CN101961512A - 一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱及其制备方法，涉及一种血液灌流技术。本吸附柱包括亲和微球(1)、聚酯柱(2)和分离膜(3)；在聚酯柱(2)内装入亲和微球(1)，在聚酯柱(2)两端通过分离膜(3)封闭。本方法包括：①制备吸附微球；②将吸附微球活化，得活化微球；③固定抗体，得亲和微球；④进行未反应完醛基和环氧基的封闭；⑤装柱；⑥封膜。本发明可以辅助或代替乙型肝炎的抗病毒疗法，效果显著；适用于乙肝病毒携带者、慢性乙型肝炎患者、乙肝重症患者、肝癌患者血液中乙肝病毒的清除，达到缓解、治疗和挽救患者生命的目的。在亲和微球(1)上固定针对其它病毒的抗体，可以对多种疾病有很好的治疗效果，如艾滋病等。

Description

一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种血液灌流技术，尤其涉及一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱及其制备方法。

背景技术

血液净化技术包括血液透析、血液滤过、血液透析滤过、血液灌流、血浆分离和治疗分离，以及血液成分吸附治疗等。自1979年，Terman首先报道了使用DNA免疫吸附柱，采用血液灌流技术来治疗系统性红斑狼疮(SLE)，从此迈入了用免疫吸附疗法治疗免疫性疾病的新阶段。近年来，血液净化技术在疾病的体外治疗方面引起了人们越来越多的重视，人们不断开拓血液净化技术治疗疑难疾病的新领域。

乙型肝炎是目前困扰人们的一种常见的病毒感染性疾病，在我国流行甚广。人群总感染率高达60％，构成乙型肝炎传染源的表面抗原携带者约为10％。全国乙型肝炎表面抗原携带者至少有1.2亿，其中约10％最终转化为各种慢性肝炎，包括慢性肝炎肝硬化和肝癌。现在我国慢性肝炎病人约为1200万，每年肝病死亡人数约为30万，其中16万人死于肝癌，可见病毒性肝炎给社会带来了巨大经济负担以及对人类健康带来的巨大影响。

目前治疗乙型肝炎的抗病毒疗法，成本高、疗程长、副作用大，不能达到较好的治疗效果，患者用药后乙型肝炎病毒容易变异，影响后续的治疗效果，给患者带来了巨大的经济压力和心理负担。

研究发现乙肝患者的血液中含有大量的乙型肝炎表面抗原的Dana颗粒(HBsAg)，形成病毒血症，为了治疗这种病毒血症，我们发现可以通过血液灌流的方法把血液从患者动脉引出，血液中的乙型肝炎病毒表面蛋白抗原与亲和微球上的乙型肝炎人免疫球蛋白特异性结合，来吸附血浆中的乙型肝炎病毒，达到清除病毒和治疗的目的。在亲和微球上固定针对其它病毒的抗体，可以对多种疾病有很好的治疗效果，如艾滋病等。

将清除了病毒的血液重新输入体内。这种方法在人体外对血液进行处理，没有化学物质的刺激，毒副作用小，且无需输入新鲜血浆或置换液，具有广阔的临床意义和市场前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有乙型肝炎治疗和吸附柱的缺点和不足，提供一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱及其制备方法。

本发明的目的是这样实现的：

我们选用壳聚糖作为原料，来源广泛，价格便宜，血液相容性好。亲和微球制作过程与其他方法相比简单易行，且制备的吸附微球粒径分布均匀。

本吸附柱毒副性小，特异性高，能够大量清除血液中的乙肝病毒，可辅助或替代传统的治疗方法。

一、一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱(简称吸附柱)

本吸附柱包括亲和微球、聚酯柱、分离膜；

在聚酯柱内装入亲和微球，在聚酯柱两端通过分离膜封闭。

本吸附柱的工作原理：

亲和吸附作为一种生物分离技术，可用于血液净化治疗免疫性疾病。亲和吸附柱是利用抗原和抗体之间特异性结合的原理，将乙型肝炎人免疫球蛋白固定在吸附微球上形成亲和微球。将乙肝患者血液从动脉输出，流经亲和吸附柱，血浆中的病毒表面蛋白抗原和乙型肝炎人免疫球蛋白结合，从而将乙肝病毒从血液中吸附掉，将清除过病毒的血液回输到人体内。

二、一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱的制备方法(简称方法)

本方法包括下列步骤：

①制备吸附微球；

②将吸附微球活化，得活化微球；

③固定抗体，得亲和微球；

④进行未反应完醛基和环氧基的封闭；

⑤装柱；

⑥封膜。

本发明具有以下优点和积极效果：

1、特异性强，乙型肝炎人免疫球蛋白只与乙肝病毒结合；

2、治疗效果显著，通过1～2个小时的血液灌流可将血液内的乙肝病毒大量清除，疗效显著；

3、毒副性小，由于选用血液相容性良好的壳聚糖作为原材料来制备吸附微球，因而对机体的伤害小；

4、安全，在聚酯柱的两端封有孔径适宜的分离膜，能够允许血细胞通过，却阻止亲和微球的通过，防止亲和微球进入血液；

5、成本较低，除去了病毒的血液回输到体内，不需要补充新鲜的血浆置换液。

总之，本发明可以辅助或代替乙型肝炎的抗病毒治疗法，效果显著；适用于乙肝病毒携带者、慢性乙型肝炎患者、乙肝重症患者、肝癌患者血液中乙肝病毒的清除，达到缓解、治疗和挽救患者生命的目的。在亲和微球上固定针对其它病毒的抗体，可以对多种疾病有很好的治疗效果，如艾滋病等。

附图说明

图1是本吸附柱的结构示意图。

其中：

1-亲和微球；

2-聚酯柱；

3-分离膜。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明：

一、一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱(简称吸附柱)

1、总体

如图1，本吸附柱包括亲和微球1、聚酯柱2和分离膜；

在聚酯柱2内装入亲和微球1，在聚酯柱2两端通过分离膜3封闭。

2、功能块

1)亲和微球1

用分子量为5～10万的壳聚糖制成直径为150～5000μm的深棕色球形颗粒，得到一种吸附微球；

在吸附微球中加入活化剂得到活化微球；

在活化微球中加入乙型肝炎人免疫球蛋白进行抗体固定得到亲和微球。

在活化微球中加入针对其它病毒的抗体，可得针对其它病毒的亲和微球。

本发明选用环氧氯丙烷作为活化剂，其能与吸附微球上的羟基反应，在碱性条件下在吸附微球上引入大量的环氧基，得到活化微球。活化微球上含有大量的环氧基能与乙型肝炎人免疫球蛋白上的氨基反应，将乙型肝炎人免疫球固定在活化微球上，形成亲和微球。

本实验选用绿十字(中国)生物制品有限公司生产的乙型肝炎人免疫球蛋白。

制备得到的亲和微球通过其上的乙型肝炎人免疫球蛋白与乙肝患者血液中的乙肝病毒表面蛋白抗原结合，而将乙肝病毒吸附掉，达到清除血液中乙肝病毒的目的。

其制备原理如下式：

①微球交联

②环氧氯丙烷活化微球

③固定抗体

2、聚酯柱2

所述的聚酯柱2是一种塑料筒，高H：直径D为1～100。

有市售产品，也可自己设计。

3、分离膜3

所述的分离膜3是一种过滤膜，孔径d为：30μm～150μm。

二、一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱的制备方法(简称方法)

①制备吸附微球

取壳聚糖1g，加30ml的5％醋酸溶液中，加热搅拌至充分溶化，得到壳聚糖溶液；在500ml的锥形瓶中加入300ml的大豆油和4ml的乳化剂span80，搅拌均匀；再沿锥形瓶壁加入壳聚糖溶液，搅拌均匀，加入10ml的交联剂戊二醛，于50℃下充分搅拌反应50min后升温至60℃，调PH＝9.0后升温至80℃反应1h；

用蒸馏水、乙醇、丙酮洗涤壳聚糖交联微球，抽滤，自然晾干。

②将吸附微球活化，得活化微球

将吸附微球用蒸馏水充分溶胀后，抽干，取1g吸附微球于250ml锥形瓶中，加入10ml、2.0M的NaoH溶液，再加入0.33ml的环氧氯丙烷，于45℃、80rpm下反应4h；

用蒸馏水定容到750ml，洗涤、抽滤，自然晾干，得活化微球。

③固定抗体，得亲和微球

取1g溶胀抽干的活化微球与250ml的锥形瓶中，加入300ul的乙型肝炎人免疫球蛋白和10ml的碳酸盐缓冲液(0.1mol/L、PH＝9.6)，在0～4℃下反应24h；

用50ml的磷酸盐缓冲液(0.2mol/L、PH＝7.4)淋洗微球，抽滤、晾干，得亲和微球。

④进行未反应完醛基和环氧基的封闭

取1g溶胀的亲和微球于250ml锥形瓶中，加入2g人血清白蛋白，常温下反应4h进行未反应完醛基和环氧基的封闭；

完毕后，用大量蒸馏水淋洗干净，抽干。

⑤装柱

将亲和微球装入到聚酯柱内。

其特点在于柱两端有孔径适宜的分离膜，用于阻止亲和微球流入血液。

⑥封膜

在装好亲和微球的聚酯柱两端封闭分离膜。

三、试验结果

将上述制备的乙型肝炎病毒亲和吸附柱与血液净化体外循环系统连接，对富含乙型肝炎病毒的血浆在体外进行亲和吸附试验，对试验前后的HBV-DNA、HBsAg进行定量检测。结果表明：经过1.5h后，血清中的HBV-DNA、HBsAg含量大量减少。

表1  体外HBVM、HBV-DNA亲和吸附结果

Claims (5)

1.一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱，其特征在于：

包括亲和微球(1)、聚酯柱(2)和分离膜(3)；

在聚酯柱(2)内装入亲和微球(1)，在聚酯柱(2)两端通过分离膜(3)封闭。

2.按权利要求所述的一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱，其特征在于：

所述的亲和微球(1)是：

用分子量为5～10万的壳聚糖制成直径为150～5000μm的深棕色球形颗粒，得到一种吸附微球；

在吸附微球中加入活化剂得到活化微球；

在活化微球中加入乙型肝炎人免疫球蛋白进行抗体固定得到亲和微球；

在活化微球中加入针对其它病毒的抗体，可得针对其它病毒的亲和微球。

3.按权利要求所述的一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱，其特征在于：

所述的聚酯柱(2)是一种塑料筒，高H：直径D为1～100。

4.按权利要求所述的一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱，其特征在于：所述的分离膜(3)是一种过滤膜，孔径d为30μm～150μm。

5.按权利要求1所述的一种乙型肝炎病毒亲和吸附柱的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

①制备吸附微球；

②将吸附微球活化，得活化微球；

③固定抗体，得亲和微球；

④进行未反应完醛基和环氧基的封闭；

⑤装柱；

⑥封膜。

Images