CN101224415A - 用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

一种用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂及其制备方法。它是由不溶于水的壳聚糖、纤维素或聚乙烯醇微球为载体，固定磷酸盐配基制得的。本吸附剂表面带有大量的负电荷，以有利于和表面带正电荷的LDL作用而产生吸附作用。本发明制备的吸附剂能选择性地除去血液中的低密度脂蛋白，而对血液中的有益成分如高密度脂蛋白等无明显吸附作用。并且载体材料选用生物相容性好的壳聚糖、纤维素和聚乙烯醇，配基为磷酸盐，为人体体液中所含有的成分，吸附剂有极好的血液相容性，可用于体外全血灌流治疗高脂血症。

Description

用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂及制备方法

【技术领域】：本发明属于生物医药技术领域。涉及用于体外全血灌流除去血液中的致病物质-低密度脂蛋白的吸附剂。

是以壳聚糖、纤维素或聚乙烯醇微球为载体，以磷酸盐为配基的吸附剂，具有良好的血液相容性和生物安全性。

【背景技术】：近年来，在一些国家和地区心脑血管疾病迅速成为发病率和死亡率最高的疾病，例如高脂血症、动脉粥样硬化和再狭窄、冠心病、脑栓塞和心肌梗塞等。现已知道，血液中的低密度脂蛋白(LDL-C)和极低密度脂蛋白(VLDL-C)水平的升高是诱发此类疾病的关键因素。

无疑，设法降低血液中的LDL-C水平可以有效缓解和加速治愈上述疾病，一般可以通过控制饮食、改变生活方式(戒烟、戒酒、加强锻炼等)和服用降脂药物控制血液中的LDL-C水平。

对于用以上方法无效者和家族性高脂血症患者则可以通过血液净化的方法来降低LDL-C水平，此方法是用体外物理方法来清除血液中高水平的LDL-C。通过近年的发展，一般有血浆置换法、肝素体外沉淀法和血液/血浆灌流法等几种。血浆置换法在一定程度上比较有效，但健康人的血浆价格昂贵，去掉了致病物质的同时也去掉了血浆中的有用成分如HDL等，还有感染其它病毒的危险；肝素体外沉淀法虽克服了血浆置换的缺点，但仪器设备复杂，治疗费用昂贵；血液灌流法即将病人的血液引出体外，流经血液净化吸附剂特异性地将血液/血浆中的LDL-C吸附掉，然后再将血液输回患者体内。有的吸附剂可以不用分离血浆，直接全血灌流。此种方法安全、快捷、较低的治疗费用以及患者的耐受性较好，近年来发展迅速。

吸附去除LDL-C方法的核心是LDL-C吸附剂，不少研究机构和学者进行了很多相关的研究工作，主要有以下几种类型的吸附剂：(1)LDL-C免疫吸附剂，Dr.Stoffel Borberg和Greve率先运用免疫亲和色谱原理去除LDL-C；有用人的单克隆抗体制成的免疫吸附剂，对人的Apo-B具有很高的特异性，在俄罗斯的研究中心得到了应用；1987年E.Richard研究了将抗LDL抗体固载于琼脂的不同方法以及由此而引起的对免疫吸附的效率的影响；(2)阴离子型LDL-C吸附剂，它是通过LDL-C表面带正电荷的Apo-B与阴离子通过静电作用结合而制得的一种吸附剂，1980年，Edwin等人把肝素-琼脂糖凝胶制成吸附柱，并用两个柱子交替使用连续灌流，在很大程度上提高了以LDL的清除效果。1985年和1987年日本的Asahi化学工业有限公司和美国Nobataka分别以聚乙烯醇和Toyogerd HW55 gel为载体，肝素为配体，制成了LDL吸附剂。由于阴离子多聚物同LDL的吸附作用，使得人工合成的阴离子聚合物作为LDL吸附剂的使用早已实现。1984-1987年，日本学者用磺化葡聚糖为配基，以纤维素为载体的磺化葡聚糖-纤维素吸附剂吸附LDL。E.Jamal和M.Fadul所作的用磺化葡聚糖对纯合家族性高脂血症患者的长达四年的跟踪观察和研究发现，这种LDL吸附剂可以长期使用，病人的LDL及Lp(c)均减少。病人的身体状况得到了很大改善，同时延缓了此类病人动脉粥样硬化和心脏病的发生。另一类合成的阴离子聚合物为聚丙烯酸类吸附剂。1987年，Kuroda用聚丙烯酸-聚乙烯醇吸附剂进行人体血浆和体外动物实验，并对一个病人进行了治疗。1988年，Karsten Thies用聚丙烯酸做成亲和吸附剂，吸附试验中，没有发现副作用，且它的价格低廉，可以多次重复使用，因此这种吸附剂具有很大的应用价值。(3)非离子型LDL吸附剂，1975年，美国学者Maloval等人用多孔玻璃作为LDL吸附剂，体外吸附试验和动物灌流实验均取得了明显的降胆固醇效果。1984年，日本的Asahi化学工业有限公司用大孔硅胶做LDL吸附剂，使血清中的LDL减少了82.5％。E.Behem研制成一种多孔纤维素，它对LDL的吸附具有高度的选择性并且吸附量随着纤维素量的增加而增加，吸附量大且血液相容性好。

在国际上用于吸附LDL及胆固醇的吸附剂研究开始于七十年代末，通过多年的研究，目前已有不少LDL-C吸附剂产品在临床上应用，具有代表性的有以下几种：(1)免疫型吸附剂(Immunoadsorption，IMA)，德国PlasmaSelect公司的Therasorb产品，其配基为抗LDL抗体Apo-B100，该系统可以重复使用进行40次以上的治疗，特异性吸附所含有Apo-B的蛋白，对其他血液成分的吸附率相对较低，价格和治疗费用也非常高。另外一种免疫吸附剂也用于临床治疗，即俄罗斯Pocard公司的lipopark LDL吸附系统，它是将多克隆抗体-Lp(a)抗体固定到葡聚糖载体上得到的免疫吸附剂，适用于脂蛋白A浓度高的病人。免疫型吸附剂的选择性高，但存在不宜用热消毒、需进行血浆灌流、制作复杂、成本高等特点，限制了其在临床上的广泛应用。(2)磺化葡聚糖吸附系统(Dextran-Sulffate Adsorption，DSA)：日本Kaneka公司的Liposorber产品，它是在多孔纤维素微球载体上固定磺化葡聚糖配基形成的阴离子型吸附剂，他们能吸附所有含Apo-B的脂蛋白，吸附容量大，选择性高，但治疗时需要血浆分离，仪器设备及治疗费用较高。(3)LDL血液灌流吸附系统(Direct Adsorption of Lipoproteins，DALI)：德国Fresenius公司的DALI产品，它是在多孔聚丙烯酰胺载体上固定聚丙烯酸盐配基形成的阴离子型吸附剂，具有很好的血液相容性。聚丙烯酸盐阴离子能够有效地结合胆固醇、LDL、脂蛋白A和甘油三酯。该吸附柱为一次性使用，不能进行再生，突出优点是很好的选择性、可用于全血灌流和操作技术简单。这种吸附装置目前完成的病例还不多，尽管仪器设备简单，但吸附剂装置本身还是很昂贵。

虽然近年来我国很多学者在LDL吸附剂方面发表了不少相关的研究工作，但是我国还没有商品化的LDL吸附剂产品出现，国外进口的产品又价格昂贵，大大限制了此类产品在我国的应用。因此急需开发一种价格低廉，制备过程简单，安全、有效的LDL吸附剂。

【发明内容】：本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂及其制备方法。

本发明涉及一种用于体外全血灌流清除LDL-C的吸附剂，它是以不溶于水的壳聚糖微球、纤维素微球或聚乙烯醇微球为载体，通过与三氯氧磷或磷酸吡多醛反应和后处理引入带负电荷的磷酸盐配基得到的。

本发明提供的吸附剂是一种新型的LDL吸附剂，可用于体外血液灌流清除血液中的低密度脂蛋白。

本发明提到的吸附剂所用载体的材料，它首先必须是不溶于水的，要有一定的机械强度而不易在血流的压力驱动下破碎，可以有多种形状，如粒状、片状和纤维状等，优选球状。适合用作载体材料的可以是无机多孔材料如多孔玻璃和多孔硅胶；也可以是天然高分子材料如琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖和纤维素等；还可以是合成高分子材料如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇等。

本发明优先选用的载体材料为天然高分子材料壳聚糖和纤维素以及合成高分子材料聚乙烯醇，因为它们有较好的生物相容性，容易制成球状载体，且含有大量供反应的活性位点。

本发明使用的载体为球形，微球的粒径对吸附剂的性能有较大的影响，若粒径过大，则微球的比表面积较小，装入吸附柱后球粒间的间隙也较大，这些会直接影响到吸附性能，若粒径过小，在吸附柱中的堆积过于紧密，会阻碍血液的快速流动，并且有泄漏的危险。综合来说粒径宜在50-800um，但在100-500um较好。本发明使用的微球是用分样筛筛分并通过光学显微镜成相计算得到的。

本发明使用的载体为硬质多孔微球，所谓硬质是指材料不易溶胀，有一定的机械强度，在一定的压力下不易变形，并且在吸附柱中液体流速和压力差几乎呈线性关系，这样的微球作为吸附剂是合适的，不易破碎和不会阻碍血液的稳定流动。载体又必须是多孔的，即比表面积不小于3m²/g，孔隙率不小于20％，而且必须是连续的较大直径的孔，孔径大小要控制得合适，大到不能让血液中的红细胞和白细胞等进入孔内部，小到要能够让LDL-C微粒顺利扩散进载体微球内部，与配基完成吸附作用，红细胞和白细胞等则可以通过微球之间的空隙顺利流出。

本发明使用的载体必须含有或部分含有反应活性基团-羟基，一方面，羟基提供了载体一定的亲水性能，保证了材料良好的生物相容性；另一方面，活性羟基有利于下一步的磷酸化反应。

本发明的载体在进行磷酸化反应的时候应该是无水的，因为本发明所用到的磷酸化反应试剂为三氯氧磷，遇水极易分解，直接影响到磷酸化效率。因此发明所用的含水较高的天然高分子微球载体壳聚糖和纤维素微球要经过干燥，干燥的方法有很多，如高温烘干和冷冻干燥等，本发明所用到的这两种载体在上述方法干燥时会塌缩，所以本发明采用了梯度脱水的方法。聚乙烯醇共聚物微球采用直接烘干的方法。

本发明所用到的吸附剂的配基为阴离子形式，具体来说为磷酸盐。磷酸盐是人体体液的正常组分，且带有明显的负电荷，可以和带正电荷的LDL-C产生明显的电荷吸附作用而达到清除LDL-C的目的，并且即使吸附剂在血液灌流过程中有微量的配基脱落也不会引起人体较大的不适反应。本发明使用的配基为磷酸盐，可以是单磷酸盐如-HPO₃ ^-和-PO₃ ^2-等，也可以为多聚磷酸盐，配基含量的多少可以通过磷酸化反应程度来控制。另外，本发明中吸附剂的磷含量由钼酸蓝比色法测定。

上述吸附剂的制备方法：

(1)、用浓度为2-8％(质量浓度)的壳聚糖/乙酸溶液喷射入氢氧化钠溶液中固化而制成壳聚糖微球，微球经脱水干燥后悬浮于无水四氢呋喃中，在0-120℃温度范围内与0.005-2倍体积的磷酸化试剂三氯氧磷反应，然后用5％(质量浓度)的碳酸氢钠水溶液进行水解得到低密度脂蛋白吸附剂。或者，

(2)壳聚糖微球载体用体积浓度为5％-40％的乙二醇二缩水甘油醚进行交联和活化后再和磷酸吡多醛进行固定化反应，经硼氢化钠还原和处理后制得低密度脂蛋白吸附剂。或者，

(3)、棉纤维素溶解后悬浮分散于有机溶剂，然后加热固化而制成纤维素微球，微球经脱水干燥后悬浮于无水吡啶中，在0-120℃温度范围内与0.005-2倍体积的磷酸化试剂三氯氧磷进行磷酸化反应，然后用10％(质量浓度)的浓度的氢氧化钠水溶液进行水解得到低密度脂蛋白吸附剂。

(4)、单体醋酸乙烯酯和交联剂异氰脲酸三烯丙酯(交联度为2040％)以及致孔剂乙酸乙酯、正庚烷分散于浓度为1.5％(质量浓度)的聚乙烯醇水溶液中，在偶氮二异丁腈引发作用下聚合成微球，经脱除致孔剂和氢氧化钠/甲醇溶液酯交换后得到聚乙烯醇微球，微球经干燥后悬浮于无水DMF中，在0-120℃温度范围内与0.005-2倍体积的磷酸化试剂三氯氧磷进行磷酸化反应，然后用10％(质量浓度)的氢氧化钠水溶液进行水解得到低密度脂蛋白吸附剂。

本发明的优点和积极效果：

本发明制备的用于体外血液灌流的吸附低密度脂蛋白的吸附剂能有效去除血液中的低密度脂蛋白，而对血液中的其它成分无明显作用。

【具体实施方式】：

实施例1：壳聚糖为载体磷酸盐为配基的吸附剂的制备

a.壳聚糖微球载体的制备

将壳聚糖粉末4.0g溶于96g浓度为2％的乙酸中，得到浓度为4％的壳聚糖乙酸溶液，在高压氮气流作用下，通过喷嘴将此溶液喷入质量浓度为8％的氢氧化钠溶液中。调节喷射速度可得到粒径均匀、大小合适的壳聚糖微球，用蒸馏水将微球洗至中性备用。壳聚糖微球载体的含水量为93.3％。

b.磷酸盐配基的引入

将一定体积的壳聚糖微球装入洗涤柱中，依次用乙醇、丙酮、四氢呋喃和无水四氢呋喃淋洗，将微球中的水分逐渐替换掉，得到不含水分的壳聚糖微球，置于干燥器中备用。

称取适量脱水的微球于三口烧瓶内，加入四氢呋喃、三乙胺，搅拌使微球均匀悬浮，冰浴下滴加三氯氧磷，在10min内加完，之后撤去冰浴，室温下反应3h。四氢呋喃的体积为微球体积的5倍，三氯氧磷的用量根据欲偶联磷酸的量计算。三乙胺的摩尔量为三氯氧磷的3倍。反应完全后，缓慢滴加质量浓度为5％的碳酸钠溶液，直到不冒气泡。倾去残液，微球依次用1mol/L的氯化钠溶液、蒸馏水淋洗至中性，得到磷酸盐型壳聚糖吸附剂，4℃保存备用。

实施例2.壳聚糖微球为载体，磷酸吡多醛为配基的吸附剂的制备

a.壳聚糖微球载体的交联和活化

向由实施例1a制备的壳聚糖微球悬液中加入10％(V∶V)的乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)，在70℃下振荡进行3h的交联反应，然后用蒸馏水充分洗涤备用。

b.磷酸吡多醛配基的固定

将0.5g磷酸吡哆醛溶于pH值为3.6的柠檬酸缓冲溶液中，加入壳聚糖微球5.0g，在50℃下振荡5h。然后用质量浓度为10％的硼氢化钠溶液还原，硼氢化钠的用量是磷酸吡哆醛的20倍，在1h内分两次加完，4℃反应3h，用蒸馏水充分淋洗，即得到吸附剂，4℃保存备用。

实施例3.吸附剂体外静态吸附实验

分别量取1.0ml由实施例1、2制备的壳聚糖为载体的吸附剂，置于5.0ml的聚丙烯塑料管中，加入适量的生理盐水平衡3h，吸去游离的生理盐水后加入3.0ml高脂血症病人血浆，37℃恒温振荡3h，静置片刻，吸取上清液做TC、LDL-C、TG和HDL-C浓度测定，并与未加吸附剂的血浆作对比。吸附量由下式计算：

AC＝([C]_B-[C]_A)V_P/V_A

式中AC为吸附量(mg/ml)，[C]_B和[C]_A分别为吸附前后浓度(mg/dl)，V_p和V_A分别为吸附过程中所用血桨和吸附剂的体积。

由实施例1、2制备的吸附剂吸附性能测试结果如表1所示：

表1壳聚糖微球为载体的吸附剂小样吸附性能测试结果

吸附剂	吸附量/(mg/ml)
				TC	LDL-C	HDL-C
	实施例1实施例2	1.161.37	2.721.30				0.060.06

实施例4.纤维素微球为载体磷酸盐为配基的吸附剂的制备

a.纤维素微球的制备

100g短绒棉剪碎，加入800ml 19％质量浓度的氢氧化钠水溶液，搅拌均匀，室温下浸泡2h，挤去部分碱液，放入广口瓶中加塞，放置于28℃老化72h。加入50ml二硫化碳，室温下反应8h，棉花由浅黄色逐渐变成橙红色，加入845ml质量浓度为6％的NaOH溶液，并进行机械搅拌，棉花全部溶解，得到橙红色粘胶液，纤维素浓度为8％。

500ml三口烧瓶中加入200ml氯苯，34ml四氯化碳，0.78g油酸钾，机械搅拌30分钟待油酸钾溶解，缓慢加入上述粘胶液80ml，调节搅拌速度，使液滴分散均匀，粒径合适，在1h内均匀升温至90℃，保持此温度和搅拌速度3h，冷却后倾去有机相，用大量水充分冲洗得到的微球，抽干水份备用。

b.磷酸盐配基的引入

由实施例4a得到的纤维素微球装入洗涤柱，依次用30％的乙醇、70％的乙醇、无水乙醇、30％的吡啶/乙醇、70％的吡啶乙醇、吡啶和处理过的无水吡啶梯度淋洗，得到在吡啶中悬浮的不含水分的纤维素微球，密封保存备用。

不含水分的纤维素微球5.0ml置于100ml三口烧瓶中，加入无水吡啶15ml，搅拌使其均匀悬浮，并缓慢升温至120℃。保温30分钟后，缓慢滴加三氯氧磷0.5ml，滴加完毕后维持温度反应30分钟，然后滴加质量浓度为10％的NaOH溶液水解，直至水解完全。得到的微球过滤后装入洗涤柱用水充分淋洗至中性，得到以纤维素微球为载体以磷酸盐为配基的吸附剂，4℃保存备用。

由实施例4得到的纤维素微球为载体的吸附剂的吸附性能测试结果如表2所示：

表2纤维素微球为载体的吸附剂的吸附性能测试结果

吸附剂	吸附量/(mg/ml)
				TC	LDL-C	HDL-C
	实施例4	1.30	3.12				0.10

实施例5.聚乙烯醇微球为载体磷酸盐为配剂的吸附剂的制备

a.聚乙烯醇微球的制备

在500ml三口烧瓶中分别加入24g醋酸乙烯酯，6g异氰脲酸三烯丙酯，15ml乙酸乙酯，15ml正庚烷，体系升温至40℃，机械搅拌，加入0.3g引发剂偶氮二异丁腈，待引发剂溶解后往体系中加入300ml水(按重量计算，含有1.5％的聚乙烯醇和3％的氯化钠)，调整搅拌速度使液滴均匀分散，大小合适，缓慢升温至65℃，保持温度和搅拌速度聚合3h，然后升温至75℃再维持3h，得到一种白色粒状共聚物。过滤，用热水洗涤，再用丙酮在索氏提取器中提取12h，晾干。

将上述共聚物微粒加入到12gNaOH和500ml甲醇组成的溶液中，机械搅拌下在40℃进行18h的酯交换反应(或称醇解反应)，反应完成后抽滤，用甲醇洗涤，晾干，得到以聚乙烯醇为主要结构单元的交联多孔共聚物微球。平均粒径为450um，比表面积为66.89m²/ml，羟基含量约10.0mmol/g。

b.磷酸盐配基的引入

将由实施例5a得到的干燥的多孔聚乙烯醇微球5.0ml置于100ml三口烧瓶中，加入15ml无水DMF，搅拌使其均匀悬浮，并缓慢升温至120℃。保温30分钟后，缓慢滴加三氯氧磷0.5ml，滴加完毕后维持温度反应30分钟，然后滴加质量浓度为10％的NaOH溶液水解，直至水解完全。得到的微球过滤后装入洗涤柱用水充分淋洗至中性，得到磷酸盐型聚乙烯醇吸附剂，与4℃保存备用。

由实施例5得到的聚乙烯醇微球为载体的吸附剂的吸附性能测试结果如表3所示：

表3聚乙烯醇微球为载体的吸附剂的吸附性能测试结果

吸附剂	吸附量/(mg/ml)
				TC	LDL-C	HDL-C
	实施例5	2.41	3.30				0.07

Claims (8)

1.一种用于体外全血灌流吸附低密度脂蛋白的吸附剂，其特征是该吸附剂以壳聚糖微球、纤维素微球或以聚乙烯醇微球为载体，通过与三氯氧磷或磷酸吡多醛反应和后处理引入带负电荷的磷酸盐配基得到。

2.根据权利要求1所说的吸附剂，其特征在于所述的磷酸盐配基为磷酸盐，可以是单磷酸盐如-HPO₃ ^-和-PO₃ ^2-等，也可以是多聚磷酸盐。

3.根据权利要求1或2所说的吸附剂，其特征在于所述的载体的粒径为50-800um，比表面积不小于3m²/g，孔隙率不小于20％，其孔径大于LDL-C微粒的粒径、小于红细胞和白细胞外径。

4.根据权利要求3所说的吸附剂，其特征在于所述的载体的粒径优选100-500um。

5.权利要求1所说的吸附剂的制备方法，其特征在于：

(1)、脱水后的壳聚糖微球载体悬浮于无水四氢呋喃中，在0-120℃温度范围内与0.005-2倍体积的磷酸化试剂三氯氧磷反应后，经水解和后处理得到低密度脂蛋白吸附剂；或，

(2)、壳聚糖微球载体用体积浓度为5％-40％的乙二醇二缩水甘油醚进行的交联和活化后再和磷酸吡多醛进行固定化反应，经硼氢化钠还原和处理后制得低密度脂蛋白吸附剂；或，

(3)、脱水后的纤维素微球载体悬浮于无水吡啶中，在0-120℃温度范围内与0.005-2倍体积的磷酸化试剂三氯氧磷进行磷酸化反应，经水解和后处理即制得低密度脂蛋白吸附剂；或，

(4)、干燥的聚乙烯醇微球载体悬浮于无水DMF中，在0-120℃温度范围内与0.005-2倍体积的磷酸化试剂三氯氧磷进行磷酸化反应，经水解和后处理得到低密度脂蛋白吸附剂。

6.根据权利要求5所说的吸附剂的制备方法，其特征在于：所述的壳聚糖微球载体的制备方法是：用质量浓度为2-8％的壳聚糖/乙酸溶液喷射入氢氧化钠溶液中固化而成。

7.根据权利要求5所说的吸附剂的制备方法，其特征在于：所述的纤维素微球载体的制备方法是：棉纤维素溶解后悬浮分散于有机溶剂，然后加热固化而成。

8.根据权利要求5所说的吸附剂的制备方法，其特征在于：所述的聚乙烯醇微球载体的制备方法是：单体醋酸乙烯酯和交联度为20-40％的交联剂异氰脲酸三烯丙酯以及致孔剂乙酸乙酯、正庚烷分散于质量浓度为1.5％的聚乙烯醇水溶液中，在偶氮二异丁腈引发作用下聚合成微球，经脱除致孔剂和氢氧化钠/甲醇溶液酯交换后得到交联聚乙烯醇共聚物微球，羟基含量约为10mmol/g。