CN102527341B - 一种用于血液净化的免疫吸附剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于血液净化的免疫吸附剂及其制备方法。其中，一种用于血液净化的免疫吸附剂包括作为吸附剂基质的高分子载体和利用化学交联固定在所述载体表面的配基，其中所述配基至少包括色氨酸配基和苯丙氨酸配基，所述色氨酸配基与所述苯丙氨酸配基的摩尔比为1∶0.1～1∶1。对IgG类致病因子、免疫复合物及群体反应性抗体(PRA)均具有良好的清除效果。

Description

一种用于血液净化的免疫吸附剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于血液净化的免疫吸附剂及其制备方法，特别是可用于血液灌流的免疫吸附剂及其制备方法。

背景技术

免疫吸附疗法是近年来发展起来的一种新的血液净化方法，它通过体外循环，利用抗原-抗体免疫反应或物理化学作用除去血浆中的致病性自身抗体或免疫复合物等致病因子，从而达到治病或减轻症状的目的。自身免疫系统疾病、器官移植排异以及各种高血脂患者均可以采用免疫吸附疗法。

用于血液净化的吸附剂一般由两部分组成：作为吸附剂基质的高分子载体材料和利用化学交联固定在载体表面的配基，其中配基的结构和性质决定了吸附剂的作用效果。目前，临床中主要采用的两种用于抗体吸附的血液净化吸附剂分别以蛋白A和疏水氨基酸作为配基分子。蛋白A可以跟人免疫球蛋白G(以下简称“IgG”)的Fc区域特异结合，因此具有选择性好、吸附容量高的优点。但是蛋白A作为一种有生物活性的蛋白质，也存在价格昂贵、配基的稳定性差、配基脱落容易造成免疫性反应等缺点。疏水性氨基酸分子可以通过疏水作用和电荷诱导作用达到对致病性抗体和循环免疫复合物(以下简称“IC”)的吸附作用，因此，采用疏水性氨基酸作为配基分子，以此替代蛋白A，成为发展新一代免疫性吸附剂的主要方向。但是对于不同的氨基酸配基，在吸附性能上均存在一定局限性。例如，以色氨酸为配基的吸附剂对重症肌无力患者体内的抗乙酰胆碱抗体具有特异性吸附能力，对IgG类抗体也有较好吸附能力，但对IC的吸附能力较低；而以苯丙氨酸为配基的吸附剂虽然对IgG吸附效果较差，但对IC具有很高的吸附性能。也正是由于单一氨基酸配基分子的这种局限性，导致其产品相比蛋白A类产品的适应症种类较少，对许多自身免疫性疾病的治疗效果也不是很理想。

此外，目前的免疫吸附疗法主要采用的是血浆吸附柱，临床治疗时需要先对患者进行血浆分离，而血浆分离装置为一大型设备，血浆分离自身也存在血液相容性等问题。近年来新兴一种全血灌流的治疗方法，不需要血浆分离器，依靠吸附剂直接吸附除去血液中的有毒成份或致病物质，达到净化血液、缓解和治疗疾病的目的，不仅在治疗时减少了对血液系统的破坏，同时还降低了治疗成本。但目前用于免疫吸附疗法的吸附剂基本都是用于血浆吸附柱的，还没有特别针对用于全血灌流的免疫吸附剂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于血液净化的免疫吸附剂，其不但对IgG具有良好的吸附性能，同时对IC也具有良好吸附性能，因此适就症更广。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种用于血液净化的免疫吸附剂，包括作为吸附剂基质的高分子载体和利用化学交联固定在所述载体表面的配基，其中所述配基至少包括色氨酸配基和苯丙氨酸配基，所述色氨酸配基与所述苯丙氨酸配基的摩尔比为1∶0.1～1∶1。

上述用于血液净化的免疫吸附剂的载体上固载混合氨基酸为配基，其中一种是对IgG类致病因子具有良好吸附性能的色氨酸，另一种是对IC类致病因子具有良好吸附性能的苯丙氨酸，从而克服单一氨基酸配基吸附剂的局限性，进一步提高自身免疫性疾病患者血液中IgG类致病因子及其免疫复合物的清除效果。另外，在器官移植领域中，移植手术前、手术后患者体内的群体反应性抗体(PRA)水平的高低会直接影响着患者手术的成功率和术后器官的存活率。群体反应性抗体(PRA)高的高敏患者进行器官移植，术中及术后容易发生超急性或急排斥反应，导致移植物功能丧失，甚至危及患者生命。导致PRA水平升高的主要是人类白细胞抗原(HLA)I类及II类IgG抗体，患者体内相关的循环免疫复合物的含量也影响着PRA水平。因此本发明的免疫吸附剂在吸附IgG类抗体、清除免疫复合物的同时，还可有效降低高致敏器官移植患者的PRA水平。因此，本发明免疫吸附剂适应症广泛，既可以应用于包括重症肌无力、格林巴利综合症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病，也可以应用于高致敏器官移植患者、器官移植后排除反应患者等器官移植领域。

本发明要解决的另一技术问题为提供一种制备上述用于血液净化的免疫吸附剂的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：制备用于血液净化的免疫吸附剂方法，所述用于血液净化的免疫吸附剂包括作为吸附剂基质的高分子载体和利用化学交联固定在载体表面的配基，其中配基至少包括色氨酸配基和苯丙氨酸配基，色氨酸配基与苯丙氨酸配基的摩尔比为1∶0.1～1∶1，方法包括以下步骤：

步骤A：在浓度为0.05-0.5M、pH值为10-12的磷酸钠缓冲溶液中，投入色氨酸和苯丙氨基酸，配制成混合氨基酸的总质量分数为1.2-5.6％的混合氨基酸的磷酸钠缓冲溶液，其中所述色氨酸与所述苯丙氨酸的摩尔比为1∶0.1～1∶1；

步骤B：将环氧活化后的载体投入到由步骤A获得的所述混合氨基酸溶液中，将反应温度升至40-60℃，反应12-24h，然后洗涤，除去未反应的氨基酸；

步骤C：在浓度为0.5-2M的乙醇胺水溶液中，投入由步骤B所获得的带混合氨基酸配基的吸附剂，其中吸附剂与乙醇胺溶液的体积比为0.2-1，在30-45℃温度下反应2-4h以对吸附剂进行封端，然后将经过封端后的吸附剂洗涤干净后，即得到用于血液净化的免疫吸附剂。

为解决上述技术问题，本发明提供的另一技术方案为：制备用于血液净化的免疫吸附剂方法，所述用于血液净化的免疫吸附剂包括作为吸附剂基质的高分子载体和利用化学交联固定在载体表面的配基，其中配基至少包括色氨酸配基和苯丙氨酸配基，色氨酸配基与苯丙氨酸配基的摩尔比为1∶0.1～1∶1，方法包括以下步骤：

步骤A：在浓度为0.05-0.5M、pH值为10-12的磷酸钠缓冲溶液中加入色氨酸，配制成质量分数为1.2-2.8％的色氨酸的磷酸钠缓冲溶液，将环氧活化后载体投入到色氨酸的磷酸钠缓冲溶液中，将反应温度升至40-60℃，反应12-24h，在载体上固载色氨酸配基，色氨酸固载反应完成后，洗涤除去未反应的色氨酸；

步骤B：在浓度为0.05-0.5M、pH值为10-12的磷酸钠缓冲溶液中加入苯丙氨酸，配制成质量分数为1.2-2.8％的苯丙氨酸的磷酸钠缓冲溶液，将从步骤A所获得的、已经固载有色氨酸配基的吸附剂投入到苯丙氨酸的磷酸钠缓冲溶液中，在40-60℃下反应2-24h，反应结束后，洗涤除去未反应的氨基酸，此时氨酸已经固载在载体上，而且载体还带有未反应的环氧活性基团；

步骤C：在浓度为0.5-2M的乙醇胺水溶液中，投入步骤B所获得的带混合氨基酸配基的吸附剂，其中吸附剂与乙醇胺溶液的体积比0.2-1，反应温度为30-45℃反应2-4h以对吸附剂封端，然后将经过封端后的吸附剂洗涤干净，即得到用于血液净化的免疫吸附剂。

在上述的方法中，洗涤除去未反应的氨基酸时可以采用浓度为0.05-0.5M，pH值为10-12的磷酸钠缓冲溶液进行洗涤。在对封端后的吸附剂进行洗涤时可以采用大量的纯净水进行冲洗。

本发明中，色氨酸可以选自L-色氨酸、D-色氨酸或它们的外消旋体。苯丙氨酸可以是L-苯丙氨酸。

本发明免疫吸附剂所用载体优选那些可以耐受全血灌流时所产生的压力、具有良好亲水性并具有良好的血液相容性的载体材料，更优选的，本发明免疫吸附剂所用载体为自身带有羟基的亲水性载体，可以举出的具体的例子包括：多糖材料，例如琼脂糖、纤维素、壳聚糖等，亲水性的合成材料，例如聚乙烯醇等。载体上带有羟基一方面可以提供载体的亲水性，提高材料的生物相容性，另一方面羟基还可以提供活化反应位点。

再优选的，本发明所用载体为球形载体，其粒径在100μm～800μm之间，排阻分子量在15,000～5,000,000之间，这样的载体具有足够的通透性和结构稳定性，具有足够的强度，可以耐受较大的压力。

相比血浆吸附剂，全血吸附剂要求更高，不仅要求吸附剂具有更好的血液相容性，还要求吸附剂载体具有更高的强度。而选择上述的载体材料的免疫吸附剂可以直接应用于全血灌流。

本发明所用的载体可以通过在市场上购买，也可以自行合成获得。现有技术中，制备吸附剂载体的方法已有很多，为简洁起见，不再赘述。优选的，可以通过以下几种方法制备：

一、高强度琼脂糖载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤a：琼脂糖凝胶球的制备：

将配制好的质量分数为2-10％的琼脂溶液缓慢倾入含有0.1-3％聚山梨酯-80(吐温-80)的甲苯和三氯甲烷混合液的三口瓶中，其中三口瓶置于40-60℃水浴中，甲苯和三氯甲烷的体积比为0.5-5；调节搅拌速度，使琼脂溶液在有机相中分散成大小适宜的液滴。待琼脂液滴冷却成凝胶球后，过筛并用大量水冲洗。

步骤b：琼脂糖凝胶球的交联

将步骤a所得的琼脂凝胶球，加入到浓度为0.5-2.5M的NaOH水溶液中，NaOH水溶液和凝胶球体积比为0.5-5，加入体积为琼脂糖凝胶球体积0.1-1倍的环氧氯丙烷，在25-50℃的条件下反应0.5-2h，反应完成后用水冲洗至中性。

步骤c：琼脂糖凝胶球的二次交联

将步骤b制得的琼脂凝胶球按步骤b的方法再进行二次交联，二次交联反应完成后，将琼脂糖凝胶球用水冲洗至中性，获得高强度琼脂糖载体。

二、纤维素凝胶球载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤a：以二醋酸纤维或三醋酸纤维素为原料，以二氯甲烷为溶剂，配制成质量分数为4-15％的溶液。

步骤b：向步骤一制得的溶液中加入邻苯二甲酸二甲酯和正十二醇作为致孔剂，其中邻苯二甲酸二甲酯和正十二醇体积比为0.1-1，致孔剂体积与二氯甲烷体积之比为0.1-1.1。

步骤c：将步骤b所获得的纤维素溶液加入到质量分数为1.5-5％的明胶水溶液中，搅拌分散成球后，加热至40-50℃，待二氯甲烷挥发干净后，将所得纤维素球过筛，然后用大量水冲洗，洗至纤维素球无明显溶剂残留气味。

步骤d：将步骤c所得纤维素球置于2M NaOH水溶液中于30-50℃下皂化反应4-12h，其中NaOH水溶液和凝胶球体积比为0.5-5。反应后用大量水将纤维素载体洗至中性。

三、交联聚乙烯醇载体的制备方法，包括以下步骤：

将乙酸乙烯酯、异氰酸三烯丙基酯、乙酸丁酯、正庚烷和AIBN(偶氮二异丁腈)的混合液悬浮于含有0.5-3％PVA(聚乙烯醇)和1-3％氯化钠的水相中。在一定的搅拌速度下，在氮气氛中55-65℃聚合12-24h，之后再在70-80℃聚合5-10h。将所得树脂用先用热水洗涤，再用丙酮提取净化。将所得的聚乙酸乙烯酯微球于含3-5％NaOH的甲醇溶液中，进行醇解反应。最后将所得的交联聚乙烯醇微球用大量水冲洗。

通过上述三种方法制备的载体为硬质球形载体，如图1所示，经测试，载体球在流速-压降测试中线性关系至少达到30KPa。

本发明所述的混合氨基酸配基可以由亲水性载体上键连的环氧基团与氨基酸上的伯氨基直接反应形成。其中，环氧基团是通过对载体进行环氧活化而获得，即是由亲水性载体上的羟基与双官能团的环氧化合物反应形成，其中双官能团的环氧化合物可以选择环氧氯丙烷、环氧溴丙烷、乙二醇二缩水甘油醚或丁二醇二缩水甘油醚等。现有技术中，对载体进行环氧活化的方法很多，如专利CN03130403.6中采用环氧氯丙烷活化球形载体，为节省起见，不再赘述。

通过本发明上述方法制备的免疫吸附剂可以有效地清除多种自身免疫性疾病患者血液中的IgG类致病性抗体及其免疫复合物，而对血液中其他有益成分无明显损害作用，还可有效降低高致敏器官移植患者体内PRA水平，提高患者器官移植手术的成功率和移植体的存活率。通过本发明上述方法制备的免疫吸附剂还可以直接用于体外全血灌流治疗，区别于现有市场产品，降低了治疗风险和治疗成本。

附图说明

图1：三种类型载体的流速-压降关系曲线。

以下结合附图和具体实施方式对本发明予以详细说明。

具体实施方式

实施例1

以高强度琼脂糖为载体，固载由色氨酸和苯丙氨基酸组成的混合氨基酸配基的血液净化用免疫吸附剂，其制备方法包括以下步骤：

步骤1：高强度琼脂糖载体的制备

步骤1-a：琼脂糖凝胶球的制备

将装有搅拌装置的500mL三口瓶置于60℃水浴中，向瓶内加入甲苯145mL、三氯甲烷55mL、吐温-805mL。搅拌均匀并保温。将100mL配制好的质量分数为4％的琼脂溶液缓慢倾入三口瓶中，调节搅拌速度，使琼脂溶液在有机相中分散成大小适宜的液滴。待分散均匀后(约30min)撤去水浴，在室温下搅拌使体系自然冷却。体系冷却后，弃去上层有机溶剂，用大量水冲洗合成的球状琼脂凝胶载体，筛选出40～50目凝胶球，用蒸馏水洗涤数次，于4℃冰箱中湿态保存。

步骤1-b：琼脂糖凝胶球的交联：

在装有搅拌装置的500mL三口瓶中，依次投入上述琼脂凝胶球100mL，1.5M的NaOH溶液200mL，环氧氯丙烷10mL，轻微搅拌并于40℃反应30分钟。反应完成后，将交联后琼脂糖微球滤出，并用大量水冲洗至中性。然后将一次交联后的琼脂糖微球按上述交联条件再进行第二次交联，经过两次交联后，琼脂糖载体强度大幅提高，既获得高强度琼脂糖载体。

步骤2：高强度琼脂糖载体的环氧氯丙烷活化

取高强度琼脂糖载体20mL，依次加入20mL二甲基亚砜、15mL的环氧氯丙烷和20mL 2M的NaOH溶液，并在40℃反应2h，用水冲洗至中性，并洗净未反应的二甲基亚砜和环氧氯丙烷，即得到环氧氯丙烷活化的琼脂糖微球，采用硫代硫酸钠钠法滴定环氧密度值，活化密度在80-120μmol/mL之间为宜。

步骤3：混合氨基酸配基固载

步骤3-a：在40mL浓度为0.2M、pH值为11的磷酸钠缓冲溶液中，依次投入色氨酸0.6g、苯丙氨基酸0.12g，搅拌溶解获得混合氨基酸的磷酸钠缓冲溶液；

步骤3-b：向步骤3-a的混合氨基酸的磷酸钠缓冲溶液中投入20mL环氧活化琼脂糖微球，于40℃下反应15h，反应结束后用pH值为11的磷酸钠缓冲溶液冲洗若干次，将未反应的氨基酸冲洗干净并收集冲洗液。用紫外分光光度计测试氨基酸溶液中色氨酸(280nm处吸光度)和苯丙氨酸(257nm处吸光度)的含量，并根据混合氨基酸混合溶液在反应前后两种氨基酸含量的变化计算出吸附剂上氨基酸的固载量。该吸附剂上色氨酸固载量为53.6μmol/mL，苯丙氨酸固载量为11.8μmol/mL。

步骤4：封端

上述反应获得的混合氨基酸配基吸附剂中仍有大量未反应的环氧基团。取20mL上述混合氨基酸配基吸附剂，投入40mL 1M的乙醇胺溶液中，于37℃下反应4h以对吸附剂上残留的环氧基团进行封端开环反应，反应后用大量纯化水冲洗吸附剂。

实施例2：

本实施例的制备方法与实施例1基本相同，不同之处仅在于步骤3混合氨基酸配基的固载过程不同。由于本实施例中高强度琼脂糖载体的制备、环氧氯丙烷活化、封端等分别与实施例1中步骤1、2、4的操作过程一致，为节省起见，此处不再重复，下面主要介绍步骤3-混合氨基配基固载过程。

步骤3：混合氨基酸配基固载

步骤3-a、在40mL浓度为0.2M、pH值为11的磷酸钠缓冲溶液中，加入色氨酸0.6g，配制成色氨酸溶液，投入20mL由步骤c获得的环氧活化琼脂糖微球，于40℃下反应15h，反应结束后用pH值为11的磷酸钠缓冲溶液冲洗若干次，将未反应的色氨酸冲洗干净并收集冲洗液。

步骤3-b：用浓度为0.2M、pH值为11的磷酸钠缓冲溶液配制40mL质量分数为2.5％的苯丙氨酸的磷酸钠缓冲溶液，将步骤3-a获得的已经固载色氨酸的吸附剂投入苯丙氨酸的磷酸钠缓冲溶液中，在40℃下反应8h，反应结束后用pH值为11的磷酸钠缓冲溶液冲洗若干次，将未反应的苯丙氨酸冲洗干净并收集冲洗液。

用紫外分光光度计分别测试色氨酸溶液(280nm处吸光度)和苯丙氨酸溶液(257nm处吸光度)的含量，并根据两种氨基酸溶液在反应前后含量的变化计算出吸附剂上两种氨基酸的固载量。通过计算，本实施例制得的吸附剂上色氨酸固载量为57.2μmol/mL，苯丙氨酸固载量为13.6μmol/mL。

实施例3

以二醋酸纤维素为载体的混合氨基酸配基吸附剂

步骤1：二醋酸纤维素载体的制备

步骤1-a：二醋酸纤维素凝胶球的制备

在装有搅拌装置的500mL三口瓶中，投入二醋酸纤维素9.5g、二氯甲烷100mL，搅拌溶解后，再依次加入邻苯二甲酸二甲酯25mL和正十二醇25mL作为致孔剂。在另一个装有搅拌装置的1L三口瓶中，先加入500mL5％的明胶水溶液，并调整一定的搅拌速度。将上述配制好的二醋酸纤维素溶液缓慢倾入明胶溶液中，待油相在水相中分散稳定后，保持搅拌速度不变，往三口瓶中充入氮气，并加热至45℃，待二氯甲烷挥发干净后，将所得纤维素球过筛、收集40～50目的凝胶球，依次用丙酮抽提及大量水冲洗。

步骤1-b：二醋酸纤维素凝胶球的皂化

取50mL上述纤维素凝胶球，置于100mL 2M NaOH溶液中，搅拌下于40℃下皂化反应8h。反应完成后所得纤维素载体用大量水冲洗至中性。

步骤2：环氧氯丙烷活化

二醋酸纤维素凝胶球的环氧氯丙烷活化过程中，除用二醋酸纤维素凝胶球替代实施例1中的琼脂糖载体外，其余一切操作均与实施例1的步骤2相同。所得环氧氯丙烷活化后二醋酸纤维素载体的活化密度为89.8μmol/mL

步骤3：混合氨基酸配基固载

二醋酸纤维素载体的混合氨基酸配基固载过程，除用二醋酸纤维素载体替代实施例1中的琼脂糖载体外，其余一切操作均与实施例1的步骤3相同。所得二醋酸纤维素混合氨基酸吸附剂中，色氨酸固载量为43.3μmol/mL，苯丙氨酸固载量为9.7μmol/mL。

步骤4：封端

二醋酸纤维素混合氨基酸吸附剂的封端过程与实施例1步骤d的操作过程基本相同，不同之处仅在于本实施例中的吸附剂是以二醋酸纤维素为载体。

实施例4

以交联聚乙烯醇为载体的混合氨基酸配基吸附剂

步骤1：交联聚乙烯醇载体的制备

步骤1-a：聚乙酸乙烯酯微球的制备

在装有搅拌装置的1L三口瓶中，先在反应瓶中通入氮气，并使整个反应过程处在氮气气氛保护下。先往三口瓶中加入400mL含1％聚乙烯醇和3％溶液氯化钠的水溶液，再依次加入乙酸乙烯酯100g、异氰酸三烯丙基酯24.1g、乙酸丁酯75mL、正庚烷75mL和AIBN 3.1g。在一定的搅拌速度下，先于60℃聚合反应18h，之后再在75℃反应8h。将所得交联聚乙酸乙烯酯微球用先用热水洗涤，再用丙酮提取净化。

步骤1-b：交联聚乙烯醇微球的制备

取上述交联聚乙酸乙烯酯微球100mL加入到500mL5％NaOH的甲醇溶液中，将所得的交联聚乙酸乙烯酯微球于含5％NaOH的甲醇溶液中，于40℃醇解18h，即获得交联聚乙烯醇微球。最后将所得的交联聚乙烯醇微球用大量水冲洗干净。

步骤2：交联聚乙烯醇微球的环氧氯丙烷活化

环氧氯丙烷活化过程与实施例1一致，所得环氧氯丙烷活化后交联聚乙烯醇载体的活化密度为107.6μmol/mL

步骤3：混合氨基酸配基固载

交联聚乙烯醇载体的混合氨基酸配基固载过程如实施例1中的步骤3基本相同，不同之处仅是以本实施例步骤2的环氧氯丙烷活化后交联聚乙烯醇载体替代实施例1步骤2中的环氧氯丙烷活化后的琼脂糖载体。

本实施例所制备的以交联聚乙烯醇为载体，含有混合氨基酸配基的血液净化用的免疫吸附剂中，色氨酸固载量为49.1μmol/mL，苯丙氨酸固载量为10.3μmol/mL。

步骤4：封端

交联聚乙烯醇混合氨基酸吸附剂的封端过程如实施例1的步骤4基本相同，不同之处仅在于以本实施例制备的吸附剂替代实施例1的吸附剂。

对比例1：

对比实施例1以高强度琼脂糖为载体，仅固载色氨酸为配基。高强度琼脂糖载体的制备、环氧氯丙烷活化等均同实施例1相同。色氨酸配基固载具体操作如下：在40m L浓度为0.2M、pH值为11的磷酸钠缓冲溶液中，加入色氨酸0.75g，配制成色氨酸溶液，投入20mL环氧活化琼脂糖微球，于40℃下反应15h，反应结束后用pH值为11的磷酸钠缓冲溶液冲洗若干次，将未反应的色氨酸冲洗干净并收集冲洗液。所得色氨酸吸附剂的色氨酸固载量为63.26μmol/mL。色氨酸吸附剂封端操作与实施例1相同。

对比例2：

对比例2仅固载苯丙氨酸为配基。高强度琼脂糖载体的制备、环氧氯丙烷活化等均同实施例1相同。苯丙氨酸配基固载具体操作如下：在40mL浓度为0.2M、pH值为11的磷酸钠缓冲溶液中，加入苯丙氨酸0.8g，配制成苯丙氨酸溶液，投入20mL环氧活化琼脂糖微球，于40℃下反应15h，反应结束后用pH值为11的磷酸钠缓冲溶液冲洗若干次，将未反应的苯丙氨酸冲洗干净并收集冲洗液。所得苯丙氨酸吸附剂的苯丙氨酸固载量为61.86μmol/mL。苯丙氨酸吸附剂封端操作与实施例1相同。

吸附性能测试：

一、采用体外静态吸附方法来测试实施例1-3及对比例1-2的吸附剂对人免疫球蛋白IgG的吸附性能。

分别取1mL实施例1-3及对比例1-2的吸附剂、5mL血浆，于37℃下震荡两小时后进行测试。IgG的检测采用免疫比浊法，使用罗氏全自动生化分析仪、免疫球蛋白IgG检测试剂盒，操作方法按试剂盒说明书进行。具体结果见表1。

表1对人免疫球蛋白IgG吸附性能

从表一的测试结果可以看出，本发明用于血液净化的免疫吸附剂对免疫球蛋白IgG具有优秀吸附性能，整体固载量较高的实施例1和实施例2具有更好的吸附性能；由于色氨酸具有更好的IgG吸附能力，因此跟对比例1相比，吸附性能保持在同一水平；跟对比例2相比，本发明的免疫吸附剂具有更好的IgG吸附能力。

二、采用体外静态吸附方法测试实施例1-3及对比例1-2的吸附剂对循环免疫复合物(IC)的吸附性能。

分别取1mL吸附剂、5mL血浆，于37℃下震荡两小时，然后测试。使用人循环免疫复合物(CIC)酶联免疫分析试剂盒检测IC，其操作过程按试剂盒说明书进行。

表2对循环免疫复合物(IC)的吸附性能

三、采用体外静态吸附方法来测试实施例1-3及对比例1-2各吸附剂对高致敏肾移植患者血浆内群体反应性抗体(PRA)的吸附性能。

分别取1mL吸附剂、5mL高致敏肾移植患者血浆，于37℃下震荡两小时后进行测试。PRA水平检测采用美国莱姆德公司的莱姆德混合抗原板(LATM)，其具体操作按试剂盒说明书进行。

表3各吸附剂对群体反应性抗体(PRA)的吸附性能

从表一、表二可以看出，本发明用于血液净化的免疫吸附剂相比于固载单一氨基酸配基的吸附剂，对人免疫球蛋白IgG和循环免疫复合物(IC)均具有良好的吸附能力。

从表三可以看出，本发明用于血液净化的免疫吸附剂相比于固载单一氨基酸配基的吸附剂，在对群体反应性抗体(PRA)的吸附能力上优异很多。

本发明的技术构思并不仅限于上述实施例，还可以依据本实用新型的构思得到许多不同的具体方案，此等微小改变以及等效变换均应包含在权利要求所述范围之内。

Claims (5)

1.制备用于器官移植领域血液净化的免疫吸附剂方法，所述用于血液净化的免疫吸附剂包括作为吸附剂基质的高分子载体和利用化学交联固定在载体表面的配基，其中配基至少包括色氨酸配基和苯丙氨酸配基，色氨酸配基与苯丙氨酸配基的摩尔比为1:0.1～1:1，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

步骤A：在浓度为0.05-0.5M、pH值为10-12的磷酸钠缓冲溶液中，投入色氨酸和苯丙氨基酸，配制成混合氨基酸的总质量分数为1.2-5.6％的混合氨基酸的磷酸钠缓冲溶液，其中所述色氨酸与所述苯丙氨酸的摩尔比为1:0.1～1:1；

步骤B：将环氧活化后的载体投入到由步骤A获得的所述混合氨基酸溶液中，将反应温度升至40-60℃，反应12-24h，然后洗涤，除去未反应的氨基酸；

步骤C：在浓度为0.5-2M的乙醇胺水溶液中，投入由步骤B所获得的带混合氨基酸配基的吸附剂，其中吸附剂与乙醇胺溶液的体积比为0.2-1，在30-45℃温度下反应2-4h以对吸附剂上残留的环氧基团进行封端，然后将经过封端后的吸附剂洗涤干净，即得到用于血液净化的免疫吸附剂；

其中，所述载体为高强度琼脂糖载体，所述高强度琼脂糖载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤a：琼脂糖凝胶球的制备：

将配制好的质量分数为2-10％的琼脂溶液缓慢倾入含有0.1-3％聚山梨酯-80(吐温-80)的甲苯和三氯甲烷混合液的三口瓶中，其中三口瓶置于40-60℃水浴中，甲苯和三氯甲烷的体积比为0.5-5；调节搅拌速度，使琼脂溶液在有机相中分散成大小适宜的液滴，待琼脂液滴冷却成凝胶球后，过筛并用大量水冲洗；

步骤b：琼脂糖凝胶球的交联

将步骤a所得的琼脂凝胶球，加入到浓度为0.5-2.5M的NaOH水溶液中，NaOH水溶液和凝胶球体积比为0.5-5，加入体积为琼脂糖凝胶球体积0.1-1倍的环氧氯丙烷，在25-50℃的条件下反应0.5-2h，反应完成后用水冲洗至中性；

步骤c：琼脂糖凝胶球的二次交联

将步骤b制得的琼脂凝胶球按步骤b的方法再进行二次交联，二次交联反应完成后，将琼脂糖凝胶球用水冲洗至中性，获得高强度琼脂糖载体。

2.制备用于器官移植领域血液净化的免疫吸附剂方法，所述用于血液净化的免疫吸附剂包括作为吸附剂基质的高分子载体和利用化学交联固定在载体表面的配基，其中配基至少包括色氨酸配基和苯丙氨酸配基，色氨酸配基与苯丙氨酸配基的摩尔比为1:0.1～1:1，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

步骤A：在浓度为0.05-0.5M、pH值为10-12的磷酸钠缓冲溶液中加入色氨酸，配制成质量分数为1.2-2.8％的色氨酸的磷酸钠缓冲溶液，将环氧活化后载体投入到色氨酸的磷酸钠缓冲溶液中，将反应温度升至40-60℃，反应12-24h，在载体上固载色氨酸配基，色氨酸固载反应完成后，洗涤除去未反应的色氨酸；

步骤B：在浓度为0.05-0.5M、pH值为10-12的磷酸钠缓冲溶液中加入苯丙氨酸，配制成质量分数为1.2-2.8％的苯丙氨酸的磷酸钠缓冲溶液，将从步骤A所获得的、已经固载有色氨酸配基的吸附剂投入到苯丙氨酸的磷酸钠缓冲溶液中，在40-60℃下反应2-24h，反应结束后，洗涤除去未反应的氨基酸；

步骤C：在浓度为0.5-2M的乙醇胺水溶液中，投入步骤B所获得的带混合氨基酸配基的吸附剂，其中吸附剂与乙醇胺溶液的体积比0.2-1，反应温度为30-45℃反应2-4h以对吸附剂封端，然后将经过封端后的吸附剂洗涤干净，即得到用于血液净化的免疫吸附剂；

其中，所述载体为高强度琼脂糖载体，所述高强度琼脂糖载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤a：琼脂糖凝胶球的制备：

将配制好的质量分数为2-10％的琼脂溶液缓慢倾入含有0.1-3％聚山梨酯-80(吐温-80)的甲苯和三氯甲烷混合液的三口瓶中，其中三口瓶置于40-60℃水浴中，甲苯和三氯甲烷的体积比为0.5-5；调节搅拌速度，使琼脂溶液在有机相中分散成大小适宜的液滴，待琼脂液滴冷却成凝胶球后，过筛并用大量水冲洗；

步骤b：琼脂糖凝胶球的交联

将步骤a所得的琼脂凝胶球，加入到浓度为0.5-2.5M的NaOH水溶液中，NaOH水溶液和凝胶球体积比为0.5-5，加入体积为琼脂糖凝胶球体积0.1-1倍的环氧氯丙烷，在25-50℃的条件下反应0.5-2h，反应完成后用水冲洗至中性；

步骤c：琼脂糖凝胶球的二次交联

将步骤b制得的琼脂凝胶球按步骤b的方法再进行二次交联，二次交联反应完成后，将琼脂糖凝胶球用水冲洗至中性，获得高强度琼脂糖载体。

3.根据权利要求1或2任一项所述的一种用于器官移植领域血液净化的免疫吸附剂，其特征在于：所述色氨酸选自L-色氨酸、D－色氨酸或它们的外消旋体。

4.根据权利要求1或2任一项所述的一种用于器官移植领域血液净化的免疫吸附剂，其特征在于：所述苯丙氨酸为L-苯丙氨酸。

5.根据权利要求1或2任一项所述的一种用于器官移植领域血液净化的免疫吸附剂，其特征在于：所述载体为自身带有羟基的、亲水性的球形载体，粒径在100μm～800μm之间，排阻分子量在15,000～5,000,000之间。