CN102824306B

CN102824306B - 一种叶酸修饰壳聚糖包裹质粒纳米粒子及其制备方法

Info

Publication number: CN102824306B
Application number: CN201210333201.4A
Authority: CN
Inventors: 卢小玲; 余夏; 赖春慧; 赵永祥
Original assignee: Guangxi Medical University
Current assignee: Guangxi Medical University
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2032-09-11
Also published as: CN102824306A

Abstract

本发明涉及一种叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子及其制备方法，该方法包括以下步骤：S1、采用三聚磷酸钠制备物理交联的壳聚糖纳米粒子；S2、加入戊二醛溶液进行化学交联；S3、壳聚糖纳米粒子的透析纯化；S4、壳聚糖纳米粒子的叶酸修饰：S5、Na₂SO₄诱导的复凝聚沉淀法制备含IP10质粒的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子。本发明的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子通过静脉注射给药后，经血液循环途径直接靶向肿瘤局部，由于材料的体积优势，在体内可以降低粒子被网状上皮系统清除速率，延长粒子在血液循环系统中的停留时间。

Description

一种叶酸修饰壳聚糖包裹质粒纳米粒子及其制备方法

技术领域

本发明属于生物材料的医学基础应用领域，更具体地说，涉及一种叶酸修饰壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法。

背景技术

肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第三位。原发性肝癌在我国属于高发病，一般男性多于女性。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手。

早期肝癌以手术治疗为主，但由于起病隐匿，早期症状不典型且诊断困难，确诊时大多数患者已达到晚期失去手术机会。肝癌对放化疗均不敏感，目前主要依赖介入（TACE）或药物辅助治疗，预后极差。目前已知肝癌的发生发展与转移和多种基因突变、信号转导通路和新生血管增生异常密切相关，这些发病机理为分子靶向治疗提供许多有利的靶点，逐渐成为新的研究靶点。

在肝癌的过继免疫治疗方面，肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicT lymphocyte，CTL）被作为治疗研究领域之一，治疗的方向放在诱导T细胞及NK细胞分泌IFN-γ及促进CTL成熟，并且诱导更强的抗血管效应。但这种疗法也有其缺陷性，原因是靶向到肿瘤局部的特异性CTL细胞数量有限，影响到免疫治疗的效果。故人们开始研究一种基于趋化因子干扰素诱导蛋白10（IP10），作为促进T细胞的定向趋化和活化增殖的促进剂。

IP10具有强大的趋化淋巴细胞和活化功能，可以定向募集T淋巴细胞并促进淋巴细胞活化和增殖，引起肿瘤内淋巴细胞浸润，并且具有抑制肿瘤新生血管生成的作用，从而发挥较强的抗肿瘤作用。在借助IP10的趋化作用下，CTL即可从注射部位靶向富集到肿瘤周围特别是侵润的肿瘤细胞周围，故目前主要通过转基因技术或者直接肿瘤局部多点注射等方法使肿瘤局部富集IP10。但这些方法存在靶向性、浓度以及体内降解等问题，不能很好的富集到肿瘤细胞局部。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有肝癌的过继免疫治疗中药物靶向性较差的缺陷，提供一种叶酸修饰壳聚糖包裹质粒纳米粒子及其制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1、将脱乙酰度大于95%的壳聚糖粉末溶解在含1%的醋酸溶液中，制备成5mg/mL的壳聚糖溶液，并调节pH值至4.9-5.2；在持续匀速搅拌作用下，将2mg/mL的三聚磷酸钠溶液按照1.0:(1.2-2.0)的体积比逐滴滴入所述壳聚糖溶液中，形成物理交联后的壳聚糖溶液；

S2、在持续匀速搅拌作用下，将5wt%的戊二醛溶液按照1:12-15的体积比逐滴加入到所述物理交联后的壳聚糖溶液中，37°C水浴震荡过夜，得到化学交联后的壳聚糖溶液，并加入过量的NaBH4粉末；

S3、对步骤S2制得的壳聚糖溶液进行透析纯化，得到壳聚糖纳米粒子悬浮液；

S4、用磷酸缓冲液将叶酸配成5mg/ml的叶酸溶液；将所述叶酸溶液、壳聚糖纳米粒子悬浮液以及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐按质量比为10:1:5混合，在匀速搅拌作用下，室温反应30min；透析去除未反应的叶酸，得到叶酸修饰的壳聚糖纳米粒子悬浮液；

S5、将IP10质粒用25mmol/L的Na₂SO₄溶液稀释至1mg/ml后与所述壳聚糖纳米粒子悬浮液分别置于55°C水浴5-20min，按质量比为10:1迅速混合后，在涡轮振荡器上以2000rpm的震荡速率震荡30-50秒，室温下静置30min；并在4°C下>10,000g离心20min，然后用磷酸缓冲液重悬，形成乳白色悬液，制得叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子。

在根据本发明所述的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法中，所述步骤S1中用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至4.9-5.2，所述持续匀速搅拌为500rpm，所述逐滴滴入为1滴/秒的速率。

在根据本发明所述的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法中，所述步骤S2中所述水浴震荡的震荡速率为120rpm。

在根据本发明所述的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法中，所述步骤S3中透析纯化使用的透析袋的截留分子量为8000-14000，透析时间为2小时。

在根据本发明所述的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法中，所述步骤S4中所述匀速搅拌的速度为200rpm；所述透析去除未反应的叶酸使用截留分子量为8000-14000的透析袋。

本发明还提供了一种叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子，采用前述的制备方法制得。

实施本发明的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子及其制备方法，具有以下有益效果：本发明采用叶酸修饰壳聚糖纳米粒子，并对IP10质粒进行包裹，制得叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子，本发明通过适当的制备条件获得的纳米粒子粒径适中，形态好，产量高，通过静脉注射给药后，经血液循环途径直接靶向肿瘤局部，由于材料的体积优势，在体内可以降低粒子被网状上皮系统清除速率，延长粒子在血液循环系统中的停留时间。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1所示为根据本发明的叶酸修饰壳聚糖纳米粒子的制备过程化学反应原理图；

图2所示为根据本发明的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法流程图；

图3所示为根据本发明的叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子的粒径分布图；

图4A所示为未采用叶酸修饰的壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子的扫描电镜图，图4B为叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子的扫描电镜图；

图5所示为叶酸、壳聚糖和本发明所述叶酸修饰壳聚糖纳米粒子的傅里叶变换红外光谱表征；

图6所示为叶酸、壳聚糖和本发明所述叶酸修饰壳聚糖纳米粒子的X射线衍射表征；

图7所示为本发明的凝胶阻滞实验结果；

图8A-图8F所示为H22细胞吞噬本发明的叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子的实验结果；

图9所示为本发明叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子给药效果检测中小鼠肿瘤生长曲线；

图10所示为本发明叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子给药效果检测中小鼠生存率；

图11A-图11D所示为本发明叶酸修饰壳聚糖包裹IP10纳米粒子对小鼠肿瘤的治疗效果照片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

请参阅图1，为根据本发明的叶酸修饰壳聚糖纳米粒子的制备过程化学反应原理图。本发明利用叶酸对壳聚糖进行修饰，制备叶酸修饰的壳聚糖纳米粒子。如图1中所示，叶酸的羧基在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）的作用下被激活后与壳聚糖的氨基发生脱水缩合形成稳定的酰胺键。

请参阅图2，为根据本发明的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法流程图。如图2所示，本发明的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法包括以下步骤：

首先，在步骤S1中，采用三聚磷酸钠制备物理交联的壳聚糖纳米粒子。步骤S1具体包括：

S1-1、将脱乙酰度＞95%的壳聚糖粉末溶解在含1%的醋酸溶液中，制备成5mg/mL的溶液，并用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至4.9-5.2，制备成壳聚糖溶液A；

S1-2、将三聚磷酸钠用蒸馏水配置成2mg/mL的三聚磷酸钠溶液B；

S1-3、在500rpm持续匀速搅拌作用下，按照溶液A:溶液B=(1.2-2.0):1.0的体积比将三聚磷酸钠溶液B按照1滴/秒的速率逐滴加入到壳聚糖溶液A中，形成物理交联后的壳聚糖溶液C。

随后，在步骤S2中，加入戊二醛进行化学交联反应。步骤S2具体包括：

S2-1、将戊二醛配置成5wt%的戊二醛溶液D；

S2-2、在持续匀速搅拌作用下，按照溶液D:溶液C=1:12-15的体积比将所述戊二醛溶液D加入到物理交联后的壳聚糖溶液C中，以120rpm的震荡速率37°C水浴震荡过夜，形成化学交联后的壳聚糖溶液E；

S2-3、在化学交联后的壳聚糖溶液E中进一步加入过量的NaBH4粉末，以还原壳聚糖的氨基与戊二醛形成的希夫氏碱。

随后，在步骤S3中，对所述化学交联后的壳聚糖溶液E进行透析纯化，得到壳聚糖纳米粒子悬浮液F。步骤S3具体为使用截留分子量为8000-14000的透析袋，透析时间为2小时。

随后，在步骤S4中，用叶酸对壳聚糖纳米粒子进行修饰，其中，叶酸的羧基在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）的作用下被激活后与壳聚糖的氨基发生脱水缩合形成稳定的酰胺键。步骤S4具体包括：

S4-1、细胞培养基级别的叶酸用磷酸缓冲液配成5mg/ml的叶酸溶液G；

S4-2、将叶酸溶液G、壳聚糖纳米粒子悬浮液F、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐按质量比为10:1:5混合、在200rpm匀速搅拌作用下，室温反应30min；

S4-3、使用截留分子量为8000-14000的透析袋透析去除未反应的叶酸，得到叶酸修饰的壳聚糖纳米粒子悬浮液H。

随后，在步骤S5中，采用Na₂SO₄诱导的复凝聚沉淀法制备含IP10质粒的叶酸修饰的壳聚糖纳米粒子。步骤S5具体包括：

S5-1、将IP10质粒用25mmol/L的Na₂SO₄溶液稀释至1mg/ml后与叶酸修饰的壳聚糖纳米粒子悬浮液H分别置于55°C水浴5-20min，按质量比为10:1迅速混合后，在涡轮振荡器上以2000rpm的震荡速率震荡30-50秒，室温下静置30min；

S5-2、4°C下>10,000g离心20min，然后用磷酸缓冲液重悬，形成乳白色悬液，制得叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子。

本发明还提供了采用上述制备方法制得的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子。

叶酸（folic acid，FA）是人体必需的但又无法合成的一种维生素，自1986年B.A.Kamen发现叶酸是由受体介导的内吞途径进入细胞并能与肿瘤细胞表面叶酸表达受体结合以来，人们开始了以叶酸作为靶向配体的研究。叶酸受体在许多肿瘤细胞都发现有表达，有时可比正常组织高出100-300倍。此受体主要在肿瘤细胞高表达，在正常组织中没有或很少表达，故具有很好的肿瘤组织特异性。在人类许多肿瘤中均有叶酸受体的高表达，靶向应用的范围很广。叶酸受体系统有以下独特优点：（1）结构比较简单，容易合成，购买价格低廉；（2）体积较小，易修饰到纳米级生物材料上，并在体内易吸收；（3）具有很好的肿瘤组织特异性，在人类大多肿瘤上表达，靶向应用的范围很广。

甲壳素是一种天然有机高分子多糖，广泛存在于甲壳素类动物的外壳中，壳聚糖是甲壳素的衍生物，壳聚糖分子上存在大量的氨基，在水溶液中能解离成大量的正电荷，很容易进行功能基团的修饰。目前基因治疗主要面临的一大难题即是进入体内的稳定性以及在体内所停留的时间，壳聚糖作为一种非病毒载体具有良好的生物相容性、可降解、对细胞及组织无毒性，能有效保护负载的质粒或基因片段在进入体内不被体液中核酸酶所降解。

本发明采用离子模板法制备壳聚糖纳米粒子，操作简单，壳聚糖与叶酸原料易得低廉。主要通过三聚磷酸钠为模板，在酸性条件下通过三聚磷酸钠上的负电荷与壳聚糖上的正电荷相结合而形成纳米粒子，再通过戊二醛的作用形成更紧密结合的纳米粒子。通过控制三聚磷酸钠与壳聚糖上氨基的比例、转速、戊二醛的用量来控制粒径的大小。离子模板法相较于传统的制备方法具有操作简便、能在温和条件下迅速生成粒径几十至数百纳米的壳聚糖纳米粒，不需使用有机溶剂，反应过程简便迅速，所以具有很高的使用价值。

虽然纳米粒子的药物控释已经得到一定程度的发展，但是针对不同的高分子载体材料以及被装载的物质，所需的制备工艺及参数也不同。本发明针对IP10采用前述制备方法制得的叶酸修饰壳聚糖包裹质粒纳米粒子的粒径适中，便于注射给药，通过血液循环靶向性到达肿瘤部位。

目前IP-10质粒大多单独治疗、制备成融合蛋白或者联合抗癌药物使用，但是单独使用的IP10具有一定的局限性，即使在肿瘤局部注射也是短暂停留，并不能长久发挥其作用。实现肿瘤基因治疗的关键是要使用高效安全的基因导入系统，本发明采用叶酸修饰的壳聚糖包裹IP10质粒能特异性的靶向至肿瘤局部并被肿瘤细胞所吞噬，壳聚糖纳米粒子本身具有很好的生物相容性，从而将外源基因安全送至肿瘤细胞中。

本发明用这种纳米粒子生物材料对BALB/c荷瘤小鼠进行尾静脉注射，通过血液循环途径直接靶向肿瘤局部，由于纳米粒子材料的体积优势，在体内可以降低粒子被网状上皮系统清除速率，延长粒子在血液循环系统中的停留时间。

请参阅图3，为根据本发明的叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子的粒径分布图。其中CS-IP10为未采用叶酸修饰的壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子；FA-CS-IP10为叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子。可以看到，叶酸修饰后壳聚糖水化粒径的主峰从396nm减小至342nm。

请参阅图4A为未采用叶酸修饰的壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子的扫描电镜图，图4B为叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子的扫描电镜图。可以看到，未采用叶酸修饰的壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子为空载壳聚糖，其透射电镜形态大小均一，表面形貌有些粗糙；叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子不再呈现出圆球形的结构，有些类似于方形，且粒径变小。

请参阅图5，为叶酸、壳聚糖和本发明所述叶酸修饰壳聚糖纳米粒子的傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征。从FTIR吸收峰可以看到，叶酸的羧基与壳聚糖的氨基反应形成的羧基。

请参阅图6，为叶酸、壳聚糖和本发明所述叶酸修饰壳聚糖纳米粒子的X射线衍射（XRD）表征。从该XRD衍射图谱可以看到，叶酸修饰壳聚糖（FA-CS）呈现出无定形相，叶酸（FA）和壳聚糖（CS）的特征峰均消失，这是由于叶酸分子结构较氨基复杂得多，当叶酸接枝在壳聚糖的氨基上时，阻碍了壳聚糖分子链的运动。

请参阅图7，为本发明的凝胶阻滞实验结果，具体为IP10质粒、壳聚糖纳米粒子、壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子和叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子的1%琼脂糖凝胶电泳图。其中第0泳道：分子量标准品（marker），第1泳道：IP10质粒，第2泳道：壳聚糖纳米粒子，第3泳道：壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子，第4泳道：叶酸修饰的壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子。由于壳聚糖带正电荷在琼脂糖胶上不出现条带，从3、4泳道可以看出壳聚糖包裹IP10质粒成功。

请参阅图8A-C为H22细胞吞噬壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子的实验结果，图8D-F为H22细胞吞噬叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子的实验结果，图8A-F均为37°C下孵育4h后荧光显微镜下观察结果。其中图8A和图8D为DAPI染核显蓝色荧光，图8B和图8E为FITC修饰壳聚糖显绿色荧光，图8C为图8A和图8B的融合图，图8F为图8D和图8E的融合图。可以看出，H22细胞吞噬壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子，可看见个别细胞吞噬现象但荧光不强；而H22细胞吞噬叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子，几乎所有细胞均有吞噬现象，胞质内荧光较强，说明叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子可被H22细胞特异吞噬。

请参阅图9，为本发明叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子给药效果检测中小鼠肿瘤生长曲线，实验组别包括PBS处理组、IP10处理组、壳聚糖包裹IP10纳米粒子（CS-IP10）处理组，叶酸修饰壳聚糖包裹IP10纳米粒子（FA-CS-IP10）处理组，各组小鼠分别在第5、12、19天给与药物治疗。可以看到，FA-CS-IP10处理组与对照组相比肿瘤生长速度较慢，表明FA-CS-IP10可显著减慢肿瘤生长速度。

请参阅图10，为本发明叶酸修饰壳聚糖包裹IP10质粒纳米粒子给药效果检测中小鼠生存率，实验组别包括PBS处理组、IP10质粒处理组、壳聚糖包裹IP10纳米粒子（CS-IP10）处理组、叶酸修饰壳聚糖包裹IP10纳米粒子（FA-CS-IP10）处理组。可以看到，FA-CS-IP10处理组与对照组生存曲线有统计学差异，小鼠生存率得到显著提高。

请参阅图11A-C分别为本发明叶酸修饰壳聚糖包裹IP10纳米粒子（FA-CS-IP10）、壳聚糖包裹IP10纳米粒子（CS-IP10）和IP10质粒给药效果检测中治疗20天后小鼠肿瘤生长情况照片，图11D为PBS处理组。收集处于对数生长期H22细胞，对4-6周BALB/c小鼠进行左下腹皮下种瘤，每只细胞数2×10⁶/个。成瘤后分组予以不同处理，观察肿瘤生长大小。在20天可观察到叶酸修饰的壳聚糖IP-10纳米粒子治疗组较对照组有明显抑制肿瘤生长的作用。本图从直观上说明叶酸修饰的壳聚糖IP-10纳米粒子通过血液循环作用直接靶向肿瘤抑制肿瘤生长。

本发明是根据特定实施例进行描述的，但本领域的技术人员应明白在不脱离本发明范围时，可进行各种变化和等同替换。此外，为适应本发明技术的特定场合或材料，可对本发明进行诸多修改而不脱离其保护范围。因此，本发明并不限于在此公开的特定实施例，而包括所有落入到权利要求保护范围的实施例。

Claims

1.一种叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2、在持续匀速搅拌作用下，将5wt%的戊二醛溶液按照1:12-15的体积比逐滴加入到所述物理交联后的壳聚糖溶液中，37℃水浴震荡过夜，得到化学交联后的壳聚糖溶液，并加入过量的NaBH₄粉末；

S5、将IP10质粒用25mmol/L的Na₂SO₄溶液稀释至1mg/ml后与所述壳聚糖纳米粒子悬浮液分别置于55℃水浴5-20min，按质量比为10:1迅速混合后，在涡轮振荡器上以2000rpm的震荡速率震荡30-50秒，室温下静置30min；并在4℃下>10,000g离心20min，然后用磷酸缓冲液重悬，形成乳白色悬液，制得叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子；

所述步骤S3中透析纯化使用的透析袋的截留分子量为8000-14000，透析时间为2小时；

所述步骤S4中所述匀速搅拌的速度为200rpm；所述透析去除未反应的叶酸使用截留分子量为8000-14000的透析袋。

2.根据权利要求1所述的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至4.9-5.2，所述持续匀速搅拌为500rpm，所述逐滴滴入为1滴/秒的速率。

3.根据权利要求1所述的叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中所述水浴震荡的震荡速率为120rpm。

4.一种叶酸修饰的壳聚糖包裹质粒纳米粒子，其特征在于，采用权利要求1-3中任意一项所述的制备方法制得。