CN110467656A - 吸附破伤风疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了吸附破伤风疫苗的制备方法,包括接种培养、杀菌、超滤浓缩、毒素纯化、脱毒、配制,毒素纯化时,毒素液调pH至7.0‑7.2,先用30‑37w/v%的硫酸铵溶液进行分段进行二次沉淀,沉淀时将硫酸铵溶液均匀分为多处流体垂直于毒素液液面流入其中,通入硫酸铵溶液过程中匀速缓慢旋转毒素液。本发明通过将硫酸铵溶液的加入方式进行改进,解决了目前存在的类毒素纯化时产品质量不稳定含量不高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及干燥装置领域,具体涉及一种吸附破伤风疫苗的制备方法。
背景技术
破伤风是一种严重危害人民生命健康的疾病,在广大贫困落后的第三世界的国家和地区尤为严重。人们为了认识、治疗和预防破伤风作出了不懈的努力,最终用破伤风类毒素成功给人进行了免疫,开创了类毒素预防免疫的新时代。
最初使用的是原制破伤风类毒素,这种原制的类毒素免疫效果是好的,但接种后的副反应很大,甚至有过敏性休克死亡的事例,调查表明是由于原制类毒素中存在着大量培养基中无关蛋白成分引起的过敏反应。为减轻接种后的副反应,人们对原制类毒素进行了精制提纯,制备出了精制的破伤风类毒素,但经过使用观察,精制破伤风类毒素的接种反应比原制类毒素的接种反应显著的减少,但免疫学效果不如原制的类毒素。为了提高精制破伤风类毒素的免疫效果,人们开展了佐剂疫苗的研究。
类毒素在精制过程中需要纯化,现有纯化过程中一般采用硫酸铵沉淀法进行粗布纯化和浓缩蛋白,但多次发现类毒素纯化时产品质量不稳定,含量不高,产品质量标准不一。
发明内容
为解决上述问题,本发明目的在于提供吸附破伤风疫苗的制备方法,该方法通过将硫酸铵溶液的加入方式进行改进,解决了目前存在的类毒素纯化时产品质量不稳定含量不高的问题。
本发明通过下述技术方案实现:
吸附破伤风疫苗的制备方法,包括接种培养、杀菌、超滤浓缩、毒素纯化、脱毒、配
制,毒素纯化时,毒素液调pH至7.0-7.2,先用30-37w/v%的硫酸铵溶液进行分段进行二次沉淀,沉淀时将硫酸铵溶液均匀分为多处流体垂直于毒素液液面流入其中,通入硫酸铵溶液过程中匀速缓慢旋转毒素液。
由于硫酸铵溶液加入手法并没有统一标准,特别是沉淀过程需要分段进行时,多次分段加入过程的差异容易引起硫酸铵溶液浓度的分布不均匀,导致局部硫酸铵浓度过高从而破坏蛋白质水化层,导致产品质量不稳定收率不高。因此有必要在沉淀过程中对此过程进行方法改进,以利于产品质量的稳定和提升。本发明通过对方法的改进:均匀通入硫酸铵使其加入到毒素液中的浓度较为均匀,匀速缓慢旋转毒素液起到适当的搅拌作用,辅助沉淀过程缓和进行且防止气泡的产生,防止蛋白质水化层遭到破坏。
进一步的,旋转速度以沉淀过程溶液中不起气泡为准。匀速缓慢旋转的转速小于等于80转/分。
进一步的,硫酸铵溶液均分的多处流体以进入毒素液液面不起气泡为准。气泡的存在会导致混合溶液内硫酸铵的分布不均造成类毒素蛋白质水化层的破坏,因此对于气泡的产生需要进行有效的控制。
现有硫酸铵溶液的加入方式是以倒入的方式进行,这种方式需要辅以较高的搅拌速度以避免硫酸铵局部过高的情况出现,一般都采用磁力搅拌的方式进行,然而较高的搅拌速度同时使得蛋白质受到剪切力的影响容易引起蛋白质变性,不利于蛋白质收率的稳定。本发明在沉淀时将硫酸铵溶液均匀分为多处流体垂直于毒素液液面采用的方法是将硫酸铵溶液通入多股分流器中,并且是选择采用将毒素液缓慢匀速旋转的方式而非直接物理搅动的方式避免蛋白质收到剪切变性,所述多股分流器包括相连通的进液管和分布盘,进液管设置在分布盘的上方,分布盘具有容腔,位于容腔上部的进液口和进液管相连,位于容腔下部的底盘上均匀连通有多个出液通道,多个出液通道的出液口设置在毒素液内,沉淀结束时分别收集沉淀和滤液。多个出液通道呈环形均匀分布在容腔的地盘上。控制多股流体以不起气泡为准的方式之一是采用多股分流器分流加入的方式,既能够保证硫酸铵分布的均匀性,又分流的作用使得流体流速变慢,大大减少了气泡的产生可能性。
进一步的,第一次沉淀将部分硫酸铵加入到毒素液中后将沉淀和滤液经中空纤维膜超滤分别收集第一次沉淀和第一次滤液,并将第一次滤液进行二次沉淀即加入余下硫酸铵,分别收集第二次沉淀和滤液,将第一次沉淀、第二次沉淀和滤液经经中空纤维膜超滤,得沉淀。此步骤能够进一步提升类毒素的蛋白纯化度。
沉淀后,将沉淀用生理盐水溶解,溶解液通入到超滤膜中,间隙加入生理盐水循环脱盐,直到测定样品硫酸铵含量低于千分之一,即可收集脱盐后精制破伤风毒素液。
在吸附制备过程中,按计算量量取10g/L Al(OH)3溶液121℃ 1小时灭菌却至28℃以下即可进行吸附, 搅拌下加入精制破伤风类毒素原液,在搅拌下加入pH8.0磷酸盐缓冲液,搅拌20分钟,以无菌手续抽样作无菌检查,抽样测定pH值,调节pH至6.0~7.0。
搅拌的转速均≤200转/分。
本发明与现有技术相比,具有如下的优点和有益效果:
本发明通过将硫酸铵溶液的加入方式进行改进,解决了目前存在的类毒素纯化时产品质量不稳定含量不高的问题。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解,构成本申请的一部分,并不构成对本发明实施例的限定。在附图中:
图1为本发明结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明,并不作为对本发明的限定。
实施例1
1接种
以无菌方法接上菌种瓶,培养基降温至40℃时,关闭降温水开关,开启恒温循环水系统,待培养基温度降至37℃以下时,即可接种菌种。接种菌种后可深层通氮气5-10min,尽可能排尽发酵罐及培养基中的氧气。
2培养
控制罐内培养温度为35±1℃,静止培养至36小时左右待培养物产气增加较多时可打开排气开关排出废气。培养至72小时抽样做镜检及絮状单位(Lf)测定、pH测定。以后每间隔24小时抽样检测一次。镜检发现杂菌应予复检,复检仍有杂菌则判定为污染,即刻停止培养并彻底灭菌处理。
3杀菌
正常培养至毒素Lf>80且不再上升时为止,按培养量的0.35%加入甲醛溶液,搅匀后转入下一工序。
4毒素纯化
用于精制的毒素可多批混合,但不得超过5批,任何一批毒素絮状单位不得低于40Lf/ml。
4.1去菌体
使用滤堆过滤去菌体,发酵液中可加入适量的硅藻土助滤,硅藻土加量为1-2%。过滤后使用0.2μm除菌滤器最终过滤一次,保证滤液中没有破伤风杂菌。
4.2 超滤浓缩
将除菌过滤后的毒素液泵入超过滤系统,循环浓缩原溶液5~10倍,测定Lf值。
4.3 硫酸铵沉淀
吸附破伤风疫苗的制备方法,包括接种培养、杀菌、超滤浓缩、毒素纯化、脱毒、配
制,毒素纯化时,毒素液调pH至7.0-7.2,先用30-37w/v%的硫酸铵溶液进行分段进行二次沉淀,沉淀时将硫酸铵溶液均匀分为多处流体垂直于毒素液液面流入其中,通入硫酸铵溶液过程中匀速缓慢旋转毒素液。
在实际操作过程中,旋转速度以沉淀过程溶液中不起气泡为准。匀速缓慢旋转的转速小于等于80转/分。硫酸铵溶液均分的多处流体以进入毒素液液面不起气泡为准。气泡的存在会导致混合溶液内硫酸铵的分布不均造成类毒素蛋白质水化层的破坏,因此对于气泡的产生需要进行有效的控制。
沉淀时将硫酸铵溶液均匀分为多处流体垂直于毒素液液面采用的方法是将硫酸铵溶液通入多股分流器中,所述多股分流器包括相连通的进液管1和分布盘2,进液管1设置在分布盘2的上方,分布盘2具有容腔,位于容腔上部的进液口和进液管1相连,位于容腔下部的底盘上均匀连通有多个出液通道3,多个出液通道3的出液口设置在毒素液内,沉淀结束时分别收集沉淀和滤液。多个出液通道3呈环形均匀分布在容腔的地盘上。控制多股流体以不起气泡为准的方式之一是采用多股分流器分流加入的方式,既能够保证硫酸铵分布的均匀性,又分流的作用使得流体流速变慢,大大减少了气泡的产生可能性。
进一步的,第一次沉淀将部分硫酸铵加入到毒素液中后将沉淀和滤液经中空纤维膜超滤分别收集第一次沉淀和第一次滤液,并将第一次滤液进行二次沉淀即加入余下硫酸铵,分别收集第二次沉淀和滤液,将第一次沉淀、第二次沉淀和滤液经经中空纤维膜超滤,得沉淀。和现有技术直接进行离心分离盐析后相比,此步骤能够进一步提升类毒素的蛋白纯化度,纯化度可提升5-8%。中空纤维膜可以采用30-50KD孔径的滤膜。第一次沉淀时加入25w/v%硫酸铵溶液,第二次沉淀时加入12w/v%硫酸铵溶液。
4.4 超滤脱盐
沉淀用生理盐水溶解,溶解液泵入超过滤系统,间隙加入生理盐水循环脱盐,直到测定样品硫酸铵含量低于千分之一,即可收集脱盐后精制破伤风毒素液。超过滤脱盐过程尽量控制在较低温度,液温不宜超过25℃。
4.5 除菌过滤
将脱盐后精制毒素液除菌过滤。过滤后测定絮状单位(Lf),如Lf较高,可用无菌生理盐水稀释至800 Lf/ml左右,并按8000~9000ml/瓶分装于10L瓶中。
5 脱毒
破伤风精制毒素液中加入甲醛溶液至终浓度为0.15~0.2 %(V/V),充分混匀后置35~37 ℃ 恒温室脱毒15-30天,脱毒过程中前三天每日振摇制品两次,到期每亚批抽样进行脱毒试验,脱毒试验或毒性逆转试验不合格的制品可加深脱毒5~7天(加深脱毒时,可根据情况酌量补加甲醛溶液),再复试脱毒试验或毒性逆转试验。脱毒合格的制品即为破伤风精制类毒素原液,抽样进行各项原液检定,原液及样品置2~8℃冷库保存。
6配制
6.1按计算量量取10g/L Al(OH)3溶液121℃ 1小时灭菌。冷却至28℃以下即可进行吸附。
6.2搅拌下(转速不超过200转/分)加入破伤风类毒素原液。
6.3在搅拌下(转速不超过200转/分)加入pH8.0磷酸盐缓冲液,搅拌20分钟,以无菌手续抽样作无菌检查,抽样测定pH值,调节pH至6.0~7.0。
6.4以无菌手续连接不锈钢过滤器进液端与稀释罐出液端,不锈钢过滤器出液端与分装罐进液端。将分装罐压气排出,打开分装罐进液开关及稀释大罐出液开关,以0.05~0.1MPa气压将制品通过不锈钢过滤器边搅拌边滤入分装罐中。过滤过程中注意观察稀释罐和分装罐进出液情况。滤完后关闭分装罐进液开关及稀释罐出液开关。分装罐内加入无菌压缩空气使罐内保持正压。移交分装。
7分装
无菌分装,分装规格为0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml。每1人次用量为0.5ml,含破伤风类毒素效价不低于40IU。
为进一步说明本发明的有益效果,采用现有倒入并配合磁力搅拌的方式和本发明的毒素纯化方式各进行10次对比实验,比较二者经毒素纯化后的蛋白质含量。原液蛋白质含量为1.45mg/ml。
表1 蛋白质含量比较
蛋白质含量(mg/ml) | 蛋白质含量(mg/ml) | ||
现有1 | 1.02 | 本发明1 | 1.23 |
现有2 | 0.98 | 本发明2 | 1.25 |
现有3 | 0.95 | 本发明3 | 1.26 |
现有4 | 1.03 | 本发明4 | 1.24 |
现有5 | 1.23 | 本发明5 | 1.25 |
现有6 | 0.94 | 本发明6 | 1.26 |
现有7 | 1.01 | 本发明7 | 1.27 |
现有8 | 0.91 | 本发明8 | 1.29 |
现有9 | 1.20 | 本发明9 | 1.24 |
现有10 | 0.96 | 本发明10 | 1.27 |
从上表可以看出,现有技术中蛋白质含量并不稳定,波动较大,且平均含量较低,本发明的蛋白质含量稳定,波动趋于平稳,平均含量较高。
本发明中,未详细描述的均是现有技术。
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.吸附破伤风疫苗的制备方法,包括接种培养、杀菌、超滤浓缩、毒素纯化、超滤脱盐、
脱毒、配制,其特征在于,毒素纯化时,毒素液调pH至7.0-7.2,用硫酸铵溶液进行二次沉淀,沉淀时将硫酸铵溶液均匀分为多处流体垂直于毒素液液面流入其中,通入硫酸铵溶液过程中匀速缓慢旋转毒素液。
2.根据权利要求1所述的吸附破伤风疫苗的制备方法,其特征在于,旋转速度以沉淀过程溶液中不起气泡为准。
3.根据权利要求1所述的吸附破伤风疫苗的制备方法,其特征在于,硫酸铵溶液均分的多处流体以进入毒素液液面不起气泡为准。
4.根据权利要求1所述的吸附破伤风疫苗的制备方法,其特征在于,沉淀时将硫酸铵溶液均匀分为多处流体垂直于毒素液液面采用的方法是:将硫酸铵溶液通入多股分流器中,所述多股分流器包括相连通的进液管和分布盘,进液管设置在分布盘的上方,分布盘具有容腔,位于容腔上部的进液口和进液管相连,位于容腔下部的底盘上均匀连通有多个出液通道,多个出液通道的出液口设置在毒素液内。
5.根据权利要求1所述的吸附破伤风疫苗的制备方法,其特征在于,第一次沉淀将部分硫酸铵加入到毒素液中后将沉淀和滤液经中空纤维膜超滤分别收集第一次沉淀和第一次滤液,并将第一次滤液进行二次沉淀即加入余下硫酸铵,分别收集第二次沉淀和滤液,将第一次沉淀、第二次沉淀和滤液经经中空纤维膜超滤,得沉淀。
6.根据权利要求5所述的吸附破伤风疫苗的制备方法,其特征在于,沉淀后,将沉淀用生理盐水溶解,溶解液通入到超滤膜中,间隙加入生理盐水循环脱盐,直到测定样品硫酸铵含量低于千分之一,即可收集脱盐后精制破伤风毒素液。
7.根据权利要求1所述的吸附破伤风疫苗的制备方法,其特征在于,在吸附制备过程中,按计算量量取10g/L Al(OH)3溶液121℃ 1小时灭菌却至28℃以下即可进行吸附, 搅拌下加入精制破伤风类毒素原液,在搅拌下加入pH8.0磷酸盐缓冲液,搅拌20分钟,以无菌手续抽样作无菌检查,抽样测定pH值,调节pH至6.0~7.0。
8.根据权利要求7所述的吸附破伤风疫苗的制备方法,其特征在于,搅拌的转速均≤200转/分。
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