JP2001505563A

JP2001505563A - 血液型の変換方法

Info

Publication number: JP2001505563A
Application number: JP52385498A
Authority: JP
Inventors: ゴールドスタイン、ジャック; レニー、レスリー; ハースト、ローザ
Original assignee: ニューヨーク・ブラッド・センター・インコーポレイテッド
Priority date: 1996-11-21
Filing date: 1997-11-19
Publication date: 2001-04-24
Also published as: US20010006772A1; CA2272925A1; WO1998021944A1; EP0951216A1; AU5447398A; EP0951216A4; IL130035A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、血液型特異的抗原を赤血球から酵素的に分離するために改良された方法に関するものである。この方法は最初に、赤血球のｐＨを酵素活性に適当なｐＨに滴定調節し、次に抗原の除去が所望される程度に到達したときに貯蔵および／または輸血に適当なｐＨに滴定調節するものである。滴定調節で使用される緩衝液は、赤血球の変換もしくは貯蔵／輸血のための目標ｐＨに対して顕著に高いまたは低いｐＨ値を有する。本発明は、少なくとも一部では、滴定調節を行っても赤血球の完全な構造がほとんど損失しないという発見に基づいている。さらに、本発明は、ポリエチレングリコールを添加して赤血球抗原の酵素的除去の効率を改良した方法に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】血液型の変換方法１．序論本発明は、赤血球から血液型特異的抗原を分離する酵素的方法に関するものである。２．発明の背景定義される抗原の存在の有無に基づいて、ヒトの血液はＯ、Ａ、Ｂ、およびＡＢで示される主な４つのタイプもしくはグループ分類されている。Ａ血液型の認知されたサブタイプは主な３つがあり、Ａ₁、Ａ_int、およびＡ₂が知られている。血液型Ａ₁、Ａ₂、Ｂ、およびＯに結合している糖質構造は図１Ａ−１Ｄに示されている。Ａ₂およびＢ抗原は外部抗原成分１種からなり、一方Ａ₁抗原は２種の抗原成分を包含し、そして多くの成分は糖鎖に関わる外部残基を持ち（図１Ｂ）、マイナーな成分は内部残基と共に外部残基の両者を持っている（図１Ａ）。血漿中においてＡ型赤血球の単体は、Ｂ型赤血球に向かう抗体を持っている（抗−Ｂ抗体）。逆に言えばＢ型赤血球の単体は、血漿中において抗−Ａ抗体を持つ。ヒトのＯ血液型はＡおよびＢ抗原の両方に向かう抗体を持つ。そのような抗体の存在は輸血に対する問題をなしている。もし輸血される人間が提供者の血液に対する抗体を持っているならば、生命の危険を脅かす重大な反応が起こるおそれがある。全ての血液型でヒトに安全に輸血ができる唯一の血液型はＯ血液型であり、しばしば“ユニバーサルドナー”血液と言われている。しかしながら、Ｏ血液型の利用の可能性は、必要とされている輸血を満たすには不十分である。なぜならＯ血液型を持つのは人口の半分もいないのである。さらに提供された血液の寿命は制限されているので、利用可能な血液の供給と、必要とされる輸血量との相違は、国際的にみてもしばしば血液バンクにある貯蔵血液の大量の破壊を導いている。安全に輸血できる血液の要求を満たし、また提供された血液をより有効に利用するために、Ａ、ＢもしくはＡＢ型の赤血球を“ユニバーサルドナー”血液に変換させる技術が発展している。Ｂ血液型をＯ血液型に変換するには、緑コーヒー豆（“Ｂ−ｚｙｍｅ”）から生じるα−ガラクトシダーゼ酵素を用いて達成することができる。そして該酵素は、Ｏ血液型に関係するＨ−抗原と全く同一の糖質構造と、末端ガラクトースとを結合しているα−１，３結合を切断する（図１Ｃに点線で切断を示す）。この方法によって変換された血液は、患者に安全な輸血がなされる（例えば、米国特許第４，３３０，６１９号および同第４，４２７，７７７号明細書；Lennyら、１９９１、Blood、７７：１３８３−１３８８；Goldstein、１９８９、Transfus ion Medicine Reviews III （３）：２０６−２１２参照）。コーヒー豆のα −ガラクトシダーゼ遺伝子はクローン化され、特性が明らかにされ、Ｂ型赤血球の変換において使用される組換え酵素が生成されるように発現され（ZhuおよびG oldstein、１９９４、Gene、１４０：２２７−２３１）、またクローン化酵素は輸血のための赤血球の生成にも使用されている（Lennyら、１９９５、Transfusi on、３５：８９９−９０２）。同様にＡ_int−Ａ₂血液型は鶏の肝臓において生じるα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ酵素の使用により十分に脱抗原化される（“Ａ−ｚｙｍｅ”、米国特許第４,６０９,６２７号明細書；Goldsteinら、１９８４、ISBT の第18回学会の要約集の“Enzymatic Removal of Group Ａ antigens”、Karger、Munic h、p.８６；Goldstein、１９８９、Transfusion Medicine Reviews III （３）：２０６−２１２）。鶏の肝臓α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ遺伝子はクローン化され、特性が明らかにされ、発現された（ZhuおよびGoldstein）１９９３、Gene、１３７：３０９−３１４）。Ａ₁抗原には、外部抗原成分と共に内部抗原成分が包まれているので、α−Ｎ −アセチルガラクトサミニダーゼで処理後であっても、内部抗原成分は残る。エンド-ガラクトシダーゼは内部抗原を分離するために必要とされる。フラボバクテリウムケラトリティクス（Flavobacterium Keratolyticus）が生産するエンド−β−ガラクトシダーゼはこの内部抗原構造を分離するために使用され、Goldsteinらの係属中の米国特許出願第０８／７１２，０７２号に開示されている。しかしながら、すでに知られている赤血球の酵素的変換方法は、数多くの欠点がある。例えば米国特許第４，３３０，６１９号および同第４，６０９，６２７号明細書に記載された方法は、酵素的変換の前後に数多くの平衡ステップを含む。まず、特に赤血球のｐＨを、リン酸クエン酸緩衝液で細胞を繰り返し懸濁することによってｐＨ５．６−５．８（酵素活性の至適ｐＨ範囲）に減少させる。次に赤血球を酵素的に脱抗原化し、最終的にはｐＨ７．２−７．４の緩衝液を用いて別の一連の平衡ステップにより酵素を除去し、赤血球を生理的ｐＨに戻す。それらの平衡ステップは時間が消費されるだけでなく、扱いにくく、多量な緩衝液および多数の遠心分離ステップが必要である。さらに、時間毎に系を開いて緩衝液を再導入し、無菌状態が維持されなくなる機会を作っているのである。多数の平衡ステップはいくつかの理由から実行されている。まず最初に、輸血反応を回避するために必要とされる程度まで赤血球を脱抗原化するために、赤血球の生理的ｐＨよりも大幅なｐＨの低下が酵素処理を行うために必要である。次に、赤血球はｐＨ変化に抵抗性を与える強い自然の緩衝液を含み、必要とされるｐＨ調整を行うが困難となる。最後に、逐次のｐＨ調整は、赤血球の構造の歪みおよび溶血を回避するのに必要である。もし酵素的方法を商業的規模で赤血球の脱抗原化に利用するならば、時間効率がよいということだけでなく、材料のコストや量を減らすために、相対的に少量の緩衝液および少ない数の洗浄ですむ方法を用いるのが望ましい。したがって本発明の方法はそれらの問題を解決するためになされたものである。３．発明の要旨本発明は、血液型に特異的な抗原を赤血球から酵素的に分離する改善された方法に関するものである。この方法は、まず酵素活性に適当なｐＨに赤血球のｐＨを滴定調節し、次に抗原の除去が所望される程度に到達したときに貯蔵および／または輸血に適当なｐＨに滴定調節するというものである。滴定調節に用いる緩衝液は、赤血球の変換もしくは貯蔵／輸血のための目標ｐＨに対して顕著に高いまたは低いｐＨ値を有する。本発明は、少なくとも一部では、赤血球の構造および代謝的完全性が滴定調節を行ってもほとんど損失しないという発見に基づいている。４．図面の説明図１Ａ−Ｄは、血液型に関する抗原構造の構造図である。（Ａ）内部抗原残基と共に外部抗原残基を含んでいるＡ₁抗原のマイナー成分；（Ｂ）外部抗原残基を包含するＡ₁抗原の主要成分；（Ｃ）Ｂ血液型に関する抗原；および（Ｄ）ユニバーサルドナーＯ血液型に関する糖質構造。図２Ａ−Ｂは、ポリエチレングリコール無し（Ａ）もしくは有り（Ｂ）で変換された赤血球とネイティブ赤血球との浸透圧脆弱性の研究である。５．発明の詳細な説明開示内容を明確にする目的のために、制限する訳ではないが、本発明の詳細な説明を以下の章に分けた。これらの章は、赤血球から血液型特異的抗原を分離するために行われるステップを連続して記述している。（ｉ）赤血球の調製；（ii）酵素処理前のｐＨ滴定調節；（iii）血液型特異的抗原の酵素的分離；および（iv）酵素の除去およびｐＨの滴定調節。５．１．赤血球の調製輸血用赤血球を生成する本発明の方法を使用するためには、最初に被検者から収集された血液から赤血球を得、次に標準的な技術を利用して、血小板および白血球のような他の血液成分から赤血球を分離する。例えば、制限する訳ではないが、パックされた赤血球（パックされた赤血球もしくはＲＢＣパック）は、血小板およびほとんどの白血球を除去する条件である、４．８分間、１，２５０ｇ−４，０００ｇの遠心分離によって収集全血から調製することができる。本発明によれば、先に貯蔵のために収集および調製しておいた赤血球を使用することができる。しかしながら、そのような調製物は、酵素処理前に除去するのが望ましい栄養素および／または防腐剤を含んでいるかもいれない。ただし、そのような除去は必ずしも求められない。本発明を実施するために、赤血球は少なくとも約８０％、より好ましくは、８５〜９５％のヘマトクリット（血球容積比）値の懸濁液であるのが好ましい。例えば、制限する訳ではないが、上記値を満たす赤血球懸濁液は標準的な血漿エクスプレッサーを用いて、パックされた赤血球から上清を一部取り除くことにより生成することができる。得られた組成物を、ここでは“ネイティブ赤血球懸濁液”とよぶ。５．２．酵素処理前のｐＨ滴定調節赤血球から酵素的に抗原を分離するために、ネイティブ赤血球懸濁液（全章に記載されたように調製したもの）のｐＨは、酵素活性に適当な範囲にすることが必要である。換言すれば、ネイティブ赤血球懸濁液のｐＨは、輸血反応が避けられるように、変換する酵素が抗原を除去するために十分に機能するレベルに調節される。このようなｐＨレベルは、典型的にはある範囲のｐＨ値であり、ここでは“変換ｐＨ”とよぶ。本発明によれば、ネイティブ赤血球懸濁液のｐＨは、適切な緩衝液を用いた滴定調節により変換ｐＨに調製される。ここで使用されている、“滴定調節”および“滴定調節する”という用語は、緩衝液（またはその均等物）の添加を言及し、該緩衝液は変換ｐＨもしくはネイティブ赤血球懸濁液のｐＨと大幅に異なるｐＨを持つ（大幅な相違とは少なくとも１ｐＨ単位の相違を言い、好ましくは２ｐＨ単位以上を言う）。したがって、変換ｐＨを維持している溶液中で繰り返し赤血球を懸濁する従来の方法とは対照的に、本発明の方法は滴定調節する緩衝液の添加によって、ネイティブ赤血球懸濁液のｐＨを変えている。滴定調節する緩衝液の使用により、１ステップまたは数ステップで赤血球のｐＨを変換ｐＨにすることができ、従来技術の方法と比較して、僅かに少量の緩衝液しか必要としない。緩衝液は、懸濁液を連続的に攪拌しながらネイティブ赤血球懸濁液に添加するのが好ましい。これは赤血球の物理学的構造もしくは生理機能を損傷するであろうｐＨ値に赤血球がさらされることを回避するためである。さらに、以下に詳細を記載したように、必要とする緩衝液の量は、あらかじめ確立された滴定曲線を基にして、前もって計算することができ、存在する赤血球の量に応じて調節することができる。例えば、制限する訳ではないが、赤血球変換で使用される酵素がコーヒー豆α −ガラクトシダーゼ（“Ｂ−ｚｙｍｅ”天然物または組換え物）である場合、変換ｐＨは５．４〜５．８（含む）が好ましく、さらに好ましくは５．４〜５．６である。制限する訳ではないが他の例として、赤血球変換で使用される酵素が鶏の肝臓Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（“Ａ−ｚｙｍｅ”天然物または組換え物）である場合、変換ｐＨは５．４〜７．０が好ましく、さらに好ましくは５．８〜６．５である。制限する訳ではないが他の例として、赤血球変換で使用される酵素がフラボバクテリウムケラトリテイクス（Flavobacterium Keratolyticus）から生じるエンド−β−ガラクトシダーゼ（“ＥＮＤＯ−Ａ”天然物または組換え物）である場合、変換ｐＨは５．４〜７．０が好ましく、さらに好ましくは５．８〜６．５である。滴定調節に使用される緩衝液は、緩衝容量の強さ（本来赤血球はｐＨの変化に抵抗性を有する）と、赤血球の生理機能への調和性とを基にして選択される。好ましい緩衝液は、リン酸クエン酸／塩化ナトリウムおよび／またはリン酸／塩化ナトリウムである。他の使用できる緩衝液はグリシン／クエン酸ナトリウムである。酢酸含有緩衝液は使わないのが好ましい。緩衝液のｐＨは、変換ｐＨと少なくとも１単位、好適には２単位以上相違するｐＨ単位であるものを選択することができ、この相違は、ネイティブ赤血球懸濁液のｐＨの望まれる変化と同じ方向である。例えば、ネイティブ赤血球懸濁液のｐＨを７．２から変換ｐＨの５．４−５．６に導くのが望まれる場合、緩衝液は４．５もしくはそれ以下のｐＨを持つのが好ましく、さらに好ましくは３．５未満のｐＨを持つのがよい。例えば、制限する訳ではないが、そのような緩衝液は２．０超のｐＨを持つ。攪拌しながら、緩衝液を添加した後、得られた懸濁液を室温で少なくとも５− １０分間、好ましくは１０−１５分間平衡化する。限定する訳ではないが、本発明の特定例として、ｐＨ２．８のリン酸クエン酸／塩化ナトリウム緩衝液（０．０５１Ｍクエン酸一水和物、０．０１９Ｍリン酸二ナトリウム（無水物）および０．１１０Ｍ塩化ナトリウム）は、室温で少なくとも１０分間、赤血球懸濁液１ｇにつき緩衝液０．５９ｇを攪拌しながら加えることにより、８５−９５％のヘマトクリットを有するネイティブ赤血球懸濁液を、ｐＨ５．４−５．６に滴定調節するために使用され得る。平衡化に続き、得られた赤血球懸濁液のヘマトクリット（変換前赤血球懸濁液とよぶ）は、遠心分離によって上清の量を減少させれば元に戻され得る。５．３．血液型特異的抗原の酵素的分離次に、輸血反応が回避される程度まで血液型特異的抗原の十分量が除去されるように、変換ｐＨで酵素を変換前赤血球懸濁液に添加することができる（ただしすべての輸血反応の発生を絶対的に阻止する必要はない）。例えば、限定する訳ではないが、輸血反応の起こる危険率が少なくとも１０倍減少するか、および／または血液型特異的抗原の酵素的分離の程度が、酵素処理された赤血球を血液型特異的抗原に関する標準凝集アッセイ試験で陰性結果を示す程度であることができる。使用される酵素の濃度、および酵素処理の時間は、変換される赤血球の量、赤血球の濃度、温度、緩衝液系等に基づいて変化するが、いかなるパラメーターの変化であってもそれを補う手段は当業者に知られている。例えば、限定する訳ではないが、本発明の第１の態様において、８５−９５％のヘマトクリットに濃縮され、かつ５．４−５．８の変換ｐＨ、好ましくは５．４−５．６の変換ｐＨで変換前赤血球懸濁液を構成する標準血液単位（ここでは、パックされた赤血球の米国標準単位について言及している）が、Ｂ抗原の除去のためにコーヒー豆α−ガラクトシダーゼにより変換される場合、ｐＨ５．６± ０．０５のリン酸クエン酸−塩化ナトリウム緩衝液（０．０２１Ｍクエン酸一水和物、０．０５８Ｍリン酸二ナトリウム（無水物）および０．０７７Ｍ塩化ナトリウム）の２０−３０ｍｌ中、３２，０００−４５，０００酵素単位、好ましくは４５，０００酵素単位のコーヒー豆α−ガラクトシダーゼ（好ましくは Pichia pastorisで発現させた組み換えコーヒー豆α−ガラクトシダーゼがよい）を赤血球懸濁液に添加することができる。次に酵素／赤血球混合物は４−３７ ℃の温度で、好ましくは２６℃、１−２４時間、好ましくは１３５分間、攪拌しながらインキュベートすることができる。一方、限定する訳ではないが、本発明の第２の特定例において、８５−９５％のヘマトクリットに濃縮され、かつ５．４−５．８の変換ｐＨ、好ましくは５．４−５．６の変換ｐＨで変換前赤血球懸濁液を構成する標準血液単位は、コーヒー豆α−ガラクトシダーゼにより変換されてＢ抗原が除去される。このＢ抗原の除去は、ｐＨ５．６のリン酸クエン酸／塩化ナトリウム緩衝液（０．０２１Ｍクエン酸一水和物、０．０５８Ｍリン酸二ナトリウム（無水物）および０．０７７Ｍ塩化ナトリウム）の８−１５ｍｌ中、１０，０００−３０，０００酵素単位、好ましくは２０，０００酵素単位のコーヒー豆α−ガラクトシダーゼ（好ましくはPichia pastorisで発現させた組み換えコーヒー豆α−ガラクトシダーゼがよい）を赤血球懸濁液に添加し、さらにポリエチレングリコールを約１０−４０％、好ましくは２５−３５％（重量／容量）含有するポリエチレングリコール溶液、もしくは同等の誘導体（約１４５０−６０００ダルトンの平均分子量を持つ）を赤血球懸濁液に添加することによりなされる。なおポリエチレングリコール溶液は得られた酵素／赤血球懸濁液中で約１−６％、好ましくは２−４％のポリエチレングリコール濃度に達しているようにするのがよい。次に酵素／赤血球／ポリエチレングリコール混合物は４−３７℃、好ましくは２６℃で、０．５−１６時間、好ましくは１時間おだやかに攪拌しながらインキュベートすることができる。ポリエチレングリコールもしくはその同等の誘導体の添加は、酵素効率を増加させるので、より短時間でより少ない酵素で所望の量の抗原除去を行うことができる。一つの態様として、酵素をポリエチレングリコール溶液に含有させることができる。限定する訳ではないが、本発明の第３の特定例において、８５−９５％のヘマトクリットに濃縮され、かつ５．４−７．０の変換ｐＨ、好ましくは５．８−６．５の変換ｐＨで変換前赤血球懸濁液を構成する標準血液単位がＡ抗原の除去のために鶏の肝臓Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（好ましくは組み換えられた、Pichia pastorisで発現させた鶏の肝臓Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼがよい）により変換される場合、ｐＨ５．８−６．５のリン酸／塩化ナトリウム緩衝液（０．０９３Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０５０Ｍリン酸二ナトリウム（無水物）である第一溶液のｐＨを、０．１１Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０５０Ｍリン酸一カリウムである第二溶液で調整することにより調製された）の１０−４０ｍｌ中、４０，０００−１６０，０００酵素単位、好ましくは６０，０００−１２０，０００酵素単位の鶏の肝臓Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼを赤血球懸濁液に添加することができる。その酵素／赤血球混合物を４−３７℃ の温度で、好ましくは２６−３７℃、２−２４時間、好ましくは２−５時間おだやかに攪拌しながらインキュベートすることができる。これとは別に、通常の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム、１５０ｍＭ）を前述の緩衝液の代わりに使用してもよい。限定する訳ではないが、先の態様の変更例であり、上記の第２の特定例とほぼ同じである本発明の第４の特定例において、赤血球／酵素混合物は、ポリエチレングリコールもしくはそれと同等の誘導体を１−６％（重量／容量）、好ましくは２−４％（重量／容量）含有することができる。なおこの場合、必要なＮ−アセチルガラクトサミニダーゼの量は３０−５０％減少し、抗原除去のために必要な時間は１０−３０％減少する。限定する訳ではないが、本発明の第５の特定例において、８５−９５％のヘマトクリットに濃縮され、かつ５．４−７．０の変換ｐＨ、好ましくは５．８−６．５の変換ｐＨで変換前赤血球懸濁液を構成する標準血液単位がＡ抗原残基の除去のためにフラボバクテリウムケラトリティクス（Flavobacterium Keratolyt icus）から生じるβ−エンドガラクトシダーゼにより変換される場合、ｐＨ５．８−６．５のリン酸／塩化ナトリウム緩衝液（０．０９３Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０５０Ｍリン酸二ナトリウム（無水物）である第一溶液のｐＨを、０．１１Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０５０Ｍリン一酸カリウムである第二溶液で調整することにより調製された）の０．５−４０ｍｌ中、１０−１２０，０００酵素単位、好ましくは１０，０００−４０，０００酵素単位のβ−エンドガラクトシダーゼを赤血球懸濁液に添加することができる。次にその酵素／赤血球混合物は、４−３７℃の温度で、好ましくは２６−３７℃、２−２４時間、好ましくは２−５時間おだやかに攪拌しながらインキュベートされる。これとは別に、通常の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム、１５０ｍＭ）を前述の緩衝液の代わりに使用することができる。限定する訳ではないが、先の特定例の変更である本発明の第６の特定例において、赤血球／酵素混合液はポリエチレングリコールもしくはその同等の誘導体を１−６％（重量／容量）、好ましくは２−４％（重量／容量）含有することができる。なおこの場合フラボバクテリウムケラトリティクス（Flavobacterium K eratolyticus）β−エンドガラクトシダーゼの量は３０−５０％減少し、抗原除去のために必要な時間は１０−３０％減少する。限定する訳ではないが、本発明の第７の態様において、鶏の肝臓Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびフラボバクテリウムケラトリティクス（Flavobac terium Keratolyticus）β−エンドガラクトシダーゼの組み合わせは、上記の特定例での記載内容と同様の酵素濃度、処理時間等を用いてＡ型赤血球から抗原を除去するために使用され得る。限定する訳ではないが、本発明の第８の態様において、コーヒー豆α−ガラクトシダーゼおよび鶏の肝臓Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよび／またはフラボバクテリウムケラトリティクス（Flavobacterium Keratolyticus）β−エンドガラクトシダーゼの組み合わせは、上記の特定例での記載内容と同様の酵素濃度、処理時間等を用いてＡＢ型赤血球から抗原を除去するために使用され得る。連続酵素処理もしくは先の酵素またはその機能的均等物の任意の同時の組み合わせによる処理も行うことができる。ポリエチレングリコール、その誘導体を利用する様態において、約０．５グラムのデキストランサルフェートを１グラムのポリエチレングリコールのかわりに使用できる。このような方法において酵素に処理された赤血球は、血液型特異的抗原が輸血反応を回避する程度に除去されており、以下“変換された赤血球”とよぶ。５．４．酵素の除去およびｐＨの滴定調節抗原を赤血球から取り除いた後、得られた変換された赤血球は、そのｐＨを生理的レベル（約ｐＨ６．７−７．４）に戻し、かつ該赤血球に結合する酵素を除去するように処理される。この処理は、一連のステップにより達成することができ、その幾つかは変換された赤血球を洗浄することであり、その他は変換された赤血球のｐＨを生理的レベルに滴定調節することである。例えば、洗浄は任意の生理的溶液を用いて行うことができる。ここで、変換された赤血球はまず該溶液に懸濁され、続いて上清を取り除いて、ヘマトクリットが７５−９５％、好ましくは８０−９０％に戻される。該溶液のｐＨは、生理的レベル（約６．７−７．４）であることができる。好適な溶液は、例えば通常の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム、１５０ｍＭ）およびリン酸緩衝液である。洗浄は、任意の遠心分離機ベースの装置、例えば自動化された細胞洗浄機、とくに、制限する訳ではないが、Cobe 2991 Blood Cell Processorが挙げられる。変換後、少なくとも１回、好ましくは２回の洗浄が行われ、さらに好ましくは５回以上の洗浄を行うのがよい。さらに、１回または２回の洗浄の後、変換された赤血球のｐＨは、生理的レベルの６．７−７．４に到達するように滴定調節されるのがよい。滴定調節の方法は、滴定調節に用いられる緩衝液のｐＨを、変換の前になされるｐＨ調節に対し、反対方向にｐＨを変化させておくこと以外は、上記の５．２．章で記載した方法と同じである。緩衝液のｐＨは、好ましくは生理的ｐＨ（６．７−７．４）と少なくとも１ｐＨ単位、好ましくは少なくとも２ｐＨ単位異なるように選択することができる。この相違は、変換された赤血球のｐＨの所望の変化と同じ方向である。例えば、変換された赤血球の懸濁液のｐＨが最初に５．５である場合、滴定調節する緩衝液のｐＨは、好ましくは８以上、さらに好ましくは９以上であるのがよい。例えば、制限する訳ではないが、このような緩衝液のｐＨは、１０未満であるのが好ましい。制限する訳ではないが、一つの特定例において、１４０ｍＭ、ｐＨ９−９．５のリン酸二カリウム緩衝液（２ＮのＮａＯＨでｐＨ調整された、０．１４Ｍのリン酸二カリウム（無水物）である）は、室温で１０分間以上攪拌しながら赤血球懸濁液１ｇにつき該緩衝液１．２５ｇ添加することにより、７５−９５％のヘマトクリットを有する変換された赤血球を、６．４−７．４の生理的ｐＨに滴定調節することができる。平衡化に続き、変換された、ｐＨ調整された赤血球を上記のように再度洗浄することができ、輸血可能な赤血球を調製することができる。これとは別に、輸血可能な赤血球をさらに処理してさらなる抗原または病原体を除去することもできる。６．実施例：Ｂ血液型血球のＨ型（Ｏ型）への変換最初に、Ｂ型赤血球の一つのユニットを遠心分離し、上清の適当量を結晶エクスプレッサーにより取り除き、８５−９５％のヘマトクリットを有するネイティブ赤血球懸濁液を生成した。このネイティブ赤血球懸濁液の重量を測定した。攪拌しながら、ｐＨ２．８のリン酸クエン酸／塩化ナトリウム緩衝液（０．０５１Ｍクエン酸一水和物；０．０１９リン酸ニナトリウム（無水物）および０．１１０Ｍ塩化ナトリウム）をネイティブ赤血球懸濁液１ｇにつき０．５９ｇ加え、得られた懸濁液を室温で１０分間平衡化させ、５．４−５．６のｐＨを有する赤血球懸濁液を生成した。続いて、この懸濁液を再度遠心分離し、上清の適当量を取り除き、ヘマトクリットを８５−９０％にした。次に、組み換えコーヒー豆α−ガラクトシダーゼ４５，０００単位をｐＨ５．６±０．５のリン酸クエン酸／塩化ナトリウム緩衝液（０．０２１Ｍクエン酸一水和物；０．０５８リン酸二ナトリウム（無水物）および０．０７７Ｍ塩化ナトリウム）２０−３０ｍｌに加えた。標準的な血液バッグにおける滅菌条件下、反応を行った。赤血球／酵素懸濁液を振とう式インキュベーターで攪拌しながら２６℃で１３５分間インキュベートした。続いて、赤血球／酵素懸濁液を含む血液バッグをCobe 2991 Cell Processorのプロセスセットに取り付け、変換された赤血球を通常の生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム、１５０ｍＭ）で２回洗浄した。２回洗浄後に得られた赤血球懸濁液（７５−８５％のヘマトクリット）に、該懸濁液１ｇにつきｐＨ８．８−９．２のリン酸二カリウム０．７５−１．２５ｇ（１４０ｍＭ）を加えた。得られた懸濁液を室温で少なくとも１０分間平衡化した。次に、赤血球を通常の生理食塩水で４回以上洗浄し、輸血可能な赤血球を生成した。抗Ｂ血球凝集試験（Walker編集、1990、Technical Manual.、１０版、アーリントン、米国血液バンク協会、５３９頁）によるin vitroでの研究では、表１に示すように、この得られた輸血可能な赤血球にＢ抗原が存在しないことか分かり、通常の浸透圧脆弱性パターンを示し、また通常のメンブランおよび代謝的完全製が維持されていた。表１Ｂ型赤血球１ｍｌのＢ抗原活性の減少速度 B-zyme200単位 B-zyme85単位およびPEG で処理したものまたは誘導体で処理したものインキュベート時間 30 60 90 135 30 60 90 （分）抗−Ｂ血球凝集 11 8 4 0 8 0 0 スコア酵素的に処理された細胞と、適切なコントロールの脆弱性の試験結果を図２Ａ −Ｂに示す。この図によれば、処理条件は、浸透圧ショックに対してこれらの細胞の感受性はそれほど増加していないことを示している（すなわち５０％の溶血値が、未処理の細胞と処理細胞とで同じである）。細胞膜および代謝の試験では、酵素処理後でも変換された細胞のＡＴＰ含量が本質的に変化せず、２−３−ジホスホグリセレート（２，３−ＤＰＧ）レベルが８０％超残り、かつメトヘモグロビンが１．５％未満であることを示した。このことは、赤血球細胞の形状維持と、通常の酸素−結合および交換とを示している。さらに、このプロトコルは、従来の方法に比べて洗浄量をおよそ半分にし、緩衝液量を２０％にし、かつ約２５％短い時間を達成することができる。７．実施例：ポリエチレングリコールを用いる変換酵素変換ステップのときにポリエチレングリコールを存在させることを除いて上記の手順を繰り返したとき、少ない酵素量および短い時間で満足なＢ抗原の除去が達成されることが見い出された。詳細には、酵素変換のときに、ｐＨ５．６のリン酸クエン酸／塩化ナトリウム緩衝液（０．０２１Ｍクエン酸一水和物；０．０５８リン酸ニナトリウム（無水物）および０．０７７Ｍ塩化ナトリウム）１０−１５ｍｌ中の組み換えコーヒー豆α−ガラクトシダーゼ２０，０００単位と、ｐＨ５．６のリン酸クエン酸／塩化ナトリウム緩衝液中の３０重量／容量％溶液としてのポリエチレングリコール（平均分子量１４５０−６０００ダルトン）とを、ｐＨ５．４−５．６で赤血球懸濁液に加えた（ポリエチレングリコールは、最終濃度２−４％（重量／容量）となるように加えた）。次に得られた混合物を上記の章に記載したように２６℃で６０分間インキュベートし、洗浄し、ｐＨを調節した。得られた変換された赤血球は、６０分以下の標準血球凝集試験で陰性であった（先の表１参照）。様々な刊行物を本明細書に引用しているが、そのすべての内容を参考として導入するものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハースト、ローザアメリカ合衆国、ニューヨーク州、スタテン・アイランド、デヴォン・プレイス 21

Claims

【特許請求の範囲】１．血液型特異的抗原を赤血球から酵素的に除去する方法であって、（ａ）ネイティブ赤血球懸濁液のｐＨを、変換酵素の活性に適切な変換ｐＨに滴定調節し、ここで前記滴定調節は、前記変換ｐＨよりも少なくとも１単位低いｐＨを有する緩衝液を加えることによってなされ；（ｂ）前記赤血球から血液型特異的抗原を除去するに有効な量の変換酵素を加え；（ｃ）前記変換酵素を含む赤血球懸濁液を、前記赤血球から血液型特異的抗原を除去するに十分な温度および時間でもってインキュベートし、これにより変換された赤血球懸濁液を形成させ；（ｄ）前記変換された赤血球懸濁液のｐＨを、ｐＨ８−１０の緩衝液を加えることにより生理的ｐＨに滴定調節し；および（ｅ）前記赤血球を洗浄して変換酵素を除去する；各ステップを連続的に含む、方法。２．変換酵素が、コーヒー豆α−ガラクトシダーゼである請求の範囲第１項に記載の方法。３．変換ｐＨが５．４−５．８である請求の範囲第２項に記載の方法。４．ステップ（ａ）に使用される緩衝液が３．５未満のｐＨを有する請求の範囲第３項に記載の方法。５．ステップ（ｂ）において、ポリエチレングリコールを添加することをさらに含む請求の範囲第２項に記載の方法。６．ステップ（ｂ）において、ポリエチレングリコールを添加することをさらに含む請求の範囲第３項に記載の方法。７．ステップ（ｂ）において、ポリエチレングリコールを添加することをさらに含む請求の範囲第４項に記載の方法。８．変換酵素が、鶏肝臓Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼである請求の範囲第１項に記載の方法。９．変換ｐＨが５．４−７．０である請求の範囲第８項に記載の方法。１０．ステップ（ａ）に使用される緩衝液が３．５未満のｐＨを有する請求の範囲第９項に記載の方法。１１．ステップ（ｂ）において、ポリエチレングリコールを添加することをさらに含む請求の範囲第８項に記載の方法。１２．ステップ（ｂ）において、ポリエチレングリコールを添加することをさらに含む請求の範囲第９項に記載の方法。１３．ステップ（ｂ）において、ポリエチレングリコールを添加することをさらに含む請求の範囲第１０項に記載の方法。１４．変換酵素が、Flavobacterium keratolyticusのエンドβ−ガラクトシダーゼである請求の範囲第１項に記載の方法。１５．変換ｐＨが５．４−７．０である請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．ステップ（ａ）に使用される緩衝液が３．５未満のｐＨを有する請求の範囲第１５項に記載の方法。１７．ステップ（ｂ）において、ポリエチレングリコールを添加することをさらに含む請求の範囲第１４項に記載の方法。１８．ステップ（ｂ）において、ポリエチレングリコールを添加することをさらに含む請求の範囲第１５項に記載の方法。１９．ステップ（ｂ）において、ポリエチレングリコールを添加することをさらに含む請求の範囲第１６項に記載の方法。