CN102441363A - 一种用于清除血液中癌细胞的吸附剂 - Google Patents

Abstract

一种用于清除血液中癌细胞的吸附剂。所述的吸附剂，以天然高分子或合成高分子为载体，以生物交联剂或化学交联剂为手臂，以癌细胞单克隆抗体为配基，通过生物或化学的合成方法将载体-手臂-配基结合，制备得到具有特异性清除血液中癌细胞的单克隆抗体吸附剂。本发明通过将肿瘤单克隆抗体偶联到吸附剂载体上，透过血液灌流的方式，特异性清除血液中的癌细胞，保护了免疫系统，预防了癌症的转移。

Description

一种用于清除血液中癌细胞的吸附剂

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种用于体外全血灌流，清除癌细胞的吸附剂。

背景技术

癌症，是威胁人类健康的主要致死疾病之一。近三十年来，世界癌症发病数以年均3～5%的速度递增，3／4的新增病例发生在新兴工业国家及发展中国家。癌症已成为人类第二位死因，其致死病例超过艾滋病、结核和疟疾致死病例的总和。2000年，世界共有癌症新发病例1040万，死亡病例650万；预计到2030年，这些数字将大幅上升，新发病例将达到2640万，死亡病例达到1640万。2002年我国癌症新发病例220万，死亡病例160万。2008年4月29日卫生部发布的第三次全国死因调查数据显示：癌症已成为城市的首位死因（占25%），农村的第二位死因（占21%）。城乡居民癌症死亡率呈持续的增长趋势，当前的死亡率分别比上世纪70年代和90年代增加83.1%和22.5%。

有调查表明：“肿瘤病人死亡，90%是肿瘤的复发转移导致，还有一部分是因为病人的其他并发症，肿瘤并发症往往也都和肿瘤转移有关。恶性肿瘤给病人造成的危害关键就在于它能够转移，因此肿瘤转移始终是肿瘤防治的重大课题及研究难点。” 

过去几十年来，医学界一直是把手术、放疗、化疗作为肿瘤治疗的主要手段。手术可切除已形成肿块的癌细胞，放疗、化疗可以杀死全部或部分成年癌细胞，而对未成熟癌细胞作用较小。由於治疗的副作用使病人的免疫功能更为低下，反而诱导幼年癌细胞从休眠状态被激活，迅速裂变、突变、形成新的成年癌细胞，这就是癌转移复发的根本原因。由于目前的医学水平尚无法保证化疗药物的靶向性，化疗药物的细胞毒性作用不仅杀伤肿瘤细胞，也杀伤正常细胞，降低了病人机体的免疫功能，甚至直接摧毁了病人的免疫系统，影响化疗的治疗效果。多年的经验告诉我们，在肿瘤患者的免疫力未恢复之前，一切想单纯通过直接杀死癌细胞的治疗方法不仅是徒劳的，而且是有害的，其结果是加速了患者的死亡！世界卫生组织统计，对比1990年与2000年十年间的肿瘤患者死亡率，不仅没有下降，反而上升了17%的实际数据，得出了为什么医学科技水平越来越先进，肿瘤治疗技术和药物也越来越多，而肿瘤患者的死亡率却不降反升的结论：因为我们还没有真正认识肿瘤，还没有找到根治肿瘤的利器！

上世纪80年代开始，科学家摸索出肿瘤免疫疗法又称生物疗法(Biotherapy, BT) 的治疗肿瘤新概念。这是继手术、化疗、放疗之后的第四种肿瘤疗法，这个新疗法也于80年代开始应用于临床治疗。生物免疫疗法可以针对不同类型的肿瘤使用不同的物质和方法。总的来说是通过提高患者自体免疫力来治疗肿瘤，抑制其生长或是减轻其它疗法所带来的副作用。单克隆抗体的出现，将生物疗法提升到更高的高度，单抗在非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌以及结直肠癌的治疗中已经发挥了重要的作用。但是单抗疗法也具有自身的缺陷，非人源型抗体的免疫原性、较短的半衰期、昂贵的费用等都是急需要解决的重要问题。

针对以上疗法所面临的不足，有必要开发出一种辅助治疗癌症的新技术。血液净化疗法在临床疑难重症如肝衰竭、自身免疫性疾病、极性中毒等的治疗中发挥着越来越重要的作用，也有望成为癌症治疗中的第五种疗法。

发明内容

本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种用于清除血液中癌细胞的吸附剂。

针对癌症细胞易于转移的特点，本发明利用癌细胞特异性抗原制备单克隆抗体，并将单抗偶联到吸附剂载体上，制备出具有特异性清除血液中癌细胞的血液净化吸附剂。

本发明涉及一种用于体外全血灌流清除血液中癌细胞的吸附剂，它是以不溶于水的壳聚糖微球、纤维素微球或聚乙烯醇微球为载体，通过与相应类型癌细胞特异性抗原的抗体为配基，制备得到的一种特异性癌细胞吸附剂。

本发明提供的用于体外全血灌流以清除血液中癌细胞的吸附剂，以天然高分子或合成高分子为载体，以生物交联剂或化学交联剂为手臂，以癌细胞单克隆抗体为配基，通过生物或化学的合成方法将载体-手臂-配基结合，制备得到具有特异性清除血液中癌细胞的单克隆抗体吸附剂。

所述的天然高分子载体材料是纤维素、壳聚糖或胶原；合成高分子材料是聚乙烯醇（天津欧瑞生物科技有限公司提供）、聚苯乙烯或聚丙烯酸脂类。因为他们具有较好的生物相容性，容易制成球状载体，其含有大量供反应的活性位点（羟基或胺基等）。

所述的吸附剂载体为球形，粒径在50-800um，以100-500um范围最佳。

所述的生物交联剂是具有异型双功能基的交联剂，具体是DPS（3,3'-二硫代二丙酸 二(N-羟基丁二酰亚胺酯)、DCC（二环己基碳化二亚胺）或PMPI（N-[p-Maleimidophenyl]isocyanate）等；化学交联剂是戊二醛或乙二胺。

所述的单克隆抗体，是来源于目前所知的所有肿瘤表面特异性抗原的抗体，包括但不限于肺癌细胞单克隆抗体、肝癌细胞单克隆抗体、肾癌细胞单克隆抗体、结肠癌细胞单克隆抗体或骨癌细胞单克隆抗体等。

所述的生物或化学的合成方法，是指目前通过文献可知的所有合成方法和反应条件。

本发明提供的吸附剂可用于全血灌流清除血液中的癌细胞。

不仅可以作为手术前的预防性治疗，也可以用于术后预防癌症的转移。不仅仅用于癌症细胞的清除。也可以推广到其他疾病的治疗领域。

本发明的优点和有益效果：

本发明通过将肿瘤单克隆抗体偶联到吸附剂载体上，透过血液灌流的方式，特异性清除血液中的癌细胞，保护了免疫系统，预防了癌症的转移。

 

具体实施方式

本发明所涉及的单克隆抗体可以通过以下步骤制备：

①                杂交瘤细胞获取：肝癌细胞杂交瘤和肺癌细胞杂交瘤（南开大学生命科学院惠赠），肾癌杂交瘤细胞（徐州医学院惠赠）。

②    杂交瘤细胞培养：将上述杂交瘤细胞用文献可知的方法进行培养扩增，以获取足够数量的杂交瘤细胞。

③     富含单克隆抗体的小鼠腹水制备：按文献已有的方法，利用小鼠腹水法制备富含相应癌细胞单克隆抗体的腹水。

④      单克隆抗体的分离纯化：按文献已有方法，如饱和硫酸铵溶液沉淀法、辛酸－硫酸铵法及Protein A亲和层析法逐级进行抗体的分离纯化，得到肺癌、肝癌、肾癌的癌细胞单克隆抗体（McAb LC-1，McAb18，G250）。

本发明将血液净化技术应用到癌症复发的预防与治疗领域，通过将单克隆抗体偶联到吸附剂载体上，避免了异源性抗体用于肿瘤治疗所引起的免疫反应，也避免了放、化疗对正常免疫系统的损害，通过抗原-抗体特异性识别作用，清除血液中的癌细胞，减少原发性癌症因血液转移而造成的转移癌的发生，为癌症治疗提供了一种辅助治疗方法。

实施例1：肺癌吸附剂的制备

取壳聚糖微球10ml，加20ml PBS（磷酸缓冲液，pH7.2）以溶胀壳聚糖微球。然后过量加入预先配制好的1mg/ml浓度的DPS(3,3'-二硫代二丙酸 二(N-羟基丁二酰亚胺酯)10ml ，室温反应30分钟，吸弃反应液，PBS清洗3次，每次5分钟，即得到具有可与单克隆抗体键合活性微球，然后将预先配制好的10ug/ml的抗肺癌细胞单克隆抗体McAb LC-1溶液20ml，和活性微球在25℃反应1小时，即得到单克隆配基的肺癌吸附剂。

 

实施例2：肝癌吸附剂的制备

聚乙烯醇微球活化：向10ml聚乙烯醇微球中加入10ml3mol/L的NaOH，60ml环氧氯丙烷（EPI），在40℃下震荡进行3小时活化反应，用蒸馏水充分洗涤后，加入7.5ml 2mol/L NaOH,50ml的1,6-己二胺，于75℃下震荡反应12小时，蒸馏水洗涤，备用。

配基固定：取上述活化聚乙烯醇载体10ml，加20ml PBS（磷酸缓冲液，pH7.2）以溶胀微球。然后过量加入预先配制好的1mg/ml浓度的DCC（二环己基碳化二亚胺），室温反应30分钟，吸弃反应液，PBS清洗3次，每次5分钟，即得到具有可与单克隆抗体键合活性微球，然后将预先配制好的10ug/ml的肝癌细胞单克隆抗体McAb18溶液20ml，和活性微球在25℃反应1小时，即得到单克隆配基的肝癌吸附剂。

 

实施例3：肾癌吸附剂的制备

纤维素微球活化：取纤维素微球10ml，加入10ml3mol/L的NaOH，60ml环氧氯丙烷（EPI），在40℃下震荡进行3小时活化反应，用蒸馏水充分洗涤后，加入10ml 2mol/L NaOH,50ml的乙二胺，于75℃下震荡反应12小时，蒸馏水洗涤，备用。

配基固定：取上述活化纤维素微球载体10ml，加20ml PBS（磷酸缓冲液，pH7.2）以溶胀微球。然后过量加入预先配制好的10%的戊二醛10ml，室温反应30分钟，吸弃反应液，PBS清洗3次，每次5分钟，即得到具有可与单克隆抗体键合活性微球，然后将预先配制好的10ug/ml的单克隆抗体p250溶液20ml，和活性微球在25℃反应1小时，即得到单克隆配基的肾癌吸附剂。

Claims (7)

1.一种用于体外全血灌流以清除血液中癌细胞的吸附剂，其特征在于，该吸附剂以天然高分子或合成高分子为载体，以生物交联剂或化学交联剂为手臂，以癌细胞单克隆抗体为配基，通过生物或化学的合成方法将载体-手臂-配基结合，制备得到具有特异性清除血液中癌细胞的单克隆抗体吸附剂。

2.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于所述的天然高分子载体材料是纤维素、壳聚糖或胶原；合成高分子材料是聚乙烯醇、聚苯乙烯或聚丙烯酸脂类。

3.根据权利要求2所述的吸附剂，其特征在于所述的吸附剂载体为球形，粒径在50-800um。

4.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于所述的生物交联剂是具有异型双功能基的交联剂，具体是DPS、DCC，但不限于这些；化学交联剂是戊二醛或乙二胺等。

5.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于所述的单克隆抗体，是来源于目前所知的所有肿瘤表面特异性抗原的抗体。

6.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于所述的生物或化学的合成方法，是指目前通过文献可知的所有合成方法和反应条件。

7.一种权利要求1所述的吸附剂的应用，用于全血灌流，清除血液中的癌细胞。