ml bromcyan-Sepharose (Pharmacia Co.) og 0,5 M NaCl (pH = 8.3) tilsatt, og den resulterende blanding ble omrørt i 2 timer til å gi et uoppløseliggjort antistoff (GGF-Sepharose).

EKSEMPEL

A. Fremstilling av antigener.

(1) Omtrent 5 g (fuktig vekt) av KATO-III celler ble homogenisert i 50 ml PBS av en mølle (Waring Blender).

Bunnfallet oppnådd ved sentrifugal-separasjon (100.000 x

g, 1 time) ble tilsatt til 50 ml.av en 0,01 M tris-saltsyre-buffer-oppløsning (pH 7,6) inneholdende 2%

"Triton X-100", 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 og 0,85% NaCl under omrøring. Supernatanten oppnådd ved sentrifugal-separasjon (100.000 x g, 1 time) ble innført i en kolonne ( <E> 0,8 x 15 cm) av et uoppløseliggjort lektin (bæreren oppnådd i det ovennevnte undereksempel 2(1)) ekvilibrert med en 0,01 M tris-saltsyre-buffer-oppløsning (pH 7,6) inneholdende 0,015% "Triton X-100", 2mM MgCl2, 2 mM CaCl2 og 0,85% NaCl.

Etter vasking med den samme bufferoppløsning ble eluering gjennomført med den samme bufferoppløsning, men

inneholdende 0,1 M fukose og eluatet ble dialysert med eh 0,85% vandig oppløsning av NaCl (5 liter x 3, 2 døgn). Etter konsentrering (CX-10 ultrafilter: Millipore Co.), ble oppløsningen filtrert (0,2 pm filter: Amicon Co.) til å gi en GRA-oppløsning. Mengden av protein: 1,5 mg. Mengden av sakkarid: 1,6, mg. Dette kalles "TCA-1".

(2) I den foregående prosedyre (1) ble omtrent 10 g

QG-90 celler anvendt i stedet for KATO-III-cellene og en

kolonne av et uoppløseliggjort antistoff oppnådd i det ovennevnte .uhdereksempel 2-(2) (elueringsmiddel: 0,2 M saltsyre-glycin-buffer-oppløsning, pH 2,7) ble anvendt som en bærer og behandlet på analog måte til å gi en GRA-

oppløsning. Mengden av protein:570 ug. Mengden av sakkarid: 500 pg. Dette kalles "TCA-2". (3) En kolonne av et uoppløseliggjort antistoff oppnådd i det ovennevnte undereksempel 2-(2) ble vasket med en 0,01 M tris-saltsyre-buf f er-oppløsning (pH = 7,6) <.

inneholdende 0,15% "Triton X-100", 2 mM MgCl2, 2mM CaCl2 og 0,85% NaCl og deretter ble GRA -1 beskrevet i GB patent-

skrift nr. 2.106.935A tilført i en mengde på 300 pg som

protein. Etter vasking med den samme buffer-oppløsning ble denne eluert med en 0,2 M saltsyre-glycin-buffer-oppløsning (pH = 2,7) til å gi en GRA-oppløsning. Mengden av protein: 200 ug. Mengden av sakkarid: 220 ug. Dette benevnes "TCA-3".

(4) I den ovennevnte prosedyre (3) ble GRA-8 beskrevet i

GB patentskrift nr. 2.106.935A anvendt i stedet for GRA—1,

idet mengden av det nevnte GRA-8 som ble anvendt var 20 ug som protein, og behandlet på analog måte til å gi en GRA-oppløsning. Mengden av protein: 15 ug. Mengden av sakkarid: 13 ug. Dette benevnes "TCA-4".

B. Denaturering

(1) En fysiologisk saltløsning inneholdende TCA-1, i en mengde på 100 pg som protein, oppnådd i det ovennevnte under A (1) ble oppvarmet i et varmt vannbad. ved 100°C i 10 min. til å gi et termisk denaturert GRA. Dette benevnes "TCA-1H. (2) I den ovennevnte prosedyre (1) ble hvert av TCA-2-4 anvendt i stedet;for TCA-1 og behandlet på analog måte til å gi hvert termisk denaturert GRA som angitt i følgende tabell 2.

Sammenlignende fysiologisk pravning

(1) Perifere blodlymfocytter oppnådd fra en frisk voksen person ved sentrifugal-separasjon ved hjelp av "Ficollpack" (Pharmacia Co.) ble kontrollert méd et medium RPMI-1640 inneholdende 10% FCS slik at det var 1,5 x IO<6 >celler/ml. Til 10 ml av dette ble TCA-2 tilsatt slik at det ble en proteinmengde på 25 mg/ml og inkubasjon ble gjennomført ved 37°C i kullsyregass-inkubator i 48 timer for å oppnå killer-celler.

Bortsett fra dette ble killer-celler oppnådd på samme måte, men uten noen tilsetning av TCA (kontroll).

(2) Etter at killer-celler oppnådd under det foregående avsnitt (1) var vasket to ganger med medium RPMI-1640 (1000 omdr. pr. min., 10 min.) ble de

kontrollert med det samme medium inneholdende 10% FCS slik at det var 1,5 x 10^ celler/ml, og disse ble kalt "Effektor-celler" (E). Som target —celler (T) ble dem som ble oppnådd ved kontrollerende Daudi vasket to ganger med det ovenfor beskrevne medium med det samme medium inneholdende 10% FCS slik at det ble anvendt 1,5 x IO<6> celler/ml.

100 pl av de ovenfor beskrevne E-celler og 100 pl av T-cellene ble blandet. Etter at blandingen var inkubert

ved 37°C i 1 time ble et testrør inneholdende blandingen anbragt i isblandet vann for å stanse reaksjonen og antallet av overlevende celler ble målt ved å gjennomføre farging med 0,02% trypan-blått. Killer-aktiviteten for E-cellene ble beregnet fra følgende formel.

Killer-aktivitet (%) = ((antall celler i tilfellet av anvendelse av E som kontroll') -

(antallet testede celler))/(E'+T')

hvori E' representerer antallet av overlevende celler etter at 100 ul av E var inkubert ved 37°C i 1 time og T' representerer'antallet av overlevende celler etter at 100 ul av T-cellene var inkubert ved 37°C i 1 time.

Som resultat ble 20,5% av killer-aktiviteten for E oppnådd som gjennomsnitt. (3) Analogt med ovennevnte (1) og (2) ble killer-aktivitet for killer-celler avledet fra hver av TCA-1, TCA-3, TCA-4, TCA-1H, TCA-2H, TCA-3H og TCA-4H beregnet og som et resultat ble nesten den samme aktivitet som i det foregående iakttatt i hvert tilfelle, altså også for de termisk denaturerte GRA betegnet med TCA-1H til TCA-4H.

Ytterligere testing av termisk denaturert GRA

(1) TCA-3H oppnådd i eksemplet ble kontrollert med fysiologisk saltlake slik at det var en proteinmengde på 100 ng/ml. Dette kalles anticancer-middel nr. 1. (2) 1 x 10 <4>celler av LLC avledet fra C57BL/6 mus (Charles Liver, hanmus, 5W) ble injisert i de nevnte C57BL/6 mus fra en halevene. Etter 6 døgn fra injeksjonen ble det ovenfor beskrevne anticancer-middel nr. 1 tilført musene i en mengde på 1 ml/mus/dag fra en halevene kontinuerlig i 3 døgn. Etter 22 døgn fra injeksjonen av LLC-cellene ble lungen tatt ut og nærværet eller fraværet av implantert LLC på lungen ble iakttatt visuelt og vekten av lungen ble målt. Som kontroller ble en gruppe hvortil anticancer-midlet ikke var tilført og normale mus anvendt. Resultatene er vist i tabell 3.

Det bekreftes fra tabell 3 at tilførsel av det termisk denaturerte antigen TCA-3H oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse klart bevirker tumor-rejeksjon eller undertrykkelse av tumor-vekst.

Anvendelse av et monoklonalt fukosebindende antistoff (GGF) som reagerer med III<3>V<3>Fuc2nLc5 og III^V^VTI^uc^nLcs, men ikke reagerer med III<3>FucnLc4, for fremstilling av et termisk denaturert cancercelleavledet glykosidisk bindingsrelatert antigen (GRA), ved trinnene: a) homogenisering av humane cancerceller i fysiologisk saltløsning eller i en egnet bufferoppløsning og samling

av bunnfall ved sentrifugering,

b) solubilisering av bunnfallet i fysiologisk saltløsning eller i en bufferoppløsning i nærvær av et solubiliserende middel og samling av den resulterende supernatant

ved sentrifugering,

c) supernatanten omsettes ved kromatografering med det nevnte antistoff under utnyttelse av dets evne til å

binde til en terminal fukoseglukosidisk bindingsstruktur, d) det bundne glykoprotein samles ved en utvekslingsreaksjon, glykoproteinet frigis og isoleres, og tilslutt e) oppvarmes glykoproteinet i vann, fysiologisk saltløsning eller en fosforsyre-bufferoppløsning under betingelser

slik at proteindelen av glykoproteinet denatureres mens den glykosidiske bindingsdel av glykoproteinet ikke denatureres, for eksempel 60-120°C i 5-60 min.