CN101298041A - 用于体外血液灌流吸附胆红素的吸附剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

用于体外血液灌流吸附胆红素的吸附剂及制备方法。本发明以生物相容性良好的聚乙烯醇微球为载体，采用环氧氯丙烷活化，然后固定胺化试剂为功能基形成胆红素吸附剂。该类吸附剂表面带有大量的正电荷，有利于与表面带负电荷的胆红素作用产生吸附作用。本发明制备的吸附剂生物相容性和吸附能力良好，并具有制作成本低廉，合成过程简单，吸附量大、吸附速率快的等特点，可以用于体外全血灌流治疗高胆红素血症。

Description

用于体外血液灌流吸附胆红素的吸附剂及制备方法

【技术领域】

本发明属于生物医药技术领域。涉及一种新型医用吸附剂，特别是用于体外血液灌流除去血液中含量过高的胆红素的吸附剂。

【背景技术】

胆红素(Bilirubin，BR)是一种胆色素，衰老红细胞的代谢产物，在体内胆红素一般与葡萄糖醛酸结合形成一种水溶性复合物，被血液运送至肝脏进行代谢，通过胆道排泄。如果体内胆红素产生过多，或者肝脏损伤，胆道堵塞等原因可造成胆红素在体内大量积蓄，造成高胆红素血症，严重的患者体内的胆红素水平可以达到700μmol/L。游离胆红素是一种内源性毒素，可以造成肝脏和胆道等器官的功能异常，由于其具有脂溶性，所以极易通过各种生物膜，并在组织内沉积，造成视网膜、皮肤等黄染，胆红素还可以透过血脑屏障和神经核团结合，干扰脑细胞的正常功能，对大脑造成不可逆性神经损伤，如核黄疸(新生儿常见疾病)和胆红素脑瘤，严重的病症甚至会危及生命。另外，临床上许多疾病的症状和胆红素在体内的积蓄有关，如果能迅速，有效去除患者体内的过量胆红素，对减轻疾病症状，赢得治疗时间，挽救患者生命有重大意义。

目前临床上常用的治疗方法为光线疗法和血液净化疗法，其主要针对症状较轻的患者，特别是对于新生儿高胆红素血症，光线疗法是首选疗法。但是该方法需要较长时间才可以使血浆中胆红素水平明显下降，而对于病症较重的患者需要借助血液净化疗法。血液净化疗法包括血液置换，血液透析和血液灌流吸附法。血液置换法需要大量新鲜血浆，价格比较昂贵且来源有限，并且存在免疫反应和交叉感染的问题。血液透析对小分子量毒素具有良好的去除效果，但对于与白蛋白结合的胆红素无效。需要血液灌流与吸附技术。

目前常用的血液吸附材料是活性炭和合成树脂。活性炭是通过大的比表面积对吸附质进行物理吸附，选择性较差，并容易发生颗粒脱落造成血管堵塞。合成树脂主要依赖相容性好的载体和选择性配基。

用血液灌流吸附法去除血液中过高含量的胆红素的研究与临床治疗方面，目前的方法主要集中在以下几个方面：(1)合成树脂类吸附剂：1956-1963年Bronnima等用AmberliteIRA-900类离子交换树脂对尿毒症、急性肝衰竭患者进行血液灌流治疗，并证明离子交换树脂对游离胆红素具有一定的吸附性能。1982年，李乃宏等研制成功一种带有氰基的聚苯乙烯大孔吸附树脂，对游离胆红素和结合胆红素均具有较高的吸附效率，并初步用于人工肝支持装置。魏斌等将载体聚丙烯酸甲酯固定氨基制成大孔树脂，对狗的全血进行体外灌流实验，树脂具有较好的血液相容性。卢玲等在大孔聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)树脂上固定氨基，对胆红素有一定的吸附效果。郑朝俊等利用β-环糊精的多羟基和疏水空腔的结构特性制备了树脂，临床灌流实验结果表明胆红素去除率为38％。(2)亲和吸附剂：1980年Brodersen等发现一个白蛋白分子可以吸附两个胆红素分子。利用这一原理三Stange等人发明了基于透析原理的MARS系统，利用高浓度的白蛋白对结合胆红素产生竞争，使血液中的胆红素与白蛋白解离，穿越半透膜与进入膜另一侧的高浓度白蛋白透析液。但是，该系统非常昂贵。Zhu XX等采用NMR研究发现，氨基酸配基与胆红素之间的结合方式主要是离子键。张克胜等合成了珠状交联聚乙烯醇水凝胶，并模拟了白蛋白的结合位点固载胍基，在血清白蛋白浓度增加的情况下，吸附量与胆红素的天然载体相比仍有差距。Adil Denizli等报道了以三嗪染料辛巴蓝(Cibacron Blue F3GA)为配基的生物亲和吸附剂。Xu Hui等人合成了固定Cibacron Blue 3GA磁性聚乙烯醇微球，在牛血清白蛋白存在的情况下，该磁性微球对胆红素的吸附量为15.6mg/g。

近年来，临床上使用的血液灌流吸附剂有日本Kuraray公司生产的BL-300吸附剂，是二乙烯基苯共聚物为骨架，聚甲基丙烯酸羟乙酯(poly 2-hydroxyethyl methacrylate，HEMA)包膜的阴离子交换树脂，对血浆中胆红素具有良好的选择吸附性能。另外，一些肝脏支持装置如：MARS，Prometheus等都可以对结合胆红素、胆汁酸等有效吸附，具有较好的血液相容性和治疗效果，但价格非常高，我国的多数患者不能承担昂贵的治疗。

综上所述，在胆红素吸附剂方面尽管有一些研究报道，但是，大都局限于实验室研究，吸附评价多为小分子的游离胆红素，而体内中的胆红素主要以白蛋白结合方式存在。因此，报道的吸附效率不能很好的反映血清中胆红素的真实清除率。但是，大量的研究表明，利用氨基带有的正电荷与胆红素分子的负电荷相互作用，是研制亲和吸附剂的理论基础。除了电荷作用，配基分子中的疏水基团与胆红素分子的疏水部分存在疏水性亲和，对吸附性能也有贡献。因为胆红素与白蛋白结合后分子量大大增加，因此，除了配基的重要性，树脂的孔径和表面积对吸附性能有决定性作用。

我国目前尚没有专用的安全有效的胆红素吸附剂产品的出现，日本的产品价格昂贵，大大限制了此类产品在我国的应用。因此急需开发一种价格低廉，制备过程简单，安全、有效的高胆红素吸附剂。

【发明内容】

本发明的目的是克服现有胆红素吸附剂产品存在的上述不足，提供生物相容性好，选择性好，吸附量大，制备成本低廉的用于体外血液灌流吸附胆红素的吸附剂及制备方法。

本发明提供的用于体外血液灌流吸附胆红素的吸附剂，是以不溶于水的大孔聚乙烯醇微球为载体，将聚乙烯醇微球载体悬浮于10倍载体体积的二甲基亚砜中，加入聚乙烯醇微球体积的0.5-6.0倍的环氧氯丙烷，在20-80℃温度范围内，在0.5-5.0NNaOH溶液中活化。于20-80℃温度范围内与0.5-5.0倍体积的胺化试剂(胺化试剂与聚乙烯醇微球体积比)反应，得到胆红素吸附剂。

本发明优先选用的载体材料为聚乙烯醇，有良好的生物相容性，容易制成球状载体，且含有大量供反应的活性位点。

本发明涉及的吸附剂载体的活化方法采用的是通用的环氧氯丙烷活化法，也可以采用其他简单实用的活化方法，目的是在载体上引入活性基团以利于在载体上固定功能配基。

本发明涉及的吸附剂的功能配基为带正电荷的胺类基团，宜多数是常规的胺化试剂，包括三甲胺，三乙胺，乙醇胺，1，6-己二胺，二乙烯三胺，三乙烯四胺，四乙烯五胺，或乙二胺等。

所述的功能基为氨基，具体是伯胺基，仲氨基，或叔胺基。都带有明显的正电荷，配基含量的多少可以通过控制反应条件实现，良好的空间结构和高的氨基含量有助于对胆红素的吸附。

本发明采用的载体形状为球形，粒径大小为100-500μm，孔隙率大于20％，孔径在50nm以上，载体的材料不易溶胀，有良好的机械强度，在灌流过程中不变形，不破碎，并且在吸附柱中液体流速和压力差几乎呈线性关系。本发明使用的载体含有或部分含有反应活性基团--羟基，一方面，羟基提供了载体一定的亲水性能，保证了材料良好的生物相容性；另一方面，活性羟基有利于下一步的活化反应。

本发明提供的吸附剂的制备路线如下：

(1)单体醋酸乙烯酯和交联剂异氰脲酸三烯丙酯(交联度为20-40％)以及致孔剂乙酸乙酯、正庚烷分散于浓度为1.5％(质量浓度)的聚乙烯醇水溶液中，在偶氮二异丁腈引发作用下悬浮聚合形成微球，经过丙酮回流脱除致孔剂，在氢氧化钠甲醇溶液中进行酯交换反应，最后得到聚乙烯醇微球，羟基含量约为10mmol/g。将聚乙烯醇微球悬浮于环氧氯丙烷中，或悬浮于10倍微球载体体积的二甲基亚砜与0.5-6倍微球载体体积的环氧氯丙烷中，20-80℃，在0.5-5.0N NaOH溶液中活化，于20-80℃温度范围内与0.5-5倍体积的胺化试剂(胺化试剂与聚乙烯醇微球体积比)反应，得到胆红素吸附剂。

本发明提供的吸附剂可以应用于血液灌流中去除胆红素。

本发明的优点和有益效果：

本发明根据白蛋白结合胆红素的分子大小，设计了相对应孔径尺寸的大孔聚乙烯醇树脂。将优选的亲和性配基高密度固定到树脂表面，获得了几种胆红素吸附剂。在白蛋白或血清存在条件下进行吸附实验，用病人血清进行吸附实验，比较动态与静态吸附。大量的吸附实验表明，本发明胆红素吸附剂对胆红素、结合胆红素具有优良的吸附率，优于文献报道的其他胆红素吸附剂。

选用大孔聚乙烯醇微球为载体，以胺化试剂为配基，具有血液相容性好，吸附能力强，治疗高胆红素血症既安全又有效。

【附图说明】

图1是以聚乙烯醇树脂为载体，分别以三甲胺、三乙胺、1，6-己二胺为配基的胆红素的吸附剂在胆红素模拟血清中对胆红素的吸附率与时间的关系图。

坐标：横坐标为吸附时间，单位为小时，纵坐标为对胆红素的吸附率，用％表示。其中■代表以实施例2制得的吸附剂●为实施例3制得的吸附剂▲为实施例4制得的吸附剂。

实验条件：胆红素初始的浓度为342μmol/L，静态吸附时间为0.5，1，1.5，2，3小时，胆红素模拟血清液和吸附材料的体积比为10∶1。

图2是以聚乙烯醇为载体，三甲胺、三乙胺、1，6-己二胺为配基的胆红素的吸附材料对高胆红素血症病人血浆中胆红素的吸附率比较图。

坐标：横坐标为三种吸附剂，纵坐标为对胆红素的吸附率，用％表示。其中□表示总胆红素，■表示直接胆红素。

实验条件：胆红素为一定初始浓度，静态吸附时间为2.5小时，胆红素血浆与吸附材料的体积比为5∶1。

图3是以1，6-己二胺为配基的胆红素的吸附材料为例，对不同的高胆红素血症病人血浆中胆红素的吸附量的比较图。

实验条件：与图2中条件相同。

【具体实施方式】

实施例1、聚乙烯醇微球为载体的吸附剂的制备

a.聚乙烯醇微球的制备

在500ml三口烧瓶中分别加入24g醋酸乙烯酯，6g异氰脲酸三烯丙酯，15ml乙酸乙酯，15ml正庚烷和1.6g聚醋酸乙烯酯(聚合度500)，体系升温至40℃，机械搅拌，待聚醋酸乙烯酯溶解完全后加入0.3g引发剂偶氮二异丁腈，待引发剂溶解后往体系中加入300ml水溶液(按重量计算，含有1.5％的聚乙烯醇和3％的氯化钠)，调整搅拌速度使液滴均匀分散，大小合适，缓慢升温至65℃，保持温度和搅拌速度聚合3小时，然后升温至75℃再维持3小时，得到一种白色粒状共聚物。过滤，用热水洗涤，再用丙酮在索氏提取器中提取12小时，晾干。

将上述共聚物微粒加入到12gNaOH和500ml甲醇组成的溶液中，机械搅拌下在40℃进行18小时的酯交换反应(或称醇解反应)，反应完成后抽滤，用甲醇洗涤，晾干，得到以聚乙烯醇为主要结构单元的交联多孔共聚物微球。平均粒径为450um，比表面积为66.89m²/ml，羟基含量约10.0mmol/g。

b.聚乙烯醇微球载体的交联和活化：向10g聚乙烯醇微球悬液中加入10ml3mol/LNaOH，60ml环氧氯丙烷(EPI)，在40℃下振荡进行3小时的活化反应，然后用蒸馏水充分洗涤备用。

实施例2、三甲胺功能基的固定：取1ml实施例1b步骤活化所得的聚乙烯醇微球，向其中加入0.75ml 2mol/LNaOH，15ml三甲胺水溶液，于40℃下振荡过夜，然后用蒸馏水充分洗涤，得到胆红素吸附剂备用。

实施例3、三乙胺功能基的固定：取1ml实施例1b步骤所得的活化微球，向其中加入0.75ml 2mol/LNaOH，5ml三乙胺，于40℃下振荡过夜，然后用蒸馏水充分洗涤，得到胆红素吸附剂备用。

实施例4、1，6-己二胺功能基的固定：取1ml实施例1b步骤所得的活化微球，向其中加入0.75ml 2mol/LNaOH，5ml 1，6-己二胺，于75℃下振荡过夜，然后用蒸馏水充分洗涤，得到胆红素吸附剂备用。

实施例5、吸附剂体外静态吸附实验：分别量取0.5ml由实施例2，实施例3，实施例4中制备的吸附剂，置于10.0ml的聚丙烯塑料管中，加入适量的生理盐水平衡3小时，吸去游离的生理盐水后加入5.0ml浓度为342μmol/L胆红素模拟血清液(一定量的胆红素溶于PBS缓冲液中，其中含白蛋白20g/L)，37℃恒温振荡3小时，静置片刻，吸取上清液做胆红素浓度测定，并设空白对照，吸附率由下式计算：

AP＝([C]_B-[C]_A)/[C]_B×100％

式中AP为吸附率(％)，[C]_B和[C]_A分别为吸附前后浓度(mg/dl)。

由实施例2、实施例3，实施例4制得的吸附剂对胆红素模拟血清液的吸附率分别为93％，96％和98％(如附图1所示)。

实施例6.取实施例2、实施例3、实施例4制得的吸附剂各0.5ml，置于5.0ml的聚丙烯塑料管中，加入适量的生理盐水平衡3小时，吸去游离的生理盐水后加入2.5ml一定浓度高胆红素症病人血浆，37℃恒温振荡2.5小时，并采用实施例5方法进行吸附性能测试。结果为由实施例2制得的吸附剂对总胆红素的吸附率为(33.6±1.2)％，由实施例3制得的吸附剂为(38.2±8.2)％，由实施例4制得的吸附剂为(49.1±3.4)％(如附图2，3所示)。

Claims (7)

1.一种用于体外血液灌流吸附胆红素的吸附剂，其特征是该吸附剂以聚乙烯醇微球为载体，将载体悬浮于环氧氯丙烷中，在20-80℃温度范围内，0.5-5.0N NaOH溶液条件下活化后，于20-80℃温度范围内与聚乙烯醇微球体积的0.5-5.0倍的胺化试剂反应，固定胺化试剂为功能基得到的胆红素吸附剂。

2.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：胺化试剂为三甲胺，三乙胺，乙醇胺，1，6-己二胺，二乙烯三胺，三乙烯四胺，四乙烯五胺，或乙二胺。

3.根据权利要求2所述的吸附剂，其特征在于所述的功能基为氨基，具体是伯胺基，仲氨基，或叔胺基。

4.根据权利要求1或2或3所述的吸附剂，其特征在于所述的载体的粒径为100-500μm，孔隙率不小于20％。

5.权利要求1所述的吸附剂的制备方法，其特征在于：将聚乙烯醇微球载体悬浮于10倍载体体积的二甲基亚砜中，加入聚乙烯醇微球体积的0.5-6.0倍的环氧氯丙烷，在20-80℃温度范围内，0.5-5.0N NaOH溶液条件下活化后，于20-80℃温度范围内与聚乙烯醇微球体积的0.5-5.0倍的胺化试剂反应得到用于体外血液灌流吸附胆红素的吸附剂。

6.根据权利要求5所述的吸附剂的制备方法，其特征在于：所述的聚乙烯醇微球载体的制备方法是：将单体醋酸乙烯酯和单体质量的20-40％的交联剂异氰脲酸三烯丙酯以及单体体积的60-80％的致孔剂乙酸乙酯、单体体积的60-80％的正庚烷分散于质量浓度为1.5％的聚乙烯醇水溶液中，在偶氮二异丁腈引发作用下聚合成微球，丙酮回流脱除致孔剂，在氢氧化钠甲醇溶液中进行酯交换反应，得到交联聚乙烯醇共聚微球，羟基含量为5-15mmol/g。

7.权利要求1所述吸附剂应用于血液灌流中去除胆红素。

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